Summary
Den nåværende protokollen etablerer og karakteriserer en pasientavledet xenograft (PDX) modell av anaplastisk skjoldbruskkarsinom (ATC) og hode og nakke plateepitelkarsinom (HNSCC), da PDX-modeller raskt blir standarden innen translasjonell onkologi.
Abstract
Pasientavledede xenograft (PDX) modeller bevarer trofast de histologiske og genetiske egenskapene til primærtumoren og opprettholder dens heterogenitet. Farmakodynamiske resultater basert på PDX-modeller er sterkt korrelert med klinisk praksis. Anaplastisk skjoldbruskkarsinom (ATC) er den mest ondartede subtypen av skjoldbruskkjertelkreft, med sterk invasivitet, dårlig prognose og begrenset behandling. Selv om forekomsten av ATC står for bare 2% -5% av skjoldbruskkjertelkreft, er dødeligheten så høy som 15% -50%. Hode og nakke plateepitelkarsinom (HNSCC) er en av de vanligste hode og nakke maligniteter, med over 600 000 nye tilfeller over hele verden hvert år. Her presenteres detaljerte protokoller for å etablere PDX-modeller av ATC og HNSCC. I dette arbeidet ble nøkkelfaktorene som påvirker suksessraten for modellkonstruksjon analysert, og de histopatologiske egenskapene ble sammenlignet mellom PDX-modellen og primærtumoren. Videre ble modellens kliniske relevans validert ved å evaluere in vivo terapeutisk effekt av representative klinisk brukte legemidler i de vellykket konstruerte PDX-modellene.
Introduction
PDX-modellen er en dyremodell der humant tumorvev transplanteres til immundefekte mus og vokser i miljøet gitt av musene1. Tradisjonelle tumorcellelinjemodeller lider av flere ulemper, for eksempel mangel på heterogenitet, manglende evne til å beholde tumormikromiljøet, sårbarheten for genetiske variasjoner under gjentatte in vitro-passasjer og den dårlige kliniske anvendelsen 2,3. De viktigste ulempene ved genetisk konstruerte dyremodeller er det potensielle tapet av genomiske egenskaper hos humane svulster, innføring av nye ukjente mutasjoner og vanskeligheten med å identifisere graden av homologi mellom musetumorer og humane svulster4. I tillegg er utarbeidelsen av genmodifiserte dyremodeller kostbar, tidkrevende og relativt ineffektiv4.
PDX-modellen har mange fordeler i forhold til andre tumormodeller når det gjelder å reflektere tumorheterogenitet. Fra histopatologiens perspektiv, selv om musemotparten erstatter den menneskelige stroma over tid, bevarer PDX-modellen den morfologiske strukturen til primærtumorbrønnen. I tillegg bevarer PDX-modellen den metabolomiske identiteten til primærtumoren i minst fire generasjoner og reflekterer bedre de komplekse sammenhengene mellom tumorceller og deres mikromiljø, noe som gjør den unik i å simulere vekst, metastase, angiogenese og immunsuppresjon av humant tumorvev 5,6,7. På cellulært og molekylært nivå reflekterer PDX-modellen nøyaktig inter- og intratumorheterogeniteten til humane svulster, samt fenotypiske og molekylære egenskaper ved opprinnelig kreft, inkludert genuttrykksmønstre, mutasjonsstatus, kopinummer og DNA-metylering og proteomikk 8,9. PDX-modeller med forskjellige passasjer har samme følsomhet for medisinering, noe som indikerer at genuttrykket til PDX-modeller er svært stabilt10,11. Studier har vist en utmerket korrelasjon mellom responsen til PDX-modellen på et legemiddel og de kliniske responsene til pasienter på det stoffet12,13. Derfor har PDX-modellen dukket opp som en kraftig preklinisk og translasjonell forskningsmodell, spesielt for legemiddelscreening og prediksjon av klinisk prognose.
Skjoldbruskkjertelkreft er en vanlig ondartet svulst i det endokrine systemet og er en human malignitet som har vist en rask økning i forekomst de siste årene14. Anaplastisk skjoldbruskkarsinom (ATC) er den mest ondartede skjoldbruskkjertelkreften, med en median pasientoverlevelse på bare 4,8 måneder15. Selv om bare et mindretall av skjoldbruskkjertelkreftpasienter diagnostiseres med ATC hvert år i Kina, er dødeligheten nær 100%16,17,18. ATC vokser vanligvis raskt og invaderer tilstøtende vev i nakken samt livmorhalsk lymfeknuter, og omtrent halvparten av pasientene har fjernmetastaser19,20. Hode og nakke plateepitelkarsinom (HNSCC) er den sjette vanligste kreft i verden og en av de viktigste årsakene til kreft dødsfall, med anslagsvis 600.000 mennesker som lider av HNSCC hvert år21,22,23. HNSCC inkluderer et stort antall svulster, inkludert de i nesen, bihulene, munnen, mandlene, svelget og strupehodet24. ATC og HNSCC er to av de viktigste hode- og nakkemalignitetene. For å legge til rette for utvikling av nye terapeutiske midler og personlige behandlinger, er det nødvendig å utvikle robuste og avanserte prekliniske dyremodeller som PDX-modeller av ATC og HNSCC.
Denne artikkelen introduserer detaljerte metoder for å etablere den subkutane PDX-modellen av ATC og HNSCC, analyserer nøkkelfaktorene som påvirker tumoropptakshastigheten i modellkonstruksjon, og sammenligner de histopatologiske egenskapene mellom PDX-modellen og primærtumoren. I mellomtiden, i dette arbeidet, ble in vivo farmakodynamiske tester utført ved hjelp av de vellykket konstruerte PDX-modellene for å validere deres kliniske relevans.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøkene ble utført i samsvar med Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care retningslinjer og protokoller godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee of West China Hospital, Sichuan University. NOD-SCID immundefekte mus i alderen 4-6 uker gamle (av begge kjønn) og kvinnelige Balb / c nakne mus i alderen 4-6 uker gamle ble brukt til denne studien. Dyrene ble hentet fra en kommersiell kilde (se materialtabell). Den etiske komiteen ved West China Hospital godkjente studien med mennesker (protokollnummer 2020353). Hver pasient ga skriftlig informert samtykke.
1. Eksperimentell forberedelse
- Ordne engangskniver, sterilisert saks og pinsett og andre instrumenter som kreves for tumortransplantasjon, plasser dem på den ultrarene arbeidsbenken og bestråle dem med ultrafiolett lys på forhånd.
- Forbered steril saltvann og petriskåler til bruk under testen.
2. Oppkjøp og transport av ferskt tumorvev
- Hent ferske tumorprøver (vanligvis større enn 5 mm x 5 mm i størrelse) fra operasjonen, og plasser dem i et 15 ml eller 50 ml sentrifugerør som inneholder steril HTK-løsning (se materialfortegnelse) eller saltvann. Merk sentrifugerørene.
MERK: Ferske tumorprøver ble oppnådd ved kirurgisk fjerning eller punktering fra pasienter med ATC eller HNSCC. - Sett sentrifugerørene i en isboks forberedt på forhånd.
MERK: I løpet av denne tiden må transplantasjonsoperatøren forberede de nødvendige elementene for transplantasjon (se materialfortegnelse). - Sørg for at tiden mellom prøvetaking og transport til laboratoriet for PDX-konstruksjon ikke overstiger 2 timer. Under transport, omgi rørene som inneholder vev med en is-vannblanding eller ispakker for å bevare vevsaktiviteten.
3. Tumortransplantasjon
- Når svulstvevet kommer til laboratoriet, registrerer og omnummererer dem.
MERK: For denne studien ble pasientinformasjonen holdt strengt konfidensiell. De resterende trinnene i prosedyren ble utført i et biosikkerhetsnivå 2 (BSL-2) laboratorium. Når du går inn i laboratoriet, anbefales det å bruke en smock over arbeidsklærne eller verneklærne, en lue og en maske. Behandlingen av tumorvev utføres i et biosikkerhetsskap. - Desinfiser sentrifugerørene som inneholder tumorvevet med 75% alkohol, og legg dem på operasjonstabellen. Overfør tumorvevet til 6 cm petriskåler fylt med saltvann ved hjelp av steriliserte oftalmiske tang. Deretter kutter du dem i små biter på ca 2 mm x 2 mm og 3 mm x 3 mm ved hjelp av et blad.
- Overfør bitene av tumorvev til en 6 cm petriskål som inneholder riktig mengde saltvann, pakk fatet med forseglingsfilmen, legg det i en isboks og bær det inn i det spesifikke patogenfrie (SPF) dyrerommet sammen med de nødvendige instrumentene (en saks, tang og inokulasjonsnåler).
- Forbered dyret ved å følge trinnene nedenfor.
- Fjern håret på høyre lateral thorax av 4-6 uker gamle kvinnelige eller mannlige NOD-SCID immundefekte mus, og desinfiser huden med 75% alkohol. Bedøv musene ved en intraperitoneal injeksjon av 80 mg / kg ketamin og 10 mg / kg xylazin (se materialtabellen), og smør øynene med veterinærsalve for å forhindre tørrhet. Bekreft anestesidybden via tap av pedalrefleks.
- Lag et 2 mm snitt med saks gjennom huden midt på høyre laterale thorax av mus.
- Ta et svulststykke fra petriskålen, og legg det i 2,4 mm x 2,0 mm trokarnålen (se materialfortegnelse) med tang.
- Hold musen, stram huden på stikkstedet, bruk trokaren som inneholder tumorbitene for å sette inn svulsten gjennom det første 2 mm hudsnittet, flytt til baksiden av skulderen og skyv trokarkjernen.
- Sørg for at svulststykket skyves ut og blir igjen i overgangssinus dannet av trokarpunkteringen, og trekk deretter ut trokaren.
- Hvis svulsten beveger seg med nålen når den trekkes tilbake, bruk trokaren til å tilbakestille den og sutur snittet.
MERK: I denne studien ble hver mus inokulert ved dorsale for- og baklemmer. En til tre mus ble inokulert per tumorprøve fra hver pasient basert på tumorstørrelsen.
4. Tumorvev bevaring, fiksering og protein frysing
MERK: De resterende tumorvevene ble brukt til henholdsvis frøkonservering, fiksering og DNA / RNA / proteinfrysing.
- Fjern saltvannet fra tumoroverflaten med en steril gasbind før du legger den i kryopreserveringsrøret for å sikre at tumoroverflaten ikke er for våt.
- Sett fire til seks stykker 2 mm x 2 mm tumorvev i et 2 ml cellekryopreserveringsrør, tilsett 1 ml kryopreserveringsløsning bestående av 90% føtalt bovint serum (FBS) og 10% dimetylsulfoksid (DMSO) i røret, sett røret i en gradient kjøleboks, frys den ved -80 ° C over natten, og til slutt, Overfør det til flytende nitrogen.
- Plasser 3 mm x 3 mm tumorvevsblokker i 10% bufret formalin for vevfiksering for patologisk undersøkelse.
- Sett 3 mm x 3 mm vevsblokken inn i et 2 ml cellekryopreserveringsrør, frys det raskt i flytende nitrogen, og overfør det deretter til et kjøleskap på -80 °C for DNA / RNA og proteinekstraksjon.
- Samle den kliniske informasjonen til pasientene, for eksempel røykehistorie, tumorstørrelse, differensiering, patologisk subtype, kreftklasse, kreftstadium, fjernmetastase, opprinnelse, medisinsk historie, immunhistokjemi, infeksjon med humant papillomavirus (HPV) hos HNSCC-pasienter og behandlingsmedisinering.
5. Passasje, kryopreservering og gjenoppliving av PDX-modelltumorer
- Mål lengden og bredden på de subkutane svulstene hos mus ved å bruke vernierkalipere en gang i uken, og beregne tumorvolumet i henhold til formelen: tumorvolum = 0,5 × lengde × bredde2. Tegn tumorvekstkurven.
- Når PDX-svulsten når 2000 mm3, pass den til neste generasjon mus, og utfør tumortransplantasjon. Utfør klargjøringen av instrumentene etter trinn 4.
- Avlive musene ved cervikal dislokasjon etter bedøvelse med 80 mg / kg ketamin.
- Desinfiser huden med 75% alkohol. Deretter kutter du huden rundt svulsten ved hjelp av saks, fjern deretter svulsten med tang, og legg den i en petriskål.
- Utfør tumortransplantasjonsprosedyren etter trinn 3.
- Utfør bevaring og kryopreservering av PDX-modelltumorene etter trinn 4.
- For gjenoppliving av tumorvevet, følg prinsippet om langsom frysing og rask oppløsning. Etter å ha fjernet kryovialene fra flytende nitrogen, legg dem raskt i et vannbad ved 37 °C for rask oppløsning.
- Rist kryovialene forsiktig i vannbadet for å akselerere tineprosessen.
- Tin, overfør tumorbitene til den tilberedte normale saltoppløsningen for vasking, og inokuler deretter neste generasjon mus. For den spesifikke operasjonen, vennligst se vevstransplantasjonsprosedyren i trinn 3.
6. Bestemmelse av terapeutisk effekt av lenvatinib og cisplatin i ATC PDX-modellen
ATC PDX-modellen ble brukt til å teste den terapeutiske effekten av tyrosinkinasehemmeren lenvatinib og det kjemoterapeutiske medikamentet cisplatin25,26,27.
- Velg P5-generasjonens tumorvev av en ATC PDX-modell (THY-017), kutt i 2-4 mm 3 vevsstykker, og inokuler subkutant (trinn3 ) til høyre bak på ti 4-6 ukers kvinnelige Balb / c nakne mus.
- Velg 15 mus med tumorvolum mellom 50-150 mm3, og del dem i tre grupper.
- Administrer lenvatinib (10 mg/kg) intragastralt i én gruppe én gang daglig i 15 dager, administrer cisplatin (3 mg/kg) intraperitonealt i én gruppe hver 3. dag med totalt seks doser, og administrer kontrollgruppen med samme volum normal saltvann.
- Mål kroppsvekten og tumorvolumet til musene to ganger per uke.
- På slutten av testen, avlive musene (trinn 5.3), og veie svulstene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Totalt 18 skjoldbruskkjertelkreftprøver ble transplantert, og fem PDX-modeller av skjoldbruskkjertelkreft ble vellykket konstruert (27,8% tumoropptaksrate), inkludert fire tilfeller av udifferensiert skjoldbruskkreft og ett tilfelle av anaplastisk skjoldbruskkreft. Korrelasjonen mellom suksessraten for modellkonstruksjon og alder, kjønn, tumordiameter, tumorgrad og differensiering ble analysert. Selv om modellens suksessrate for grad 4-tumorprøver var høyere enn for prøver med lavere karakterer, og suksessraten for udifferensierte tumorprøver også var høyere enn for svært differensierte prøver, viste korrelasjonsanalyseresultatene at disse faktorene ikke var assosiert med suksessraten til PDX-modellen (tabell 1). Sytten HNSCC-prøver ble inokulert, og fire PDX-modeller av HNSCCC ble vellykket konstruert. Korrelasjonsanalysen mellom tumorinntaksraten i modellkonstruksjonen og tumorprøvenes kliniske parametere viste at graden av differensiering var assosiert med modellens suksessrate, mens alder, kjønn, røykehistorie, tumordiameter, kreftgrad, metastase og HPV-infeksjon ikke påvirket tumorinntaksraten (tab 2).
Tumorvekstkurvene for hver PDX-modell ble plottet for bedre å forstå vekstratene til PDX-modellene fra forskjellige pasienter (figur 1, figur 2 og tabell 3). De gjennomsnittlige tumorigene syklusene (tid fra inokulasjon til en tumorstørrelse på 1000 mm3) av THY-004 fra generasjon P0 til P5 var henholdsvis 68 dager, 87 dager, 29 dager, 34 dager, 28 dager og 26 dager. De gjennomsnittlige tumorigene syklusene av THY-012 fra generasjon P0 til P5 var henholdsvis 119 dager, 61 dager, 66 dager, 55 dager, 87 dager og 116 dager. De gjennomsnittlige tumorigene syklusene av THY-017 fra generasjon P0 til P5 var henholdsvis 27 dager, 17 dager, 30 dager, 13 dager, 22 dager og 15 dager. De gjennomsnittlige tumorigene syklusene av THY-018 fra generasjon P0 til P3 var henholdsvis 134 dager, 70 dager, 48 dager og 48 dager. De gjennomsnittlige tumorigene syklusene av THY-021 fra generasjon P0 til P3 var henholdsvis 53 dager, 66 dager, 35 dager og 49 dager. Gjennomsnittlig tumorigen syklus av OTO-017 fra generasjon P0 til P4 var henholdsvis 118 dager, 86 dager, 67 dager, 129 dager og 88 dager. Gjennomsnittlig tumorigen syklus av OTO-022 fra generasjon P0 til P5 var henholdsvis 155 dager, 55 dager, 32 dager, 37 dager, 27 dager og 46 dager. Gjennomsnittlig tumorigen syklus av OTO-030 fra generasjon P0 til P2 var henholdsvis 133 dager, 93 dager og 104 dager. Gjennomsnittlig tumorigen syklus av OTO-031 fra generasjon P0 til P5 var henholdsvis 144 dager, 58 dager, 33 dager, 34 dager, 52 dager og 50 dager. ATC-prøvene ble stabilt sendt til P3-generasjonen og senere, mens to tilfeller av HNSCC-prøver ikke klarte å danne svulster etter å ha gått over til P1-generasjonen. Vekstratene for noen prøver var relativt sakte i P0-generasjonen, men vekstratene ble akselerert etter å ha gått over til P1 og senere generasjoner. De histopatologiske egenskapene til pasientsvulstene med de av forskjellige generasjoner av PDX-modeller ble sammenlignet. Resultatene viste at PDX-svulster og pasientavledede primærsvulster var morfologisk nesten like (figur 3), med små forskjeller som kan skyldes heterogeniteten i prøvetakingsområdet mellom pasienter og ulike generasjoner av PDX.
Antitumoreffekten av lenvatinib (en multi-target tyrosinkinasehemmer godkjent for behandling av avansert skjoldbruskkjertelkreft28) ble evaluert i PDX-modellen til ATC. Som vist i figur 4A hemmet lenvatinibbehandling signifikant tumorveksten i ATC PDX-modellen sammenlignet med den normale saltvannskontrollgruppen (P < 0,05). På slutten av forsøket ble tumorvevet skåret ut og veid for å bestemme tumorvekten. Sammenlignet med kontrollgruppen var tumorvekten i lenvatinibbehandlingsgruppen lavere, selv om statistisk forskjell ikke ble oppnådd (figur 4B). I tillegg ble det ikke observert noen åpenbare endringer i generell status og kroppsvekt hos mus behandlet med lenvatinib (figur 4C). På grunn av overdreven frekvens av cisplatinadministrasjon under forsøkene viste musene signifikant toksisitet, manifestert av vekttap og til og med død. Cisplatins antitumoreffekt er vist i tilleggsfigur 1.
Figur 1 Tumorvekstkurve for ATC PDX-modeller fra ulike pasienter. Hver farge representerer den angitte generasjonen, og hver kurve representerer en enkelt svulst. En til tre mus ble inokulert ved passasje 0 (P0) generasjon, og fem mus ble inokulert i de påfølgende passasjene (P1-P5). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Tumorvekstkurve for HNSCC PDX-modellene fra ulike pasienter. Hver farge representerer den angitte generasjonen, og hver kurve representerer en enkelt svulst. En til tre mus ble inokulert ved P0-generasjonen, og fem mus ble inokulert ved P1 og senere generasjoner. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Histopatologisk studie. Histopatologisk sammenligning mellom pasientens primærsvulster og tilsvarende PDX (passasje 1 og passasje 3) av ATC (THY-012, THY-017) og HNSCC (OTO-017) (hematoksylin-eosinfarging, 100x). De patologiske subtypene av THY-012 og THY-017 var anaplastisk tyreoideakarsinom, og den patologiske subtypen av OTO-017 var plateepitelkarsinom. Skalastenger = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Den terapeutiske effekten av lenvatinib i ATC PDX-modellen. Endringer i (A) tumorvolum, (B) tumorvekt og (C) kroppsvekt hos ATC PDX-bærende mus etter behandling med lenvatinib (10 mg/kg). Statistiske analyser ble utført med T-test for å sammenligne levatinib med kontrollgruppen. *P < 0,05 versus kontroll ble ansett å være statistisk signifikant. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Parametere | Klasse | Tumorinntaksfrekvens (%) | P |
| Alder (år) | <60 | 16.67 (1/6) | 0.615 |
| ≥60 | 33.33 (4/12) | ||
| Kjønn | Mannlig | 16.67 (1/6) | 0.615 |
| Kvinnelig | 33.33 (4/12) | ||
| Tumor diameter | <6cm | 37.50 (3/8) | 0.608 |
| ≥6cm | 20.00 (2/10) | ||
| Patologisk TNM-stadium | Jeg | 0.00 (0/1) | 1 |
| Ш | 0.00 (0/1) | ||
 |
31.25 (5/16) | ||
| Differensiering | Høy | 0.00 (0/7) | 0.059 |
| Fattig | 25.00 (1/4) | ||
| Udifferensierte | 57.14 (4/7) |
Tabell 1: Korrelasjon mellom ATC-tumorfrekvensen og pasientenes kliniske karakteristika.
| Parametere | Klasse | Tumorinntaksfrekvens (%) | P |
| HPV | Negativ | 33.33 (2/6) | 1 |
| Ukjent eller positiv | 36.36 (4/11) | ||
| Alder (år) | <60 | 33.33 (3/9) | 1 |
| ≥60 | 37.50 (3/8) | ||
| Kjønn | Mannlig | 50.00 (5/10) | 0.304 |
| Kvinnelig | 14.29 (1/7) | ||
| Røykestatus | Noensinne | 44.44 (4/9) | 0.62 |
| Aldri | 25.00 (2/8) | ||
| Tumor diameter | <3cm | 40.00 (4/10) | 1 |
| ≥3cm | 28.57 (2/7) | ||
| Patologisk TNM-stadium | Jeg | 75.00 (3/4) | 0.423 |
 |
25.00 (2/8) | ||
| Ш | 0.00 (0/1) | ||
|
33.33 (1/3) | ||
| Fjernmetastase | Y | 28.57 (2/7) | 0.633 |
| N | 44.44 (4/9) | ||
| Differensiering | Høy | 12.50 (1/8) | 0.036* |
| Moderat til høy | 100.00 (2/2) | ||
| Moderat | 0.00 (0/2) | ||
| Moderat til fattig | 66.67 (2/3) | ||
| * P < 0,05 |
Tabell 2: Korrelasjon mellom HNSCC-tumorfrekvensen og pasientens kliniske egenskaper. * P < 0,05.
| Eksempel på navn | Generasjon P til P0 | generasjon P0 til P1 | generasjon P1 til P2 | generasjon P2 til P3 | generasjon P3 til P4 | generasjon P4 til P5 |
| THY-004 | 68 | 87 | 29 | 34 | 28 | 26 |
| THY-012 | 119 | 61 | 66 | 55 | 87 | 116 |
| THY-017 | 27 | 17 | 30 | 13 | 22 | 15 |
| THY-018 | 134 | 70 | 48 | 48 | - | - |
| THY-021 | 53 | 66 | 35 | 49 | - | - |
| OTO-017 | 118 | 86 | 67 | 129 | - | - |
| OTO-022 | 155 | 55 | 32 | 37 | 27 | 46 |
| OTO-030 | 133 | 93 | 104 | - | - | - |
| OTO-031 | 144 | 58 | 33 | 34 | 52 | 50 |
Tabell 3: Den gjennomsnittlige tumorigene syklusen (tid fra inokulasjon til en tumorstørrelse på 1000 mm3) av ATC- og HNSCC-modellene.
Tilleggsfigur 1: Den terapeutiske effekten av cisplatin i ATC PDX-modellen. Endringer i (A) tumorvolum, (B) tumorvekt og (C) kroppsvekt hos ATC PDX-bærende mus etter behandling med cisplatin (3 mg/kg). Statistiske analyser ble utført med T-test for å sammenlikne cisplatin med kontrollgruppen. *P < 0,05 versus kontroll ble ansett å være statistisk signifikant. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne studien har vellykket etablert de subkutane PDX-modellene til ATC og HNSCC. Det er mange aspekter å være oppmerksom på under prosessen med PDX-modellkonstruksjon. Når tumorvevet skilles fra pasienten, skal det legges inn i isboksen og sendes til laboratoriet for inokulering så snart som mulig. Etter at svulsten kommer til laboratoriet, må operatøren være oppmerksom på å opprettholde et sterilt felt og praktisere aseptiske prosedyrer. For nålbiopsiprøver, fordi tumorvevet er spesielt lite, vil inokulering etter blanding av prøven med matriksgelen være mer gunstig for å etablere modellen. Det primære tumorvevet bør også bevares, fikseres og fryses så mye som mulig for fremtidig forskning. Under inokulering må luften i trokaren utvises så mye som mulig etter at svulstbitene er satt inn i trokaren før bruk. Etter tumorinokulering bør tumorveksten observeres hos mus i 1-4 måneder, og mus uten tumorvekst i mer enn 6 måneder kan avlives29.
Immundefekte mus velges vanligvis som vert for PDX-modellkonstruksjon29,30. Fra P0-generasjonen til P2-generasjonen brukes vanligvis ikke-overvektige diabetikere-alvorlig kompromitterte immundefekte (NOD-SCID) mus eller NOD Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl / SzJ (NSG) mus. I P3-generasjonen og utover anses prøvene å være stabilt bestått, så nakne mus kan vanligvis også tjene som vert, og svulster kan også vokse normalt. I tillegg var total operasjonstid, tumorisolasjonstid, sykdomsfri overlevelse og total overlevelse hos pasientene, tumor ondartet grad og histologisk subtype alle assosiert med PDX-modelltumorgenisitet31,32,33,34. Transplantasjonsstedet har også innvirkning på suksessraten for PDX-modellering, og studier har vist at nyrekapsel og ortotrop transplantasjon har en høy tumorigen hastighet33,35. I tillegg kan bruk av Matrigel også forbedre tumorigenhastigheten36,37. Det har blitt rapportert at infeksjon med humant papillomavirus (HPV) påvirker suksessraten for transplantasjon i HNSCC-svulster; HPV-negative svulster har en overlegen opptaksrate sammenlignet med HPV-positive svulster38,39. Denne studien kom ikke til samme konklusjon, sannsynligvis på grunn av små utvalgstall og ufullstendig informasjon om HPV-infeksjon.
Forskjellig fra ortotopiske og nyrekapseltransplantasjonsmodeller, er den subkutane modellen mer praktisk for å observere veksten av svulster og bidrar også til operasjon40,41,42. Basert på tumorvekstdataene til ATC og HNSCC PDX-modellen, fant vi at vekstratene for svulster fra forskjellige pasienter var inkonsekvente, noe som gjenspeiler intertumorheterogenitet. Tumorveksthastigheten til P0-generasjonen fra de fleste PDX-modeller var relativt langsommere enn for de sistnevnte passasjene, noe som sannsynligvis skyldtes tilpasningen av musemikromiljøet. Spesielt økte vekstraten fra noen pasientavledede svulster i forskjellige passasjer etter P1-generasjonen, i samsvar med det forkortede passasjeintervallet rapportert av Pearson et al.43. Histopatologisk undersøkelse viste at PDX-svulstene beholdt de morfologiske egenskapene til primærsvulstene. Korrelasjonen mellom PDX-modellen og de kliniske ATC-pasientene ble også reflektert i resultatene fra in vivo farmakodynamiske tester, som viste at lenvartinib viste en god antitumoreffekt, i samsvar med kliniske rapporter25,26,27.
PDX-modellen har imidlertid også visse ulemper. For eksempel er tumordannelsestiden relativt lang, noe som er uegnet for pasienter med avanserte eller aggressive svulster. I tillegg er tiden og de monetære kostnadene ved narkotikascreening med høy gjennomstrømning for høye44. Faktisk vil kombinasjon av PDX-modellen med tumororganoider og etablering av en pasientavledet organoid (PUD) modell tilsvarende PDX-modellen kompensere for denne mangelen44,45,46. Ortotopiske transplantasjonsmodeller kan brukes til å studere patogenesen og metastatiske mekanismer av svulster40,41,47. Mangelen på et funksjonelt immunsystem er en annen ulempe ved PDX-modellen, så økende antall eksperimenter bruker humaniserte mus til å konstruere PDX-modellen for tumorimmunologiforskning48,49,50.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen potensielle interessekonflikter avsløres.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Sichuan Province Science and Technology Support Program (Grant Nos. 2019JDRC0019 og 2021ZYD0097), 1.3.5-prosjektet for disipliner av fortreffelighet, West China Hospital, Sichuan University (Grant nr. ZYJC18026), 1.3.5-prosjektet for disipliner av fortreffelighet-Clinical Research Incubation Project, West China Hospital, Sichuan University (Grant No. 2020HXFH023), Fundamental Research Funds for the Central Universities (SCU2022D025), det internasjonale samarbeidsprosjektet til Chengdu Science and Technology Bureau (Grant No. 2022-GH02-00023-HZ), Innovation Spark Project of Sichuan University (Grant No. 2019SCUH0015), og Talent Training Fund for Medical-engineering Integration of West China Hospital - University of Electronic Science and Technology (Grant No. HXDZ22012).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.4 mm x 2.0 mm trocar | Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd | 18-9065 | |
| Balb/c nude mice | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. | 401 | |
| Biosafety cabinet | Suzhou Antai | BSC-1300IIA2 | |
| Blade | Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd | 18-0823 | |
| Centrifuge tube | Corning | 430791/430829 | |
| Cryopreservation tube | Chengdu Dianrui Experimental Instrument Co., Ltd | / | |
| Custodiol HTK-Solution | Custodiol | 2103417 | |
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | SIGMA-ALORICH | D5879-500mL | |
| Electronic balance | METTLER | ME104 | |
| Electronic digital caliper | Chengdu Chengliang Tool Group Co., Ltd | 0-220 | |
| fetal bovine serum(FBS) | VivaCell | C04001-500 | |
| IBM SPSS Statistics 26 | IBM | ||
| Ketamine | Jiangsu Zhongmu Beikang Pharmaceutical Co., Ltd | 100761663 | |
| Lenvatinib | ApexBio | A2174 | |
| NOD-SCID immunodeficient mice | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. | 406 | |
| Pen-Strep Solution | Biological Industries | 03-03101BCS | |
| Petri dish | WHB | WHB-60/WHB-100 | |
| Saline | Sichuan Kelun | W220051705 | |
| Scissor | Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd | 18-0110 | |
| Tweezer | Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd | 18-1241 | |
| Vet ointment | Pfizer Inc. | P10015353 | |
| Xylazine | Dunhua Shengda Animal Medicine Co., Ltd | 070031777 |
References
- Toolan, H. W. Successful subcutaneous growth and transplantation of human tumors in X-irradiated laboratory animals. Proceedings of The Society for Experimental Biology and Medicine. 77 (3), 572-578 (1951).
- Gillet, J. P., et al. Redefining the relevance of established cancer cell lines to the study of mechanisms of clinical anti-cancer drug resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (46), 18708-18713 (2011).
- Hausser, H. J., Brenner, R. E. Phenotypic instability of Saos-2 cells in long-term culture. Biochemical & Biophysical Research Communications. 333 (1), 216-222 (2005).
- Pérez-Mancera, P., Guerra, C., Barbacid, M., Tuvesonet, D. A. What we have learned about pancreatic cancer from mouse models. Gastroenterology. 142 (5), 1079-1092 (2012).
- Bruna, A., et al. A biobank of breast cancer explants with preserved intra-tumor heterogeneity to screen anticancer compounds. Cell. 167 (1), 260-274 (2016).
- Choi, S., et al. Lessons from patient-derived xenografts for better in vitro modeling of human cancer. Advanced Drug Delivery Reviews. 79-80, 222-237 (2014).
- Blomme, A., et al. Murine stroma adopts a human-like metabolic phenotype in the PDX model of colorectal cancer and liver metastases. Oncogene. 37 (9), 1237-1250 (2018).
- Wang, D., et al. Molecular heterogeneity of non-small cell lung carcinoma patient-derived xenografts closely reflect their primary tumors. International Journal of Cancer. 140 (3), 662-673 (2016).
- Jung, J., et al. Generation and molecular characterization of pancreatic cancer patient-derived xenografts reveals their heterologous nature. Oncotarget. 7 (38), 62533-62546 (2016).
- Keysar, S., et al. A patient tumor transplant model of squamous cell cancer identifies PI3K inhibitors as candidate therapeutics in defined molecular bins. Molecular Oncology. 7 (4), 776-790 (2013).
- Rubio-Viqueira, B., et al. An in vivo platform for translational drug development in pancreatic cancer. Clinical Cancer Research. 12 (15), 4652-4661 (2006).
- Fiebig, H. H., et al. Development of three human small cell lung cancer models in nude mice. Recent Results in Cancer Research. 97, 77-86 (1985).
- Morelli, M. P., et al. Prioritizing phase I treatment options through preclinical testing on personalized tumorgraft. Journal of Clinical Oncology. 30 (4), 45-48 (2012).
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA. 68 (6), 394-424 (2018).
- Onoda, N., et al. Evaluation of the 8th edition TNM classification for anaplastic thyroid carcinoma. Cancers. 12 (3), 552 (2020).
- Nel, C., et al. Anaplastic carcinoma of the thyroid: A clinicopathologic study of 82 cases. Mayo Clinic Proceedings. 60 (1), 51-58 (1985).
- Mazzaferri, E. L. Increasing incidence of thyroid cancer in the United States, 1973-2002. Yearbook of Medicine. 2007, 496-499 (2007).
- Kebebew, E., Greenspan, F. S., Clark, O. H., Woeber, K. A., Mcmillan, A. Anaplastic thyroid carcinoma. Treatment outcome and prognostic factors. Cancer. 103 (7), 1330-1335 (2005).
- Lin, B., et al. The incidence and survival analysis for anaplastic thyroid cancer: A SEER database analysis. American Journal of Translational Research. 11 (9), 5888-5896 (2019).
- Maniakas, A., Dadu, R., Busaidy, N. L., Wang, J. R., Zafereo, M. Evaluation of overall survival in patients with anaplastic thyroid carcinoma, 2000-2019. JAMA Oncology. 6 (9), 1397-1404 (2020).
- Gilardi, M., et al. Tipifarnib as a precision therapy for HRAS-mutant head and neck squamous cell carcinomas. Molecular Cancer Therapeutics. 19 (9), 1784-1796 (2020).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Chow, L. Q. M.
- Swiecicki, P. L., Brennan, J. R., Mierzwa, M., Spector, M. E., Brenner, J. C. Head and neck squamous cell carcinoma detection and surveillance: Advances of liquid biomarkers. Laryngoscope. 129 (8), 1836-1843 (2019).
- Wang, R., et al. Distribution and activity of lenvatinib in brain tumor models of human anaplastic thyroid cancer cells in severe combined immune deficient mice. Molecular Cancer Therapeutics. 18 (5), 947-956 (2019).
- Takahashi, S., et al. A phase II study of the safety and efficacy of lenvatinib in patients with advanced thyroid cancer. Future Oncology. 15 (7), 717-726 (2019).
- Ferrari, S. M., et al. Lenvatinib exhibits antineoplastic activity in anaplastic thyroid cancer in vitro and in vivo. Oncology Reports. 39 (5), 2225-2234 (2018).
- Cabanillas, M. E., Habra, M. A. Lenvatinib: Role in thyroid cancer and other solid tumors. Cancer Treatment Reviews. 42, 47-55 (2016).
- Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. The generation and application of patient-derived xenograft model for cancer research. Cancer Research and Treatment. 50 (1), 1-10 (2018).
- Peng, S., et al. Tumor grafts derived from patients with head and neck squamous carcinoma authentically maintain the molecular and histologic characteristics of human cancers. Journal of Translational Medicine. 11, 198 (2013).
- Derose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17 (11), 1514-1520 (2011).
- Chen, X., Shen, C., Wei, Z., Zhang, R., Xiao, K. Patient-derived non-small cell lung cancer xenograft mirrors complex tumor heterogeneity. Cancer Biology and Medicine. 18 (1), 184-198 (2021).
- Choi, Y. Y., et al. Establishment and characterisation of patient-derived xenografts as paraclinical models for gastric cancer. Scientific Reports. 6, 22172 (2016).
- Maider, I. V., Andrés, C., Alberto, B. Preclinical models for precision oncology. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer. 1872 (2), 239-246 (2018).
- Okada, S., Vaeteewoottacharn, K., Kariya, R. Establishment of a patient-derived tumor xenograft model and application for precision cancer medicine. Chemical & Pharmaceutical Bulletin. 66 (3), 225-230 (2018).
- Michael, G., et al. Tumor take rate optimization for colorectal carcinoma patient-derived xenograft models. BioMed Research International. 2016, 1715053 (2016).
- Bernardo, C., Costa, C., Sousa, N., Amado, F., Santos, L. Patient-derived bladder cancer xenografts: a systematic review. Translational Research. 166 (4), 324-331 (2015).
- Facompre, N. D., et al. Barriers to generating PDX models of HPV-related head and neck. Laryngoscope. 127 (12), 2777-2783 (2017).
- Kang, H. N., Kim, J. H., Park, A. Y., Choi, J. W., Kim, H. R. Establishment and characterization of patient-derived xenografts as paraclinical models for head and neck cancer. BMC Cancer. 20 (1), 316 (2020).
- Ahn, S. H., et al. An orthotopic model of papillary thyroid carcinoma in athymic nude mice. Archives of Otolaryngology-Head & Neck Surgery. 134 (2), 190-197 (2008).
- Nucera, C., et al. A novel orthotopic mouse model of human anaplastic thyroid carcinoma. Thyroid. 19 (10), 1077-1084 (2009).
- De Rose, F., et al. Galectin-3 targeting in thyroid orthotopic tumors opens new ways to characterize thyroid cancer. Journal of Nuclear Medicine. 60 (6), 770-776 (2019).
- Pearson, A. T., et al. Patient-derived xenograft (PDX) tumors increase growth rate with time. Oncotarget. 7 (7), 7993-8005 (2016).
- Huo, K. G., D'Arcangelo, E., Tsao, M. S. Patient-derived cell line, xenograft and organoid models in lung cancer therapy. Translational Lung Cancer Research. 9 (5), 2214-2232 (2020).
- Kumari, R., Xu, X., Li, H. Q. Translational and clinical relevance of PDX-derived organoid models in oncology drug discovery and development. Current Protocols. 2 (7), e431 (2022).
- Takahashi, N., et al. Construction of in vitro patient-derived tumor models to evaluate anticancer agents and cancer immunotherapy. Oncology Letters. 21 (5), 406 (2021).
- Barasch, A., et al. Photobiomodulation effects on head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) in an orthotopic animal model. Supportive Care in Cancer. 28 (6), 2721-2727 (2020).
- Wang, M., et al. Humanized mice in studying efficacy and mechanisms of PD-1-targeted cancer immunotherapy. FASEB Journal. 32 (3), 1537-1549 (2018).
- Wu, C., Wang, X., Shang, H., Wei, H. Construction of a humanized PBMC-PDX model to study the efficacy of a bacterial marker in lung cancer immunotherapy. Disease Markers. 2022, 1479246 (2022).
- Yao, L. C., et al. Creation of PDX-bearing humanized mice to study immuno-oncology. Methods in Molecular Biology. 1953, 241-252 (2019).
