Summary
Il presente protocollo stabilisce e caratterizza un modello di xenotrapianto derivato dal paziente (PDX) di carcinoma anaplastico della tiroide (ATC) e carcinoma a cellule squamose della testa e del collo (HNSCC), poiché i modelli PDX stanno rapidamente diventando lo standard nel campo dell'oncologia traslazionale.
Abstract
I modelli di xenotrapianto derivato dal paziente (PDX) preservano fedelmente le caratteristiche istologiche e genetiche del tumore primario e ne mantengono l'eterogeneità. I risultati farmacodinamici basati su modelli PDX sono altamente correlati con la pratica clinica. Il carcinoma anaplastico della tiroide (ATC) è il sottotipo più maligno di cancro della tiroide, con forte invasività, prognosi infausta e trattamento limitato. Sebbene il tasso di incidenza di ATC rappresenti solo il 2% -5% del cancro alla tiroide, il suo tasso di mortalità è pari al 15% -50%. Il carcinoma a cellule squamose della testa e del collo (HNSCC) è uno dei tumori maligni della testa e del collo più comuni, con oltre 600.000 nuovi casi in tutto il mondo ogni anno. Qui vengono presentati protocolli dettagliati per stabilire modelli PDX di ATC e HNSCC. In questo lavoro, sono stati analizzati i fattori chiave che influenzano il tasso di successo della costruzione del modello e le caratteristiche istopatologiche sono state confrontate tra il modello PDX e il tumore primario. Inoltre, la rilevanza clinica del modello è stata convalidata valutando l'efficacia terapeutica in vivo di farmaci rappresentativi clinicamente utilizzati nei modelli PDX costruiti con successo.
Introduction
Il modello PDX è un modello animale in cui il tessuto tumorale umano viene trapiantato in topi immunodeficienti e cresce nell'ambiente fornito dai topi1. I modelli tradizionali di linee cellulari tumorali soffrono di diversi svantaggi, come la mancanza di eterogeneità, l'incapacità di trattenere il microambiente tumorale, la vulnerabilità alle variazioni genetiche durante ripetuti passaggi in vitro e la scarsa applicazione clinica 2,3. I principali inconvenienti dei modelli animali geneticamente modificati sono la potenziale perdita delle caratteristiche genomiche dei tumori umani, l'introduzione di nuove mutazioni sconosciute e la difficoltà di identificare il grado di omologia tra tumori murini e tumori umani4. Inoltre, la preparazione di modelli animali geneticamente modificati è costosa, dispendiosa in termini di tempo e relativamente inefficiente4.
Il modello PDX presenta molti vantaggi rispetto ad altri modelli tumorali in termini di rispecchiamento dell'eterogeneità tumorale. Dal punto di vista dell'istopatologia, sebbene la controparte murina sostituisca lo stroma umano nel tempo, il modello PDX conserva bene la struttura morfologica del tumore primario. Inoltre, il modello PDX conserva l'identità metabolomica del tumore primario per almeno quattro generazioni e riflette meglio le complesse interrelazioni tra le cellule tumorali e il loro microambiente, rendendolo unico nel simulare la crescita, le metastasi, l'angiogenesi e l'immunosoppressione del tessuto tumorale umano 5,6,7. A livello cellulare e molecolare, il modello PDX riflette accuratamente l'eterogeneità inter- e intra-tumorale dei tumori umani, così come le caratteristiche fenotipiche e molecolari del cancro originale, inclusi i modelli di espressione genica, lo stato di mutazione, il numero di copie e la metilazione del DNA e la proteomica 8,9. I modelli PDX con passaggi diversi hanno la stessa sensibilità alla terapia farmacologica, indicando che l'espressione genica dei modelli PDX è altamente stabile10,11. Gli studi hanno dimostrato un'eccellente correlazione tra la risposta del modello PDX a un farmaco e le risposte cliniche dei pazienti a quel farmaco12,13. Pertanto, il modello PDX è emerso come un potente modello di ricerca preclinica e traslazionale, in particolare per lo screening dei farmaci e la previsione della prognosi clinica.
Il cancro della tiroide è un tumore maligno comune del sistema endocrino ed è un tumore maligno umano che ha mostrato un rapido aumento dell'incidenza negli ultimi anni14. Il carcinoma anaplastico della tiroide (ATC) è il tumore tiroideo più maligno, con una sopravvivenza mediana del paziente di soli 4,8 mesi15. Sebbene solo una minoranza di pazienti affetti da cancro alla tiroide venga diagnosticata con ATC ogni anno in Cina, il tasso di mortalità è vicino al 100% 16,17,18. L'ATC di solito cresce rapidamente e invade i tessuti adiacenti del collo e dei linfonodi cervicali, e circa la metà dei pazienti ha metastasi a distanza19,20. Il carcinoma a cellule squamose della testa e del collo (HNSCC) è il sesto tumore più comune al mondo e una delle principali cause di morte per cancro, con una stima di 600.000 persone affette da HNSCC ogni anno21,22,23. HNSCC comprende un gran numero di tumori, compresi quelli nel naso, seni, bocca, tonsille, faringe e laringe24. ATC e HNSCC sono due delle principali neoplasie della testa e del collo. Al fine di facilitare lo sviluppo di nuovi agenti terapeutici e trattamenti personalizzati, è necessario sviluppare modelli animali preclinici robusti e avanzati come i modelli PDX di ATC e HNSCC.
Questo articolo introduce metodi dettagliati per stabilire il modello PDX sottocutaneo di ATC e HNSCC, analizza i fattori chiave che influenzano il tasso di prelievo del tumore nella costruzione del modello e confronta le caratteristiche istopatologiche tra il modello PDX e il tumore primario. Nel frattempo, in questo lavoro, sono stati eseguiti test farmacodinamici in vivo utilizzando i modelli PDX costruiti con successo al fine di convalidare la loro rilevanza clinica.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e i protocolli dell'Associazione per la valutazione e l'accreditamento della cura degli animali da laboratorio approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'ospedale della Cina occidentale, Università del Sichuan. Per il presente studio sono stati utilizzati topi immunodeficienti NOD-SCID di età compresa tra 4-6 settimane (di entrambi i sessi) e topi nudi femmina Balb/c di età compresa tra 4-6 settimane. Gli animali sono stati ottenuti da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali). Il comitato etico del West China Hospital ha autorizzato lo studio con soggetti umani (protocollo numero 2020353). Ogni paziente ha fornito il consenso informato scritto.
1. Preparazione sperimentale
- Disporre lame monouso, forbici e pinzette sterilizzate e altri strumenti necessari per il trapianto di tumore, posizionarli sul banco da lavoro ultra-pulito e irradiarli con luce ultravioletta in anticipo.
- Preparare soluzione salina sterile e piastre di Petri per l'uso durante il test.
2. Acquisizione e trasporto di tessuto tumorale fresco
- Prelevare campioni di tumore freschi (di solito di dimensioni superiori a 5 mm x 5 mm) dalla sala operatoria e metterli in una provetta da centrifuga da 15 ml o 50 ml contenente soluzione sterile di HTK (vedere Tabella dei materiali) o soluzione salina. Etichettare le provette della centrifuga.
NOTA: Campioni di tumore freschi sono stati ottenuti mediante rimozione chirurgica o puntura da pazienti con ATC o HNSCC. - Mettere i tubi della centrifuga in una ghiacciaia preparata in anticipo.
NOTA: Durante questo periodo, l'operatore del trapianto deve preparare gli elementi necessari per il trapianto (vedi Tabella dei materiali). - Assicurarsi che il tempo che intercorre tra la raccolta del campione e il trasporto al laboratorio per la costruzione del PDX non superi le 2 ore. Durante il trasporto, circondare i tubi contenenti i tessuti con una miscela di acqua ghiacciata o impacchi di ghiaccio per preservare l'attività tissutale.
3. Trapianto di tumore
- Una volta che i tessuti tumorali arrivano al laboratorio, registrarli e rinumerarli.
NOTA: Per il presente studio, le informazioni sul paziente sono state mantenute strettamente riservate. Le fasi rimanenti della procedura sono state eseguite in un laboratorio di livello di biosicurezza 2 (BSL-2). Quando si entra nel laboratorio, si consiglia di indossare un grembiule sopra gli abiti da lavoro o indumenti protettivi, un cappello e una maschera. Il trattamento del tessuto tumorale è condotto in un armadio di biosicurezza. - Disinfettare le provette da centrifuga contenenti i tessuti tumorali con alcool al 75% e posizionarle sul tavolo operatorio. Trasferire i tessuti tumorali in piastre di Petri da 6 cm riempite con soluzione salina utilizzando una pinza oftalmica sterilizzata. Quindi, tagliarli in piccoli pezzi di circa 2 mm x 2 mm e 3 mm x 3 mm usando una lama.
- Trasferire i pezzi di tessuto tumorale in una capsula di Petri di 6 cm contenente la quantità appropriata di soluzione salina, avvolgere il piatto con la pellicola sigillante, metterlo in una ghiacciaia e trasportarlo nella stanza degli animali specifici privi di agenti patogeni (SPF) insieme agli strumenti necessari (un paio di forbici, pinze e aghi per inoculazione).
- Prepara l'animale seguendo i passaggi seguenti.
- Rimuovere i peli sul torace laterale destro di topi immunodeficienti NOD-SCID femmina o maschio di 4-6 settimane e disinfettare la pelle con alcol al 75%. Anestetizzare i topi con un'iniezione intraperitoneale di 80 mg/kg di ketamina e 10 mg/kg di xilazina (vedere Tabella dei materiali) e spalmare gli occhi con unguento veterinario per prevenire la secchezza. Confermare la profondità dell'anestesia attraverso la perdita del riflesso del pedale.
- Fai un'incisione di 2 mm con le forbici attraverso la pelle al centro del torace laterale destro dei topi.
- Prendere un pezzo di tumore dalla capsula di Petri e inserirlo nell'ago del trocar da 2,4 mm x 2,0 mm (vedi Tabella dei materiali) con una pinza.
- Tenere il mouse, stringere la pelle nel sito di puntura, utilizzare il trocar contenente i pezzi del tumore per inserire il tumore attraverso l'incisione cutanea iniziale di 2 mm, spostarsi nella parte posteriore della spalla e spingere il nucleo del trocar.
- Assicurarsi che il pezzo di tumore venga spinto fuori e sia lasciato nel seno di transizione formato dalla puntura del trocar, quindi estrarre il trocar.
- Se il tumore si muove con l'ago quando viene ritirato, utilizzare il trocar per ripristinarlo e suturare l'incisione.
NOTA: In questo studio, ogni topo è stato inoculato agli arti anteriori e posteriori dorsali. Da uno a tre topi sono stati inoculati per campione tumorale da ciascun paziente in base alle dimensioni del tumore.
4. Conservazione, fissazione e congelamento delle proteine del tessuto tumorale
NOTA: I restanti tessuti tumorali sono stati utilizzati rispettivamente per la conservazione dei semi, la fissazione e il congelamento del DNA / RNA / proteine.
- Rimuovere la soluzione salina dalla superficie del tumore con una garza sterile prima di posizionarla nel tubo di crioconservazione per assicurarsi che la superficie del tumore non sia eccessivamente bagnata.
- Mettere da quattro a sei pezzi di tessuto tumorale di 2 mm x 2 mm in un tubo di crioconservazione cellulare da 2 ml, aggiungere 1 ml di soluzione di crioconservazione composta dal 90% di siero bovino fetale (FBS) e dal 10% di dimetilsolfossido (DMSO) nel tubo, mettere il tubo in una scatola di raffreddamento a gradiente, congelarlo a -80 ° C durante la notte e, infine, trasferirlo in azoto liquido.
- Posizionare i blocchi di tessuto tumorale di 3 mm x 3 mm in formalina tamponata al 10% per la fissazione del tessuto per l'esame patologico.
- Inserire il blocco di tessuto da 3 x 3 mm in una provetta di crioconservazione cellulare da 2 ml, congelarlo rapidamente in azoto liquido e quindi trasferirlo in un frigorifero a -80 °C per l'estrazione di DNA/RNA e proteine.
- Raccogliere le informazioni cliniche dei pazienti, come la storia del fumo, le dimensioni del tumore, la differenziazione, il sottotipo patologico, il grado di cancro, lo stadio del cancro, le metastasi a distanza, l'origine, la storia medica, l'immunoistochimica, l'infezione da papillomavirus umano (HPV) nei pazienti HNSCC e il trattamento farmacologico.
5. Passaging, crioconservazione e rianimazione di tumori modello PDX
- Misurare la lunghezza e la larghezza dei tumori sottocutanei nei topi utilizzando pinze vernier una volta alla settimana e calcolare il volume del tumore secondo la formula: volume del tumore = 0,5 × lunghezza × larghezza2. Disegna la curva di crescita del tumore.
- Quando il tumore PDX raggiunge i 2.000 mm3, passarlo alla generazione successiva di topi ed eseguire il retrapianto del tumore. Eseguire la preparazione degli strumenti seguendo il punto 4.
- Eutanasia dei topi per lussazione cervicale dopo anestetizzazione con 80 mg / kg di ketamina.
- Disinfettare la pelle con alcool al 75%. Quindi, tagliare la pelle che circonda il tumore usando le forbici, quindi rimuovere il tumore con una pinza e posizionarlo in una capsula di Petri.
- Eseguire la procedura di trapianto tumorale seguendo il passaggio 3.
- Eseguire la conservazione e la crioconservazione dei tumori modello PDX seguendo la fase 4.
- Per la rianimazione del tessuto tumorale, seguire il principio del congelamento lento e della rapida dissoluzione. Dopo aver estratto i crioviali dall'azoto liquido, metterli rapidamente a bagnomaria a 37 °C per una rapida dissoluzione.
- Agitare delicatamente i crioviali a bagnomaria per accelerare il processo di scongelamento.
- Scongelare, trasferire i pezzi del tumore alla soluzione salina normale preparata per il lavaggio e quindi inoculare la prossima generazione di topi. Per l'operazione specifica, vedere la procedura di trapianto di tessuto al punto 3.
6. Determinazione dell'efficacia terapeutica di lenvatinib e cisplatino nel modello ATC PDX
NOTA: Il modello ATC PDX è stato utilizzato per testare l'effetto terapeutico dell'inibitore della tirosin-chinasi lenvatinib e del farmaco chemioterapico cisplatino25,26,27.
- Selezionare il tessuto tumorale della generazione P5 di un modello ATC PDX (THY-017), tagliarlo in pezzidi tessuto 3 di 2-4 mm e inoculare per via sottocutanea (fase 3) sul dorso destro di dieci topi nudi Balb / c femmina di 4-6 settimane.
- Selezionare 15 topi con volumi tumorali tra 50-150 mm3 e dividerli in tre gruppi.
- Somministrare lenvatinib (10 mg/kg) per via intragastrica a un gruppo una volta al giorno per 15 giorni, somministrare cisplatino (3 mg/kg) per via intraperitoneale a un gruppo ogni 3 giorni per un totale di sei dosi e somministrare il gruppo di controllo con lo stesso volume di soluzione salina normale.
- Misurare il peso corporeo e il volume tumorale dei topi due volte a settimana.
- Alla fine del test, eutanasia i topi (passo 5.3) e pesare i tumori.
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Representative Results
Sono stati trapiantati un totale di 18 campioni di cancro alla tiroide e sono stati costruiti con successo cinque modelli PDX di cancro alla tiroide (tasso di assunzione del tumore del 27,8%), inclusi quattro casi di tumori tiroidei indifferenziati e un caso di carcinoma anaplastico della tiroide. È stata analizzata la correlazione tra il tasso di successo della costruzione del modello e l'età, il sesso, il diametro del tumore, il grado del tumore e la differenziazione. Sebbene il tasso di successo del modello dei campioni tumorali di grado 4 fosse superiore a quello dei campioni con gradi inferiori e il tasso di successo dei campioni tumorali indifferenziati fosse anche superiore a quello dei campioni altamente differenziati, i risultati dell'analisi di correlazione hanno mostrato che questi fattori non erano associati al tasso di successo del modello PDX (Tabella 1). Diciassette campioni HNSCC sono stati inoculati e quattro modelli PDX di HNSCCC sono stati costruiti con successo. L'analisi di correlazione tra il tasso di assunzione del tumore nella costruzione del modello e i parametri clinici dei campioni tumorali ha dimostrato che il grado di differenziazione era associato al tasso di successo del modello, mentre età, sesso, storia del fumo, diametro del tumore, grado di cancro, metastasi e infezione da HPV non hanno influenzato il tasso di assunzione del tumore (Tabella 2).
Le curve di crescita tumorale per ciascun modello PDX sono state tracciate per comprendere meglio i tassi di crescita dei modelli PDX di diversi pazienti (Figura 1, Figura 2 e Tabella 3). I cicli tumorigenici medi (tempo dall'inoculazione a una dimensione tumorale di 1.000 mm3) di THY-004 dalle generazioni da P0 a P5 sono stati rispettivamente di 68 giorni, 87 giorni, 29 giorni, 34 giorni, 28 giorni e 26 giorni. I cicli tumorigenici medi di THY-012 dalle generazioni da P0 a P5 sono stati rispettivamente di 119 giorni, 61 giorni, 66 giorni, 55 giorni, 87 giorni e 116 giorni. I cicli tumorigenici medi di THY-017 dalle generazioni da P0 a P5 sono stati rispettivamente di 27 giorni, 17 giorni, 30 giorni, 13 giorni, 22 giorni e 15 giorni. I cicli tumorigenici medi di THY-018 dalle generazioni da P0 a P3 sono stati rispettivamente di 134 giorni, 70 giorni, 48 giorni e 48 giorni. I cicli tumorigenici medi di THY-021 dalle generazioni da P0 a P3 sono stati rispettivamente di 53 giorni, 66 giorni, 35 giorni e 49 giorni. I cicli tumorigenici medi di OTO-017 dalle generazioni P0 a P4 sono stati rispettivamente di 118 giorni, 86 giorni, 67 giorni, 129 giorni e 88 giorni. I cicli tumorigenici medi di OTO-022 dalle generazioni da P0 a P5 sono stati rispettivamente di 155 giorni, 55 giorni, 32 giorni, 37 giorni, 27 giorni e 46 giorni. I cicli tumorigenici medi di OTO-030 dalle generazioni P0 a P2 sono stati rispettivamente di 133 giorni, 93 giorni e 104 giorni. I cicli tumorigenici medi di OTO-031 dalle generazioni da P0 a P5 sono stati rispettivamente di 144 giorni, 58 giorni, 33 giorni, 34 giorni, 52 giorni e 50 giorni. I campioni ATC sono stati stabilmente passati alla generazione P3 e successivamente, mentre due casi di campioni HNSCC non sono riusciti a formare tumori dopo essere passati alla generazione P1. I tassi di crescita di alcuni campioni sono stati relativamente lenti nella generazione P0, ma i loro tassi di crescita sono stati accelerati dopo il passaggio al P1 e alle generazioni successive. Sono state confrontate le caratteristiche istopatologiche dei tumori del paziente con quelle di diverse generazioni di modelli PDX. I risultati hanno mostrato che i tumori PDX e i tumori primari derivati dal paziente erano morfologicamente quasi simili (Figura 3), con lievi differenze che possono essere dovute all'eterogeneità nell'area di campionamento tra pazienti e diverse generazioni di PDX.
L'efficacia antitumorale di lenvatinib (un inibitore multi-target della tirosin-chinasi approvato per il trattamento del carcinoma tiroideo avanzato28) è stata valutata nel modello PDX di ATC. Come mostrato nella Figura 4A, il trattamento con lenvatinib ha inibito significativamente la crescita tumorale nel modello ATC PDX rispetto al normale gruppo di controllo salino (P < 0,05). Alla fine dell'esperimento, il tessuto tumorale è stato asportato e pesato per determinare il peso del tumore. Rispetto al gruppo di controllo, il peso tumorale del gruppo di trattamento con lenvatinib era inferiore, sebbene non sia stata raggiunta una differenza statistica (Figura 4B). Inoltre, non sono stati osservati cambiamenti evidenti nello stato generale e nel peso corporeo nei topi trattati con lenvatinib (Figura 4C). A causa dell'eccessiva frequenza di somministrazione di cisplatino durante gli esperimenti, i topi hanno mostrato una tossicità significativa, manifestata dalla perdita di peso e persino dalla morte. L'efficacia antitumorale del cisplatino è mostrata nella Figura supplementare 1.
Figura 1: Curva di crescita tumorale dei modelli ATC PDX di diversi pazienti. Ogni colore rappresenta la generazione specificata e ogni curva rappresenta un singolo tumore. Da uno a tre topi sono stati inoculati alla generazione del passaggio 0 (P0) e cinque topi sono stati inoculati nei passaggi successivi (P1-P5). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Curva di crescita tumorale dei modelli HNSCC PDX di diversi pazienti. Ogni colore rappresenta la generazione specificata e ogni curva rappresenta un singolo tumore. Da uno a tre topi sono stati inoculati alla generazione P0 e cinque topi sono stati inoculati a P1 e generazioni successive. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Studio istopatologico. Confronto istopatologico tra i tumori primari del paziente e i corrispondenti PDX (passaggio 1 e passaggio 3) di ATC (THY-012, THY-017) e HNSCC (OTO-017) (colorazione ematossilina-eosina, 100x). I sottotipi patologici di THY-012 e THY-017 erano carcinoma anaplastico della tiroide e il sottotipo patologico di OTO-017 era carcinoma a cellule squamose. Barre di scala = 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: L'efficacia terapeutica di lenvatinib nel modello ATC PDX. Variazioni del volume (A) del tumore, del peso del tumore (B) e del peso corporeo (C) dei topi portatori di ATC PDX dopo il trattamento con lenvatinib (10 mg/kg). Le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando test T per confrontare levatinib con il controllo. *P < 0,05 rispetto al controllo è stato considerato statisticamente significativo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Parametri | Classe | Tasso di assunzione del tumore (%) | P |
| Età (anni) | <60 | 16.67 (1/6) | 0.615 |
| ≥60 | 33.33 (4/12) | ||
| Genere | Maschio | 16.67 (1/6) | 0.615 |
| Femmina | 33.33 (4/12) | ||
| Diametro del tumore | <6cm | 37.50 (3/8) | 0.608 |
| ≥6cm | 20.00 (2/10) | ||
| Stadio TNM patologico | Io | 0.00 (0/1) | 1 |
| Ш | 0.00 (0/1) | ||
 |
31.25 (5/16) | ||
| Differenziazione | Alto | 0.00 (0/7) | 0.059 |
| Povero | 25.00 (1/4) | ||
| Indifferenziato | 57.14 (4/7) |
Tabella 1: Correlazione tra il tasso di assunzione del tumore ATC e le caratteristiche cliniche dei pazienti.
| Parametri | Classe | Tasso di assunzione del tumore (%) | P |
| HPV | Negativo | 33.33 (2/6) | 1 |
| Sconosciuto o positivo | 36.36 (4/11) | ||
| Età (anni) | <60 | 33.33 (3/9) | 1 |
| ≥60 | 37.50 (3/8) | ||
| Genere | Maschio | 50.00 (5/10) | 0.304 |
| Femmina | 14.29 (1/7) | ||
| Stato di fumo | Mai | 44.44 (4/9) | 0.62 |
| Mai | 25.00 (2/8) | ||
| Diametro del tumore | <3cm | 40.00 (4/10) | 1 |
| ≥3cm | 28.57 (2/7) | ||
| Stadio TNM patologico | Io | 75.00 (3/4) | 0.423 |
 |
25.00 (2/8) | ||
| Ш | 0.00 (0/1) | ||
|
33.33 (1/3) | ||
| Metastasi a distanza | Y | 28.57 (2/7) | 0.633 |
| N | 44.44 (4/9) | ||
| Differenziazione | Alto | 12.50 (1/8) | 0.036* |
| Da moderato ad alto | 100.00 (2/2) | ||
| Moderato | 0.00 (0/2) | ||
| Da moderato a scarso | 66.67 (2/3) | ||
| * P < 0,05 |
Tabella 2: Correlazione tra il tasso di assunzione del tumore HNSCC e le caratteristiche cliniche dei pazienti. *P < 0,05.
| Nome del campione | Generazione da P a P0 | Generazione da P0 a P1 | Generazione da P1 a P2 | Generazione da P2 a P3 | Generazione da P3 a P4 | Generazione da P4 a P5 |
| THY-004 | 68 | 87 | 29 | 34 | 28 | 26 |
| THY-012 | 119 | 61 | 66 | 55 | 87 | 116 |
| THY-017 | 27 | 17 | 30 | 13 | 22 | 15 |
| THY-018 | 134 | 70 | 48 | 48 | - | - |
| THY-021 | 53 | 66 | 35 | 49 | - | - |
| OTO-017 | 118 | 86 | 67 | 129 | - | - |
| OTO-022 | 155 | 55 | 32 | 37 | 27 | 46 |
| OTO-030 | 133 | 93 | 104 | - | - | - |
| OTO-031 | 144 | 58 | 33 | 34 | 52 | 50 |
Tabella 3: Il ciclo tumorigenico medio (tempo dall'inoculazione a una dimensione tumorale di 1.000 mm3) dei modelli ATC e HNSCC.
Figura supplementare 1: L'efficacia terapeutica del cisplatino nel modello ATC PDX. Variazioni del volume (A) del tumore, del peso del tumore (B) e del peso corporeo (C) dei topi portatori di ATC PDX dopo il trattamento con cisplatino (3 mg/kg). Le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando test T per confrontare il cisplatino con il controllo. *P < 0,05 rispetto al controllo è stato considerato statisticamente significativo. Clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
Questo studio ha stabilito con successo i modelli PDX sottocutanei di ATC e HNSCC. Ci sono molti aspetti a cui prestare attenzione durante il processo di costruzione del modello PDX. Quando il tessuto tumorale viene separato dal paziente, deve essere messo nella ghiacciaia e inviato al laboratorio per l'inoculazione il prima possibile. Dopo che il tumore arriva in laboratorio, l'operatore deve prestare attenzione al mantenimento di un campo sterile e praticare procedure asettiche. Per i campioni di agobiopsia, poiché il tessuto tumorale è particolarmente piccolo, l'inoculazione dopo aver miscelato il campione con il gel della matrice sarebbe più favorevole alla creazione del modello. Il tessuto tumorale primario dovrebbe anche essere preservato, fissato e congelato il più possibile per la ricerca futura. Durante l'inoculazione, l'aria nel trocar deve essere espulsa il più possibile dopo che i pezzi del tumore sono stati inseriti nel trocar prima dell'uso. Dopo l'inoculazione del tumore, la crescita tumorale deve essere osservata nei topi per 1-4 mesi e i topi senza crescita tumorale per più di 6 mesi possono essere eutanizzati29.
I topi immunodeficienti sono generalmente scelti come host per la costruzione del modello PDX29,30. Dalla generazione P0 alla generazione P2, vengono generalmente utilizzati topi immunodeficienti diabetici gravemente compromessi (NOD-SCID) non obesi o NOD Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl / SzJ (NSG). Nella generazione P3 e oltre, i campioni sono considerati stabilmente passati, quindi i topi nudi di solito possono anche servire come ospite e anche i tumori possono crescere normalmente. Inoltre, il tempo totale di operazione, il tempo di isolamento del tumore, la sopravvivenza libera da malattia e il tasso di sopravvivenza globale dei pazienti, il grado maligno del tumore e il sottotipo istologico erano tutti associati alla tumorigenicità del modello PDX31,32,33,34. Il sito di trapianto ha anche un impatto sul tasso di successo della modellazione PDX e gli studi hanno dimostrato che il trapianto di capsula renale e ortotropo ha un alto tasso tumorigenico33,35. Inoltre, l'uso di Matrigel può anche migliorare il tasso tumorigenico36,37. È stato riportato che l'infezione da papillomavirus umano (HPV) influenza il tasso di successo del trapianto nei tumori HNSCC; I tumori HPV-negativi hanno un tasso di assunzione superiore rispetto ai tumori HPV-positivi38,39. Questo studio non ha raggiunto la stessa conclusione, probabilmente a causa del piccolo numero di campioni e delle informazioni incomplete sull'infezione da HPV.
A differenza dei modelli di trapianto ortotopico e della capsula renale, il modello sottocutaneo è più conveniente per osservare la crescita dei tumori ed è anche favorevole all'operazione40,41,42. Sulla base dei dati di crescita tumorale del modello ATC e HNSCC PDX, abbiamo scoperto che i tassi di crescita dei tumori di pazienti diversi erano incoerenti, riflettendo l'eterogeneità intertumorale. Il tasso di crescita tumorale della generazione P0 dalla maggior parte dei modelli PDX era relativamente più lento rispetto agli ultimi passaggi, il che era probabilmente dovuto all'adattamento del microambiente murino. In particolare, il tasso di crescita di alcuni tumori derivati dal paziente è aumentato in diversi passaggi dopo la generazione di P1, coerentemente con l'intervallo di passaggio abbreviato riportato da Pearson et al.43. L'esame istopatologico ha dimostrato che i tumori PDX conservavano le caratteristiche morfologiche dei tumori primitivi. La correlazione tra il modello PDX e i pazienti clinici ATC si è riflessa anche nei risultati dei test farmacodinamici in vivo, che hanno dimostrato che Lenvartinib ha mostrato un buon effetto antitumorale, coerente con i rapporti clinici25,26,27.
Tuttavia, il modello PDX presenta anche alcuni svantaggi. Ad esempio, il tempo di formazione del tumore è relativamente lungo, il che non è adatto per i pazienti con tumori avanzati o aggressivi. Inoltre, il tempo e i costi monetari dello screening farmacologico ad alto rendimento sono troppo elevati44. Infatti, combinando il modello PDX con organoidi tumorali e stabilendo un modello organoide derivato dal paziente (PDO) corrispondente al modello PDX compenserebbe questa carenza44,45,46. I modelli di trapianto ortotopico possono essere utilizzati per studiare la patogenesi e i meccanismi metastatici dei tumori40,41,47. La mancanza di un sistema immunitario funzionale è un altro svantaggio del modello PDX, quindi un numero crescente di esperimenti sta usando topi umanizzati per costruire il modello PDX per la ricerca sull'immunologia tumorale48,49,50.
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Disclosures
Non vengono divulgati potenziali conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal Programma di supporto scientifico e tecnologico della provincia del Sichuan (Grant Nos. 2019JDRC0019 e 2021ZYD0097), il progetto 1.3.5 per le discipline di eccellenza, West China Hospital, Sichuan University (Grant No. ZYJC18026), il progetto 1.3.5 per discipline di eccellenza-Progetto di incubazione della ricerca clinica, West China Hospital, Sichuan University (Grant No. 2020HXFH023), i fondi di ricerca fondamentale per le università centrali (SCU2022D025), il progetto di cooperazione internazionale del Chengdu Science and Technology Bureau (sovvenzione n. 2022-GH02-00023-HZ), il progetto Innovation Spark dell'Università del Sichuan (sovvenzione n. 2019SCUH0015) e il Talent Training Fund for Medical-engineering Integration of West China Hospital - University of Electronic Science and Technology (Grant No. HXDZ22012).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.4 mm x 2.0 mm trocar | Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd | 18-9065 | |
| Balb/c nude mice | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. | 401 | |
| Biosafety cabinet | Suzhou Antai | BSC-1300IIA2 | |
| Blade | Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd | 18-0823 | |
| Centrifuge tube | Corning | 430791/430829 | |
| Cryopreservation tube | Chengdu Dianrui Experimental Instrument Co., Ltd | / | |
| Custodiol HTK-Solution | Custodiol | 2103417 | |
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | SIGMA-ALORICH | D5879-500mL | |
| Electronic balance | METTLER | ME104 | |
| Electronic digital caliper | Chengdu Chengliang Tool Group Co., Ltd | 0-220 | |
| fetal bovine serum(FBS) | VivaCell | C04001-500 | |
| IBM SPSS Statistics 26 | IBM | ||
| Ketamine | Jiangsu Zhongmu Beikang Pharmaceutical Co., Ltd | 100761663 | |
| Lenvatinib | ApexBio | A2174 | |
| NOD-SCID immunodeficient mice | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. | 406 | |
| Pen-Strep Solution | Biological Industries | 03-03101BCS | |
| Petri dish | WHB | WHB-60/WHB-100 | |
| Saline | Sichuan Kelun | W220051705 | |
| Scissor | Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd | 18-0110 | |
| Tweezer | Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd | 18-1241 | |
| Vet ointment | Pfizer Inc. | P10015353 | |
| Xylazine | Dunhua Shengda Animal Medicine Co., Ltd | 070031777 |
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