Summary
Bu protokol, anaplastik tiroid karsinomu (ATC) ve baş boyun skuamöz hücreli karsinomunun (HNSCC) hasta kaynaklı ksenogreft (PDX) modelini oluşturmakta ve karakterize etmektedir, çünkü PDX modelleri translasyonel onkoloji alanında hızla standart hale gelmektedir.
Abstract
Hasta kaynaklı ksenogreft (PDX) modelleri, primer tümörün histolojik ve genetik özelliklerini sadık bir şekilde korumakta ve heterojenliğini korumaktadır. PDX modellerine dayanan farmakodinamik sonuçlar klinik uygulama ile yüksek oranda ilişkilidir. Anaplastik tiroid karsinomu (ATK), güçlü invazivlik, kötü prognoz ve sınırlı tedavi ile tiroid kanserinin en kötü huylu alt tipidir. ATK insidansı tiroid kanserinin sadece %2-5'ini oluştursa da mortalite oranı %15-%50 gibi yüksek bir orandadır. Baş boyun skuamöz hücreli karsinomu (HNSCC) en sık görülen baş ve boyun malignitelerinden biridir ve her yıl dünya çapında 600.000'den fazla yeni vaka vakaya neden olmaktadır. Burada, ATC ve HNSCC'nin PDX modellerini oluşturmak için ayrıntılı protokoller sunulmaktadır. Bu çalışmada model yapımının başarı oranını etkileyen anahtar faktörler analiz edilmiş ve PDX modeli ile primer tümör arasındaki histopatolojik özellikler karşılaştırılmıştır. Ayrıca, başarılı bir şekilde oluşturulmuş PDX modellerinde temsili klinik olarak kullanılan ilaçların in vivo terapötik etkinliği değerlendirilerek modelin klinik önemi doğrulanmıştır.
Introduction
PDX modeli, insan tümör dokusunun immün yetmezlikli farelere nakledildiği ve fareler tarafından sağlanan ortamda büyüdüğü bir hayvan modelidir1. Geleneksel tümör hücre hattı modelleri, heterojenlik eksikliği, tümör mikroçevresini koruyamama, tekrarlanan in vitro pasajlar sırasında genetik varyasyonlara karşı savunmasızlık ve zayıf klinik uygulama gibi çeşitli dezavantajlardan muzdariptir 2,3. Genetiği değiştirilmiş hayvan modellerinin temel dezavantajları, insan tümörlerinin genomik özelliklerinin potansiyel kaybı, yeni bilinmeyen mutasyonların ortaya çıkması ve fare tümörleri ile insan tümörleri arasındaki homoloji derecesini belirlemedeki zorluktur4. Ek olarak, genetiği değiştirilmiş hayvan modellerinin hazırlanması pahalı, zaman alıcı ve nispeten verimsizdir4.
PDX modeli, tümör heterojenitesini yansıtması açısından diğer tümör modellerine göre birçok avantaja sahiptir. Histopatoloji açısından bakıldığında, fare muadili zamanla insan stromasının yerini almasına rağmen, PDX modeli primer tümörün morfolojik yapısını iyi korur. Ek olarak, PDX modeli, primer tümörün metabolomik kimliğini en az dört nesil boyunca korur ve tümör hücreleri ile mikro çevreleri arasındaki karmaşık ilişkileri daha iyi yansıtır, bu da onu insan tümör dokusunun büyümesini, metastazını, anjiyogenezini ve immünsüpresyonunu simüle etmede benzersiz kılar 5,6,7. Hücresel ve moleküler düzeylerde, PDX modeli, insan tümörlerinin tümörler arası ve tümör içi heterojenliğinin yanı sıra, gen ekspresyon paternleri, mutasyon durumu, kopya sayısı ve DNA metilasyonu ve proteomik 8,9 dahil olmak üzere orijinal kanserin fenotipik ve moleküler özelliklerini doğru bir şekilde yansıtır. Farklı pasajlara sahip PDX modelleri, ilaç tedavisine karşı aynı duyarlılığa sahiptir, bu da PDX modellerinin gen ekspresyonunun oldukça kararlı olduğunu göstermektedir10,11. Çalışmalar, PDX modelinin bir ilaca cevabı ile hastaların bu ilaca klinik yanıtları arasında mükemmel bir korelasyon olduğunu göstermiştir12,13. Bu nedenle, PDX modeli, özellikle ilaç taraması ve klinik prognoz tahmini için güçlü bir preklinik ve translasyonel araştırma modeli olarak ortaya çıkmıştır.
Tiroid kanseri, endokrin sistemin sık görülen malign bir tümörüdür ve son yıllarda insidansında hızlı bir artış gösteren bir insan malignitesidir14. Anaplastik tiroid karsinomu (ATK) en kötü huylu tiroid kanseridir ve ortanca hasta sağkalımı sadece 4.8 aydır15. Çin'de her yıl tiroid kanseri hastalarının sadece azınlığına ATC tanısı konmasına rağmen, ölüm oranı %100'e yakındır16,17,18. ATK genellikle hızla büyür ve boynun bitişik dokularını ve servikal lenf nodlarını istila eder ve hastaların yaklaşık yarısında uzak metastaz vardır19,20. Baş ve boyun skuamöz hücreli karsinomu (HNSCC), dünyadaki en yaygın altıncı kanserdir ve kanser ölümlerinin önde gelen nedenlerinden biridir ve her yıl HNSCC'den muzdarip tahmini 600.000 kişi21.22.23'tür. HNSCC, burun, sinüsler, ağız, bademcikler, farenks ve larinks24 dahil olmak üzere çok sayıda tümör içerir. ATC ve HNSCC başlıca baş ve boyun malignitelerinden ikisidir. Yeni terapötik ajanların ve kişiselleştirilmiş tedavilerin geliştirilmesini kolaylaştırmak için, ATC ve HNSCC'nin PDX modelleri gibi sağlam ve gelişmiş klinik öncesi hayvan modelleri geliştirmek gerekmektedir.
Bu makalede ATC ve HNSCC'nin subkutan PDX modelini oluşturmak için ayrıntılı yöntemler tanıtılmış, model yapımında tümör alım hızını etkileyen anahtar faktörler analiz edilmekte ve PDX modeli ile primer tümör arasındaki histopatolojik özellikler karşılaştırılmaktadır. Bu arada, bu çalışmada, klinik ilgilerini doğrulamak için başarılı bir şekilde oluşturulmuş PDX modelleri kullanılarak in vivo farmakodinamik testler yapılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan deneyleri, Sichuan Üniversitesi, Batı Çin Hastanesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan Laboratuvar Hayvan Bakımı Değerlendirme ve Akreditasyon Derneği kılavuzlarına ve protokollerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Bu çalışma için 4-6 haftalık (her iki cinsiyetten) NOD-SCID immün yetmezlikli fareler ve 4-6 haftalık dişi Balb/c çıplak fareler kullanıldı. Hayvanlar ticari bir kaynaktan elde edilmiştir (bakınız Malzeme Tablosu). Batı Çin Hastanesi etik komitesi, insan deneklerle çalışmayı onayladı (protokol numarası 2020353). Her hasta yazılı bilgilendirilmiş onam verdi.
1. Deneysel hazırlık
- Tek kullanımlık bıçakları, sterilize edilmiş makas ve cımbızları ve tümör nakli için gerekli diğer aletleri düzenleyin, ultra temiz tezgaha yerleştirin ve önceden ultraviyole ışıkla ışınlayın.
- Test sırasında kullanılmak üzere steril salin ve Petri kapları hazırlayın.
2. Taze tümör dokusunun edinilmesi ve taşınması
- Ameliyathaneden taze tümör örnekleri (genellikle 5 mm x 5 mm'den büyük) alın ve bunları steril HTK çözeltisi ( Malzeme Tablosuna bakınız) veya salin içeren 15 mL veya 50 mL santrifüj tüpüne yerleştirin. Santrifüj tüplerini etiketleyin.
NOT: ATC veya HNSCC'li hastalardan cerrahi olarak çıkarılması veya delinmesi ile taze tümör örnekleri alındı. - Santrifüj tüplerini önceden hazırlanmış bir buz kutusuna koyun.
NOT: Bu süre zarfında, nakil operatörü nakil için gerekli eşyaları hazırlamalıdır (bakınız Malzeme Tablosu). - PDX yapımı için numune toplama ile laboratuvara taşıma arasındaki sürenin 2 saati geçmediğinden emin olun. Taşıma sırasında, doku aktivitesini korumak için dokuları içeren tüpleri buzlu su karışımı veya buz paketleri ile çevreleyin.
3. Tümör nakli
- Tümör dokuları laboratuvara ulaştığında, bunları kaydedin ve yeniden numaralandırın.
NOT: Bu çalışmada hasta bilgileri kesinlikle gizli tutulmuştur. Prosedürün geri kalan adımları bir biyogüvenlik seviye 2 (BSL-2) laboratuvarında gerçekleştirildi. Laboratuvara girerken, iş kıyafetlerinin veya koruyucu giysilerin üzerine bir smokin giymek, şapka ve maske takılması önerilir. Tümör dokusunun tedavisi bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirilir. - Tümör dokularını içeren santrifüj tüplerini %75 alkol ile dezenfekte edin ve ameliyat masasına yerleştirin. Tümör dokularını, sterilize edilmiş oftalmik forseps kullanarak salinle doldurulmuş 6 cm'lik Petri kaplarına aktarın. Daha sonra, bir bıçak kullanarak bunları yaklaşık 2 mm x 2 mm ve 3 mm x 3 mm'lik küçük parçalara ayırın.
- Tümör dokularının parçalarını uygun miktarda salin içeren 6 cm'lik bir Petri kabına aktarın, kabı sızdırmazlık filmi ile sarın, bir buz kutusuna yerleştirin ve gerekli aletlerle (bir çift makas, forseps ve aşılama iğneleri) birlikte spesifik patojen içermeyen (SPF) hayvan odasına taşıyın.
- Aşağıdaki adımları izleyerek hayvanı hazırlayın.
- 4-6 haftalık dişi veya erkek NOD-SCID immün yetmezlikli farelerin sağ lateral toraksındaki kılları çıkarın ve cildi% 75 alkol ile dezenfekte edin. Fareleri 80 mg / kg ketamin ve 10 mg / kg ksilazin intraperitoneal enjeksiyonu ile uyuşturun (bakınız Malzeme Tablosu) ve kuruluğu önlemek için gözlerini veteriner merhemi ile sürün. Pedal refleksinin kaybıyla anestezi derinliğini doğrulayın.
- Farelerin sağ lateral toraksının ortasındaki deriden makasla 2 mm'lik bir kesi yapın.
- Petri kabından bir tümör parçası alın ve forseps ile 2.4 mm x 2.0 mm trokar iğnesine (bkz.
- Fareyi tutun, cildi delinme bölgesinde sıkın, tümörü ilk 2 mm'lik cilt insizyonundan sokmak için tümör parçalarını içeren trokarı kullanın, omzun arkasına doğru hareket edin ve trokar çekirdeğini itin.
- Tümör parçasının dışarı itildiğinden ve trokar ponksiyonu ile oluşan geçiş sinüsünde bırakıldığından emin olun ve ardından trokarı dışarı çekin.
- Tümör çekildiğinde iğne ile birlikte hareket ederse, sıfırlamak ve insizyonu dikmek için trokarı kullanın.
NOT: Bu çalışmada, her fare dorsal ön ve arka bacaklarda aşılandı. Tümör boyutuna bağlı olarak her hastadan alınan tümör örneği başına bir ila üç fare aşılandı.
4. Tümör dokusunun korunması, fiksasyonu ve protein dondurulması
NOT: Kalan tümör dokuları sırasıyla tohum koruma, fiksasyon ve DNA / RNA / protein dondurma için kullanıldı.
- Tümör yüzeyinin aşırı ıslak olmadığından emin olmak için kriyoprezervasyon tüpüne yerleştirmeden önce salini steril bir gazlı bezle tümör yüzeyinden çıkarın.
- 2 mL'lik bir hücre kriyoprezervasyon tüpüne dört ila altı parça 2 mm x 2 mm tümör dokusu koyun, tüpe % 90 fetal sığır serumu (FBS) ve% 10 dimetil sülfoksitten (DMSO) oluşan 1 mL kriyoprezervasyon çözeltisi ekleyin, tüpü bir gradyan soğutma kutusuna koyun, gece boyunca -80 ° C'de dondurun ve son olarak, sıvı azota aktarın.
- 3 mm x 3 mm tümör doku bloklarını patolojik inceleme için doku fiksasyonu için% 10 tamponlu formalin içine yerleştirin.
- 3 mm x 3 mm doku bloğunu 2 mL'lik bir hücre kriyoprezervasyon tüpüne koyun, sıvı azotta hızlıca dondurun ve ardından DNA / RNA ve protein ekstraksiyonu için -80 ° C'lik bir buzdolabına aktarın.
- HNSCC hastalarında sigara içme öyküsü, tümör boyutu, farklılaşması, patolojik alt tipi, kanser derecesi, kanser evresi, uzak metastaz, orijin, tıbbi öykü, immünohistokimya, insan papilloma virüsü (HPV) enfeksiyonu ve tedavi ilaçları gibi hastaların klinik bilgilerini toplar.
5. PDX model tümörlerin geçişi, kriyoprezervasyonu ve resüsitasyonu
- Haftada bir kez vernier kumpasları kullanarak farelerdeki deri altı tümörlerin uzunluğunu ve genişliğini ölçün ve tümör hacmini şu formüle göre hesaplayın: tümör hacmi = 0.5 × uzunluk × genişlik2. Tümör büyüme eğrisini çizin.
- PDX tümörü 2.000mm3'e ulaştığında, onu yeni nesil farelere geçirin ve tümör yeniden nakli gerçekleştirin. 4. adımı takip eden enstrümanların hazırlanmasını gerçekleştirin.
- 80 mg/kg ketamin ile anestezi uygulandıktan sonra servikal çıkık ile fareleri ötenazi yapın.
- Cildi% 75 alkol ile dezenfekte edin. Ardından, makas kullanarak tümörü çevreleyen cildi kesin, ardından tümörü forseps ile çıkarın ve bir Petri kabına yerleştirin.
- 3. adımı takiben tümör nakli prosedürünü uygulayın.
- 4. adımı takiben PDX model tümörlerin korunması ve kriyoprezervasyonunu gerçekleştirin.
- Tümör dokusunun resüsitasyonu için, yavaş donma ve hızlı çözünme prensibini izleyin. Kriyovalleri sıvı azottan çıkardıktan sonra, hızlı çözünme için hızlı bir şekilde 37 ° C'de bir su banyosuna yerleştirin.
- Çözülme işlemini hızlandırmak için su banyosundaki kriyovyalleri yavaşça sallayın.
- Çözülür, tümör parçalarını yıkamak için hazırlanan normal saline aktarın ve ardından yeni nesil fareleri aşılayın. Özel operasyon için lütfen 3. adımdaki doku nakli prosedürüne bakın.
6. ATC PDX modelinde lenvatinib ve sisplatinin terapötik etkinliğinin belirlenmesi
NOT: ATC PDX modeli, tirozin kinaz inhibitörü lenvatinib ve kemoterapötik ilaç sisplatin25,26,27'nin terapötik etkisini test etmek için kullanılmıştır.
- Bir ATC PDX modelinin (THY-017) P5 jenerasyon tümör dokusunu seçin, 2-4 mm 3 doku parçalarına bölün ve on adet 4-6 haftalık dişi Balb/c çıplak farenin sağ arkasına deri altından (adım3 ) aşılayın.
- Tümör hacimleri 50-150mm3 arasında olan 15 fareyi seçin ve bunları üç gruba ayırın.
- Lenvatinib (10 mg / kg) intragastrik olarak 15 gün boyunca günde bir kez bir gruba uygulayın, sisplatin (3 mg / kg) intraperitoneal olarak her 3 günde bir gruba toplam altı doz uygulayın ve kontrol grubuna aynı miktarda normal salin uygulayın.
- Farelerin vücut ağırlığını ve tümör hacmini haftada iki kez ölçün.
- Testin sonunda, fareleri ötenazi yapın (adım 5.3) ve tümörleri tartın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Toplam 18 tiroid kanseri örneği nakledildi ve dört farklılaşmamış tiroid kanseri vakası ve bir anaplastik tiroid kanseri vakası dahil olmak üzere beş PDX tiroid kanseri modeli başarıyla oluşturuldu (% 27.8 tümör alım oranı). Model yapımının başarı oranı ile yaş, cinsiyet, tümör çapı, tümör derecesi ve farklılaşması arasındaki korelasyon analiz edildi. Her ne kadar derece 4 tümör örneklerinin model başarı oranı düşük dereceli örneklere göre daha yüksek olmasına ve farklılaşmamış tümör örneklerinin başarı oranı da yüksek oranda farklılaşmış örneklere göre daha yüksek olmasına rağmen, korelasyon analizi sonuçları bu faktörlerin PDX modelinin başarı oranı ile ilişkili olmadığını göstermiştir (Tablo 1). On yedi HNSCC örneği aşılandı ve HNSCCC'nin dört PDX modeli başarıyla inşa edildi. Model yapımında tümör alım oranı ile tümör örneklerinin klinik parametreleri arasındaki korelasyon analizi, farklılaşma derecesinin model başarı oranı ile ilişkili olduğunu, yaş, cinsiyet, sigara içme öyküsü, tümör çapı, kanser derecesi, metastaz ve HPV enfeksiyonunun tümör alım oranını etkilemediğini göstermiştir (Tablo 2).
Her PDX modeli için tümör büyüme eğrileri, farklı hastalardan PDX modellerinin büyüme oranlarını daha iyi anlamak için çizilmiştir (Şekil 1, Şekil 2 ve Tablo 3). THY-004'ün P0 ila P5 kuşaklarından ortalama tümörojenik siklusları (aşılamadan 1.000mm3'lük bir tümör boyutuna kadar geçen süre) sırasıyla 68 gün, 87 gün, 29 gün, 34 gün, 28 gün ve 26 gündü. THY-012'nin P0 ila P5 kuşakları arasındaki ortalama tümörojenik siklusları sırasıyla 119 gün, 61 gün, 66 gün, 55 gün, 87 gün ve 116 gün idi. THY-017'nin P0 ila P5 kuşakları arasındaki ortalama tümörojenik siklusları sırasıyla 27 gün, 17 gün, 30 gün, 13 gün, 22 gün ve 15 gün idi. THY-018'in P0 ila P3 kuşakları arasındaki ortalama tümörojenik döngüleri sırasıyla 134 gün, 70 gün, 48 gün ve 48 gün idi. THY-021'in P0 ila P3 kuşakları arasındaki ortalama tümörojenik döngüleri sırasıyla 53 gün, 66 gün, 35 gün ve 49 gün idi. OTO-017'nin P0 ila P4 kuşakları arasındaki ortalama tümörojenik döngüleri sırasıyla 118 gün, 86 gün, 67 gün, 129 gün ve 88 gün idi. OTO-022'nin P0 ila P5 kuşakları arasındaki ortalama tümörojenik döngüleri sırasıyla 155 gün, 55 gün, 32 gün, 37 gün, 27 gün ve 46 gün idi. OTO-030'un P0 ila P2 kuşaklarından ortalama tümörojenik döngüleri sırasıyla 133 gün, 93 gün ve 104 gün idi. OTO-031'in P0 ila P5 kuşakları arasındaki ortalama tümörojenik döngüleri sırasıyla 144 gün, 58 gün, 33 gün, 34 gün, 52 gün ve 50 gün idi. ATC örnekleri kararlı bir şekilde P3 nesline ve daha sonrasına geçirilirken, iki HNSCC örneği vakası P1 nesline geçtikten sonra tümör oluşturamadı. Bazı örneklerin büyüme oranları P0 neslinde nispeten yavaştı, ancak büyüme oranları P1 ve sonraki nesillere geçtikten sonra hızlandı. Hasta tümörlerinin histopatolojik özellikleri ile farklı nesil PDX modellerinin histopatolojik özellikleri karşılaştırıldı. Sonuçlar, PDX tümörlerinin ve hasta kaynaklı primer tümörlerin morfolojik olarak neredeyse benzer olduğunu göstermiştir (Şekil 3), hastalar ve farklı PDX nesilleri arasındaki örnekleme alanındaki heterojenlikten kaynaklanabilecek küçük farklılıklar vardır.
Lenvatinibin (ilerlemiş tiroid kanseri28 tedavisi için onaylanmış çok hedefli bir tirozin kinaz inhibitörü) anti-tümör etkinliği, ATC'nin PDX modelinde değerlendirildi. Şekil 4A'da gösterildiği gibi, lenvatinib tedavisi, ATC PDX modelinde tümör büyümesini normal salin kontrol grubuna (P < 0.05) kıyasla anlamlı olarak inhibe etmiştir. Deneyin sonunda, tümör dokusu eksize edildi ve tümör ağırlığını belirlemek için tartıldı. Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, lenvatinib tedavi grubunun tümör ağırlığı daha düşüktü, ancak istatistiksel bir fark elde edilemedi (Şekil 4B). Ek olarak, lenvatinib ile tedavi edilen farelerde genel durum ve vücut ağırlığında belirgin bir değişiklik gözlenmemiştir (Şekil 4C). Deneyler sırasında sisplatin uygulamasının aşırı sıklığı nedeniyle, fareler kilo kaybı ve hatta ölümle kendini gösteren önemli toksisite gösterdi. Sisplatinin anti-tümör etkinliği Ek Şekil 1'de gösterilmiştir.
Şekil 1: Farklı hastalardan ATC PDX modellerinin tümör büyüme eğrisi. Her renk belirtilen nesli temsil eder ve her eğri tek bir tümörü temsil eder. Bir ila üç fare pasaj 0 (P0) jenerasyonunda aşılandı ve sonraki pasajlarda beş fare aşılandı (P1-P5). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Farklı hastalardan HNSCC PDX modellerinin tümör büyüme eğrisi. Her renk belirtilen nesli temsil eder ve her eğri tek bir tümörü temsil eder. P0 neslinde bir ila üç fare aşılandı ve beş fare P1 ve sonraki nesillerde aşılandı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Histopatolojik çalışma. Hastanın primer tümörleri ile ATC (THY-012, THY-017) ve HNSCC'nin (OTO-017) karşılık gelen PDX'leri (pasaj 1 ve pasaj 3) (hematoksilin-eozin boyama, 100x) arasındaki histopatolojik karşılaştırma. THY-012 ve THY-017'nin patolojik alt tipleri anaplastik tiroid karsinomu, OTO-017'nin patolojik alt tipleri ise skuamöz hücreli karsinom idi. Ölçek çubukları = 100 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: ATC PDX modelinde lenvatinibin terapötik etkinliği. Lenvatinib (10 mg / kg) ile tedaviden sonra ATC PDX taşıyan farelerin (A) tümör hacmi, (B) tümör ağırlığı ve (C) vücut ağırlığındaki değişiklikler. İstatistiksel analizler levatinib ile kontrolü karşılaştırmak için T-testleri kullanılarak yapıldı. *P < 0.05 ve kontrol istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul edildi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
| Parametre | Sınıf | Tümör alım oranı (%) | P |
| Yaş (yıl) | <60 | 16.67 (1/6) | 0.615 |
| ≥60 | 33.33 (4/12) | ||
| Cinsiyet | Erkek | 16.67 (1/6) | 0.615 |
| Dişi | 33.33 (4/12) | ||
| Tümör çapı | <6cm | 37.50 (3/8) | 0.608 |
| ≥6cm | 20.00 (2/10) | ||
| Patolojik TNM evresi | Ben | 0.00 (0/1) | 1 |
| Ш | 0.00 (0/1) | ||
 |
31.25 (5/16) | ||
| Farklılaştırma | Yüksek | 0.00 (0/7) | 0.059 |
| Fakir | 25.00 (1/4) | ||
| Farklılaşmamış | 57.14 (4/7) |
Tablo 1: ATK tümör alım hızı ile hastaların klinik özellikleri arasındaki korelasyon.
| Parametre | Sınıf | Tümör alım oranı (%) | P |
| HPV | Negatif | 33.33 (2/6) | 1 |
| Bilinmeyen veya olumlu | 36.36 (4/11) | ||
| Yaş (yıl) | <60 | 33.33 (3/9) | 1 |
| ≥60 | 37.50 (3/8) | ||
| Cinsiyet | Erkek | 50.00 (5/10) | 0.304 |
| Dişi | 14.29 (1/7) | ||
| Sigara içme durumu | Hiç | 44.44 (4/9) | 0.62 |
| Hiç | 25.00 (2/8) | ||
| Tümör çapı | <3cm | 40.00 (4/10) | 1 |
| ≥3cm | 28.57 (2/7) | ||
| Patolojik TNM evresi | Ben | 75.00 (3/4) | 0.423 |
 |
25.00 (2/8) | ||
| Ш | 0.00 (0/1) | ||
|
33.33 (1/3) | ||
| Uzak metastaz | Y | 28.57 (2/7) | 0.633 |
| N | 44.44 (4/9) | ||
| Farklılaştırma | Yüksek | 12.50 (1/8) | 0.036* |
| Orta ila yüksek | 100.00 (2/2) | ||
| Ilımlı | 0.00 (0/2) | ||
| Orta ila zayıf | 66.67 (2/3) | ||
| * P < 0.05 |
Tablo 2: HNSCC tümör alım hızı ile hastaların klinik özellikleri arasındaki korelasyon. *P < 0,05.
| Örnek ad | P Kuşağından P0'a | P0 - P1 Arası Nesil | P1'den P2'ye Nesil | P2'den P3'e Nesil | P3 - P4 Arası Nesil | P4 - P5 Arası Nesil |
| THY-004 | 68 | 87 | 29 | 34 | 28 | 26 |
| THY-012 | 119 | 61 | 66 | 55 | 87 | 116 |
| THY-017 | 27 | 17 | 30 | 13 | 22 | 15 |
| THY-018 | 134 | 70 | 48 | 48 | - | - |
| THY-021 | 53 | 66 | 35 | 49 | - | - |
| OTO-017 | 118 | 86 | 67 | 129 | - | - |
| OTO-022 | 155 | 55 | 32 | 37 | 27 | 46 |
| OTO-030 | 133 | 93 | 104 | - | - | - |
| OTO-031 | 144 | 58 | 33 | 34 | 52 | 50 |
Tablo 3: ATC ve HNSCC modellerinin ortalama tümörojenik döngüsü (aşılamadan 1.000mm3'lük bir tümör boyutuna kadar geçen süre).
Ek Şekil 1: ATC PDX modelinde sisplatinin terapötik etkinliği. Sisplatin (3 mg/kg) ile tedaviden sonra ATC PDX taşıyan farelerin (A) tümör hacmi, (B) tümör ağırlığı ve (C) vücut ağırlığındaki değişiklikler. Sisplatini kontrol ile karşılaştırmak için T-testleri kullanılarak istatistiksel analizler yapıldı. *P < 0.05 ve kontrol istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul edildi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmada ATC ve HNSCC'nin subkutan PDX modelleri başarıyla oluşturulmuştur. PDX model yapımı sürecinde dikkat edilmesi gereken birçok husus vardır. Tümör dokusu hastadan ayrıldığında buz kutusuna konulmalı ve en kısa sürede aşılama için laboratuvara gönderilmelidir. Tümör laboratuvara ulaştıktan sonra, operatör steril bir alanın korunmasına dikkat etmeli ve aseptik prosedürleri uygulamalıdır. İğne biyopsi örnekleri için, tümör dokusu özellikle küçük olduğu için, numuneyi matris jeli ile karıştırdıktan sonra aşılama, modelin oluşturulması için daha elverişli olacaktır. Primer tümör dokusu da gelecekteki araştırmalar için mümkün olduğunca korunmalı, sabitlenmeli ve dondurulmalıdır. Aşılama sırasında, tümör parçaları kullanımdan önce trokarın içine konduktan sonra trokardaki havanın mümkün olduğunca dışarı atılması gerekir. Tümör aşılamasından sonra, tümör büyümesi farelerde 1-4 ay boyunca gözlenmelidir ve 6 aydan fazla tümör büyümesi olmayan fareler ötenazi yapılabilir29.
İmmün yetmezlikli fareler genellikle PDX model yapımı için konakçı olarak seçilir 29,30. P0 neslinden P2 nesline kadar, obez olmayan diyabetik-ciddi derecede tehlikeye girmiş bağışıklık yetmezliği (NOD-SCID) fareler veya NOD Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl / SzJ (NSG) fareleri genellikle kullanılır. P3 neslinde ve ötesinde, örneklerin istikrarlı bir şekilde geçirildiği kabul edilir, bu nedenle çıplak fareler genellikle konakçı olarak da hizmet edebilir ve tümörler de normal şekilde büyüyebilir. Ek olarak, hastaların toplam ameliyat süresi, tümör izolasyon süresi, hastalıksız sağkalım ve genel sağkalım oranı, tümörün malign derecesi ve histolojik alt tipi PDX modeli tümörijenite31,32,33,34 ile ilişkiliydi. Transplantasyon bölgesi PDX modellemesinin başarı oranı üzerinde de etkilidir ve çalışmalar renal kapsül ve ortotropik transplantasyonun yüksek tümörojenik orana sahip olduğunu göstermiştir33,35. Ek olarak, Matrigel kullanımı da tümörojenik oranı36,37 artırabilir. İnsan papilloma virüsü (HPV) enfeksiyonunun HNSCC tümörlerinde transplantasyonun başarı oranını etkilediği bildirilmiştir; HPV negatif tümörler HPV pozitif tümörlere göre daha üstün bir alım oranına sahiptir38,39. Bu çalışma, muhtemelen küçük örneklem sayıları ve HPV enfeksiyonu hakkındaki eksik bilgiler nedeniyle aynı sonuca ulaşmamıştır.
Ortotopik ve renal kapsül transplantasyon modellerinden farklı olarak, subkutan model tümörlerin büyümesini gözlemlemek için daha uygundur ve ayrıca40,41,42 operasyonuna elverişlidir. ATC ve HNSCC PDX modelinin tümör büyüme verilerine dayanarak, farklı hastalardan tümörlerin büyüme oranlarının, tümörler arası heterojenliği yansıtan tutarsız olduğunu bulduk. Çoğu PDX modelinden P0 neslinin tümör büyüme hızı, muhtemelen fare mikro ortamının adaptasyonundan kaynaklanan ikinci pasajlardan nispeten daha yavaştı. Özellikle, bazı hasta kaynaklı tümörlerden kaynaklanan büyüme oranı, P1 jenerasyonundan sonra, Pearson ve ark.43 tarafından bildirilen kısaltılmış geçiş aralığı ile tutarlı olarak farklı pasajlarda artmıştır. Histopatolojik incelemede PDX tümörlerinin primer tümörlerin morfolojik özelliklerini koruduğu saptandı. PDX modeli ile klinik ATC hastaları arasındaki korelasyon, Lenvartinib'in klinik raporlarla tutarlı olarak iyi bir anti-tümör etkisi sergilediğini gösteren in vivo farmakodinamik testlerin sonuçlarına da yansımıştır25,26,27.
Bununla birlikte, PDX modelinin de bazı dezavantajları vardır. Örneğin, tümör oluşum süresi nispeten uzundur, bu da ileri veya agresif tümörleri olan hastalar için uygun değildir. Ek olarak, yüksek verimli ilaç taramasının zaman ve parasal maliyetleri çok yüksektir44. Gerçekten de, PDX modelini tümör organoidleri ile birleştirmek ve PDX modeline karşılık gelen hasta kaynaklı bir organoid (PDO) modeli oluşturmak, bu eksikliğitelafi edecektir 44,45,46. Ortotopik transplantasyon modelleri tümörlerin patogenezini ve metastatik mekanizmalarını incelemek için kullanılabilir40,41,47. İşlevsel bir bağışıklık sisteminin olmaması, PDX modelinin bir başka dezavantajıdır, bu nedenle artan sayıda deney, tümör immünolojisi araştırması için PDX modelini oluşturmak için insanlaştırılmış fareleri kullanmaktadır48,49,50.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Hiçbir potansiyel çıkar çatışması açıklanmaz.
Acknowledgments
Bu çalışma, Sichuan Eyaleti Bilim ve Teknoloji Destek Programı (Hibe No. 2019JDRC0019 ve 2021ZYD0097), mükemmellik disiplinleri için 1.3.5 projesi, Batı Çin Hastanesi, Sichuan Üniversitesi (Hibe No. ZYJC18026), mükemmellik disiplinleri için 1.3.5 projesi-Klinik Araştırma Kuluçka Projesi, Batı Çin Hastanesi, Sichuan Üniversitesi (Hibe No. 2020HXFH023), Merkez Üniversiteler için Temel Araştırma Fonları (SCU2022D025), Chengdu Bilim ve Teknoloji Bürosu Uluslararası İşbirliği Projesi (Hibe No. 2022-GH02-00023-HZ), Sichuan Üniversitesi İnovasyon Kıvılcım Projesi (Hibe No. 2019SCUH0015) ve Batı Çin Hastanesi Tıbbi-Mühendislik Entegrasyonu için Yetenek Eğitim Fonu - Elektronik Bilim ve Teknoloji Üniversitesi (Hibe No. HXDZ22012).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.4 mm x 2.0 mm trocar | Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd | 18-9065 | |
| Balb/c nude mice | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. | 401 | |
| Biosafety cabinet | Suzhou Antai | BSC-1300IIA2 | |
| Blade | Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd | 18-0823 | |
| Centrifuge tube | Corning | 430791/430829 | |
| Cryopreservation tube | Chengdu Dianrui Experimental Instrument Co., Ltd | / | |
| Custodiol HTK-Solution | Custodiol | 2103417 | |
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | SIGMA-ALORICH | D5879-500mL | |
| Electronic balance | METTLER | ME104 | |
| Electronic digital caliper | Chengdu Chengliang Tool Group Co., Ltd | 0-220 | |
| fetal bovine serum(FBS) | VivaCell | C04001-500 | |
| IBM SPSS Statistics 26 | IBM | ||
| Ketamine | Jiangsu Zhongmu Beikang Pharmaceutical Co., Ltd | 100761663 | |
| Lenvatinib | ApexBio | A2174 | |
| NOD-SCID immunodeficient mice | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. | 406 | |
| Pen-Strep Solution | Biological Industries | 03-03101BCS | |
| Petri dish | WHB | WHB-60/WHB-100 | |
| Saline | Sichuan Kelun | W220051705 | |
| Scissor | Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd | 18-0110 | |
| Tweezer | Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd | 18-1241 | |
| Vet ointment | Pfizer Inc. | P10015353 | |
| Xylazine | Dunhua Shengda Animal Medicine Co., Ltd | 070031777 |
References
- Toolan, H. W. Successful subcutaneous growth and transplantation of human tumors in X-irradiated laboratory animals. Proceedings of The Society for Experimental Biology and Medicine. 77 (3), 572-578 (1951).
- Gillet, J. P., et al. Redefining the relevance of established cancer cell lines to the study of mechanisms of clinical anti-cancer drug resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (46), 18708-18713 (2011).
- Hausser, H. J., Brenner, R. E. Phenotypic instability of Saos-2 cells in long-term culture. Biochemical & Biophysical Research Communications. 333 (1), 216-222 (2005).
- Pérez-Mancera, P., Guerra, C., Barbacid, M., Tuvesonet, D. A. What we have learned about pancreatic cancer from mouse models. Gastroenterology. 142 (5), 1079-1092 (2012).
- Bruna, A., et al. A biobank of breast cancer explants with preserved intra-tumor heterogeneity to screen anticancer compounds. Cell. 167 (1), 260-274 (2016).
- Choi, S., et al. Lessons from patient-derived xenografts for better in vitro modeling of human cancer. Advanced Drug Delivery Reviews. 79-80, 222-237 (2014).
- Blomme, A., et al. Murine stroma adopts a human-like metabolic phenotype in the PDX model of colorectal cancer and liver metastases. Oncogene. 37 (9), 1237-1250 (2018).
- Wang, D., et al. Molecular heterogeneity of non-small cell lung carcinoma patient-derived xenografts closely reflect their primary tumors. International Journal of Cancer. 140 (3), 662-673 (2016).
- Jung, J., et al. Generation and molecular characterization of pancreatic cancer patient-derived xenografts reveals their heterologous nature. Oncotarget. 7 (38), 62533-62546 (2016).
- Keysar, S., et al. A patient tumor transplant model of squamous cell cancer identifies PI3K inhibitors as candidate therapeutics in defined molecular bins. Molecular Oncology. 7 (4), 776-790 (2013).
- Rubio-Viqueira, B., et al. An in vivo platform for translational drug development in pancreatic cancer. Clinical Cancer Research. 12 (15), 4652-4661 (2006).
- Fiebig, H. H., et al. Development of three human small cell lung cancer models in nude mice. Recent Results in Cancer Research. 97, 77-86 (1985).
- Morelli, M. P., et al. Prioritizing phase I treatment options through preclinical testing on personalized tumorgraft. Journal of Clinical Oncology. 30 (4), 45-48 (2012).
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA. 68 (6), 394-424 (2018).
- Onoda, N., et al. Evaluation of the 8th edition TNM classification for anaplastic thyroid carcinoma. Cancers. 12 (3), 552 (2020).
- Nel, C., et al. Anaplastic carcinoma of the thyroid: A clinicopathologic study of 82 cases. Mayo Clinic Proceedings. 60 (1), 51-58 (1985).
- Mazzaferri, E. L. Increasing incidence of thyroid cancer in the United States, 1973-2002. Yearbook of Medicine. 2007, 496-499 (2007).
- Kebebew, E., Greenspan, F. S., Clark, O. H., Woeber, K. A., Mcmillan, A. Anaplastic thyroid carcinoma. Treatment outcome and prognostic factors. Cancer. 103 (7), 1330-1335 (2005).
- Lin, B., et al. The incidence and survival analysis for anaplastic thyroid cancer: A SEER database analysis. American Journal of Translational Research. 11 (9), 5888-5896 (2019).
- Maniakas, A., Dadu, R., Busaidy, N. L., Wang, J. R., Zafereo, M. Evaluation of overall survival in patients with anaplastic thyroid carcinoma, 2000-2019. JAMA Oncology. 6 (9), 1397-1404 (2020).
- Gilardi, M., et al. Tipifarnib as a precision therapy for HRAS-mutant head and neck squamous cell carcinomas. Molecular Cancer Therapeutics. 19 (9), 1784-1796 (2020).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Chow, L. Q. M.
- Swiecicki, P. L., Brennan, J. R., Mierzwa, M., Spector, M. E., Brenner, J. C. Head and neck squamous cell carcinoma detection and surveillance: Advances of liquid biomarkers. Laryngoscope. 129 (8), 1836-1843 (2019).
- Wang, R., et al. Distribution and activity of lenvatinib in brain tumor models of human anaplastic thyroid cancer cells in severe combined immune deficient mice. Molecular Cancer Therapeutics. 18 (5), 947-956 (2019).
- Takahashi, S., et al. A phase II study of the safety and efficacy of lenvatinib in patients with advanced thyroid cancer. Future Oncology. 15 (7), 717-726 (2019).
- Ferrari, S. M., et al. Lenvatinib exhibits antineoplastic activity in anaplastic thyroid cancer in vitro and in vivo. Oncology Reports. 39 (5), 2225-2234 (2018).
- Cabanillas, M. E., Habra, M. A. Lenvatinib: Role in thyroid cancer and other solid tumors. Cancer Treatment Reviews. 42, 47-55 (2016).
- Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. The generation and application of patient-derived xenograft model for cancer research. Cancer Research and Treatment. 50 (1), 1-10 (2018).
- Peng, S., et al. Tumor grafts derived from patients with head and neck squamous carcinoma authentically maintain the molecular and histologic characteristics of human cancers. Journal of Translational Medicine. 11, 198 (2013).
- Derose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17 (11), 1514-1520 (2011).
- Chen, X., Shen, C., Wei, Z., Zhang, R., Xiao, K. Patient-derived non-small cell lung cancer xenograft mirrors complex tumor heterogeneity. Cancer Biology and Medicine. 18 (1), 184-198 (2021).
- Choi, Y. Y., et al. Establishment and characterisation of patient-derived xenografts as paraclinical models for gastric cancer. Scientific Reports. 6, 22172 (2016).
- Maider, I. V., Andrés, C., Alberto, B. Preclinical models for precision oncology. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer. 1872 (2), 239-246 (2018).
- Okada, S., Vaeteewoottacharn, K., Kariya, R. Establishment of a patient-derived tumor xenograft model and application for precision cancer medicine. Chemical & Pharmaceutical Bulletin. 66 (3), 225-230 (2018).
- Michael, G., et al. Tumor take rate optimization for colorectal carcinoma patient-derived xenograft models. BioMed Research International. 2016, 1715053 (2016).
- Bernardo, C., Costa, C., Sousa, N., Amado, F., Santos, L. Patient-derived bladder cancer xenografts: a systematic review. Translational Research. 166 (4), 324-331 (2015).
- Facompre, N. D., et al. Barriers to generating PDX models of HPV-related head and neck. Laryngoscope. 127 (12), 2777-2783 (2017).
- Kang, H. N., Kim, J. H., Park, A. Y., Choi, J. W., Kim, H. R. Establishment and characterization of patient-derived xenografts as paraclinical models for head and neck cancer. BMC Cancer. 20 (1), 316 (2020).
- Ahn, S. H., et al. An orthotopic model of papillary thyroid carcinoma in athymic nude mice. Archives of Otolaryngology-Head & Neck Surgery. 134 (2), 190-197 (2008).
- Nucera, C., et al. A novel orthotopic mouse model of human anaplastic thyroid carcinoma. Thyroid. 19 (10), 1077-1084 (2009).
- De Rose, F., et al. Galectin-3 targeting in thyroid orthotopic tumors opens new ways to characterize thyroid cancer. Journal of Nuclear Medicine. 60 (6), 770-776 (2019).
- Pearson, A. T., et al. Patient-derived xenograft (PDX) tumors increase growth rate with time. Oncotarget. 7 (7), 7993-8005 (2016).
- Huo, K. G., D'Arcangelo, E., Tsao, M. S. Patient-derived cell line, xenograft and organoid models in lung cancer therapy. Translational Lung Cancer Research. 9 (5), 2214-2232 (2020).
- Kumari, R., Xu, X., Li, H. Q. Translational and clinical relevance of PDX-derived organoid models in oncology drug discovery and development. Current Protocols. 2 (7), e431 (2022).
- Takahashi, N., et al. Construction of in vitro patient-derived tumor models to evaluate anticancer agents and cancer immunotherapy. Oncology Letters. 21 (5), 406 (2021).
- Barasch, A., et al. Photobiomodulation effects on head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) in an orthotopic animal model. Supportive Care in Cancer. 28 (6), 2721-2727 (2020).
- Wang, M., et al. Humanized mice in studying efficacy and mechanisms of PD-1-targeted cancer immunotherapy. FASEB Journal. 32 (3), 1537-1549 (2018).
- Wu, C., Wang, X., Shang, H., Wei, H. Construction of a humanized PBMC-PDX model to study the efficacy of a bacterial marker in lung cancer immunotherapy. Disease Markers. 2022, 1479246 (2022).
- Yao, L. C., et al. Creation of PDX-bearing humanized mice to study immuno-oncology. Methods in Molecular Biology. 1953, 241-252 (2019).
