Summary
Het huidige protocol stelt een patiënt-afgeleid xenograft (PDX) model van anaplastisch schildkliercarcinoom (ATC) en hoofd en nek plaveiselcelcarcinoom (HNSCC) vast en karakteriseert het, aangezien PDX-modellen snel de standaard worden op het gebied van translationele oncologie.
Abstract
Patiënt-afgeleide xenograft (PDX) modellen behouden getrouw de histologische en genetische kenmerken van de primaire tumor en behouden de heterogeniteit ervan. Farmacodynamische resultaten op basis van PDX-modellen zijn sterk gecorreleerd met de klinische praktijk. Anaplastisch schildkliercarcinoom (ATC) is het meest kwaadaardige subtype van schildklierkanker, met sterke invasiviteit, slechte prognose en beperkte behandeling. Hoewel de incidentie van ATC slechts 2% -5% van de schildklierkanker vertegenwoordigt, is het sterftecijfer zo hoog als 15% -50%. Hoofd-hals plaveiselcelcarcinoom (HNSCC) is een van de meest voorkomende hoofd-halsmaligniteiten, met meer dan 600.000 nieuwe gevallen wereldwijd per jaar. Hierin worden gedetailleerde protocollen gepresenteerd om PDX-modellen van ATC en HNSCC vast te stellen. In dit werk werden de belangrijkste factoren die van invloed zijn op het succespercentage van modelconstructie geanalyseerd en werden de histopathologische kenmerken vergeleken tussen het PDX-model en de primaire tumor. Bovendien werd de klinische relevantie van het model gevalideerd door de in vivo therapeutische werkzaamheid van representatieve klinisch gebruikte geneesmiddelen in de succesvol geconstrueerde PDX-modellen te evalueren.
Introduction
Het PDX-model is een diermodel waarin menselijk tumorweefsel wordt getransplanteerd in immunodeficiënte muizen en groeit in de omgeving die door de muizen wordt geleverd1. Traditionele tumorcellijnmodellen lijden aan verschillende nadelen, zoals het gebrek aan heterogeniteit, het onvermogen om de micro-omgeving van de tumor te behouden, de kwetsbaarheid voor genetische variaties tijdens herhaalde in vitro passages en de slechte klinische toepassing 2,3. De belangrijkste nadelen van genetisch gemanipuleerde diermodellen zijn het potentiële verlies van de genomische kenmerken van menselijke tumoren, de introductie van nieuwe onbekende mutaties en de moeilijkheid om de mate van homologie tussen muistumoren en menselijke tumoren te identificeren4. Bovendien is de voorbereiding van genetisch gemanipuleerde diermodellen duur, tijdrovend en relatief inefficiënt4.
Het PDX-model heeft veel voordelen ten opzichte van andere tumormodellen in termen van het weerspiegelen van tumorheterogeniteit. Vanuit het perspectief van histopathologie, hoewel de tegenhanger van de muis het menselijke stroma in de loop van de tijd vervangt, behoudt het PDX-model de morfologische structuur van de primaire tumor goed. Bovendien behoudt het PDX-model de metabolomische identiteit van de primaire tumor gedurende ten minste vier generaties en weerspiegelt het beter de complexe onderlinge relaties tussen tumorcellen en hun micro-omgeving, waardoor het uniek is in het simuleren van de groei, metastase, angiogenese en immunosuppressie van menselijk tumorweefsel 5,6,7. Op cellulair en moleculair niveau weerspiegelt het PDX-model nauwkeurig de inter- en intratumor heterogeniteit van menselijke tumoren, evenals de fenotypische en moleculaire kenmerken van oorspronkelijke kanker, waaronder genexpressiepatronen, mutatiestatus, kopienummer en DNA-methylatie en proteomics 8,9. PDX-modellen met verschillende passages hebben dezelfde gevoeligheid voor medicamenteuze therapie, wat aangeeft dat de genexpressie van PDX-modellen zeer stabiel is10,11. Studies hebben een uitstekende correlatie aangetoond tussen de respons van het PDX-model op een geneesmiddel en de klinische reacties van patiënten op dat geneesmiddel12,13. Daarom is het PDX-model naar voren gekomen als een krachtig preklinisch en translationeel onderzoeksmodel, met name voor geneesmiddelenscreening en klinische prognosevoorspelling.
Schildklierkanker is een veel voorkomende kwaadaardige tumor van het endocriene systeem en is een menselijke maligniteit die de afgelopen jaren een snelle toename van de incidentie heeft laten zien14. Anaplastisch schildkliercarcinoom (ATC) is de meest kwaadaardige schildklierkanker, met een mediane overleving van de patiënt van slechts 4,8 maanden15. Hoewel slechts een minderheid van de schildklierkankerpatiënten elk jaar in China met ATC wordt gediagnosticeerd, is het sterftecijfer bijna 100% 16,17,18. ATC groeit meestal snel en dringt de aangrenzende weefsels van de nek en de cervicale lymfeklieren binnen, en ongeveer de helft van de patiënten heeft metastasen op afstand 19,20. Hoofd-hals plaveiselcelcarcinoom (HNSCC) is de zesde meest voorkomende kanker ter wereld en een van de belangrijkste oorzaken van sterfgevallen door kanker, met naar schatting 600.000 mensen die lijden aan HNSCC per jaar21,22,23. HNSCC omvat een groot aantal tumoren, waaronder die in de neus, sinussen, mond, amandelen, keelholte en strottenhoofd24. ATC en HNSCC zijn twee van de belangrijkste hoofd-halsmaligniteiten. Om de ontwikkeling van nieuwe therapeutische middelen en gepersonaliseerde behandelingen te vergemakkelijken, is het noodzakelijk om robuuste en geavanceerde preklinische diermodellen te ontwikkelen, zoals PDX-modellen van ATC en HNSCC.
Dit artikel introduceert gedetailleerde methoden voor het vaststellen van het subcutane PDX-model van ATC en HNSCC, analyseert de belangrijkste factoren die van invloed zijn op de tumoropnamesnelheid in modelconstructie en vergelijkt de histopathologische kenmerken tussen het PDX-model en de primaire tumor. Ondertussen werden in dit werk in vivo farmacodynamische tests uitgevoerd met behulp van de met succes geconstrueerde PDX-modellen om hun klinische relevantie te valideren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en protocollen van de Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care, goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van het West China Hospital, Sichuan University. NOD-SCID immunodeficiënte muizen van 4-6 weken oud (van beide geslachten) en vrouwelijke Balb/c naakte muizen van 4-6 weken oud werden gebruikt voor deze studie. De dieren werden verkregen uit een commerciële bron (zie tabel met materialen). De ethische commissie van het West China Hospital gaf toestemming voor de studie met menselijke proefpersonen (protocolnummer 2020353). Elke patiënt gaf schriftelijke geïnformeerde toestemming.
1. Experimentele voorbereiding
- Schik wegwerpmesjes, gesteriliseerde scharen en pincetten en andere instrumenten die nodig zijn voor tumortransplantatie, plaats ze op de ultraschone werkbank en bestraal ze van tevoren met ultraviolet licht.
- Bereid steriele zoutoplossing en petrisalen voor gebruik tijdens de test.
2. Verwerving en transport van vers tumorweefsel
- Verkrijg verse tumormonsters (meestal groter dan 5 mm x 5 mm) uit de operatiekamer en plaats ze in een centrifugebuis van 15 ml of 50 ml met steriele HTK-oplossing (zie materiaaltabel) of zoutoplossing. Label de centrifugebuizen.
OPMERKING: Nieuwe tumormonsters werden verkregen door chirurgische verwijdering of punctie van patiënten met ATC of HNSCC. - Doe de centrifugebuizen in een vooraf voorbereide ijskist.
OPMERKING: Gedurende deze tijd moet de transplantatieoperator de benodigde items voorbereiden voor transplantatie (zie tabel met materialen). - Zorg ervoor dat de tijd tussen het verzamelen van monsters en het transport naar het laboratorium voor PDX-constructie niet langer is dan 2 uur. Omring tijdens het transport de buizen met de weefsels met een ijs-watermengsel of ijspakketten om de weefselactiviteit te behouden.
3. Tumortransplantatie
- Zodra de tumorweefsels in het laboratorium aankomen, registreer en hernummer ze.
OPMERKING: Voor de huidige studie werd de patiëntinformatie strikt vertrouwelijk behandeld. De resterende stappen van de procedure werden uitgevoerd in een bioveiligheidsniveau 2 (BSL-2) laboratorium. Bij het betreden van het laboratorium wordt het dragen van een sok over de werkkleding of beschermende kleding, een hoed en een masker aanbevolen. De behandeling van tumorweefsel wordt uitgevoerd in een bioveiligheidskast. - Desinfecteer de centrifugebuizen met de tumorweefsels met 75% alcohol en plaats ze op de operatietafel. Breng de tumorweefsels over naar 6 cm petrischalen gevuld met zoutoplossing met behulp van een gesteriliseerde oogheelkundige tang. Snijd ze vervolgens in kleine stukjes van ongeveer 2 mm x 2 mm en 3 mm x 3 mm met behulp van een mes.
- Breng de stukjes tumorweefsel over in een petrischaal van 6 cm met de juiste hoeveelheid zoutoplossing, wikkel de schaal in met de afsluitfolie, plaats deze in een ijskist en breng deze samen met de benodigde instrumenten (een schaar, tang en inentnaalden) naar de specifieke pathogeenvrije (SPF) dierenkamer.
- Bereid het dier voor volgens de onderstaande stappen.
- Verwijder het haar op de rechter laterale thorax van 4-6 weken oude vrouwelijke of mannelijke NOD-SCID immunodeficiënte muizen en desinfecteer de huid met 75% alcohol. Verdoof de muizen door een intraperitoneale injectie van 80 mg/kg ketamine en 10 mg/kg xylazine (zie tabel met materialen) en smeer hun ogen in met veterinaire zalf om uitdroging te voorkomen. Bevestig de anesthesiediepte via verlies van pedaalreflex.
- Maak een incisie van 2 mm met een schaar door de huid in het midden van de rechter laterale thorax van muizen.
- Neem een tumorstukje uit de petrischaal en plaats het met een tang in de 2,4 mm x 2,0 mm trocarnaald (zie materiaaltabel).
- Houd de muis vast, span de huid aan op de prikplaats, gebruik de trocar met de tumorstukken om de tumor door de initiële 2 mm huidincisie in te brengen, ga naar de achterkant van de schouder en duw de trocarkern.
- Zorg ervoor dat het tumorstuk naar buiten wordt geduwd en achterblijft in de overgangssinus gevormd door de trocarpunctie en trek vervolgens de trocar eruit.
- Als de tumor met de naald meebeweegt wanneer deze wordt teruggetrokken, gebruik dan de trocar om deze te resetten en de incisie te hechten.
OPMERKING: In deze studie werd elke muis ingeënt op de dorsale voor- en achterpoten. Van elke patiënt werden één tot drie muizen per tumormonster ingeënt op basis van de tumorgrootte.
4. Behoud van tumorweefsel, fixatie en eiwitbevriezing
OPMERKING: De resterende tumorweefsels werden respectievelijk gebruikt voor zaadbehoud, fixatie en DNA / RNA / eiwitbevriezing.
- Verwijder de zoutoplossing van het tumoroppervlak met een steriel gaasje voordat u het in de cryopreservatiebuis plaatst om ervoor te zorgen dat het tumoroppervlak niet te nat is.
- Doe vier tot zes stukjes tumorweefsel van 2 mm x 2 mm in een cryopreservatiebuis van 2 ml, voeg 1 ml cryopreservatieoplossing bestaande uit 90% foetaal runderserum (FBS) en 10% dimethylsulfoxide (DMSO) toe aan de buis, plaats de buis in een gradiëntkoelbox, vries deze 's nachts in bij −80 °C en ten slotte, Breng het over op vloeibare stikstof.
- Plaats de tumorweefselblokken van 3 mm x 3 mm in 10% gebufferde formaline voor weefselfixatie voor pathologisch onderzoek.
- Doe het weefselblok van 3 mm x 3 mm in een cryopreservatiebuis van 2 ml, vries het snel in vloeibare stikstof in en breng het vervolgens over naar een koelkast van −80 °C voor DNA / RNA en eiwitextractie.
- Verzamel de klinische informatie van de patiënten, zoals de rookgeschiedenis, tumorgrootte, differentiatie, pathologisch subtype, kankergraad, kankerstadium, metastase op afstand, oorsprong, medische geschiedenis, immunohistochemie, humaan papillomavirus (HPV) infectie bij HNSCC-patiënten en behandelingsmedicatie.
5. Passaging, cryopreservatie en reanimatie van PDX-modeltumoren
- Meet de lengte en breedte van de onderhuidse tumoren bij muizen door eenmaal per week vernier-remklauwen te gebruiken en bereken het tumorvolume volgens de formule: tumorvolume = 0,5 × lengte × breedte2. Teken de tumorgroeicurve.
- Wanneer de PDX-tumor 2.000 mm3 bereikt, passeert u deze naar de volgende generatie muizen en voert u tumorhertransplantatie uit. Voer de voorbereiding van de instrumenten uit volgens stap 4.
- Euthanaseer de muizen door cervicale dislocatie na verdoving met 80 mg/kg ketamine.
- Desinfecteer de huid met 75% alcohol. Knip vervolgens de huid rond de tumor met een schaar, verwijder vervolgens de tumor met een tang en plaats deze in een petrischaal.
- Voer de tumortransplantatieprocedure uit volgens stap 3.
- Voer de conservering en cryopreservatie van de PDX-modeltumoren uit na stap 4.
- Volg voor de reanimatie van het tumorweefsel het principe van langzaam bevriezen en snel oplossen. Nadat u de cryovialen uit vloeibare stikstof hebt gehaald, plaatst u ze snel in een waterbad bij 37 °C voor een snelle oplossing.
- Schud de cryovialen voorzichtig in het waterbad om het ontdooiproces te versnellen.
- Ontdooi, breng de tumorstukken over naar de voorbereide normale zoutoplossing om te wassen en ent vervolgens de volgende generatie muizen. Zie voor de specifieke operatie de weefseltransplantatieprocedure in stap 3.
6. Bepaling van de therapeutische werkzaamheid van lenvatinib en cisplatine in het ATC PDX-model
OPMERKING: Het ATC PDX-model werd gebruikt om het therapeutische effect van de tyrosinekinaseremmer lenvatinib en het chemotherapeutische geneesmiddel cisplatine25,26,27 te testen.
- Selecteer het P5-generatie tumorweefsel van een ATC PDX-model (THY-017), snijd in2-4 mm 3 weefselstukken en ent subcutaan (stap 3) naar de rechterrug van tien 4-6 weken vrouwelijke Balb / c naaktmuizen.
- Selecteer 15 muizen met tumorvolumes tussen 50-150 mm3 en verdeel ze in drie groepen.
- Dien lenvatinib (10 mg/kg) intragastrisch toe aan één groep eenmaal daags gedurende 15 dagen, dien cisplatine (3 mg/kg) intraperitoneaal toe aan één groep om de 3 dagen voor een totaal van zes doses en dien de controlegroep toe met hetzelfde volume normale zoutoplossing.
- Meet het lichaamsgewicht en het tumorvolume van de muizen twee keer per week.
- Aan het einde van de test euthanaseert u de muizen (stap 5.3) en weegt u de tumoren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een totaal van 18 schildklierkanker specimens werden getransplanteerd, en vijf PDX-modellen van schildklierkanker werden met succes geconstrueerd (27,8% tumor take rate), waaronder vier gevallen van ongedifferentieerde schildklierkanker en één geval van anaplastische schildklierkanker. De correlatie tussen het succespercentage van modelconstructie en de leeftijd, geslacht, tumordiameter, tumorgraad en differentiatie werden geanalyseerd. Hoewel het succespercentage van graad 4 tumormonsters hoger was dan voor monsters met lagere graden, en het succespercentage van ongedifferentieerde tumormonsters ook hoger was dan dat van sterk gedifferentieerde monsters, toonden de correlatieanalyseresultaten aan dat deze factoren niet geassocieerd waren met het succespercentage van het PDX-model (tabel 1). Zeventien HNSCC-monsters werden ingeënt en vier PDX-modellen van HNSCCC werden met succes geconstrueerd. De correlatieanalyse tussen de tumoropnamesnelheid in de modelconstructie en de klinische parameters van de tumormonsters toonde aan dat de mate van differentiatie geassocieerd was met het succespercentage van het model, terwijl leeftijd, geslacht, rookgeschiedenis, tumordiameter, kankergraad, metastase en HPV-infectie geen invloed hadden op de tumoropnamesnelheid (tabel 2).
De tumorgroeicurven voor elk PDX-model werden uitgezet om de groeisnelheden van de PDX-modellen van verschillende patiënten beter te begrijpen (figuur 1, figuur 2 en tabel 3). De gemiddelde tumorogene cycli (tijd vanaf inenting tot een tumorgrootte van 1.000 mm3) van THY-004 van generaties P0 tot P5 waren respectievelijk 68 dagen, 87 dagen, 29 dagen, 34 dagen, 28 dagen en 26 dagen. De gemiddelde tumorogene cycli van THY-012 van generaties P0 tot P5 waren respectievelijk 119 dagen, 61 dagen, 66 dagen, 55 dagen, 87 dagen en 116 dagen. De gemiddelde tumorogene cycli van THY-017 van generaties P0 tot P5 waren respectievelijk 27 dagen, 17 dagen, 30 dagen, 13 dagen, 22 dagen en 15 dagen. De gemiddelde tumorogene cycli van THY-018 van generaties P0 tot P3 waren respectievelijk 134 dagen, 70 dagen, 48 dagen en 48 dagen. De gemiddelde tumorogene cycli van THY-021 van generaties P0 tot P3 waren respectievelijk 53 dagen, 66 dagen, 35 dagen en 49 dagen. De gemiddelde tumorogene cycli van OTO-017 van generaties P0 tot P4 waren respectievelijk 118 dagen, 86 dagen, 67 dagen, 129 dagen en 88 dagen. De gemiddelde tumorogene cycli van OTO-022 van generaties P0 tot P5 waren respectievelijk 155 dagen, 55 dagen, 32 dagen, 37 dagen, 27 dagen en 46 dagen. De gemiddelde tumorogene cycli van OTO-030 van generaties P0 tot P2 waren respectievelijk 133 dagen, 93 dagen en 104 dagen. De gemiddelde tumorogene cycli van OTO-031 van generaties P0 tot P5 waren respectievelijk 144 dagen, 58 dagen, 33 dagen, 34 dagen, 52 dagen en 50 dagen. De ATC-monsters werden stabiel doorgegeven aan de P3-generatie en later, terwijl twee gevallen van HNSCC-monsters geen tumoren vormden na het doorgeven aan de P1-generatie. De groeisnelheden van sommige monsters waren relatief traag in de P0-generatie, maar hun groeisnelheden werden versneld na het overgaan naar de P1 en latere generaties. De histopathologische kenmerken van de patiënttumoren met die van verschillende generaties PDX-modellen werden vergeleken. De resultaten toonden aan dat PDX-tumoren en patiënt-afgeleide primaire tumoren morfologisch bijna vergelijkbaar waren (figuur 3), met kleine verschillen die te wijten kunnen zijn aan de heterogeniteit in het bemonsteringsgebied tussen patiënten en verschillende generaties PDX.
De antitumorale werkzaamheid van lenvatinib (een multi-target tyrosinekinaseremmer die is goedgekeurd voor de behandeling van gevorderde schildklierkanker28) werd geëvalueerd in het PDX-model van ATC. Zoals te zien is in figuur 4A, remde behandeling met lenvatinib de tumorgroei significant in het ATC PDX-model in vergelijking met de normale zoutoplossingcontrolegroep (P < 0,05). Aan het einde van het experiment werd het tumorweefsel weggesneden en gewogen om het tumorgewicht te bepalen. In vergelijking met de controlegroep was het tumorgewicht van de behandelingsgroep met lenvatinib lager, hoewel er geen statistisch verschil werd bereikt (figuur 4B). Bovendien werden geen duidelijke veranderingen in de algemene status en het lichaamsgewicht waargenomen bij de muizen die met lenvatinib werden behandeld (figuur 4C). Vanwege de overmatige frequentie van toediening van cisplatine tijdens de experimenten, vertoonden de muizen significante toxiciteit, gemanifesteerd door gewichtsverlies en zelfs de dood. De antitumorale werkzaamheid van cisplatine wordt weergegeven in aanvullende figuur 1.
Figuur 1: Tumorgroeicurve van ATC PDX-modellen van verschillende patiënten. Elke kleur vertegenwoordigt de opgegeven generatie en elke curve vertegenwoordigt een enkele tumor. Eén tot drie muizen werden geënt bij de passage 0 (P0) generatie, en vijf muizen werden geënt in de daaropvolgende passages (P1-P5). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Tumorgroeicurve van de HNSCC PDX-modellen van verschillende patiënten. Elke kleur vertegenwoordigt de opgegeven generatie en elke curve vertegenwoordigt een enkele tumor. Eén tot drie muizen werden geënt op de P0-generatie en vijf muizen werden geënt op P1 en latere generaties. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Histopathologisch onderzoek. Histopathologische vergelijking tussen de primaire tumoren van de patiënt en overeenkomstige PDX's (passage 1 en passage 3) van ATC (THY-012, THY-017) en HNSCC (OTO-017) (hematoxyline-eosinekleuring, 100x). De pathologische subtypen van THY-012 en THY-017 waren anaplastisch schildkliercarcinoom en het pathologische subtype van OTO-017 was plaveiselcelcarcinoom. Schaalbalken = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: De therapeutische werkzaamheid van lenvatinib in het ATC PDX-model. Veranderingen in het (A) tumorvolume, (B) tumorgewicht en (C) lichaamsgewicht van ATC PDX-dragende muizen na behandeling met lenvatinib (10 mg/kg). Statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van T-tests om levatinib te vergelijken met controle. *P < 0,05 versus controle werd als statistisch significant beschouwd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Parameters | Klas | Tumor take rate (%) | P |
| Leeftijd (jaren) | <60 | 16.67 (1/6) | 0.615 |
| ≥60 | 33.33 (4/12) | ||
| Geslacht | Mannelijk | 16.67 (1/6) | 0.615 |
| Vrouwelijk | 33.33 (4/12) | ||
| Tumor diameter | <6cm | 37.50 (3/8) | 0.608 |
| ≥6cm | 20.00 (2/10) | ||
| Pathologic TNM stadium | Ik | 0.00 (0/1) | 1 |
| Ш | 0.00 (0/1) | ||
 |
31.25 (5/16) | ||
| Differentiatie | Hoog | 0.00 (0/7) | 0.059 |
| Arm | 25.00 (1/4) | ||
| Ongedifferentieerde | 57.14 (4/7) |
Tabel 1: Correlatie tussen de atc-tumoropnamesnelheid en de klinische kenmerken van de patiënten.
| Parameters | Klas | Tumor take rate (%) | P |
| Hpv | Negatief | 33.33 (2/6) | 1 |
| Onbekend of positief | 36.36 (4/11) | ||
| Leeftijd (jaren) | <60 | 33.33 (3/9) | 1 |
| ≥60 | 37.50 (3/8) | ||
| Geslacht | Mannelijk | 50.00 (5/10) | 0.304 |
| Vrouwelijk | 14.29 (1/7) | ||
| Rookstatus | Ooit | 44.44 (4/9) | 0.62 |
| Nooit | 25.00 (2/8) | ||
| Tumor diameter | <3cm | 40.00 (4/10) | 1 |
| ≥3cm | 28.57 (2/7) | ||
| Pathologic TNM stadium | Ik | 75.00 (3/4) | 0.423 |
 |
25.00 (2/8) | ||
| Ш | 0.00 (0/1) | ||
|
33.33 (1/3) | ||
| Metastase op afstand | Y | 28.57 (2/7) | 0.633 |
| N | 44.44 (4/9) | ||
| Differentiatie | Hoog | 12.50 (1/8) | 0.036* |
| Matig tot hoog | 100.00 (2/2) | ||
| Gematigd | 0.00 (0/2) | ||
| Matig tot slecht | 66.67 (2/3) | ||
| * P < 0,05 |
Tabel 2: Correlatie tussen de HNSCC-tumoropnamesnelheid en de klinische kenmerken van de patiënten. *P < 0,05.
| Naam van het voorbeeld | Generatie P tot P0 | Generatie P0 tot P1 | Generatie P1 tot P2 | Generatie P2 tot P3 | Generatie P3 tot P4 | Generatie P4 tot P5 |
| THY-004 | 68 | 87 | 29 | 34 | 28 | 26 |
| THY-012 | 119 | 61 | 66 | 55 | 87 | 116 |
| THY-017 | 27 | 17 | 30 | 13 | 22 | 15 |
| THY-018 | 134 | 70 | 48 | 48 | - | - |
| THY-021 | 53 | 66 | 35 | 49 | - | - |
| OTO-017 | 118 | 86 | 67 | 129 | - | - |
| OTO-022 | 155 | 55 | 32 | 37 | 27 | 46 |
| OTO-030 | 133 | 93 | 104 | - | - | - |
| OTO-031 | 144 | 58 | 33 | 34 | 52 | 50 |
Tabel 3: De gemiddelde tumorogene cyclus (tijd vanaf inenting tot een tumorgrootte van 1.000 mm3) van de ATC- en HNSCC-modellen.
Aanvullende figuur 1: De therapeutische werkzaamheid van cisplatine in het ATC PDX-model. Veranderingen in het (A) tumorvolume, (B) tumorgewicht en (C) lichaamsgewicht van ATC PDX-dragende muizen na behandeling met cisplatine (3 mg/kg). Statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van T-tests om cisplatine te vergelijken met de controlegroep. *P < 0,05 versus controle werd als statistisch significant beschouwd. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze studie heeft met succes de subcutane PDX-modellen van ATC en HNSCC vastgesteld. Er zijn veel aspecten om op te letten tijdens het proces van PDX-modelbouw. Wanneer het tumorweefsel van de patiënt is gescheiden, moet het in de ijskast worden geplaatst en zo snel mogelijk naar het laboratorium worden gestuurd voor inenting. Nadat de tumor in het laboratorium is aangekomen, moet de operator aandacht besteden aan het onderhouden van een steriel veld en aseptische procedures uitvoeren. Voor naaldbiopsiemonsters, omdat het tumorweefsel bijzonder klein is, zou inenting na het mengen van het monster met de matrixgel meer bevorderlijk zijn voor het vaststellen van het model. Het primaire tumorweefsel moet ook zoveel mogelijk worden bewaard, gefixeerd en ingevroren voor toekomstig onderzoek. Tijdens de inenting moet de lucht in de trocar zoveel mogelijk worden verdreven nadat de tumorstukken voor gebruik in de trocar zijn geplaatst. Na tumorinenting moet de tumorgroei gedurende 1-4 maanden bij muizen worden waargenomen en muizen zonder tumorgroei gedurende meer dan 6 maanden kunnen worden geëuthanaseerd29.
Immunodeficiënte muizen worden over het algemeen gekozen als gastheer voor PDX-modelconstructie 29,30. Van de P0-generatie tot de P2-generatie worden over het algemeen niet-obese diabetische - ernstig gecompromitteerde immuundeficiënte (NOD-SCID) muizen of NOD Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl / SzJ (NSG) muizen gebruikt. In de P3-generatie en daarna worden de monsters beschouwd als stabiel doorgegeven, dus naakte muizen kunnen meestal ook als gastheer dienen en tumoren kunnen ook normaal groeien. Bovendien waren de totale operatietijd, tumorisolatietijd, ziektevrije overleving en algehele overlevingskans van de patiënten, de kwaadaardige tumorgraad en het histologische subtype allemaal geassocieerd met PDX-model tumorigeniciteit31,32,33,34. De transplantatieplaats heeft ook een invloed op het slagingspercentage van PDX-modellering en studies hebben aangetoond dat niercapsule en orthotrope transplantatie een hoog tumorogene percentage hebben33,35. Bovendien kan het gebruik van Matrigel ook de tumorogene snelheidverbeteren 36,37. Er is gemeld dat infectie met humaan papillomavirus (HPV) het succespercentage van transplantatie in HNSCC-tumoren beïnvloedt; HPV-negatieve tumoren hebben een superieure take rate in vergelijking met HPV-positieve tumoren38,39. Deze studie kwam niet tot dezelfde conclusie, waarschijnlijk vanwege de kleine steekproefaantallen en onvolledige informatie over HPV-infectie.
Anders dan de orthotopische en renale capsuletransplantatiemodellen, is het subcutane model handiger voor het observeren van de groei van tumoren en is het ook bevorderlijk voor operatie40,41,42. Op basis van de tumorgroeigegevens van het ATC- en HNSCC PDX-model vonden we dat de groeisnelheden van tumoren van verschillende patiënten inconsistent waren, wat de heterogeniteit tussen tumoren weerspiegelt. De tumorgroeisnelheid van de P0-generatie van de meeste PDX-modellen was relatief langzamer dan voor de laatste passages, wat waarschijnlijk te wijten was aan de aanpassing van de micro-omgeving van de muis. Met name de groeisnelheid van sommige van patiënten afgeleide tumoren nam toe in verschillende passages na de P1-generatie, in overeenstemming met het verkorte passage-interval gerapporteerd door Pearson et al.43. Histopathologisch onderzoek toonde aan dat de PDX-tumoren de morfologische kenmerken van de primaire tumoren behielden. De correlatie tussen het PDX-model en de klinische ATC-patiënten werd ook weerspiegeld in de resultaten van de in vivo farmacodynamische tests, die aantoonden dat Lenvartinib een goed antitumoreffect vertoonde, in overeenstemming met klinische rapporten25,26,27.
Het PDX-model heeft echter ook bepaalde nadelen. De tumorvormingstijd is bijvoorbeeld relatief lang, wat ongeschikt is voor patiënten met gevorderde of agressieve tumoren. Bovendien zijn de tijd en geldelijke kosten van high-throughput drugsscreening te hoog44. Inderdaad, het combineren van het PDX-model met tumororganoïden en het opzetten van een patiënt-afgeleid organoïde (PDO) -model dat overeenkomt met het PDX-model zou deze deficiëntiecompenseren 44,45,46. Orthotopische transplantatiemodellen kunnen worden gebruikt om de pathogenese en metastatische mechanismen van tumoren te bestuderen40,41,47. Het ontbreken van een functioneel immuunsysteem is een ander nadeel van het PDX-model, dus steeds meer experimenten gebruiken gehumaniseerde muizen om het PDX-model voor tumorimmunologisch onderzoek te construeren48,49,50.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Er worden geen potentiële belangenconflicten bekendgemaakt.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het Sichuan Province Science and Technology Support Program (Grant Nos. 2019JDRC0019 en 2021ZYD0097), het 1.3.5-project voor disciplines van uitmuntendheid, West China Hospital, Sichuan University (Grant No. ZYJC18026), het 1.3.5-project voor disciplines van excellentie-Clinical Research Incubation Project, West China Hospital, Sichuan University (Grant No. 2020HXFH023), de Fundamental Research Funds for the Central Universities (SCU2022D025), het International Cooperation Project van Chengdu Science and Technology Bureau (Grant No. 2022-GH02-00023-HZ), het Innovation Spark Project van Sichuan University (Grant No. 2019SCUH0015), en het Talent Training Fund for Medical-engineering Integration of West China Hospital - University of Electronic Science and Technology (Grant No. HXDZ22012).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.4 mm x 2.0 mm trocar | Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd | 18-9065 | |
| Balb/c nude mice | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. | 401 | |
| Biosafety cabinet | Suzhou Antai | BSC-1300IIA2 | |
| Blade | Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd | 18-0823 | |
| Centrifuge tube | Corning | 430791/430829 | |
| Cryopreservation tube | Chengdu Dianrui Experimental Instrument Co., Ltd | / | |
| Custodiol HTK-Solution | Custodiol | 2103417 | |
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | SIGMA-ALORICH | D5879-500mL | |
| Electronic balance | METTLER | ME104 | |
| Electronic digital caliper | Chengdu Chengliang Tool Group Co., Ltd | 0-220 | |
| fetal bovine serum(FBS) | VivaCell | C04001-500 | |
| IBM SPSS Statistics 26 | IBM | ||
| Ketamine | Jiangsu Zhongmu Beikang Pharmaceutical Co., Ltd | 100761663 | |
| Lenvatinib | ApexBio | A2174 | |
| NOD-SCID immunodeficient mice | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. | 406 | |
| Pen-Strep Solution | Biological Industries | 03-03101BCS | |
| Petri dish | WHB | WHB-60/WHB-100 | |
| Saline | Sichuan Kelun | W220051705 | |
| Scissor | Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd | 18-0110 | |
| Tweezer | Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd | 18-1241 | |
| Vet ointment | Pfizer Inc. | P10015353 | |
| Xylazine | Dunhua Shengda Animal Medicine Co., Ltd | 070031777 |
References
- Toolan, H. W. Successful subcutaneous growth and transplantation of human tumors in X-irradiated laboratory animals. Proceedings of The Society for Experimental Biology and Medicine. 77 (3), 572-578 (1951).
- Gillet, J. P., et al. Redefining the relevance of established cancer cell lines to the study of mechanisms of clinical anti-cancer drug resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (46), 18708-18713 (2011).
- Hausser, H. J., Brenner, R. E. Phenotypic instability of Saos-2 cells in long-term culture. Biochemical & Biophysical Research Communications. 333 (1), 216-222 (2005).
- Pérez-Mancera, P., Guerra, C., Barbacid, M., Tuvesonet, D. A. What we have learned about pancreatic cancer from mouse models. Gastroenterology. 142 (5), 1079-1092 (2012).
- Bruna, A., et al. A biobank of breast cancer explants with preserved intra-tumor heterogeneity to screen anticancer compounds. Cell. 167 (1), 260-274 (2016).
- Choi, S., et al. Lessons from patient-derived xenografts for better in vitro modeling of human cancer. Advanced Drug Delivery Reviews. 79-80, 222-237 (2014).
- Blomme, A., et al. Murine stroma adopts a human-like metabolic phenotype in the PDX model of colorectal cancer and liver metastases. Oncogene. 37 (9), 1237-1250 (2018).
- Wang, D., et al. Molecular heterogeneity of non-small cell lung carcinoma patient-derived xenografts closely reflect their primary tumors. International Journal of Cancer. 140 (3), 662-673 (2016).
- Jung, J., et al. Generation and molecular characterization of pancreatic cancer patient-derived xenografts reveals their heterologous nature. Oncotarget. 7 (38), 62533-62546 (2016).
- Keysar, S., et al. A patient tumor transplant model of squamous cell cancer identifies PI3K inhibitors as candidate therapeutics in defined molecular bins. Molecular Oncology. 7 (4), 776-790 (2013).
- Rubio-Viqueira, B., et al. An in vivo platform for translational drug development in pancreatic cancer. Clinical Cancer Research. 12 (15), 4652-4661 (2006).
- Fiebig, H. H., et al. Development of three human small cell lung cancer models in nude mice. Recent Results in Cancer Research. 97, 77-86 (1985).
- Morelli, M. P., et al. Prioritizing phase I treatment options through preclinical testing on personalized tumorgraft. Journal of Clinical Oncology. 30 (4), 45-48 (2012).
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA. 68 (6), 394-424 (2018).
- Onoda, N., et al. Evaluation of the 8th edition TNM classification for anaplastic thyroid carcinoma. Cancers. 12 (3), 552 (2020).
- Nel, C., et al. Anaplastic carcinoma of the thyroid: A clinicopathologic study of 82 cases. Mayo Clinic Proceedings. 60 (1), 51-58 (1985).
- Mazzaferri, E. L. Increasing incidence of thyroid cancer in the United States, 1973-2002. Yearbook of Medicine. 2007, 496-499 (2007).
- Kebebew, E., Greenspan, F. S., Clark, O. H., Woeber, K. A., Mcmillan, A. Anaplastic thyroid carcinoma. Treatment outcome and prognostic factors. Cancer. 103 (7), 1330-1335 (2005).
- Lin, B., et al. The incidence and survival analysis for anaplastic thyroid cancer: A SEER database analysis. American Journal of Translational Research. 11 (9), 5888-5896 (2019).
- Maniakas, A., Dadu, R., Busaidy, N. L., Wang, J. R., Zafereo, M. Evaluation of overall survival in patients with anaplastic thyroid carcinoma, 2000-2019. JAMA Oncology. 6 (9), 1397-1404 (2020).
- Gilardi, M., et al. Tipifarnib as a precision therapy for HRAS-mutant head and neck squamous cell carcinomas. Molecular Cancer Therapeutics. 19 (9), 1784-1796 (2020).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Chow, L. Q. M.
- Swiecicki, P. L., Brennan, J. R., Mierzwa, M., Spector, M. E., Brenner, J. C. Head and neck squamous cell carcinoma detection and surveillance: Advances of liquid biomarkers. Laryngoscope. 129 (8), 1836-1843 (2019).
- Wang, R., et al. Distribution and activity of lenvatinib in brain tumor models of human anaplastic thyroid cancer cells in severe combined immune deficient mice. Molecular Cancer Therapeutics. 18 (5), 947-956 (2019).
- Takahashi, S., et al. A phase II study of the safety and efficacy of lenvatinib in patients with advanced thyroid cancer. Future Oncology. 15 (7), 717-726 (2019).
- Ferrari, S. M., et al. Lenvatinib exhibits antineoplastic activity in anaplastic thyroid cancer in vitro and in vivo. Oncology Reports. 39 (5), 2225-2234 (2018).
- Cabanillas, M. E., Habra, M. A. Lenvatinib: Role in thyroid cancer and other solid tumors. Cancer Treatment Reviews. 42, 47-55 (2016).
- Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. The generation and application of patient-derived xenograft model for cancer research. Cancer Research and Treatment. 50 (1), 1-10 (2018).
- Peng, S., et al. Tumor grafts derived from patients with head and neck squamous carcinoma authentically maintain the molecular and histologic characteristics of human cancers. Journal of Translational Medicine. 11, 198 (2013).
- Derose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17 (11), 1514-1520 (2011).
- Chen, X., Shen, C., Wei, Z., Zhang, R., Xiao, K. Patient-derived non-small cell lung cancer xenograft mirrors complex tumor heterogeneity. Cancer Biology and Medicine. 18 (1), 184-198 (2021).
- Choi, Y. Y., et al. Establishment and characterisation of patient-derived xenografts as paraclinical models for gastric cancer. Scientific Reports. 6, 22172 (2016).
- Maider, I. V., Andrés, C., Alberto, B. Preclinical models for precision oncology. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer. 1872 (2), 239-246 (2018).
- Okada, S., Vaeteewoottacharn, K., Kariya, R. Establishment of a patient-derived tumor xenograft model and application for precision cancer medicine. Chemical & Pharmaceutical Bulletin. 66 (3), 225-230 (2018).
- Michael, G., et al. Tumor take rate optimization for colorectal carcinoma patient-derived xenograft models. BioMed Research International. 2016, 1715053 (2016).
- Bernardo, C., Costa, C., Sousa, N., Amado, F., Santos, L. Patient-derived bladder cancer xenografts: a systematic review. Translational Research. 166 (4), 324-331 (2015).
- Facompre, N. D., et al. Barriers to generating PDX models of HPV-related head and neck. Laryngoscope. 127 (12), 2777-2783 (2017).
- Kang, H. N., Kim, J. H., Park, A. Y., Choi, J. W., Kim, H. R. Establishment and characterization of patient-derived xenografts as paraclinical models for head and neck cancer. BMC Cancer. 20 (1), 316 (2020).
- Ahn, S. H., et al. An orthotopic model of papillary thyroid carcinoma in athymic nude mice. Archives of Otolaryngology-Head & Neck Surgery. 134 (2), 190-197 (2008).
- Nucera, C., et al. A novel orthotopic mouse model of human anaplastic thyroid carcinoma. Thyroid. 19 (10), 1077-1084 (2009).
- De Rose, F., et al. Galectin-3 targeting in thyroid orthotopic tumors opens new ways to characterize thyroid cancer. Journal of Nuclear Medicine. 60 (6), 770-776 (2019).
- Pearson, A. T., et al. Patient-derived xenograft (PDX) tumors increase growth rate with time. Oncotarget. 7 (7), 7993-8005 (2016).
- Huo, K. G., D'Arcangelo, E., Tsao, M. S. Patient-derived cell line, xenograft and organoid models in lung cancer therapy. Translational Lung Cancer Research. 9 (5), 2214-2232 (2020).
- Kumari, R., Xu, X., Li, H. Q. Translational and clinical relevance of PDX-derived organoid models in oncology drug discovery and development. Current Protocols. 2 (7), e431 (2022).
- Takahashi, N., et al. Construction of in vitro patient-derived tumor models to evaluate anticancer agents and cancer immunotherapy. Oncology Letters. 21 (5), 406 (2021).
- Barasch, A., et al. Photobiomodulation effects on head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) in an orthotopic animal model. Supportive Care in Cancer. 28 (6), 2721-2727 (2020).
- Wang, M., et al. Humanized mice in studying efficacy and mechanisms of PD-1-targeted cancer immunotherapy. FASEB Journal. 32 (3), 1537-1549 (2018).
- Wu, C., Wang, X., Shang, H., Wei, H. Construction of a humanized PBMC-PDX model to study the efficacy of a bacterial marker in lung cancer immunotherapy. Disease Markers. 2022, 1479246 (2022).
- Yao, L. C., et al. Creation of PDX-bearing humanized mice to study immuno-oncology. Methods in Molecular Biology. 1953, 241-252 (2019).
