Summary
由于PDX模型正在迅速成为转化肿瘤学领域的标准，因此本协议建立并表征了间变性甲状腺癌（ATC）和头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）的患者来源异种移植（PDX）模型。
Abstract
患者来源的异种移植（PDX）模型忠实地保留了原发肿瘤的组织学和遗传学特征，并保持了其异质性。基于PDX模型的药效学结果与临床实践高度相关。间变性甲状腺癌（ATC）是甲状腺癌最恶性的亚型，侵袭性强，预后差，治疗有限。虽然ATC的发病率仅占甲状腺癌的2%-5%，但其死亡率高达15%-50%。头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）是最常见的头颈部恶性肿瘤之一，全球每年有超过60万例新病例。本文提出了详细的协议来建立ATC和HNSCC的PDX模型。本工作分析了影响模型构建成功率的关键因素，比较了PDX模型与原发肿瘤的组织病理学特征。此外，通过评估成功构建的PDX模型中代表性临床使用药物的 体内 治疗效果，验证了该模型的临床相关性。
Introduction
PDX模型是一种动物模型，其中人类肿瘤组织被移植到免疫缺陷小鼠中并在小鼠提供的环境中生长1。传统的肿瘤细胞系模型存在一些缺点，例如缺乏异质性，无法保留肿瘤微环境，在重复体外传代过程中易受遗传变异的影响，以及临床应用不良2，3。基因工程动物模型的主要缺点是人类肿瘤基因组特征的潜在丧失，新的未知突变的引入，以及难以确定小鼠肿瘤与人类肿瘤之间的同源程度4。此外，基因工程动物模型的制备成本高、耗时且效率相对低下4.
PDX模型在反映肿瘤异质性方面比其他肿瘤模型具有许多优势。从组织病理学的角度来看，虽然小鼠对应物随着时间的推移取代了人类基质，但PDX模型很好地保留了原发肿瘤的形态结构。此外，PDX模型保留了原发肿瘤至少四代的代谢组学特性，更好地反映了肿瘤细胞与其微环境之间复杂的相互关系，使其在模拟人肿瘤组织的生长、转移、血管生成和免疫抑制方面独树一帜5，6，7.在细胞和分子水平上，PDX模型准确反映了人类肿瘤的肿瘤间和肿瘤内异质性，以及原始癌症的表型和分子特征，包括基因表达模式、突变状态、拷贝数以及DNA甲基化和蛋白质组学8，9。不同传代的PDX模型对药物治疗具有相同的敏感性，表明PDX模型的基因表达高度稳定10，11。研究表明，PDX模型对药物的反应与患者对该药物的临床反应之间存在极好的相关性12，13。因此，PDX模型已成为一种强大的临床前和转化研究模型，特别是在药物筛选和临床预后预测方面。
甲状腺癌是内分泌系统常见的恶性肿瘤，是一种人类恶性肿瘤，近年来发病率迅速上升14。间变性甲状腺癌（ATC）是最恶性的甲状腺癌，患者的中位生存期仅为4.8个月15。虽然中国每年只有少数甲状腺癌患者被诊断为ATC，但死亡率接近100%16，17，18。ATC通常生长迅速并侵入颈部的邻近组织以及颈部淋巴结，约一半的患者有远处转移19，20。头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）是世界上第六大常见癌症，也是癌症死亡的主要原因之一，估计每年有60万人患有HNSCC21，22，23。HNSCC包括大量肿瘤，包括鼻子，鼻窦，口腔，扁桃体，咽部和喉部的肿瘤24。ATC和HNSCC是两种主要的头颈部恶性肿瘤。为了促进新型治疗药物和个性化治疗的开发，有必要开发稳健和先进的临床前动物模型，例如ATC和HNSCC的PDX模型。
本文介绍了建立ATC和HNSCC皮下PDX模型的详细方法，分析了模型构建中影响肿瘤取样率的关键因素，并比较了PDX模型与原发肿瘤的组织病理学特征。同时，在这项工作中，使用成功构建的PDX模型进行了 体内 药效学测试，以验证其临床相关性。
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Protocol
所有动物实验均按照四川大学华西医院机构动物护理和使用委员会批准的实验动物护理评估与认证协会指南和协议进行。本研究使用4-6周龄的NOD-SCID免疫缺陷小鼠（两性）和4-6周龄的雌性Balb / c裸鼠。这些动物是从商业来源获得的（见 材料表）。华西医院伦理委员会授权对人类受试者进行研究（方案编号2020353）。每位患者都提供了书面知情同意书。
1. 实验准备
- 安排一次性刀片、消毒剪刀和镊子等肿瘤移植所需的器械，放在超净工作台上，提前用紫外线照射。
- 准备无菌盐水和培养皿，以便在测试期间使用。
2. 新鲜肿瘤组织的获取和运输
- 从手术室获取新鲜肿瘤样本（通常大于5 mm x 5 mm），并将其放入含有无菌HTK溶液（参见 材料表）或盐水的15 mL或50 mL离心管中。标记离心管。
注意：新鲜的肿瘤样本是通过手术切除或穿刺从ATC或HNSCC患者中获得的。 - 将离心管放入预先准备好的冰箱中。
注意：在此期间，移植操作员必须准备移植所需的物品（见 材料表）。 - 确保样品收集和运输到实验室进行PDX构建之间的时间不超过2小时。在运输过程中，用冰水混合物或冰袋包围装有组织的管子，以保持组织活性。
3.肿瘤移植
- 一旦肿瘤组织到达实验室，记录并重新编号。
注意：对于本研究，患者信息严格保密。该程序的其余步骤在生物安全2级（BSL-2）实验室进行。进入实验室时，建议在工作服或防护服上穿工作服，戴帽子和口罩。肿瘤组织的治疗在生物安全柜中进行。 - 用75%酒精消毒含有肿瘤组织的离心管，并将其放在手术台上。使用无菌眼科钳将肿瘤组织转移到装有盐水的6cm培养皿中。接下来，用刀片将它们切成约 2 毫米 x 2 毫米和 3 毫米 x 3 毫米的小块。
- 将肿瘤组织碎片转移到含有适量盐水的6cm培养皿中，用密封膜包裹培养皿，将其放入冰盒中，并将其与必要的器械（一把剪刀，镊子和接种针）一起带入特定的无病原体（SPF）动物室。
- 按照以下步骤准备动物。
- 去除4-6周龄雌性或雄性NOD-SCID免疫缺陷小鼠右侧胸部的毛发，并用75%酒精消毒皮肤。通过腹膜内注射80mg / kg氯胺酮和10mg / kg甲苯噻嗪麻醉小鼠（见 材料表），并用兽医软膏涂抹眼睛以防止干燥。通过踏板反射的丧失确认麻醉深度。
- 用剪刀在小鼠右外侧胸部中间的皮肤上做一个2毫米的切口。
- 从培养皿中取出肿瘤片，并用镊子将其放入2.4mm x 2.0mm穿刺针（见 材料表）中。
- 握住鼠标，收紧穿刺部位的皮肤，使用含有肿瘤碎片的穿刺器通过最初的2毫米皮肤切口插入肿瘤，移动到肩膀后部，推动穿刺器芯。
- 确保肿瘤片被推出并留在套管穿刺形成的过渡窦中，然后拔出穿刺器。
- 如果肿瘤在抽出时随针头移动，请使用套管器将其重置并缝合切口。
注意：在这项研究中，每只小鼠都接种在前后肢背侧。根据肿瘤大小，每个患者的每个肿瘤样本接种一至三只小鼠。
4. 肿瘤组织保存、固定和蛋白质冷冻
注意：剩余的肿瘤组织分别用于种子保存，固定和DNA / RNA /蛋白质冷冻。
- 在将其放入冷冻保存管之前，用无菌纱布从肿瘤表面去除盐水，以确保肿瘤表面不会过度潮湿。
- 将4至6片2 mm x 2 mm肿瘤组织放入2 mL细胞冷冻保存管中，将1 mL由90%胎牛血清（FBS）和10%二甲基亚砜（DMSO）组成的冷冻保存溶液加入管中，将管放入梯度冷却箱中，在-80°C冷冻过夜，最后， 将其转移到液氮中。
- 将3 mm x 3 mm肿瘤组织块置于10%缓冲福尔马林中以进行组织固定以进行病理检查。
- 将 3 mm x 3 mm 组织块放入 2 mL 细胞冷冻保存管中，在液氮中快速冷冻，然后转移到 −80 °C 冰箱中进行 DNA/RNA 和蛋白质提取。
- 收集患者的临床信息，如吸烟史、肿瘤大小、分化、病理亚型、癌症分级、癌症分期、远处转移、来源、病史、免疫组织化学、HNSCC患者人瘤病毒（HPV）感染、治疗用药等。
5. PDX模型肿瘤的传代、冷冻保存和复苏
- 每周一次使用游标卡尺测量小鼠皮下肿瘤的长度和宽度，并根据公式计算肿瘤体积：肿瘤体积= 0.5×长度×宽度2。绘制肿瘤生长曲线。
- 当PDX肿瘤达到2，000mm3时，将其传代给下一代小鼠，并进行肿瘤再移植。按照步骤4执行仪器的准备。
- 用80mg / kg氯胺酮麻醉后通过颈椎脱位对小鼠实施安乐死。
- 用75%的酒精消毒皮肤。然后，用剪刀切割肿瘤周围的皮肤，然后用镊子切除肿瘤，并将其放入培养皿中。
- 按照步骤3执行肿瘤移植程序。
- 按照步骤4对PDX模型肿瘤进行保存和冷冻保存。
- 对于肿瘤组织的复苏，遵循慢速冷冻和快速溶解的原则。从液氮中取出冷冻管后，迅速将其置于37°C的水浴中以快速溶解。
- 在水浴中轻轻摇晃冷冻管以加速解冻过程。
- 解冻，将肿瘤碎片转移到准备好的生理盐水中洗涤，然后接种下一代小鼠。具体操作请参见步骤3中的组织移植程序。
6.确定仑伐替尼和顺铂在ATC PDX模型中的治疗效果
注意：ATC PDX模型用于测试酪氨酸激酶抑制剂仑伐替尼和化疗药物顺铂25，26，27的治疗效果。
- 选择ATC PDX模型（THY-017）的P5代肿瘤组织，切成2-4mm 3组织块，皮下接种（步骤3 ）到10只4-6周雌性Balb / c裸鼠的右后部。
- 选择肿瘤体积在50-150mm3之间的15只小鼠，并将它们分成三组。
- 胃内给予仑伐替尼（10mg / kg），每天一次，持续15天，每3天腹膜内给予顺铂（3mg / kg），总共6剂，并用相同体积的生理盐水给予对照组。
- 每周两次测量小鼠的体重和肿瘤体积。
- 在测试结束时，对小鼠实施安乐死（步骤5.3），并称量肿瘤。
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Representative Results
共移植甲状腺癌标本18例，成功构建甲状腺癌PDX模型5例（肿瘤取率为27.8%），其中未分化甲状腺癌4例，间变性甲状腺癌1例。分析模型构建成功率与年龄、性别、肿瘤直径、肿瘤分级、分化等相关性。虽然4级肿瘤样本的模型成功率高于低分级样本，未分化肿瘤样本的成功率也高于高分化样本，但相关性分析结果表明，这些因素与PDX模型的成功率无关（表1).接种了17个HNSCC样本，并成功构建了4个HNSCCC的PDX模型。模型构建中肿瘤取药率与肿瘤标本临床参数的相关性分析表明，分化程度与模型成功率相关，年龄、性别、吸烟史、肿瘤直径、癌分级、转移、HPV感染均不影响肿瘤取药率（表2）。
绘制每个PDX模型的肿瘤生长曲线，以更好地了解不同患者的PDX模型的生长速率（图1， 图2和 表3）。THY-004从P0至P5代的平均致瘤周期（从接种到肿瘤大小为1，000mm3的时间）分别为68天，87天，29天，34天，28天和26天。THY-012从P0到P5代的平均致瘤周期分别为119天、61天、66天、55天、87天和116天。THY-017从P0到P5世代的平均致瘤周期分别为27天、17天、30天、13天、22天和15天。THY-018从P0代到P3代的平均致瘤周期分别为134天、70天、48天和48天。THY-021从P0代到P3代的平均致瘤周期分别为53天、66天、35天和49天。OTO-017从P0到P4代的平均致瘤周期分别为118天、86天、67天、129天和88天。OTO-022从P0到P5的平均致瘤周期分别为155天、55天、32天、37天、27天和46天。OTO-030从P0代到P2代的平均致瘤周期分别为133天、93天和104天。OTO-031从P0到P5世代的平均致瘤周期分别为144天、58天、33天、34天、52天和50天。ATC样本稳定传给P3代及以后，而两例HNSCC样本在传给P1代后未能形成肿瘤。一些样本的生长速度在P0代相对较慢，但在传递到P1及以后几代后，其生长速度加快。比较患者肿瘤与不同代PDX模型的组织病理学特征。结果显示，PDX肿瘤和患者来源的原发性肿瘤在形态上几乎相似（图3），略有不同差异可能是由于患者与不同代PDX之间采样区域的异质性。
在ATC的PDX模型中评估了仑伐替尼（一种批准用于治疗晚期甲状腺癌的多靶点酪氨酸激酶抑制剂28）的抗肿瘤功效。如图 4A所示，与生理盐水对照组相比，仑伐替尼治疗在ATC PDX模型中显着抑制肿瘤生长（P <0.05）。在实验结束时，切除肿瘤组织并称重以确定肿瘤重量。与对照组相比，仑伐替尼治疗组的肿瘤重量较低，尽管没有达到统计学差异（图4B）。此外，在用仑伐替尼治疗的小鼠中未观察到一般状态和体重的明显变化（图4C）。由于实验过程中顺铂给药频率过高，小鼠表现出明显的毒性，表现为体重减轻甚至死亡。顺铂的抗肿瘤功效见 补充图1。
图1：来自不同患者的ATC PDX模型的肿瘤生长曲线。 每种颜色代表指定的世代，每条曲线代表单个肿瘤。在第0代（P0）代接种1至3只小鼠，在随后的传代（P1-P5）中接种5只小鼠。 请点击此处查看此图的大图。
图2：来自不同患者的HNSCC PDX模型的肿瘤生长曲线。 每种颜色代表指定的世代，每条曲线代表单个肿瘤。在P0代接种1至3只小鼠，在P1及以后世代接种5只小鼠。 请点击此处查看此图的大图。
图3：组织病理学研究。 患者原发性肿瘤与ATC（THY-012，THY-017）和HNSCC （OTO-017）（苏木精-伊红染色，100x）的相应PDX（第1代和第3代）之间的组织病理学比较。THY-012和THY-017的病理亚型为间变性甲状腺癌，OTO-017的病理亚型为鳞状细胞癌。比例尺 = 100 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：仑伐替尼在 ATC PDX 模型中的治疗效果。 用仑伐替尼（10mg / kg）治疗后，携带ATC PDX的小鼠的（A）肿瘤体积，（B）肿瘤重量和（C）体重的变化。使用T检验进行统计分析，以比较左伐替尼与对照组。*P < 0.05与对照组相比被认为具有统计学意义。 请点击此处查看此图的大图。
| 参数 | 类 | 肿瘤取药率（%） | P |
| 年龄（岁） | <60 | 16.67 (1/6) | 0.615 |
| ≥60 | 33.33 (4/12) | ||
| 性 | 雄 | 16.67 (1/6) | 0.615 |
| 女性 | 33.33 (4/12) | ||
| 肿瘤直径 | <6厘米 | 37.50 (3/8) | 0.608 |
| ≥6厘米 | 20.00 (2/10) | ||
| 病理性 TNM 分期 | 我 | 0.00 (0/1) | 1 |
| Ш | 0.00 (0/1) | ||
 |
31.25 (5/16) | ||
| 分化 | 高 | 0.00 (0/7) | 0.059 |
| 穷 | 25.00 (1/4) | ||
| 分化 | 57.14 (4/7) |
表1：ATC肿瘤取样率与患者临床特征的相关性。
| 参数 | 类 | 肿瘤取药率（%） | P |
| 人瘤病毒 | 阴性 | 33.33 (2/6) | 1 |
| 未知或阳性 | 36.36 (4/11) | ||
| 年龄（岁） | <60 | 33.33 (3/9) | 1 |
| ≥60 | 37.50 (3/8) | ||
| 性 | 雄 | 50.00 (5/10) | 0.304 |
| 女性 | 14.29 (1/7) | ||
| 吸烟状况 | 曾 | 44.44 (4/9) | 0.62 |
| 从不 | 25.00 (2/8) | ||
| 肿瘤直径 | <3厘米 | 40.00 (4/10) | 1 |
| ≥3厘米 | 28.57 (2/7) | ||
| 病理性 TNM 分期 | 我 | 75.00 (3/4) | 0.423 |
 |
25.00 (2/8) | ||
| Ш | 0.00 (0/1) | ||
|
33.33 (1/3) | ||
| 远处转移 | Y | 28.57 (2/7) | 0.633 |
| N | 44.44 (4/9) | ||
| 分化 | 高 | 12.50 (1/8) | 0.036* |
| 中到高 | 100.00 (2/2) | ||
| 温和 | 0.00 (0/2) | ||
| 中度至差 | 66.67 (2/3) | ||
| * P < 0.05 |
表2：HNSCC肿瘤取病率与患者临床特征的相关性。 *P < 0.05。
| 示例名称 | P至P0代 | P0 至 P1 代 | P1 至 P2 世代 | P2 至 P3 代 | P3 至 P4 世代 | P4 至 P5 世代 |
| THY-004 | 68 | 87 | 29 | 34 | 28 | 26 |
| THY-012 | 119 | 61 | 66 | 55 | 87 | 116 |
| THY-017 | 27 | 17 | 30 | 13 | 22 | 15 |
| THY-018 | 134 | 70 | 48 | 48 | - | - |
| THY-021 | 53 | 66 | 35 | 49 | - | - |
| OTO-017 | 118 | 86 | 67 | 129 | - | - |
| OTO-022 | 155 | 55 | 32 | 37 | 27 | 46 |
| OTO-030 | 133 | 93 | 104 | - | - | - |
| OTO-031 | 144 | 58 | 33 | 34 | 52 | 50 |
表3：ATC和HNSCC模型的平均致瘤周期（从接种到肿瘤大小为1，000mm3的时间）。
补充图1：顺铂在ATC PDX模型中的治疗效果。 用顺铂（3mg / kg）处理后，携带ATC PDX的小鼠的（A）肿瘤体积，（B）肿瘤重量和（C）体重的变化。使用T检验进行统计分析，将顺铂与对照进行比较。*P < 0.05与对照组相比被认为具有统计学意义。 请点击此处下载此文件。
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Discussion
本研究成功建立了ATC和HNSCC的皮下PDX模型。在PDX模型构建过程中，有很多方面需要注意。当肿瘤组织与患者分离时，应尽快放入冰盒中送实验室接种。肿瘤到达实验室后，操作人员必须注意保持无菌区域并练习无菌程序。对于穿刺活检样品，由于肿瘤组织特别小，接种后将样品与基质凝胶混合会更有利于模型的建立。原发肿瘤组织也应尽可能保存、固定和冷冻，以备将来研究之用。在接种过程中，在使用前将肿瘤碎片放入穿刺器后，需要尽可能排出穿刺器中的空气。肿瘤接种后，应在小鼠中观察肿瘤生长1-4个月，未肿瘤生长超过6个月的小鼠可实施安乐死29。
通常选择免疫缺陷小鼠作为PDX模型构建的宿主29，30。从P0代到P2代，通常使用非肥胖糖尿病严重受损免疫缺陷（NOD-SCID）小鼠或NOD Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl / SzJ（NSG）小鼠。在P3代及以后，样本被认为是稳定通过的，所以裸鼠通常也可以作为宿主，肿瘤也可以正常生长。此外，患者总手术时间、肿瘤分离时间、无病生存期、总生存率、肿瘤恶性程度和组织学亚型均与PDX模型致瘤性31，32，33，34相关。移植部位对PDX建模的成功率也有影响，研究表明肾囊和正交各向异性移植具有较高的致瘤率33，35。此外，使用基质胶还可以提高致瘤率36，37。据报道，人瘤病毒（HPV）感染会影响HNSCC肿瘤的移植成功率;与HPV阳性肿瘤相比，HPV阴性肿瘤具有更高的服用率38，39。这项研究没有得出同样的结论，可能是由于样本数量少和HPV感染信息不完整。
与原位和肾囊移植模型不同，皮下模型更便于观察肿瘤的生长，也有利于手术40，41，42。基于ATC和HNSCC PDX模型的肿瘤生长数据，我们发现不同患者肿瘤的生长速率不一致，反映了肿瘤间的异质性。大多数PDX模型中P0代的肿瘤生长速度相对慢于后一种传代，这可能是由于小鼠微环境的适应。值得注意的是，一些患者来源的肿瘤的生长速率在P1代后的不同传代中增加，与Pearson等人报告的缩短传代间隔一致43。组织病理学检查表明，PDX肿瘤保留了原发肿瘤的形态特征。PDX模型与临床ATC患者的相关性也反映在体内药效学测试结果中，表明仑伐替尼表现出良好的抗肿瘤作用，与临床报道25，26，27一致。
但是，PDX模型也有一定的缺点。例如，肿瘤形成时间相对较长，不适合晚期或侵袭性肿瘤患者。此外，高通量药物筛选的时间和金钱成本太高44。事实上，将PDX模型与肿瘤类器官相结合，并建立与PDX模型相对应的患者来源类器官（PDO）模型，将弥补这一缺陷44，45，46。原位移植模型可用于研究肿瘤的发病机制和转移机制40，41，47。缺乏功能性免疫系统是PDX模型的另一个缺点，因此越来越多的实验正在使用人源化小鼠来构建用于肿瘤免疫学研究的PDX模型48，49，50。
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Disclosures
没有披露潜在的利益冲突。
Acknowledgments
本工作得到了四川省科技支撑计划（批准号：2019JDRC0019和2021ZYD0097）、四川大学华西医院优秀学科1.3.5项目（批准号ZYJC18026）、四川大学华西医院优秀学科1.3.5项目-临床研究孵化项目（批准号：2020HXFH023）、中央高校基本科研业务费专项（SCU2022D025）的支持。 成都市科技局国际合作项目（批准号：2022-GH02-00023-HZ）、四川大学创新星火项目（批准号：2019SCUH0015）、电子科技大学华西医院医工融合人才培养基金（批准号：HXDZ22012）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.4 mm x 2.0 mm trocar | Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd | 18-9065 | |
| Balb/c nude mice | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. | 401 | |
| Biosafety cabinet | Suzhou Antai | BSC-1300IIA2 | |
| Blade | Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd | 18-0823 | |
| Centrifuge tube | Corning | 430791/430829 | |
| Cryopreservation tube | Chengdu Dianrui Experimental Instrument Co., Ltd | / | |
| Custodiol HTK-Solution | Custodiol | 2103417 | |
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | SIGMA-ALORICH | D5879-500mL | |
| Electronic balance | METTLER | ME104 | |
| Electronic digital caliper | Chengdu Chengliang Tool Group Co., Ltd | 0-220 | |
| fetal bovine serum(FBS) | VivaCell | C04001-500 | |
| IBM SPSS Statistics 26 | IBM | ||
| Ketamine | Jiangsu Zhongmu Beikang Pharmaceutical Co., Ltd | 100761663 | |
| Lenvatinib | ApexBio | A2174 | |
| NOD-SCID immunodeficient mice | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. | 406 | |
| Pen-Strep Solution | Biological Industries | 03-03101BCS | |
| Petri dish | WHB | WHB-60/WHB-100 | |
| Saline | Sichuan Kelun | W220051705 | |
| Scissor | Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd | 18-0110 | |
| Tweezer | Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd | 18-1241 | |
| Vet ointment | Pfizer Inc. | P10015353 | |
| Xylazine | Dunhua Shengda Animal Medicine Co., Ltd | 070031777 |
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