Summary
Das vorliegende Protokoll etabliert und charakterisiert ein patientenabgeleitetes Xenotransplantat-Modell (PDX) für anaplastisches Schilddrüsenkarzinom (ATC) und Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinom (HNSCC), da PDX-Modelle schnell zum Standard im Bereich der translationalen Onkologie werden.
Abstract
Patient-derived xenograft (PDX)-Modelle bewahren die histologischen und genetischen Merkmale des Primärtumors und bewahren seine Heterogenität. Pharmakodynamische Ergebnisse, die auf PDX-Modellen basieren, korrelieren stark mit der klinischen Praxis. Das anaplastische Schilddrüsenkarzinom (ATC) ist die bösartigste Subform des Schilddrüsenkarzinoms mit starker Invasivität, schlechter Prognose und begrenzter Behandlung. Obwohl die Inzidenzrate von ATC nur 2%-5% des Schilddrüsenkrebses ausmacht, liegt die Sterblichkeitsrate bei 15%-50%. Das Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinom (HNSCC) ist mit über 600.000 Neuerkrankungen weltweit eine der häufigsten bösartigen Erkrankungen des Kopfes und Halses. Im Folgenden werden detaillierte Protokolle vorgestellt, um PDX-Modelle von ATC und HNSCC zu erstellen. In dieser Arbeit wurden die Schlüsselfaktoren, die die Erfolgsrate der Modellkonstruktion beeinflussen, analysiert und die histopathologischen Merkmale zwischen dem PDX-Modell und dem Primärtumor verglichen. Darüber hinaus wurde die klinische Relevanz des Modells validiert, indem die in vivo therapeutische Wirksamkeit repräsentativer klinisch eingesetzter Medikamente in den erfolgreich konstruierten PDX-Modellen evaluiert wurde.
Introduction
Das PDX-Modell ist ein Tiermodell, bei dem menschliches Tumorgewebe in immundefiziente Mäuse transplantiert wird und in der von den Mäusen bereitgestellten Umgebung wächst1. Herkömmliche Tumorzelllinienmodelle leiden unter mehreren Nachteilen, wie z. B. der mangelnden Heterogenität, der Unfähigkeit, die Tumormikroumgebung zu erhalten, der Anfälligkeit für genetische Variationen während wiederholter In-vitro-Passagen und der schlechten klinischen Anwendung 2,3. Die Hauptnachteile gentechnisch veränderter Tiermodelle sind der potenzielle Verlust der genomischen Merkmale menschlicher Tumore, die Einführung neuer unbekannter Mutationen und die Schwierigkeit, den Grad der Homologie zwischen Maustumoren und menschlichen Tumoren zu bestimmen4. Hinzu kommt, dass die Herstellung gentechnisch veränderter Tiermodelle teuer, zeitaufwendig und relativ ineffizient ist4.
Das PDX-Modell hat gegenüber anderen Tumormodellen viele Vorteile in Bezug auf die Widerspiegelung der Tumorheterogenität. Aus histopathologischer Sicht ersetzt das Maus-Pendant zwar im Laufe der Zeit das menschliche Stroma, aber das PDX-Modell bewahrt die morphologische Struktur des Primärtumors gut. Darüber hinaus bewahrt das PDX-Modell die metabolomische Identität des Primärtumors für mindestens vier Generationen und spiegelt die komplexen Wechselbeziehungen zwischen Tumorzellen und ihrer Mikroumgebung besser wider, was es einzigartig in der Simulation von Wachstum, Metastasierung, Angiogenese und Immunsuppression von menschlichem Tumorgewebe macht 5,6,7. Auf zellulärer und molekularer Ebene spiegelt das PDX-Modell die Heterogenität zwischen und innerhalb des Tumors menschlicher Tumore sowie die phänotypischen und molekularen Merkmale des ursprünglichen Krebses genau wider, einschließlich Genexpressionsmuster, Mutationsstatus, Kopienzahl sowie DNA-Methylierung und Proteomik 8,9. PDX-Modelle mit unterschiedlichen Passagen weisen die gleiche Sensitivität gegenüber medikamentöser Therapie auf, was darauf hindeutet, dass die Genexpression von PDX-Modellen sehr stabil ist10,11. Studien haben eine ausgezeichnete Korrelation zwischen dem Ansprechen des PDX-Modells auf ein Medikament und dem klinischen Ansprechen der Patienten auf dieses Medikament gezeigt12,13. Daher hat sich das PDX-Modell zu einem leistungsstarken präklinischen und translationalen Forschungsmodell entwickelt, insbesondere für das Wirkstoffscreening und die Vorhersage klinischer Prognosen.
Schilddrüsenkrebs ist ein häufiger bösartiger Tumor des endokrinen Systems und eine bösartige Erkrankung des Menschen, deren Inzidenz in den letzten Jahren rapide zugenommen hat14. Das anaplastische Schilddrüsenkarzinom (ATC) ist mit einer medianen Überlebenszeit von nur 4,8 Monaten der bösartigste Schilddrüsenkrebs15. Obwohl in China jedes Jahr nur bei einer Minderheit der Schilddrüsenkrebspatienten ATC diagnostiziert wird, liegt die Sterblichkeitsrate bei fast 100 %16,17,18. ATC wächst in der Regel schnell und dringt in das angrenzende Gewebe des Halses sowie in die zervikalen Lymphknoten ein, und etwa die Hälfte der Patienten hat Fernmetastasen19,20. Das Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinom (HNSCC) ist die sechsthäufigste Krebserkrankung der Welt und eine der häufigsten Krebstodesursachen, wobei jedes Jahr schätzungsweise 600.000 Menschen an HNSCC erkranken21,22,23. Das HNSCC umfasst eine große Anzahl von Tumoren, darunter solche in der Nase, den Nasennebenhöhlen, dem Mund, den Mandeln, dem Rachen und dem Kehlkopf24. ATC und HNSCC sind zwei der wichtigsten Malignome von Kopf und Hals. Um die Entwicklung neuartiger Therapeutika und personalisierter Behandlungen zu erleichtern, ist es notwendig, robuste und fortschrittliche präklinische Tiermodelle wie PDX-Modelle von ATC und HNSCC zu entwickeln.
In diesem Artikel werden detaillierte Methoden zur Etablierung des subkutanen PDX-Modells von ATC und HNSCC vorgestellt, die Schlüsselfaktoren analysiert, die die Tumoraufnahmerate in der Modellkonstruktion beeinflussen, und die histopathologischen Charakteristika zwischen dem PDX-Modell und dem Primärtumor verglichen. Währenddessen wurden in vivo pharmakodynamische Tests unter Verwendung der erfolgreich konstruierten PDX-Modelle durchgeführt, um deren klinische Relevanz zu validieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Protokollen der Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee des West China Hospital der Universität Sichuan genehmigt wurden. Für die vorliegende Studie wurden immundefiziente NOD-SCID-Mäuse im Alter von 4-6 Wochen (beiderlei Geschlechts) und weibliche Balb/c-Nacktmäuse im Alter von 4-6 Wochen verwendet. Die Tiere wurden aus einer kommerziellen Quelle bezogen (siehe Materialtabelle). Die Ethikkommission des West China Hospital genehmigte die Studie mit menschlichen Probanden (Protokollnummer 2020353). Jeder Patient gab eine schriftliche Einverständniserklärung ab.
1. Experimentelle Vorbereitung
- Ordnen Sie Einwegklingen, sterilisierte Scheren und Pinzetten und andere für die Tumortransplantation erforderliche Instrumente an, legen Sie sie auf die ultrareine Werkbank und bestrahlen Sie sie im Voraus mit ultraviolettem Licht.
- Bereiten Sie sterile Kochsalzlösung und Petrischalen für die Verwendung während des Tests vor.
2. Gewinnung und Transport von frischem Tumorgewebe
- Frische Tumorproben (in der Regel größer als 5 mm x 5 mm) aus dem Operationssaal entnehmen und in ein 15-ml- oder 50-ml-Zentrifugenröhrchen mit steriler HTK-Lösung (siehe Materialtabelle) oder Kochsalzlösung geben. Beschriften Sie die Zentrifugenröhrchen.
HINWEIS: Frische Tumorproben wurden durch chirurgische Entfernung oder Punktion von Patienten mit ATC oder HNSCC gewonnen. - Stellen Sie die Zentrifugenröhrchen in eine im Voraus vorbereitete Eisbox.
HINWEIS: Während dieser Zeit muss der Transplantationsarzt die für die Transplantation erforderlichen Gegenstände vorbereiten (siehe Materialtabelle). - Stellen Sie sicher, dass die Zeit zwischen der Probenentnahme und dem Transport zum Labor für die PDX-Konstruktion 2 Stunden nicht überschreitet. Umgeben Sie die Röhrchen, die das Gewebe enthalten, während des Transports mit einem Eis-Wasser-Gemisch oder Eisbeuteln, um die Gewebeaktivität zu erhalten.
3. Tumortransplantation
- Sobald das Tumorgewebe im Labor angekommen ist, wird es aufgezeichnet und neu nummeriert.
HINWEIS: Für die vorliegende Studie wurden die Patienteninformationen streng vertraulich behandelt. Die restlichen Schritte des Verfahrens wurden in einem Labor der Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2) durchgeführt. Beim Betreten des Labors wird empfohlen, einen Kittel über der Arbeitskleidung oder Schutzkleidung, einen Hut und eine Maske zu tragen. Die Behandlung des Tumorgewebes erfolgt in einer Biosicherheitswerkbank. - Desinfizieren Sie die Zentrifugenröhrchen mit dem Tumorgewebe mit 75%igem Alkohol und legen Sie sie auf den OP-Tisch. Das Tumorgewebe wird mit einer sterilisierten Augenzange in 6 cm dicke, mit Kochsalzlösung gefüllte Petrischalen überführt. Schneiden Sie sie anschließend mit einer Klinge in kleine Stücke von ca. 2 mm x 2 mm und 3 mm x 3 mm.
- Übertragen Sie die Stücke des Tumorgewebes in eine 6-cm-Petrischale mit der entsprechenden Menge Kochsalzlösung, wickeln Sie die Schale mit der Siegelfolie ein, stellen Sie sie in eine Eisbox und tragen Sie sie zusammen mit den erforderlichen Instrumenten (Schere, Pinzette und Impfnadeln) in den speziellen erregerfreien Tierraum (SPF).
- Bereiten Sie das Tier vor, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
- Entfernen Sie die Haare am rechten seitlichen Thorax von 4-6 Wochen alten weiblichen oder männlichen immundefizienten NOD-SCID-Mäusen und desinfizieren Sie die Haut mit 75%igem Alkohol. Betäuben Sie die Mäuse durch eine intraperitoneale Injektion von 80 mg/kg Ketamin und 10 mg/kg Xylazin (siehe Materialtabelle) und schmieren Sie ihre Augen mit Tierarztsalbe ein, um Trockenheit zu verhindern. Bestätigen Sie die Narkosetiefe durch den Verlust des Pedalreflexes.
- Machen Sie einen 2-mm-Schnitt mit einer Schere durch die Haut in der Mitte des rechten seitlichen Brustkorbs von Mäusen.
- Nehmen Sie ein Tumorstück aus der Petrischale und legen Sie es mit einer Pinzette in die 2,4 mm x 2,0 mm große Trokarnadel (siehe Materialtabelle).
- Halten Sie die Maus fest, straffen Sie die Haut an der Einstichstelle, führen Sie den Tumor mit dem Trokar mit den Tumorstücken durch den ersten 2 mm Hautschnitt ein, bewegen Sie sich auf die Rückseite der Schulter und schieben Sie den Trokarkern.
- Stellen Sie sicher, dass das Tumorstück herausgedrückt wird und in der durch die Trokarpunktion gebildeten Übergangshöhle verbleibt, und ziehen Sie dann den Trokar heraus.
- Wenn sich der Tumor beim Herausziehen mit der Nadel bewegt, verwenden Sie den Trokar, um ihn zurückzusetzen und den Schnitt zu vernähen.
HINWEIS: In dieser Studie wurde jede Maus an den dorsalen Vorder- und Hinterbeinen geimpft. Pro Tumorprobe wurden von jedem Patienten ein bis drei Mäuse geimpft, basierend auf der Tumorgröße.
4. Konservierung, Fixierung und Einfrieren von Tumorgewebe
HINWEIS: Das verbleibende Tumorgewebe wurde für die Konservierung von Samen, die Fixierung bzw. das Einfrieren von DNA/RNA/Proteinen verwendet.
- Entfernen Sie die Kochsalzlösung mit einer sterilen Gaze von der Tumoroberfläche, bevor Sie sie in das Kryokonservierungsröhrchen legen, um sicherzustellen, dass die Tumoroberfläche nicht übermäßig nass wird.
- Geben Sie vier bis sechs Stücke von 2 mm x 2 mm Tumorgewebe in ein 2-ml-Zellkryokonservierungsröhrchen, geben Sie 1 ml Kryokonservierungslösung, die zu 90 % aus fötalem Knöberserum (FBS) und 10 % Dimethylsulfoxid (DMSO) besteht, in das Röhrchen, legen Sie das Röhrchen in eine Gradientenkühlbox, frieren Sie es über Nacht bei −80 °C ein und schließen Sie es Übertragen Sie es in flüssigen Stickstoff.
- Legen Sie die 3 mm x 3 mm großen Tumorgewebeblöcke in 10%iges gepuffertes Formalin zur Gewebefixierung für die pathologische Untersuchung.
- Legen Sie den 3 mm x 3 mm großen Gewebeblock in ein 2-ml-Zellkryokonservierungsröhrchen, frieren Sie ihn schnell in flüssigem Stickstoff ein und stellen Sie ihn dann zur DNA/RNA- und Proteinextraktion in einen Kühlschrank mit einer Temperatur von −80 °C.
- Sammeln Sie die klinischen Informationen der Patienten, wie z. B. die Raucheranamnese, die Tumorgröße, die Differenzierung, den pathologischen Subtyp, den Krebsgrad, das Krebsstadium, die Fernmetastasen, die Herkunft, die Krankengeschichte, die Immunhistochemie, die Infektion mit dem humanen Papillomavirus (HPV) bei HNSCC-Patienten und die Behandlungsmedikation.
5. Passierung, Kryokonservierung und Reanimation von PDX-Modelltumoren
- Messen Sie die Länge und Breite der subkutanen Tumore bei Mäusen einmal pro Woche mit Nonius-Messschiebern und berechnen Sie das Tumorvolumen nach der Formel: Tumorvolumen = 0,5 × Länge × Breite2. Zeichne die Tumorwachstumskurve.
- Wenn der PDX-Tumor 2.000 mm3 erreicht, wird er an die nächste Generation von Mäusen weitergegeben und eine erneute Tumortransplantation durchgeführt. Führen Sie die Vorbereitung der Instrumente gemäß Schritt 4 durch.
- Euthanasieren Sie die Mäuse durch Zervixluxation nach Betäubung mit 80 mg/kg Ketamin.
- Desinfizieren Sie die Haut mit 75%igem Alkohol. Schneiden Sie dann die Haut, die den Tumor umgibt, mit einer Schere ab, entfernen Sie den Tumor mit einer Pinzette und legen Sie ihn in eine Petrischale.
- Führen Sie die Tumortransplantation nach Schritt 3 durch.
- Führen Sie die Konservierung und Kryokonservierung der PDX-Modelltumoren gemäß Schritt 4 durch.
- Für die Wiederbelebung des Tumorgewebes gilt das Prinzip des langsamen Einfrierens und der schnellen Auflösung. Nachdem Sie die Kryogefäße aus flüssigem Stickstoff entnommen haben, legen Sie sie schnell in ein Wasserbad bei 37 °C, um sie schnell aufzulösen.
- Schütteln Sie die Kryogefäße vorsichtig im Wasserbad, um den Auftauprozess zu beschleunigen.
- Tauen Sie die Tumorstücke auf, geben Sie sie zum Waschen in die vorbereitete normale Kochsalzlösung und impfen Sie dann die nächste Generation von Mäusen. Für die spezifische Operation lesen Sie bitte das Gewebetransplantationsverfahren in Schritt 3.
6. Bestimmung der therapeutischen Wirksamkeit von Lenvatinib und Cisplatin im ATC-PDX-Modell
HINWEIS: Das ATC-PDX-Modell wurde verwendet, um die therapeutische Wirkung des Tyrosinkinase-Inhibitors Lenvatinib und des Chemotherapeutikums Cisplatin25,26,27 zu testen.
- Wählen Sie das Tumorgewebe der P5-Generation eines ATC-PDX-Modells (THY-017) aus, schneiden Sie es in 2-4mm 3 Gewebestücke und inokulieren Sie subkutan (Schritt 3) auf den rechten Rücken von zehn 4-6 Wochen weiblichen Balb/c-Nacktmäusen.
- Wählen Sie 15 Mäuse mit einem Tumorvolumen zwischen 50 und 150mm3 aus und teilen Sie sie in drei Gruppen ein.
- Verabreichen Sie einer Gruppe 15 Tage lang einmal täglich intragastrisch Lenvatinib (10 mg/kg), einer Gruppe alle 3 Tage alle 3 Tage intraperitoneal Cisplatin (3 mg/kg) für insgesamt sechs Dosen und der Kontrollgruppe das gleiche Volumen normaler Kochsalzlösung.
- Messen Sie zweimal pro Woche das Körpergewicht und das Tumorvolumen der Mäuse.
- Am Ende des Tests werden die Mäuse eingeschläfert (Schritt 5.3) und die Tumore gewogen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Insgesamt wurden 18 Schilddrüsenkrebsproben transplantiert und fünf PDX-Modelle für Schilddrüsenkrebs erfolgreich konstruiert (27,8 % Tumorentnahmerate), darunter vier Fälle von undifferenziertem Schilddrüsenkrebs und ein Fall von anaplastischem Schilddrüsenkrebs. Der Zusammenhang zwischen der Erfolgsrate der Modellkonstruktion und dem Alter, dem Geschlecht, dem Tumordurchmesser, dem Tumorgrad und der Differenzierung wurde analysiert. Obwohl die Modellerfolgsrate von Tumorproben Grad 4 höher war als bei Proben mit niedrigerem Grad und auch die Erfolgsrate von undifferenzierten Tumorproben höher war als die von hochdifferenzierten Proben, zeigten die Ergebnisse der Korrelationsanalyse, dass diese Faktoren nicht mit der Erfolgsrate des PDX-Modells assoziiert waren (Tabelle 1). Siebzehn HNSCC-Proben wurden beimpft, und vier PDX-Modelle von HNSCCC wurden erfolgreich konstruiert. Die Korrelationsanalyse zwischen der Tumorentnahmerate in der Modellkonstruktion und den klinischen Parametern der Tumorproben zeigte, dass der Grad der Differenzierung mit der Modellerfolgsrate assoziiert war, während Alter, Geschlecht, Rauchergeschichte, Tumordurchmesser, Krebsgrad, Metastasierung und HPV-Infektion keinen Einfluss auf die Tumorentnahmerate hatten (Tabelle 2).
Die Tumorwachstumskurven für jedes PDX-Modell wurden aufgetragen, um die Wachstumsraten der PDX-Modelle verschiedener Patienten besser zu verstehen (Abbildung 1, Abbildung 2 und Tabelle 3). Die durchschnittlichen tumorigenen Zyklen (Zeit von der Inokulation bis zu einer Tumorgröße von 1.000 mm3) von THY-004 aus den Generationen P0 bis P5 betrugen 68 Tage, 87 Tage, 29 Tage, 34 Tage, 28 Tage bzw. 26 Tage. Die durchschnittlichen tumorigenen Zyklen von THY-012 aus den Generationen P0 bis P5 betrugen 119 Tage, 61 Tage, 66 Tage, 55 Tage, 87 Tage bzw. 116 Tage. Die durchschnittlichen tumorigenen Zyklen von THY-017 aus den Generationen P0 bis P5 betrugen 27 Tage, 17 Tage, 30 Tage, 13 Tage, 22 Tage bzw. 15 Tage. Die durchschnittlichen tumorigenen Zyklen von THY-018 aus den Generationen P0 bis P3 betrugen 134 Tage, 70 Tage, 48 Tage bzw. 48 Tage. Die durchschnittlichen tumorigenen Zyklen von THY-021 aus den Generationen P0 bis P3 betrugen 53 Tage, 66 Tage, 35 Tage bzw. 49 Tage. Die durchschnittlichen tumorigenen Zyklen von OTO-017 aus den Generationen P0 bis P4 betrugen 118 Tage, 86 Tage, 67 Tage, 129 Tage bzw. 88 Tage. Die durchschnittlichen tumorigenen Zyklen von OTO-022 aus den Generationen P0 bis P5 betrugen 155 Tage, 55 Tage, 32 Tage, 37 Tage, 27 Tage bzw. 46 Tage. Die durchschnittlichen tumorigenen Zyklen von OTO-030 aus den Generationen P0 bis P2 betrugen 133 Tage, 93 Tage bzw. 104 Tage. Die durchschnittlichen tumorigenen Zyklen von OTO-031 aus den Generationen P0 bis P5 betrugen 144 Tage, 58 Tage, 33 Tage, 34 Tage, 52 Tage bzw. 50 Tage. Die ATC-Proben wurden stabil an die P3-Generation und später weitergegeben, während in zwei Fällen von HNSCC-Proben nach dem Übergang in die P1-Generation keine Tumore gebildet wurden. Die Wachstumsraten einiger Proben waren in der P0-Generation relativ langsam, aber ihre Wachstumsraten wurden nach dem Übergang zur P1-Generation und späteren Generationen beschleunigt. Die histopathologischen Charakteristika der Patiententumoren wurden mit denen verschiedener Generationen von PDX-Modellen verglichen. Die Ergebnisse zeigten, dass PDX-Tumoren und patienteneigene Primärtumoren morphologisch nahezu ähnlich waren (Abbildung 3), mit leichten Unterschieden, die auf die Heterogenität im Probenahmegebiet zwischen Patienten und verschiedenen PDX-Generationen zurückzuführen sein könnten.
Die Anti-Tumor-Wirksamkeit von Lenvatinib (ein Multi-Target-Tyrosinkinase-Inhibitor, der für die Behandlung von fortgeschrittenem Schilddrüsenkrebs zugelassen ist28) wurde im PDX-Modell der ATC untersucht. Wie in Abbildung 4A dargestellt, hemmte die Behandlung mit Lenvatinib das Tumorwachstum im ATC-PDX-Modell im Vergleich zur Kontrollgruppe mit normaler Kochsalzlösung signifikant (P < 0,05). Am Ende des Experiments wurde das Tumorgewebe herausgeschnitten und gewogen, um das Tumorgewicht zu bestimmen. Im Vergleich zur Kontrollgruppe war das Tumorgewicht der Lenvatinib-Behandlungsgruppe geringer, obwohl ein statistischer Unterschied nicht erreicht wurde (Abbildung 4B). Darüber hinaus wurden bei den mit Lenvatinib behandelten Mäusen keine offensichtlichen Veränderungen des Allgemeinzustands und des Körpergewichts beobachtet (Abbildung 4C). Aufgrund der übermäßigen Häufigkeit der Cisplatin-Verabreichung während der Experimente zeigten die Mäuse eine signifikante Toxizität, die sich in Gewichtsverlust und sogar Tod äußerte. Die Anti-Tumor-Wirksamkeit von Cisplatin ist in der ergänzenden Abbildung 1 dargestellt.
Abbildung 1: Tumorwachstumskurve von ATC-PDX-Modellen verschiedener Patienten. Jede Farbe steht für die angegebene Generation und jede Kurve für einen einzelnen Tumor. Ein bis drei Mäuse wurden in der Passage 0 (P0)-Generation und fünf Mäuse in den nachfolgenden Passagen (P1-P5) inokuliert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Tumorwachstumskurve der HNSCC PDX-Modelle verschiedener Patienten. Jede Farbe steht für die angegebene Generation und jede Kurve für einen einzelnen Tumor. Ein bis drei Mäuse wurden in der P0-Generation und fünf Mäuse in der P1-Generation und späteren Generationen inokuliert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Histopathologische Untersuchung. Histopathologischer Vergleich zwischen den Patienten-Primärtumoren und den entsprechenden PDXs (Passage 1 und Passage 3) von ATC (THY-012, THY-017) und HNSCC (OTO-017) (Hämatoxylin-Eosin-Färbung, 100x). Die pathologischen Subtypen von THY-012 und THY-017 waren das anaplastische Schilddrüsenkarzinom und der pathologische Subtyp von OTO-017 das Plattenepithelkarzinom. Maßstabsbalken = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Die therapeutische Wirksamkeit von Lenvatinib im ATC-PDX-Modell. Veränderungen des (A) Tumorvolumens, (B) des Tumorgewichts und (C) des Körpergewichts von ATC PDX-tragenden Mäusen nach Behandlung mit Lenvatinib (10 mg/kg). Statistische Analysen wurden mit Hilfe von T-Tests durchgeführt, um Levatinib mit der Kontrolle zu vergleichen. *P < 0,05 gegenüber der Kontrollgruppe wurde als statistisch signifikant angesehen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Parameter | Klasse | Tumorentnahmerate (%) | P |
| Alter (Jahre) | <60 | 16.67 (1/6) | 0.615 |
| ≥60 | 33.33 (4/12) | ||
| Geschlecht | Männlich | 16.67 (1/6) | 0.615 |
| Weiblich | 33.33 (4/12) | ||
| Durchmesser des Tumors | <6cm | 37.50 (3/8) | 0.608 |
| ≥6cm | 20.00 (2/10) | ||
| Pathologisches TNM-Stadium | Ich | 0.00 (0/1) | 1 |
| Ш | 0.00 (0/1) | ||
 |
31.25 (5/16) | ||
| Differenzierung | Hoch | 0.00 (0/7) | 0.059 |
| Arm | 25.00 (1/4) | ||
| Undifferenziert | 57.14 (4/7) |
Tabelle 1: Korrelation zwischen der ATC-Tumorentnahmerate und den klinischen Merkmalen der Patienten.
| Parameter | Klasse | Tumorentnahmerate (%) | P |
| HPV | Negativ | 33.33 (2/6) | 1 |
| Unbekannt oder positiv | 36.36 (4/11) | ||
| Alter (Jahre) | <60 | 33.33 (3/9) | 1 |
| ≥60 | 37.50 (3/8) | ||
| Geschlecht | Männlich | 50.00 (5/10) | 0.304 |
| Weiblich | 14.29 (1/7) | ||
| Status des Rauchers | Jemals | 44.44 (4/9) | 0.62 |
| Nie | 25.00 (2/8) | ||
| Durchmesser des Tumors | <3cm | 40.00 (4/10) | 1 |
| ≥3cm | 28.57 (2/7) | ||
| Pathologisches TNM-Stadium | Ich | 75.00 (3/4) | 0.423 |
 |
25.00 (2/8) | ||
| Ш | 0.00 (0/1) | ||
|
33.33 (1/3) | ||
| Fernmetastasen | Y | 28.57 (2/7) | 0.633 |
| N | 44.44 (4/9) | ||
| Differenzierung | Hoch | 12.50 (1/8) | 0.036* |
| Mäßig bis hoch | 100.00 (2/2) | ||
| Mäßig | 0.00 (0/2) | ||
| Mäßig bis schlecht | 66.67 (2/3) | ||
| * P < 0,05 |
Tabelle 2: Korrelation zwischen der HNSCC-Tumorentnahmerate und den klinischen Merkmalen der Patienten. *P < 0,05.
| Name des Beispiels | Generation P bis P0 | Generation P0 bis P1 | Generation P1 bis P2 | Generation P2 bis P3 | Generation P3 bis P4 | Generation P4 bis P5 |
| THY-004 | 68 | 87 | 29 | 34 | 28 | 26 |
| THY-012 | 119 | 61 | 66 | 55 | 87 | 116 |
| THY-017 | 27 | 17 | 30 | 13 | 22 | 15 |
| THY-018 | 134 | 70 | 48 | 48 | - | - |
| THY-021 | 53 | 66 | 35 | 49 | - | - |
| OTO-017 | 118 | 86 | 67 | 129 | - | - |
| OTO-022 | 155 | 55 | 32 | 37 | 27 | 46 |
| OTO-030 | 133 | 93 | 104 | - | - | - |
| OTO-031 | 144 | 58 | 33 | 34 | 52 | 50 |
Tabelle 3: Der durchschnittliche tumorigene Zyklus (Zeit von der Inokulation bis zu einer Tumorgröße von 1.000 mm3) der ATC- und HNSCC-Modelle.
Ergänzende Abbildung 1: Die therapeutische Wirksamkeit von Cisplatin im ATC-PDX-Modell. Veränderungen des (A) Tumorvolumens, (B) des Tumorgewichts und (C) des Körpergewichts von ATC PDX-tragenden Mäusen nach Behandlung mit Cisplatin (3 mg/kg). Statistische Analysen wurden mit Hilfe von T-Tests durchgeführt, um Cisplatin mit der Kontrolle zu vergleichen. *P < 0,05 gegenüber der Kontrollgruppe wurde als statistisch signifikant angesehen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dieser Studie konnten die subkutanen PDX-Modelle von ATC und HNSCC erfolgreich etabliert werden. Es gibt viele Aspekte, auf die beim Bau von PDX-Modellen geachtet werden muss. Wenn das Tumorgewebe vom Patienten getrennt wird, sollte es so schnell wie möglich in die Eisbox gelegt und zur Impfung ins Labor geschickt werden. Nachdem der Tumor im Labor angekommen ist, muss der Bediener auf die Aufrechterhaltung eines sterilen Feldes achten und aseptische Verfahren anwenden. Da das Tumorgewebe bei Nadelbiopsieproben besonders klein ist, wäre eine Inokulation nach dem Mischen der Probe mit dem Matrixgel für die Etablierung des Modells förderlicher. Auch das Primärtumorgewebe sollte für zukünftige Forschungen so weit wie möglich konserviert, fixiert und eingefroren werden. Während der Inokulation muss die Luft im Trokar so weit wie möglich ausgestoßen werden, nachdem die Tumorstücke vor der Anwendung in den Trokar eingebracht wurden. Nach der Tumorinokulation sollte das Tumorwachstum bei Mäusen 1-4 Monate lang beobachtet werden, und Mäuse ohne Tumorwachstum von mehr als 6 Monaten können euthanasiert werden29.
Immundefiziente Mäuse werden in der Regel als Wirt für die PDX-Modellkonstruktion ausgewählt29,30. Von der P0-Generation bis zur P2-Generation werden in der Regel nicht-adipöse, diabetisch-schwer geschwächte immundefiziente (NOD-SCID) Mäuse oder NOD Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) Mäuse verwendet. In der P3-Generation und darüber hinaus gelten die Proben als stabil bestanden, so dass in der Regel auch Nacktmäuse als Wirt dienen können und Tumore auch normal wachsen können. Darüber hinaus waren die Gesamtoperationszeit, die Tumorisolationszeit, das krankheitsfreie Überleben und die Gesamtüberlebensrate der Patienten, der maligne Tumorgrad und der histologische Subtyp mit der Tumorigenität des PDX-Modells assoziiert31,32,33,34. Die Transplantationsstelle hat auch einen Einfluss auf die Erfolgsrate der PDX-Modellierung, und Studien haben gezeigt, dass Nierenkapseltransplantationen und orthotrope Transplantationen eine hohe tumorigene Rate aufweisen33,35. Darüber hinaus kann die Anwendung von Matrigel auch die Tumorigenenrate verbessern36,37. Es wurde berichtet, dass eine Infektion mit humanen Papillomaviren (HPV) die Erfolgsrate der Transplantation bei HNSCC-Tumoren beeinflusst. HPV-negative Tumoren haben im Vergleich zu HPV-positiven Tumoren eine höhere Aufnahmerate38,39. Diese Studie kam nicht zum gleichen Ergebnis, wahrscheinlich aufgrund der geringen Stichprobenzahlen und der unvollständigen Informationen über die HPV-Infektion.
Im Gegensatz zu den orthotopen und renalen Kapseltransplantationsmodellen ist das subkutane Modell für die Beobachtung des Tumorwachstums bequemer und auch für die Operation förderlich40,41,42. Basierend auf den Tumorwachstumsdaten des ATC- und HNSCC-PDX-Modells fanden wir heraus, dass die Wachstumsraten von Tumoren verschiedener Patienten inkonsistent waren, was die Heterogenität zwischen den Tumoren widerspiegelt. Die Tumorwachstumsrate der P0-Generation war in den meisten PDX-Modellen relativ langsamer als bei den letztgenannten Passagen, was wahrscheinlich auf die Anpassung der Mikroumgebung der Maus zurückzuführen war. Bemerkenswert ist, dass die Wachstumsrate einiger patientenbezogener Tumoren in verschiedenen Passagen nach der P1-Generierung zunahm, was mit dem verkürzten Passagenintervall übereinstimmt, das von Pearson et al.43 berichtet wurde. Die histopathologische Untersuchung zeigte, dass die PDX-Tumoren die morphologischen Merkmale der Primärtumoren beibehielten. Die Korrelation zwischen dem PDX-Modell und den klinischen ATC-Patienten spiegelte sich auch in den Ergebnissen der pharmakodynamischen In-vivo-Tests wider, die zeigten, dass Lenvartinib eine gute Anti-Tumor-Wirkung zeigte, die mit den klinischen Berichten übereinstimmte25,26,27.
Allerdings hat das PDX-Modell auch gewisse Nachteile. So ist beispielsweise die Tumorentstehungszeit relativ lang, was für Patienten mit fortgeschrittenen oder aggressiven Tumoren ungeeignet ist. Darüber hinaus sind die zeitlichen und monetären Kosten für das Hochdurchsatz-Drogenscreening zu hoch44. In der Tat würde die Kombination des PDX-Modells mit Tumororganoiden und die Etablierung eines patientenabgeleiteten Organoid-Modells (PDO), das dem PDX-Modell entspricht, diesen Mangel kompensieren 44,45,46. Orthotope Transplantationsmodelle können verwendet werden, um die Pathogenese und die Metastasierungsmechanismen von Tumoren zu untersuchen40,41,47. Das Fehlen eines funktionierenden Immunsystems ist ein weiterer Nachteil des PDX-Modells, so dass immer mehr Experimente mit humanisierten Mäusen durchgeführt werden, um das PDX-Modell für die Tumorimmunologie-Forschung zu konstruieren48,49,50.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Mögliche Interessenkonflikte werden nicht offengelegt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Wissenschafts- und Technologieunterstützungsprogramm der Provinz Sichuan (Förderkennzeichen 2019JDRC0019 und 2021ZYD0097), das Projekt 1.3.5 für Exzellenzdisziplinen, West China Hospital, Sichuan University (Förderkennzeichen ZYJC18026), das Projekt 1.3.5 für Exzellenzdisziplinen – Clinical Research Incubation Project, West China Hospital, Sichuan University (Förderkennzeichen 2020HXFH023), den Grundlagenforschungsfonds für die Zentraluniversitäten (SCU2022D025), das internationale Kooperationsprojekt des Chengdu Science and Technology Bureau (Fördernummer 2022-GH02-00023-HZ), das Innovation Spark-Projekt der Universität Sichuan (Fördernummer 2019SCUH0015) und der Talent Training Fund for Medical-Engineering Integration des West China Hospital - University of Electronic Science and Technology (Fördernummer HXDZ22012).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.4 mm x 2.0 mm trocar | Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd | 18-9065 | |
| Balb/c nude mice | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. | 401 | |
| Biosafety cabinet | Suzhou Antai | BSC-1300IIA2 | |
| Blade | Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd | 18-0823 | |
| Centrifuge tube | Corning | 430791/430829 | |
| Cryopreservation tube | Chengdu Dianrui Experimental Instrument Co., Ltd | / | |
| Custodiol HTK-Solution | Custodiol | 2103417 | |
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | SIGMA-ALORICH | D5879-500mL | |
| Electronic balance | METTLER | ME104 | |
| Electronic digital caliper | Chengdu Chengliang Tool Group Co., Ltd | 0-220 | |
| fetal bovine serum(FBS) | VivaCell | C04001-500 | |
| IBM SPSS Statistics 26 | IBM | ||
| Ketamine | Jiangsu Zhongmu Beikang Pharmaceutical Co., Ltd | 100761663 | |
| Lenvatinib | ApexBio | A2174 | |
| NOD-SCID immunodeficient mice | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. | 406 | |
| Pen-Strep Solution | Biological Industries | 03-03101BCS | |
| Petri dish | WHB | WHB-60/WHB-100 | |
| Saline | Sichuan Kelun | W220051705 | |
| Scissor | Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd | 18-0110 | |
| Tweezer | Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd | 18-1241 | |
| Vet ointment | Pfizer Inc. | P10015353 | |
| Xylazine | Dunhua Shengda Animal Medicine Co., Ltd | 070031777 |
References
- Toolan, H. W. Successful subcutaneous growth and transplantation of human tumors in X-irradiated laboratory animals. Proceedings of The Society for Experimental Biology and Medicine. 77 (3), 572-578 (1951).
- Gillet, J. P., et al. Redefining the relevance of established cancer cell lines to the study of mechanisms of clinical anti-cancer drug resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (46), 18708-18713 (2011).
- Hausser, H. J., Brenner, R. E. Phenotypic instability of Saos-2 cells in long-term culture. Biochemical & Biophysical Research Communications. 333 (1), 216-222 (2005).
- Pérez-Mancera, P., Guerra, C., Barbacid, M., Tuvesonet, D. A. What we have learned about pancreatic cancer from mouse models. Gastroenterology. 142 (5), 1079-1092 (2012).
- Bruna, A., et al. A biobank of breast cancer explants with preserved intra-tumor heterogeneity to screen anticancer compounds. Cell. 167 (1), 260-274 (2016).
- Choi, S., et al. Lessons from patient-derived xenografts for better in vitro modeling of human cancer. Advanced Drug Delivery Reviews. 79-80, 222-237 (2014).
- Blomme, A., et al. Murine stroma adopts a human-like metabolic phenotype in the PDX model of colorectal cancer and liver metastases. Oncogene. 37 (9), 1237-1250 (2018).
- Wang, D., et al. Molecular heterogeneity of non-small cell lung carcinoma patient-derived xenografts closely reflect their primary tumors. International Journal of Cancer. 140 (3), 662-673 (2016).
- Jung, J., et al. Generation and molecular characterization of pancreatic cancer patient-derived xenografts reveals their heterologous nature. Oncotarget. 7 (38), 62533-62546 (2016).
- Keysar, S., et al. A patient tumor transplant model of squamous cell cancer identifies PI3K inhibitors as candidate therapeutics in defined molecular bins. Molecular Oncology. 7 (4), 776-790 (2013).
- Rubio-Viqueira, B., et al. An in vivo platform for translational drug development in pancreatic cancer. Clinical Cancer Research. 12 (15), 4652-4661 (2006).
- Fiebig, H. H., et al. Development of three human small cell lung cancer models in nude mice. Recent Results in Cancer Research. 97, 77-86 (1985).
- Morelli, M. P., et al. Prioritizing phase I treatment options through preclinical testing on personalized tumorgraft. Journal of Clinical Oncology. 30 (4), 45-48 (2012).
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA. 68 (6), 394-424 (2018).
- Onoda, N., et al. Evaluation of the 8th edition TNM classification for anaplastic thyroid carcinoma. Cancers. 12 (3), 552 (2020).
- Nel, C., et al. Anaplastic carcinoma of the thyroid: A clinicopathologic study of 82 cases. Mayo Clinic Proceedings. 60 (1), 51-58 (1985).
- Mazzaferri, E. L. Increasing incidence of thyroid cancer in the United States, 1973-2002. Yearbook of Medicine. 2007, 496-499 (2007).
- Kebebew, E., Greenspan, F. S., Clark, O. H., Woeber, K. A., Mcmillan, A. Anaplastic thyroid carcinoma. Treatment outcome and prognostic factors. Cancer. 103 (7), 1330-1335 (2005).
- Lin, B., et al. The incidence and survival analysis for anaplastic thyroid cancer: A SEER database analysis. American Journal of Translational Research. 11 (9), 5888-5896 (2019).
- Maniakas, A., Dadu, R., Busaidy, N. L., Wang, J. R., Zafereo, M. Evaluation of overall survival in patients with anaplastic thyroid carcinoma, 2000-2019. JAMA Oncology. 6 (9), 1397-1404 (2020).
- Gilardi, M., et al. Tipifarnib as a precision therapy for HRAS-mutant head and neck squamous cell carcinomas. Molecular Cancer Therapeutics. 19 (9), 1784-1796 (2020).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Chow, L. Q. M.
- Swiecicki, P. L., Brennan, J. R., Mierzwa, M., Spector, M. E., Brenner, J. C. Head and neck squamous cell carcinoma detection and surveillance: Advances of liquid biomarkers. Laryngoscope. 129 (8), 1836-1843 (2019).
- Wang, R., et al. Distribution and activity of lenvatinib in brain tumor models of human anaplastic thyroid cancer cells in severe combined immune deficient mice. Molecular Cancer Therapeutics. 18 (5), 947-956 (2019).
- Takahashi, S., et al. A phase II study of the safety and efficacy of lenvatinib in patients with advanced thyroid cancer. Future Oncology. 15 (7), 717-726 (2019).
- Ferrari, S. M., et al. Lenvatinib exhibits antineoplastic activity in anaplastic thyroid cancer in vitro and in vivo. Oncology Reports. 39 (5), 2225-2234 (2018).
- Cabanillas, M. E., Habra, M. A. Lenvatinib: Role in thyroid cancer and other solid tumors. Cancer Treatment Reviews. 42, 47-55 (2016).
- Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. The generation and application of patient-derived xenograft model for cancer research. Cancer Research and Treatment. 50 (1), 1-10 (2018).
- Peng, S., et al. Tumor grafts derived from patients with head and neck squamous carcinoma authentically maintain the molecular and histologic characteristics of human cancers. Journal of Translational Medicine. 11, 198 (2013).
- Derose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17 (11), 1514-1520 (2011).
- Chen, X., Shen, C., Wei, Z., Zhang, R., Xiao, K. Patient-derived non-small cell lung cancer xenograft mirrors complex tumor heterogeneity. Cancer Biology and Medicine. 18 (1), 184-198 (2021).
- Choi, Y. Y., et al. Establishment and characterisation of patient-derived xenografts as paraclinical models for gastric cancer. Scientific Reports. 6, 22172 (2016).
- Maider, I. V., Andrés, C., Alberto, B. Preclinical models for precision oncology. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer. 1872 (2), 239-246 (2018).
- Okada, S., Vaeteewoottacharn, K., Kariya, R. Establishment of a patient-derived tumor xenograft model and application for precision cancer medicine. Chemical & Pharmaceutical Bulletin. 66 (3), 225-230 (2018).
- Michael, G., et al. Tumor take rate optimization for colorectal carcinoma patient-derived xenograft models. BioMed Research International. 2016, 1715053 (2016).
- Bernardo, C., Costa, C., Sousa, N., Amado, F., Santos, L. Patient-derived bladder cancer xenografts: a systematic review. Translational Research. 166 (4), 324-331 (2015).
- Facompre, N. D., et al. Barriers to generating PDX models of HPV-related head and neck. Laryngoscope. 127 (12), 2777-2783 (2017).
- Kang, H. N., Kim, J. H., Park, A. Y., Choi, J. W., Kim, H. R. Establishment and characterization of patient-derived xenografts as paraclinical models for head and neck cancer. BMC Cancer. 20 (1), 316 (2020).
- Ahn, S. H., et al. An orthotopic model of papillary thyroid carcinoma in athymic nude mice. Archives of Otolaryngology-Head & Neck Surgery. 134 (2), 190-197 (2008).
- Nucera, C., et al. A novel orthotopic mouse model of human anaplastic thyroid carcinoma. Thyroid. 19 (10), 1077-1084 (2009).
- De Rose, F., et al. Galectin-3 targeting in thyroid orthotopic tumors opens new ways to characterize thyroid cancer. Journal of Nuclear Medicine. 60 (6), 770-776 (2019).
- Pearson, A. T., et al. Patient-derived xenograft (PDX) tumors increase growth rate with time. Oncotarget. 7 (7), 7993-8005 (2016).
- Huo, K. G., D'Arcangelo, E., Tsao, M. S. Patient-derived cell line, xenograft and organoid models in lung cancer therapy. Translational Lung Cancer Research. 9 (5), 2214-2232 (2020).
- Kumari, R., Xu, X., Li, H. Q. Translational and clinical relevance of PDX-derived organoid models in oncology drug discovery and development. Current Protocols. 2 (7), e431 (2022).
- Takahashi, N., et al. Construction of in vitro patient-derived tumor models to evaluate anticancer agents and cancer immunotherapy. Oncology Letters. 21 (5), 406 (2021).
- Barasch, A., et al. Photobiomodulation effects on head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) in an orthotopic animal model. Supportive Care in Cancer. 28 (6), 2721-2727 (2020).
- Wang, M., et al. Humanized mice in studying efficacy and mechanisms of PD-1-targeted cancer immunotherapy. FASEB Journal. 32 (3), 1537-1549 (2018).
- Wu, C., Wang, X., Shang, H., Wei, H. Construction of a humanized PBMC-PDX model to study the efficacy of a bacterial marker in lung cancer immunotherapy. Disease Markers. 2022, 1479246 (2022).
- Yao, L. C., et al. Creation of PDX-bearing humanized mice to study immuno-oncology. Methods in Molecular Biology. 1953, 241-252 (2019).
