Summary
يصف هذا البروتوكول القدرات وطرائق الاستزراع الأساسية لرقاقة الجهاز المفتوح من أجل الإنشاء الناجح ونضج مزارع الأعضاء على الرقاقة كاملة السماكة للأنسجة الأولية (الجلد والحويصلات الهوائية ومجرى الهواء والأمعاء) ، مما يوفر الفرصة للتحقيق في الجوانب الوظيفية المختلفة للواجهة الظهارية / الوسيطة والأوعية الدموية البشرية في المختبر.
Abstract
تصطف جميع الأعضاء البشرية تقريبا مع الأنسجة الظهارية ، التي تضم طبقة واحدة أو عدة طبقات من الخلايا المتصلة بإحكام منظمة في هياكل ثلاثية الأبعاد (3D). واحدة من الوظائف الرئيسية للظهارة هي تشكيل الحواجز التي تحمي الأنسجة السفلية ضد الإهانات الفيزيائية والكيميائية والعوامل المعدية. بالإضافة إلى ذلك ، تتوسط الظهارة في نقل العناصر الغذائية والهرمونات وجزيئات الإشارات الأخرى ، وغالبا ما تخلق تدرجات كيميائية حيوية توجه وضع الخلايا وتقسيمها داخل العضو. نظرا لدورها المركزي في تحديد بنية الأعضاء ووظيفتها ، تعد الظهارة أهدافا علاجية مهمة للعديد من الأمراض البشرية التي لا يتم التقاطها دائما بواسطة النماذج الحيوانية. إلى جانب الاختلافات الواضحة بين الأنواع ، فإن إجراء دراسات بحثية حول وظيفة الحاجز وخصائص نقل الظهارة في الحيوانات يتفاقم بسبب صعوبة الوصول إلى هذه الأنسجة في نظام حي. في حين أن ثقافات الخلايا البشرية ثنائية الأبعاد (2D) مفيدة للإجابة على الأسئلة العلمية الأساسية ، إلا أنها غالبا ما تسفر عن تنبؤات ضعيفة في الجسم الحي . للتغلب على هذه القيود ، في العقد الماضي ، ظهر عدد كبير من منصات المحاكاة الحيوية المهندسة بدقة ، والمعروفة باسم الأعضاء على رقاقة ، كبديل واعد للاختبارات التقليدية في المختبر والحيوانات. هنا ، نصف رقاقة الجهاز المفتوحة (أو رقاقة مفتوحة العلوي) ، وهي منصة مصممة لنمذجة الأنسجة الظهارية الخاصة بالأعضاء ، بما في ذلك الجلد والرئتين والأمعاء. توفر هذه الشريحة فرصا جديدة لإعادة تشكيل البنية متعددة الخلايا ووظيفة الأنسجة الظهارية ، بما في ذلك القدرة على إعادة إنشاء مكون انسجة 3D من خلال دمج الخلايا الليفية الخاصة بالأنسجة والخلايا البطانية داخل نظام نشط ميكانيكيا. توفر هذه الشريحة المفتوحة أداة غير مسبوقة لدراسة التفاعلات الظهارية / الوسيطة والأوعية الدموية على مستويات متعددة من الدقة ، من الخلايا المفردة إلى تركيبات الأنسجة متعددة الطبقات ، مما يسمح بالتشريح الجزيئي للحديث المتبادل بين الخلايا للأعضاء الظهارية في الصحة والمرض.
Introduction
تاريخيا ، اعتمد العلماء على الاختبارات قبل السريرية على الحيوانات لاكتشاف الأدوية ، ولكن تم التشكيك في عدد متزايد من هذه الطرق بسبب ضعف الارتباط بالنتيجة البشرية1. إن تنفيذ مبادئ "3Rs" لاستبدال التجارب على الحيوانات وتقليلها وصقلها يحث العلماء على إيجاد طرق بديلة جديدة في المختبر لدعم تقييم مخاطر الأدوية والسموم الكيميائية قبل السريرية2. ومع ذلك ، فإن العديد من النماذج المختبرية التي تم تطويرها حتى الآن تفتقر إلى البنية البيولوجية والتعقيد الخلوي والبيئة الميكانيكية اللازمة لتلخيص الطبيعة الديناميكية للأعضاء الحية البشرية 3,4.
عادة ما تستخدم الأنظمة قبل السريرية التقليدية في المختبر زراعات أحادية 2D للخلايا البشرية المزروعة على سطح بلاستيكي صلب. توفر هذه الأساليب أداة لإجراء دراسات ميكانيكية بسيطة وتمكن من الفحص السريع للأدوية المرشحة. نظرا لتكلفتها المنخفضة نسبيا وقوتها العالية ، غالبا ما يتم إقران نماذج 2D بأنظمة أوتوماتيكية عالية الإنتاجية وتستخدم لتحديد سريع للأدوية المرشحة المحتملة خلال المرحلة المبكرة من عملية تطوير الأدوية 5,6. ومع ذلك ، فإن نماذج 2D هذه لا توفر نهجا متعديا لنمذجة الاستجابات على مستوى الأنسجة أو على مستوى الأعضاء أو النظامية للمرشحين العلاجيين ، وهو أمر ضروري للتنبؤات الدقيقة بسلامة الأدوية وفعاليتها خلال المرحلة قبل السريرية من تطورها. لا تلخص مزارع الخلايا المسطحة البيئة المكروية للأنسجة الأصلية ، بما في ذلك التفاعل المعقد متعدد الخلايا ، والخصائص الميكانيكية الحيوية ، والبنية ثلاثية الأبعاد (3D) للأنسجة البشرية7. غالبا لا تكتسب الخلايا التي تنمو على سطح مستو نمطا ظاهريا ناضجا؛ ومن ثم لا يمكنها الاستجابة للمثيرات الدوائية كما تفعل في الأنسجة الأصلية. على سبيل المثال ، تظهر الخلايا الظهارية السنخية البشرية الأولية التي تنمو في المختبر نمطا ظاهريا حرشفيا وتفقد علامات النمط الظاهري الرئيسية ، بما في ذلك البروتينات الخافضة للتوتر السطحي C و B (SP-C و SP-B)8. بالإضافة إلى التمايز غير الكافي ، غالبا ما تصبح الخلايا الأولية غير حساسة للضغوط البيولوجية في المختبر ، حيث تصبح بعض المسارات الكيميائية الحيوية المرتبطة بالتهاب الأنسجة غير وظيفية9. يبدو أن هذا الفقدان لوظيفة الخلية يرتبط في المقام الأول باستخدام ركائز صلبة بالإضافة إلى نقص العوامل القابلة للذوبان التي تطلقها بشكل طبيعي الخلايا اللحمية الخاصة بالأنسجة مثل الخلايا الليفية الرئوية وخلايا العضلات الملساء10,11.
إن فهم أن الافتقار إلى التعقيد الكيميائي الفيزيائي والبيولوجي يحد من السلوك الفسيولوجي للخلايا في المختبر قد عزز تطوير نماذج متعددة الخلايا أكثر تطورا ، والتي أثبتت أنها تلتقط بشكل أفضل تعقيد الأنسجة البشرية خارج الجسم12,13. منذ إنشاء أول نماذج الثقافة المشتركة في أوائل سبعينيات القرن العشرين14 ، أدى إدخال الهلاميات المائية الاصطناعية والطبيعية إلى تحسين القدرة على تقليد البيئات الدقيقة للأنسجة الأصلية بشكل كبير وأصبح أداة لا تقدر بثمن لدفع التمايز الخلوي ، وتوجيه التنظيم الذاتي للخلايا إلى هياكل تشبه الأنسجة ، واستعادة وظائف الأنسجة الأصلية15,16. على سبيل المثال ، عندما تزرع في سقالة 3D المناسبة ، يمكن للخلايا البشرية أن ترتب ذاتيا في هياكل وظيفية مثل الكرويات أو المواد العضوية ، معبرة عن علامات الخلايا الجذعية ، وتكون قادرة على التجديد الذاتي17. في المقابل ، فإن الخلايا البشرية (بما في ذلك الخلايا الجذعية) ، عندما تنمو على ركائز 2D التقليدية ، تتقدم في العمر بسرعة وتخضع للشيخوخة بعد بضع مقاطع18. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن "تخصيص" الهلاميات المائية لتتناسب مع خصائص الأنسجة المحددة مثل المسامية وحجم المسام وسمك الألياف ومرونة اللزوجة والتضاريس والصلابة أو هندستها بشكل أكبر مع المكونات الخلوية المشتقة من الأنسجة و / أو الجزيئات النشطة بيولوجيا التي تمكن من محاكاة الظروف الفسيولوجية أو المرضية19,20. على الرغم من إمكاناتها الهائلة لاختبار الأدوية ، فإن النماذج القائمة على الهيدروجيل 3D المستخدمة في الأبحاث الصيدلانية لا تلخص بشكل كامل البنية الخلوية المعقدة للأنسجة في الجسم الحي وتفتقر إلى محفزات الدورة الدموية والميكانيكية المهمة الموجودة عادة في جسم الإنسان ، بما في ذلك الضغط الهيدروستاتيكي والتمدد الدوري وقص السوائل21.
ظهرت الأنظمة الفيزيولوجية الدقيقة (MPSs) مثل الأعضاء على الرقائق (OOCs) مؤخرا كأدوات قادرة على التقاط الاستجابات الفسيولوجية المعقدة في المختبر22,23. غالبا ما تستخدم هذه النماذج استخدام منصات الموائع الدقيقة ، والتي تمكن من نمذجة البيئة المكروية الديناميكية للأعضاء الحية.
لقد جمعنا بين مبادئ الهندسة الحيوية للأنسجة 3D وعلم الأحياء الميكانيكي لإنشاء نموذج رقاقة مفتوح للأنسجة الظهارية البشرية المعقدة. سمح لنا ذلك بتلخيص البيئة المكروية متعددة الخلايا والديناميكية للأنسجة الظهارية عن كثب. وهذا يشمل الإشارات البيوكيميائية والميكانيكية الحيوية الخاصة بالأنسجة الموجودة بشكل طبيعي في الأعضاء الحية ولكن غالبا ما يتم إهمالها من قبل النماذج التقليدية في المختبر 24. تشتمل الرقاقة المفتوحة على جزأتين: حجرة وعائية (الشكل 1 أ) وحجرة انسجة (الشكل 1 ب) مفصولة بغشاء مسامي ، مما يسمح بنشر العناصر الغذائية بين الغرفتين (الشكل 1 ج). تتعرض حجرة الأوعية الدموية لتدفق مستمر للسوائل لتلخيص إجهاد القص الفسيولوجي ، بينما يسمح التصميم القابل للتمدد للغرفة اللحمية بنمذجة الإجهاد الميكانيكي المرتبط بحركات التنفس أو التمعج المعوي. تحتوي المقصورة اللحمية على سقالة هيدروجيل 3D القابلة للضبط المصممة لدعم النمو الفسيولوجي للخلايا الليفية الخاصة بالأنسجة. إنه يمتلك غطاء قابلا للإزالة يسهل إنشاء واجهة هوائية سائلة ، وهي حالة تسمح بمحاكاة أكبر لفسيولوجيا الإنسان للأنسجة المخاطية بالإضافة إلى الوصول المباشر إلى الأنسجة لإدارة الأدوية مباشرة على الطبقة الظهارية. يلتقط الشكل التكميلي 1 بعض المكونات الرئيسية لتصميم الرقاقة المفتوحة بما في ذلك الأبعاد والمقصورات البيولوجية (الشكل التكميلي 1A-D) بالإضافة إلى الخطوات الفنية الرئيسية الموضحة في هذا البروتوكول (الشكل التكميلي 1E).
يتم تحقيق نضح الرقاقة المفتوحة باستخدام مضخة تمعجية قابلة للبرمجة (الشكل 1 د). يسمح إعداد المضخة التمعجية بإدخال 12 شريحة مفتوحة في وقت واحد. يمكن لمعظم الحاضنات استيعاب إعدادين مما يتيح ثقافة ما يصل إلى 24 شريحة لكل حاضنة. يتم تحقيق التمدد الميكانيكي باستخدام منظم ضغط فراغ قابل للبرمجة حسب الطلب (الشكل 1E). يتكون من منظم فراغ كهربائي هوائي يتم التحكم فيه إلكترونيا بواسطة محول رقمي إلى تناظري. بمعنى آخر ، يقوم منظم الفراغ الكهربائي الهوائي بإنشاء ملف تعريف فراغ جيبي بسعة وتردد يحددهما المستخدم. يتم إنشاء سلالة دورية تتراوح من 0٪ إلى 15٪ عن طريق تطبيق ضغط سلبي على قناة الفراغ للرقاقة المفتوحة بسعة تتراوح من 0 إلى -90 كيلو باسكال وتردد 0.2 هرتز. إنه نظام مصمم خصيصا يعادل وحدة إجهاد Flexcell المتاحة تجاريا والتي تم اعتمادها ووصفها سابقا في أوراق أخرى25. لتقليد تشوه الأنسجة الميكانيكية المرتبط ، على سبيل المثال ، بحركة التنفس في الرئة أو التمعج في الأمعاء ، يطبق المشغل الهوائي موجات الفراغ / الإجهاد الجيبية التي يمكن تعديل حجمها وسعتها لتتناسب مع المستوى الفسيولوجي للإجهاد والتردد الذي تختبره الخلايا البشرية في أنسجتها الأصلية.
هنا ، نصف طريقة فعالة وقابلة للتكرار لهندسة وزراعة مكافئات الظهارة العضوية على نموذج أولي لمنصة رقاقة Open-Top. يسمح بتوليد نماذج أعضاء معقدة مثل الجلد والحويصلات الهوائية ومجرى الهواء والقولون مع دمج تدفق السوائل الوعائية والتمدد الميكانيكي. سنحدد الجوانب الفنية الرئيسية التي يجب مراعاتها أثناء تنفيذ مبادئ هندسة الأنسجة لتوليد نماذج ظهارية معقدة. سنناقش المزايا والقيود المحتملة للتصميم الحالي.
تم الإبلاغ عن نظرة عامة على الخطوات الرئيسية المستخدمة لتحقيق نضج الأنسجة والأعضاء ، بما في ذلك معلمات التدفق والتمدد ، في: الشكل 2 للجلد ، الشكل 3 للحويصلات الهوائية ، الشكل 4 لمجرى الهواء ، والشكل 5 للأمعاء. وترد في الجداول التكميلية معلومات إضافية عن تكوين الوسائط والكواشف المستخدمة في استزراع نماذج الأعضاء المختلفة (الجدول التكميلي 1 للجلد؛ والجدول 1 للجلد؛ والجدول 1 للجلد؛ والجدول 1 للجلد). الجدول التكميلي 2 للحويصلات الهوائية؛ الجدول التكميلي 3 لمجرى الهواء ، والجدول التكميلي 4 للأمعاء).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم الحصول على القولون البشري من استئصال الأمعاء وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة السلامة البيولوجية المؤسسية لمستشفى سينسيناتي للأطفال (IBC 2017-2011).
1. تنشيط السطح
- إعداد المخزن المؤقت للتنشيط
- ضع الكواشف العازلة للربط المتشابك والمذيبات تحت خزانة السلامة البيولوجية (BSC) واتركها تتوازن في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 10 دقائق قبل الاستخدام.
- أعد تكوين 5 مجم من الرابط المتشابك في 5 مل من المخزن المؤقت للمذيب باستخدام حاوية معقمة منيعة للضوء أو أنبوب مخروطي شفاف سعة 15 مل ملفوف بورق الألمنيوم لحماية محلول الرابط المتشابك من التعرض المباشر للضوء.
- دوامة الحل لمدة 1 دقيقة لإزالة جميع الكتل ، ثم ماصة 50 ميكرولتر من محلول crosslinker مباشرة في القناة السفلية للرقاقة و 150 ميكرولتر في الغرفة المفتوحة.
- قم بإزالة أي فائض من محلول التشابك من سطح الشريحة باستخدام شفاط. ثم ماصة إضافية 50 ميكرولتر من محلول التشابك مباشرة في القناة السفلية للرقاقة و 150 ميكرولتر في الغرفة المفتوحة لإزالة أي فقاعة هواء متبقية.
- التنشيط باستخدام آلة التشابك للأشعة فوق البنفسجية
- قم بإزالة الغطاء برفق من الشريحة الموجودة أسفل BSC وقم بتخزينه في حاوية معقمة.
- انقل الرقائق التي تحتوي على محلول التشابك إلى طبق بتري ، وأغلق طبق بتري لتجنب التلوث ، وضع الطبق مع الرقائق تحت آلة التشابك للأشعة فوق البنفسجية.
ملاحظة: قم بإزالة غطاء طبق بتري لزيادة التعرض للأشعة فوق البنفسجية. - اضبط آلة التشابك للأشعة فوق البنفسجية بطول موجي ذروة يبلغ 365 نانومتر بكثافة 100 μJ / cm2 ، وقم بتشغيل ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 20 دقيقة.
ملاحظة: بعد 20 دقيقة من العلاج بالأشعة فوق البنفسجية ، سيبدو محلول التشابك أغمق (بني). - أعد الرقائق إلى أسفل BSC واستنشق محلول التشابك المؤكسد. بعد ذلك ، اشطف جميع الرقائق ثلاث مرات باستخدام المخزن المؤقت للمذيبات واترك الرقائق تجف تحت BSC لمدة 5-10 دقائق لإكمال الوظيفة الكيميائية لسطح polydimethylsiloxane (PDMS).
2. إعداد ما يعادل سدى
- تحضير 10x عازلة لإعادة الإعمار (100 مل)
- قم بإذابة 2.2 جم من بيكربونات الصوديوم في 75 مل من 0.067 M NaOH في ماء مقطر مزدوج.
- أضف 4.76 جم من HEPES وارفع الحجم إلى 100 مل باستخدام الماء المقطر المزدوج.
- قم بتصفية المحلول المعقم تحت BSC باستخدام مرشح معقم أعلى الزجاجة يمكن التخلص منه بغشاء 0.22 ميكرومتر.
ملاحظة: المحلول مستقر لمدة 6 أشهر تقريبا عند تخزينه عند 4 درجات مئوية.
- تقدير حجم محلول ما قبل الهلام
- اضرب عدد الرقائق اللازمة للتجربة في 150 ميكرولتر (الحجم الداخلي للغرفة المركزية المفتوحة) لتقدير كمية محلول ما قبل الهلام المطلوب للتجربة:
الحجم المطلوب = (عدد الرقائق × 150) ميكرولتر - تحضير محلول الكولاجين قبل الهلام على الجليد عن طريق خلط: حجم واحد من 10x EMEM يحتوي على الخلايا المفضلة ، 1 حجم من 10x العازلة لإعادة البناء (انظر الخطوة 2.1) ، 8 مجلدات من محلول الكولاجين I (10 ملغ / مل) و 1 ميكرولتر من محلول 1 N NaOH لكل ملغ من الكولاجين I.
ملاحظة: يوصى بإعداد حجم إضافي + 15٪ لحساب الأخطاء التجريبية ؛ يوفر المثال الموضح في القسم 2.2 إجراء تفصيليا خطوة بخطوة لإعداد ما يكفي من محلول ما قبل الهلام ل 12 شريحة وحجم إضافي بنسبة 15٪.
- اضرب عدد الرقائق اللازمة للتجربة في 150 ميكرولتر (الحجم الداخلي للغرفة المركزية المفتوحة) لتقدير كمية محلول ما قبل الهلام المطلوب للتجربة:
- تحضير محلول ما قبل الهلام لمكافئ السدى (ل 12 رقائق)
- جلب الحلول التالية تحت BSC على الجليد: 10x EMEM ؛ 10x المخزن المؤقت لإعادة الإعمار (انظر الخطوة 2.1) ؛ محلول الكولاجين I (10 ملغ / مل) ؛ ومحلول معقم 1 N NaOH.
- زراعة خلايا اللحمة المتوسطة الخاصة بالأنسجة حسب توجيهات مقدمي الخدمة حتى 80٪ -90٪ متقاربة ، ثم فصل الخلايا باستخدام التربسين أو طرق أخرى على النحو الموصى به من قبل مزود الخلية. اجمع الخلايا في حبيبات عن طريق الطرد المركزي عند 250 × جم لمدة 5 دقائق عند 24 درجة مئوية.
- أعد تعليق حبيبات الخلية في 225 ميكرولتر من الثلج البارد 10x EMEM ، وأضف 225 ميكرولتر من المخزن المؤقت لإعادة البناء 10x المثلج البارد (انظر الخطوة 2.1). امزج المحلول عن طريق سحب الإصبع برفق لأعلى ولأسفل ، ثم أضف 1800 ميكرولتر من محلول الكولاجين المثلج I.
- ماصة صعودا وهبوطا 5-6 مرات ، وتجنب الفقاعات لخلط محلول ما قبل الجل أثناء الثلج.
- دمج مكافئ السدى على الرقاقة (ل 12 شريحة)
- تحييد محلول ما قبل الجل مع 18 ميكرولتر من 1 N هيدروكسيد الصوديوم. امزج بلطف عن طريق سحب الماصة لأعلى ولأسفل 5-6 مرات ، ثم ماصة 150 ميكرولتر من الهيدروجيل المحمل بالخلايا في الغرفة المركزية للشريحة المفتوحة لتجنب الفقاعات.
ملاحظة: إذا كان النقش الدقيق مطلوبا ، فيرجى الانتقال إلى الخطوة التالية (القسم 3). - قم بتجميع الرقائق في أطباق بتري منفصلة ، بما في ذلك غطاء أنبوب طرد مركزي مملوء ب 2 مل من ddH 2 O المعقم في كل طبق بتري ، واحتضان طبق (أطباق) بتري في الحاضنة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2.
ملاحظة: بعد 90 دقيقة ، سيتم بلمرة الهيدروجيل المحمل بالخلايا بالكامل.
- تحييد محلول ما قبل الجل مع 18 ميكرولتر من 1 N هيدروكسيد الصوديوم. امزج بلطف عن طريق سحب الماصة لأعلى ولأسفل 5-6 مرات ، ثم ماصة 150 ميكرولتر من الهيدروجيل المحمل بالخلايا في الغرفة المركزية للشريحة المفتوحة لتجنب الفقاعات.
3. النقش الدقيق السطحي (اختياري)
- قم بإجراء النقش الدقيق السطحي للهيدروجيل اللحمي بعد سحب هيدروجيل الكولاجين المحايد (لا يزال في حالته السائلة) باستخدام طوابع مطبوعة 3D.
ملاحظة: يمكن الحصول على الطوابع المطبوعة 3D في مختلف التصاميم القابلة للتخصيص ، كما هو موضح سابقا في مكان آخر24. - ماصة 20 ميكرولتر من محلول الكولاجين المحايد I pre-gel على السطح المنقوش لختم معقم مطبوع 3D وأدخل الختم داخل (في الأعلى) من الغرفة المفتوحة بينما لا يزال هيدروجيل اللحمية في شكل سائل.
- قم بإزالة أي بقايا من الهيدروجيل قد تنسكب من أعلى الحجرة المفتوحة باستخدام شفاط (أو ماصة). قم بتجميع جميع الرقائق في أطباق بتري منفصلة وقم بتضمين غطاء أنبوب مخروطي سعة 15 مل مملوء ب 2 مل من ddH2O المعقم في كل طبق بتري.
- احتضن جميع أطباق بتري عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 لمدة 90 دقيقة ، ثم أعد الرقائق تحت BSC وقم بإزالة الطوابع برفق باستخدام ملاقط دقيقة لتقليل مخاطر إتلاف الهيدروجيل.
4. طلاء السطح الظهاري والأوعية الدموية ببروتينات ECM الخاصة بالأنسجة
- طلاء غرفة الموائع الدقيقة الوعائية ببروتينات مصفوفة خارج الخلية
- اضرب عدد الرقائق اللازمة للتجربة في 20 ميكرولتر (حجم القناة الوعائية) لتقدير حجم محلول طلاء ECM الوعائي المطلوب للتجربة:
الحجم المطلوب = (عدد الرقائق × 20) ميكرولتر
ملاحظة: يوصى بإعداد حجم إضافي بنسبة 15٪ لحساب الأخطاء التجريبية. - قم بإعداد محلول طلاء ECM الوعائي لجميع الرقائق (على سبيل المثال ، 300 ميكرولتر لكل 12 شريحة) باستخدام برنامج تلفزيوني بارد أو HBSS.
ملاحظة: ارجع إلى جدول بروتوكول الأعضاء المحدد في قسم المواد التكميلية (الجدول التكميلي 1 للبشرة; الجدول التكميلي 2 للحويصلات الهوائية؛ الجدول التكميلي 2 لمجرى الهواء ، والجدول التكميلي 4 للأمعاء) لتحديد الكواشف المحددة وتكوين ECM الموصى به. - ماصة 20 ميكرولتر من محلول طلاء ECM الوعائي في القناة الوعائية لكل شريحة.
- اضرب عدد الرقائق اللازمة للتجربة في 20 ميكرولتر (حجم القناة الوعائية) لتقدير حجم محلول طلاء ECM الوعائي المطلوب للتجربة:
- طلاء السطح القمي للمكافئ اللحمي ببروتينات مصفوفة خارج الخلية
- اضرب عدد الرقائق اللازمة للتجربة في 50 ميكرولتر (حجم القناة الوعائية) لتقدير حجم محلول طلاء ECM الظهاري المطلوب للتجربة:
الحجم المطلوب = (عدد الرقائق × 50) ميكرولتر
ملاحظة: يوصى بإعداد حجم إضافي بنسبة 15٪ لحساب الأخطاء التجريبية. - قم بإعداد ما يكفي من محلول طلاء ECM لجميع الرقائق (على سبيل المثال ، 750 ميكرولتر لكل 12 شريحة) في PBS أو HBSS الباردة الجليدية ونقل 50 ميكرولتر من محلول طلاء ECM الظهاري مباشرة فوق سطح الهيدروجيل.
ملاحظة: ارجع إلى جدول بروتوكول الأعضاء المحدد في قسم المواد التكميلية (الجدول التكميلي 1 للبشرة; الجدول التكميلي 2 للحويصلات الهوائية؛ الجدول التكميلي 2 لمجرى الهواء ، والجدول التكميلي 4 للأمعاء) لتحديد الكواشف المحددة وتكوين ECM الموصى به. - قم بتجميع الرقائق في أطباق بتري منفصلة ، بما في ذلك غطاء أنبوب مخروطي سعة 15 مل مملوء ب 2 مل من ddH 2 O المعقم في كلطبق بتري ، واحتضان أطباق بتري في الحاضنة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 لمدة ساعتين قبل الشروع في بذر الخلايا الظهارية.
- اضرب عدد الرقائق اللازمة للتجربة في 50 ميكرولتر (حجم القناة الوعائية) لتقدير حجم محلول طلاء ECM الظهاري المطلوب للتجربة:
5. بذر الخلايا الظهارية على المكافئ اللحمي
- ثقافة الخلايا الظهارية
- زراعة الخلايا الظهارية الخاصة بالأنسجة حسب توجيهات مقدمي الخدمة حتى 80٪ -90٪ متقاربة.
- فصل الخلايا باستخدام إجراءات الإنزيم المحلل للبروتين على النحو الموصى به من قبل مزود الخلية.
ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج ، احصد الخلايا الظهارية عند ممر منخفض (P1-P2) خلال مرحلة النمو النشط عندما تصل إلى التقاء يتراوح بين 70٪ -90٪. - بمجرد الانفصال ، قم بطرد الخلايا وجمعها على شكل حبيبات.
- أعد تعليق الخلايا الظهارية إلى كثافة الخلية / الشظية المناسبة كما هو موضح في جدول بروتوكول العضو المحدد.
ملاحظة: في هذه الدراسة ، تم استخدام محلول الخلايا بكثافة 3 × 10 6 خلايا / مل للجلد ، 1 × 10 6 خلايا / مل للحويصلات الهوائية ، 6 × 10 6 خلايا / مل لمجرى الهواء و 8 × 10 6 شظايا / مل للأمعاء.
- بذر الخلايا الظهارية
- نقل الرقائق من الحاضنة إلى BSC. نضح محلول الطلاء من قناة الأوعية الدموية ، وشطف قناة الموائع الدقيقة الوعائية ثلاث مرات باستخدام 50 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا البطانية الطازجة.
- نضح محلول الطلاء من سطح الهيدروجيل وشطف السطح اللحمي ثلاث مرات باستخدام 100 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا الظهارية الطازجة لإزالة أي محلول طلاء زائد.
- نضح الوسط الصاعد وبذر سطح الهيدروجيل ب 50 ميكرولتر من تعليق الخلية الظهارية باستخدام كثافة الخلية المناسبة ، كما هو موضح في الجداول التكميلية ، ثم انقل الرقائق مرة أخرى إلى الحاضنة لمدة 2 ساعة (أو بين عشية وضحاها للقولون).
- اشطف سطح الهيدروجيل برفق باستخدام وسط زراعة الخلايا مرتين لإزالة الحطام الخلوي. أخيرا ، قم بتحديث الوسيط عن طريق التعقيم في حاويات محكمة الغلق قابلة للتعقيم ، وقم بتوصيل الرقائق بالمضخة التمعجية.
6. توصيل الرقائق بالتدفق
- تحضير الأجزاء السائلة
- قطع 2 بوصة من أنابيب نقل المطاط الصناعي الحراري (TPE) المتوافقة حيويا (جدول المواد) لإعداد أنابيب الموائع الدقيقة القصيرة المطلوبة لتوصيل الرقائق بخزانات الوسائط.
- قطع 7.5 بوصة من أنابيب نقل TPE المتوافقة حيويا لإنتاج أنابيب الموائع الدقيقة الطويلة.
- قم بإعداد ما يكفي من الموصلات المعدنية 18 جم و 19 جم (جدول المواد).
ملاحظة: يوصى بإعداد وتعقيم الأنابيب والموصلات الموضحة في الخطوتين 6.1.1 و 6.1.2 قبل يوم واحد على الأقل من توصيل الرقائق المفتوحة بالمضخات التمعجية. - اثقب غطاء كل خزان متوسط بإبرة تحت الجلد مقاس 4 بوصات (جدول المواد).
- تفريغ متوسط
- اسمح لوسط زراعة الخلية بالتوازن مع درجة حرارة الغرفة (RT).
- انقل حجم الوسط المطلوب إلى أنبوب ترشيح مخروطي.
- قم بتطبيق ضغط فراغ سلبي يبلغ -20 رطل لكل بوصة مربعة لإزالة الغاز من الوسط (الترشيح المدفوع بالفراغ).
ملاحظة: في حالة عدم توفر فراغ ، يمكن ترك وسط زراعة الخلايا للتوازن في الحاضنة طوال الليل لتحقيق نتائج مماثلة.
- قم بإعداد الشريحة المفتوحة لتدفق السوائل
- ضع الرقائق والأجزاء السائلة المعقمة أسفل BSC وقم بمحاذاة الغطاء (الجزء العلوي) من الشريحة المفتوحة لإغلاق النموذج الأولي للشريحة المفتوحة قبل بدء تدفق السوائل.
- ماصة 200 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا المنزوعة الغازات (انظر الجداول الخاصة بالأعضاء) في منفذ مدخل كل من القنوات العلوية والسفلية للرقاقة مع الانتباه لتجنب الفقاعات.
- ماصة 300 ميكرولتر من وسط الاستزراع في أنابيب الموائع الدقيقة القصيرة لتجهيز السطح الداخلي للأنابيب وتوصيل الأنبوب القصير بمداخل القنوات العلوية والسفلية للرقاقة.
- قم بتوصيل وتجهيز أسطح الموائع الدقيقة
- ضع الخزانات المتوسطة في رف المزرعة ، وقم بتوصيل الإبرة تحت الجلد بالمدخل السفلي للرقائق ، وأخيرا ، استوعب جميع الرقائق في حامل (ناقلات) الإسكان داخل الحاضنة.
- قم بتوصيل الرقائق بالمضخة التمعجية ، ثم افحص جميع الموصلات للتأكد من توصيل جميع الرقائق بشكل صحيح وأنه لا يوجد تسرب مرئي لوسائط زراعة الخلايا.
- استخدم زر التطهير الموجود على المضخة واحتفظ به لمدة 15 ثانية تقريبا أو حتى تظهر قطرات وسط زراعة الخلايا في نهاية أنبوب التدفق الخارجي.
- استخدم نظام التحكم في المضخة لضبط معدل تدفق رقاقة العضو المناسب (الشكل 2 والشكل 3 والشكل 4 والشكل 5).
7. صيانة الرقائق
- صيانة رقاقة الجهاز
- تحضير وسط زراعة الخلايا الطازجة للظهارة و / أو البطانة وتنفيذ خطوات التفريغ (كما هو موضح سابقا في الخطوة 6.2).
- أوقف المضخة التمعجية مؤقتا ، وافصل الرقائق بعناية عن المضخة ، واستخرج حامل (ناقلات) غلاف الرقاقة. نقل الرقائق من الحاضنة إلى BSC وإزالة حجم الوسائط المتبقية في الخزانات.
- استبدل وسائط زراعة الخلايا في خزانات المدخل العلوية والسفلية ب 5 مل من وسائط زراعة الخلايا الطازجة وضع حامل (ناقلات) غلاف الرقائق مرة أخرى في الحاضنة. قم بتوصيل الرقائق بالمضخة التمعجية وأعد تشغيل التدفق.
ملاحظة: يوصى باستخدام وظيفة التطهير لتحديث الوسط بسرعة إلى حجرة الأوعية الدموية وتقليل خطر حدوث فقاعات هواء. - كرر الخطوات 7.1.1-7.1.3 كل يومين ، كما هو موضح في الشكل 2 والشكل 3 والشكل 4 والشكل 5.
- إنشاء واجهة الهواء والسائل (ALI)
- أوقف المضخة التمعجية مؤقتا ، وافصل الرقائق بعناية عن المضخة ، واستخرج حامل (ناقلات) غلاف الرقاقة. نقل الرقائق من الحاضنة إلى خزانة السلامة الحيوية ، وإزالة حجم الوسط الأيسر في الخزان العلوي.
- قم بسحب كل الوسط برفق من قناة الموائع الدقيقة العلوية وقم بتثبيت أنبوب الموائع الدقيقة القصير المتصل بالمداخل العلوية باستخدام مشابك الموثق لتقليل تبخر الوسائط وصيانة ALI.
- ضع الشريحة المفتوحة على حامل (حاملات) الإسكان مرة أخرى في الحاضنة وأعد توصيل الرقائق بالمضخة التمعجية.
ملاحظة: يوصى باستخدام وظيفة التطهير لتحديث الوسط بسرعة إلى حجرة الأوعية الدموية وتقليل خطر حدوث فقاعات هواء. - استئناف التدفق عن طريق بدء تشغيل المضخة التمعجية.
- تمتد (اختياري)
- أوقف المضخة التمعجية مؤقتا وقم بتوصيل منافذ تفريغ الرقائق بوحدة التفريغ باستخدام أنبوبين طويلين من الموائع الدقيقة لكل شريحة.
- استخدم وحدة التفريغ لضبط إعداد التمدد على الحالة الموصى بها لكل عضو كما هو محدد داخل جداول بروتوكول الجهاز: الجدول التكميلي 1 للبشرة. الجدول التكميلي 2 للحويصلات الهوائية؛ الجدول التكميلي 2 لمجرى الهواء؛ والجدول التكميلي 4 للأمعاء.
- افحص توصيلات الأنبوب بصريا للتأكد من توصيل جميع الرقائق بشكل صحيح وعدم وجود قطرات مرئية من التنقيط المتوسط.
- استئناف التدفق عن طريق بدء تشغيل المضخة التمعجية.
8. بذر الخلايا البطانية في حجرة الأوعية الدموية
- تحضير الخلايا والرقائق لبذر الخلايا الوعائية
- استزراع الخلايا البطانية الخاصة بالأنسجة حسب توجيهات مقدمي الخدمة حتى 80٪ -90٪ متقاربة. فصل الخلايا باستخدام إجراء إنزيم محلل للبروتين (على النحو الموصى به من قبل المزود) ، وأخيرا ، أعد تعليق الخلايا البطانية في محلول 3 × 106 خلايا / مل.
ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج ، احصد الخلايا البطانية عند ممر منخفض (P2-P4) خلال مرحلة النمو النشط عندما تصل إلى التقاء يتراوح بين 70٪ -90٪. - أوقف المضخة التمعجية مؤقتا. انقل الرقائق من الحاضنة إلى BSC ، وافصل الرقائق عن خزانات الوسائط وأي أنابيب متصلة ، ثم قم بتجميع الرقائق في أطباق بتري منفصلة.
- قم بتحديث وسط زراعة الخلايا في المقصورة الظهارية بوسط زراعة الخلايا الظهارية الطازجة. شطف قناة الأوعية الدموية مع زراعة خلايا البطانة الطازجة المتوسطة مرتين ، ثم استنشاق الوسط من حجرة الأوعية الدموية.
- استزراع الخلايا البطانية الخاصة بالأنسجة حسب توجيهات مقدمي الخدمة حتى 80٪ -90٪ متقاربة. فصل الخلايا باستخدام إجراء إنزيم محلل للبروتين (على النحو الموصى به من قبل المزود) ، وأخيرا ، أعد تعليق الخلايا البطانية في محلول 3 × 106 خلايا / مل.
- بذر الخلايا البطانية
- قم بزرع القناة السفلية (الوعائية) ب 25 ميكرولتر من تعليق الخلايا البطانية (3 × 106 خلايا / مل) ، واقلب الرقائق رأسا على عقب للسماح للخلايا البطانية بالالتصاق بالسطح العلوي لغرفة الموائع الدقيقة.
ملاحظة: أضف 50 ميكرولتر من تعليق الخلية لكل شريحة (600 ميكرولتر لكل 12 شريحة). - ضع الرقائق في أطباق بتري. ضعها مرة أخرى في الحاضنة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 ، واترك الخلايا البطانية تلتصق لمدة 1 ساعة.
- بعد 1 ساعة ، انقل الرقائق من الحاضنة إلى BSC. شطف قناة الأوعية الدموية مع وسط زراعة الخلايا البطانية مرتين لإزالة الحطام الخلوي.
- كرر الخطوات 8.2.1-8.2.2 لزرع القناة الوعائية مرة أخرى بالخلايا البطانية ووضع الرقائق بشكل مسطح لتسهيل التصاق الخلايا البطانية بالسطح السفلي للقناة الوعائية.
- قم بزرع القناة السفلية (الوعائية) ب 25 ميكرولتر من تعليق الخلايا البطانية (3 × 106 خلايا / مل) ، واقلب الرقائق رأسا على عقب للسماح للخلايا البطانية بالالتصاق بالسطح العلوي لغرفة الموائع الدقيقة.
- أعد توصيل الشريحة بالتدفق
- املأ خزان الوسط الوعائي بوسط زراعة الخلايا الوعائية المفرغة تحت BSC.
- ضع الرقائق مرة أخرى داخل حامل (حاملات) غلاف الرقائق وأعد توصيل الرقائق بالخزانات المتوسطة في أحد طرفيها بالمضخة التمعجية على الطرف الآخر.
ملاحظة: يوصى باستخدام وظيفة التطهير لتحديث الوسط بسرعة إلى حجرة الأوعية الدموية وتقليل خطر حدوث فقاعات هواء. - افحص بصريا وصلات الموائع الدقيقة للتأكد من توصيل جميع الرقائق بشكل صحيح وعدم وجود قطرات مرئية من التنقيط المتوسط. بعد ذلك ، استأنف تدفق السوائل عن طريق بدء تشغيل المضخة التمعجية.
9. مقايسات نقطة النهاية الشائعة
- افصل الرقائق لفحوصات نقطة النهاية
- أوقف المضخة التمعجية مؤقتا ، وافصل الرقائق بعناية عن المضخة ، واستخرج حامل (ناقلات) غلاف الرقاقة. انقل حامل (حاملات) غلاف الرقائق من الحاضنة إلى BSC واضبط الرقائق مجانا.
- اغسل برفق الحجرة المركزية للرقاقة المفتوحة باستخدام وسط زراعة الخلايا الظهارية والقناة الوعائية باستخدام وسط زراعة البطانة مرتين لإزالة أي حطام خلوي.
- قم بإزالة غطاء الشريحة المفتوحة للوصول إلى المقصورة القمية للشريحة باستخدام الملقط.
- تلطيخ مناعي للفحص المجهري الفلوري
- تابع تثبيت العينات التقليدية والنفاذية والحظر.
ملاحظة: في هذه الدراسة ، تم تثبيت العينات في 200 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهايد (PFA) لمدة 1 ساعة متبوعة بالشطف باستخدام PBS ، والنفاذية في 0.1٪ Triton X-100 لمدة 40 دقيقة والحجب في 1٪ من ألبومين مصل الأبقار لمدة 1 ساعة. - احتضان الرقائق بالأجسام المضادة الأولية (جدول المواد) عند 4 درجات مئوية طوال الليل. ثم اغسل كل من المقصورات الظهارية والبطانية للرقائق ب 200 ميكرولتر من PBS مرتين. ثم ، تابع الأجسام المضادة الثانوية المناسبة لمدة 2 ساعة.
ملاحظة: قم بتخفيف الأجسام المضادة الأولية والأجسام المضادة الثانوية في PBS + 1٪ BSA بتخفيف 1: 100 (الجسم المضاد الأساسي) و 1: 200 (الجسم المضاد الثانوي).
- تابع تثبيت العينات التقليدية والنفاذية والحظر.
- الكيمياء الهيستولوجية المناعية
- استخرج المكافئات اللحمية من الغرفة الرئيسية للرقاقة المفتوحة باستخدام ملاقط ، واجمعها في أنبوب سعة 1.5 مل مملوء بالفورمالين المخزن المحايد بنسبة 10٪ واحتضانها لمدة 24 ساعة على الأقل.
- انقل المكافئ اللحمي الثابت إلى معالج الأنسجة واتبع الخطوات التالية لتحقيق الجفاف الأمثل للعينة.
- اغمر الهيدروجيل في 70٪ إيثانول لمدة 90 دقيقة.
- قم بإزالة الإيثانول بنسبة 70٪ واغمر الهيدروجيل في 80٪ إيثانول لمدة 90 دقيقة.
- قم بإزالة الإيثانول بنسبة 80٪ واغمر الهيدروجيل في 95٪ إيثانول لمدة 90 دقيقة.
- قم بإزالة الإيثانول بنسبة 95٪ واغمر الهيدروجيل في إيثانول 100٪ لمدة 90 دقيقة مرتين.
- قم بإزالة الإيثانول بنسبة 100٪ واغمر الهيدروجيل في محلول من الزيلين لمدة 120 دقيقة مرتين.
- قم بإزالة محلول الزيلين وتسلل إلى مكافئات اللحمة المعالجة في شمع البارافين لمدة 120 دقيقة (~ 2 ساعة) مرتين.
- قم بتضمين مكافئات اللحمة المتسللة في كتل البارافين المقسمة.
- في هذه المرحلة ، يمكن تقسيم المكافئات اللحمية ككتل بارافين باستخدام ميكروتوم ومعالجتها وفقا للتقنيات النسيجية التقليدية26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
النقش الدقيق السطحي
يمكن استخدام التنميط الدقيق للمصفوفة خارج الخلية (ECM) لتكرار التكوين المكاني لواجهة القبو المعوي. يمكن تعديل تكوين رقاقة Open-Top لدمج الطوابع الدقيقة المصممة خصيصا لتقليد التضاريس الطبيعية لواجهة سدى ظهارة القولون (الشكل 6A ، B) والخبايا المعوية بمقياس ميكرومتر (الشكل 6C-E). يرجى ملاحظة أننا استخدمنا سطحا مستويا (غير منقوش) لنماذج الجلد ومجرى الهواء والحويصلات الهوائية. تم استخدام الختم في هذه الحالة للحصول على سطح هيدروجيل موحد لزرع الخلايا الظهارية. اخترنا تصميما يمكن أن يحاكي البنية الطبيعية للغشاء المخاطي المعوي البشري ، والذي يتكون من تناوب القباب الإيجابية والسلبية التي تحاكي الخبايا المعوية.
نماذج الجهاز
قمنا بزراعة وتمييز أربعة ظهارات مختلفة (الجلد والحويصلات الهوائية ومجرى الهواء والأمعاء) باستخدام النموذج الأولي لشريحة Open-Top لإثبات تعدد استخدامات منصة المحاكاة الحيوية هذه. تؤكد الأقسام النسيجية لرقائق الأعضاء وجود خلايا ظهارية متميزة ظاهريا وممثلة لما يلي: ظهارة طبقية في حالة الجلد (الشكل 7) ، ظهارة عمودية طبقية زائفة في حالة مجرى الهواء (الشكل 8 والفيديو التكميلي 1) ، ظهارة حرشفية بسيطة في حالة الحويصلات الهوائية (الشكل 9) ، وظهارة عمودية بسيطة في حالة الأمعاء (الشكل 10). تم الحصول على خلايا الجلد ومجرى الهواء والخلايا السنخية من البائعين المتاحين تجاريا (كما هو محدد في جدول المواد).
الشكل 1: رسم تخطيطي للرقاقة المفتوحة وإعداد الموائع الدقيقة المستخدم في هذه الدراسة. (A-C) عرض علوي ، إسقاط طبقة تلو الأخرى ، وعرض 3D يظهر النموذج الأولي تصميم رقاقة مفتوحة من الأعلى يتألف من الغطاء العلوي القابل للإزالة مع قناة السوائل الدقيقة المغلفة (الأزرق) ، وقناتي الفراغ شبه القمرية جنبا إلى جنب مع غرفة الثقافة (الرمادي) ، والقنوات السائلة الدقيقة البطانية الحلزونية السفلية (أرجواني). (د) حامل رقاقة مصنوع حسب الطلب (يسمى أيضا "نظام المزرعة") بما في ذلك حامل غلاف الرقاقة (السهم الأحمر) ، والمضخة التمعجية ، والخزانات (السهم الأصفر) مرتبة في تكوين يتناسب مع حاضنة زراعة الخلايا المشتركة. € المحرك الهوائي ، الأداة التي تتحكم في الضغط السلبي المطبق على قناة الفراغ للرقائق ، والتي تستخدم لتوليد تجربة خلايا القوة الميكانيكية الدورية أثناء التنفس أو حركة التمعج (التمدد). تم تكييف هذا الرقم بإذن من Varone et al.24. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: نظرة عامة فنية على بروتوكول رقاقة الجلد المكشوفة. (أ) رسم تخطيطي يوضح تسلسل الإجراءات لإعداد رقاقة الجلد المكشوفة من الأعلى و (ب) توفير الخطوة البيولوجية الرئيسية لثقافة رقاقة الجلد المكشوفة. في المرحلة الأولية من تحضير الرقاقة ، يتم تضمين خلايا اللحمة المتوسطة (الخلايا الليفية) في الجل وتحميلها في رقاقة مفتوحة لتشكيل الطبقة اللحمية ، والتي يتم تغليفها لمدة 2-4 ساعات وبذرها بالخلايا الظهارية. بمجرد أن تشكل الخلايا الظهارية طبقة أحادية مدمجة ، فإنها تتعرض للهواء (ALI). يتم الاحتفاظ بالنظام البيولوجي تحت نظام ALI حتى يتم التضحية به للتحليل في اليوم 14. يمكن تطبيق التمدد الميكانيكي أثناء تدفق النظام وفي ALI. يتم الاحتفاظ بالتمدد حتى يتم التضحية بالأنسجة لتحليلها. يمكن العثور على معلومات إضافية حول تكوين الوسائط والكواشف المحددة وأنواع الخلايا في الجدول التكميلي 1. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: نظرة عامة فنية على بروتوكول رقاقة الحويصلات الهوائية المكشوفة. (أ) رسم تخطيطي يوضح تسلسل إجراءات تحضير رقاقة الحويصلات الهوائية المكشوفة؛ (ب) توفير الخطوة البيولوجية الرئيسية لاستزراع رقاقة الحويصلات الهوائية المكشوفة. في المرحلة الأولية من تحضير الرقاقة ، يتم تضمين خلايا اللحمة المتوسطة (الخلايا الليفية) في الجل وتحميلها في رقاقة مفتوحة لتشكيل الطبقة اللحمية ، والتي يتم تغليفها لمدة 2-4 ساعات وبذرها بالخلايا الظهارية الهوائية في وسط مكمل ب KIAD (انظر الجدول التكميلي 2). يتم الحفاظ على الوسط المكمل ب EGF لمدة ~ 4 أيام لدعم نمو الخلايا الظهارية. ثم تتعرض الظهارة للهواء (ALI) لمدة ~ 10 أيام لتحقيق نضوج كامل للأنسجة. يتم زرع الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة الرئوية في اليوم 14 ، ويتم الاحتفاظ بالنظام البيولوجي تحت ALI ونظام التدفق حتى يتم التضحية به للتحليل في اليوم 21. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: نظرة عامة فنية على بروتوكول رقاقة مجرى الهواء المكشوف. (أ) رسم تخطيطي يوضح تسلسل الإجراءات الخاصة بإعداد رقاقة مجرى الهواء المكشوف و (ب) توفير الخطوة البيولوجية الرئيسية لثقافة رقاقة مجرى الهواء المكشوف. في المرحلة الأولية من تحضير الرقاقة ، يتم تضمين خلايا اللحمة المتوسطة (الخلايا الليفية و / أو خلايا العضلات الملساء) في الجل وتحميلها في رقاقة مفتوحة لتشكيل الطبقة اللحمية ، والتي يتم تغليفها لمدة 2-4 ساعات وبذرها بالخلايا الظهارية في وسط مكمل ب EGF (انظر الجدول التكميلي 3). يتم الحفاظ على الوسط المكمل ب EGF لمدة ~ 4 أيام لدعم نمو الخلايا الظهارية. ثم تتعرض الظهارة للهواء (ALI) لمدة ~ 10 أيام لتحقيق نضوج كامل للأنسجة. يتم زرع الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة الرئوية في اليوم 14 ، ويتم الاحتفاظ بالنظام البيولوجي تحت ALI ونظام التدفق حتى يتم التضحية به للتحليل في اليوم 21. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: نظرة عامة فنية على بروتوكول رقاقة الأمعاء المفتوحة. (أ) رسم تخطيطي يوضح تسلسل إجراءات تحضير رقاقة الأمعاء المفتوحة؛ (ب) توفير الخطوة البيولوجية الرئيسية لمزرعة رقاقة الأمعاء المفتوحة. في المرحلة الأولى من تحضير الرقاقة ، يتم تضمين خلايا اللحمة المتوسطة (الخلايا الليفية القولونية) في الجل وتحميلها في رقاقة مفتوحة لتشكيل الطبقة اللحمية ، والتي يتم تغليفها لمدة 2-4 ساعات وبذرها بشظايا من القولون الظهاري التي تم الحصول عليها من الاستئصال السريري. وسط زراعة الخلايا ، بما في ذلك المكملات الغذائية (ROCK و CHIR ، انظر الجدول التكميلي 4) مطلوب أثناء خطوة البذر للحفاظ على صلاحية خلايا القولون والتشكل الفسيولوجي. ثم يتم استخدام وسائط مختلفة لدفع التوسع (اليوم 1 إلى 6) والنضج (اليوم 6 إلى 9) لظهارة القولون. يتم زرع الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة القولونية في اليوم 6 باستخدام وسط زراعة الخلايا البطانية (EGM2 MV) ، ثم يتم استزراعها تحت التدفق باستخدام وسط تمدد ظهاري لمدة تصل إلى 10 أيام أخرى. تتعرض الظهارة ل ALI من اليوم 10 لزيادة تعزيز نضوج الخلايا الظهارية. يمكن تطبيق التمدد الميكانيكي على النظام من اليوم 13 والحفاظ عليه حتى اليوم 16 ، عندما يتم التضحية بنموذج العضو لتحليل نقطة النهاية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: ختم النمط المجهري. (أ) يستخدم المنظر الجانبي والعلوي للطابع الذي يظهر نسيجا دقيقا (ارتفاع 500 ميكرومتر ومصفوفة أعمدة بعرض 250 ميكرومتر) لإعادة إنشاء واجهة أنسجة سرداب القولون والعرض العلوي والجانبي لمجموعة رقاقة الطوابع ، مما يدل على ملاءمة العنصرين عند استخدامهما لصب سطح الهلام. (B) منظر جانبي بزاوية يوضح واجهة الختم والرقاقة. (جيم - ه) صور لسطح الهلام الدقيق مع وبدون خلايا. قضبان المقياس: 200 ميكرومتر. تم تكييف هذا الرقم بإذن من Varone et al.24. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: البيانات التمثيلية التي تم الحصول عليها باستخدام رقاقة الجلد المفتوحة. (أ) رسم تخطيطي يوضح تسلسل العمل لإعداد رقاقة الجلد المكشوفة من الأعلى ويوفر الخطوات البيولوجية الرئيسية لثقافة رقاقة الجلد المكشوفة. (ب) PCNA Cytokeratin 14 و Cytokeratin10 و Involucrin و Fillagrin fluorescence تلطيخ و H&E يظهر بشرة طبقية ناضجة متعددة الطبقات متمايزة على الرقاقة. قضبان المقياس: 100 ميكرومتر. (C) صورة عرض علوي لشريحة الجلد (قضبان المقياس: 5 مم) والمقطع العرضي H&E (قضبان المقياس: 100 ميكرومتر) تظهر وجود الخلايا الليفية داخل طبقة الجلد. (د) PECAM-1 و VE-Cadherin و Von Willebrand تلطيخ مضان يظهر تمايز الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة البشرية المزروعة في رقاقة الجلد المفتوحة. قضبان المقياس: 20 ميكرومتر. (E) تقديم مفهوم الكرتون 3D لرقاقة الجلد المفتوحة. تم تكييف هذا الرقم بإذن من Varone et al.24. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 8: البيانات التمثيلية التي تم الحصول عليها باستخدام رقاقة مجرى الهواء المكشوفة. (أ) رسم تخطيطي يوضح تسلسل العمل لإعداد رقاقة مجرى الهواء المكشوف وتوفير الخطوة البيولوجية الرئيسية لثقافة رقاقة مجرى الهواء المفتوح. (B) MUC5AC (الكأس) ، α و β-توبولين (الخلايا المهدبة) ، بروتين خلية كلارا 16 (خلايا النادي) ، p63 (الخلايا القاعدية / السلفية) وتلطيخ مضان ZO-1 يظهر ظهارة مجرى الهواء الناضجة. قضبان المقياس: 20 ميكرومتر. (C) فيديو / صورة تباين الطور تظهر وجود أهداب الضرب. قضبان المقياس: 50 ميكرومتر. (D) تلطيخ H&E (قضبان المقياس: 20 ميكرومتر) وصورة TEM (أشرطة المقياس: 5 ميكرومتر) تظهر ظهارة طبقية زائفة ناضجة متمايزة على الرقاقة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 9: البيانات التمثيلية التي تم الحصول عليها باستخدام شريحة الحويصلات الهوائية المفتوحة. (أ) رسم تخطيطي يوضح تسلسل عمل تحضير رقاقة الحويصلات الهوائية المفتوحة من الأعلى، ويوفر الخطوة البيولوجية الرئيسية لاستزراع الحويصلات الهوائية المفتوحة. (ب) النوع الأول (HTI-56 ، AT1-α) ، النوع الثاني (HTII-280 ، LAMP3 ، ABCA3 ، الفاعل بالسطح (C) و E-Cadherin تلطيخ مضان يظهر وجود خلايا رئوية ناضجة على رقاقة. قضبان المقياس: 20 ميكرومتر. (C) صورة SEM و TEM تظهر وجود الزغابات الدقيقة والحويصلات الليزوزومية دليل على النمط الظاهري السنخي الناضج. قضبان المقياس: 5 ميكرومتر. (د) المقطع العرضي H& E (قضبان المقياس: 5 ميكرومتر) يؤكد وجود خلايا حرشفية مسطحة تتفق مع النمط الظاهري من النوع الأول والخلايا المكعبة المرصوفة بالحصى المتماسكة مع النمط الظاهري من النوع الثاني ، و (ه) تظهر وجود الخلايا الليفية داخل الطبقة الجلدية (قضبان المقياس: 10 ميكرومتر). (F) تقديم مفهوم الكرتون 3D من رقاقة الحويصلات الهوائية المفتوحة. تم تكييف هذا الرقم بإذن من Varone et al.24. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 10: البيانات التمثيلية التي تم الحصول عليها باستخدام شريحة الأمعاء المفتوحة. (أ) رسم تخطيطي يوضح تسلسل العمل لإعداد رقاقة الأمعاء المفتوحة وتوفير الخطوة البيولوجية الرئيسية لثقافة رقاقة الأمعاء المفتوحة. (ب) منظر جانبي بزاوية يظهر تجميع الطوابع والرقاقة أثناء مرحلة صب الهلام ، والمفهوم الكرتوني للهلام ذو الأنماط الدقيقة وصور تباين الطور لهيكل يشبه القبو منقوش على سطح الهلام ومصنف بقولون على ارتفاعين مختلفين. قضبان المقياس: 200 ميكرومتر. (C) تلطيخ مضان Mucin 2 و E-Cadherin يظهر وجود الخلايا المعوية والخلايا الكأسية الناضجة على الرقاقة. قضبان المقياس: 200 ميكرومتر. (د) مقطع عرضي H&E لهيكل يشبه القبو يظهر وجود الخلايا الليفية داخل طبقة الجلد ويؤكد وجود ظهارة عمودية بسيطة. قضبان المقياس: 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الفيديو التكميلي 1: فيديو تباين الطور يظهر ضرب الأهداب. قضبان المقياس: 100 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي 1: مجموعة رقاقة مفتوحة. (أ) رسم تخطيطي يوضح العرض ثلاثي الأبعاد لمجموعة الرقاقة المفتوحة والعرض الكرتوني لشريحة الجلد المفتوحة مع إبراز المقصورات البيولوجية المختلفة بما في ذلك الظهارية (الأزرق) والجلدية (الصفراء) والأوعية الدموية (الأحمر). (ب) منصة الموائع الدقيقة المجمعة لها شكل 35 مم × 17 مم ، ومنطقة زراعة الأنسجة 0.32 سم2 ، وقناة الموائع الدقيقة الحلزونية السفلية ، وغطاء غرفة مع قناة الموائع الدقيقة. (ج) تتكون المنصة من غرفة ذات جدار بزاوية 5 درجات ، يبلغ قطرها 6 مم على مستوى الغشاء و 5.7 مم في الجزء العلوي من جدار غرفة PDMS وارتفاعها 4 مم وعرضها. يبلغ سمك الغشاء المسامي 50 ميكرومتر ويبلغ قطر المسام 7 ميكرومتر. (د) قناة الموائع الدقيقة السفلية الحلزونية الشكل لها أبعاد مقطع عرضي تبلغ 400 ميكرومتر (ارتفاع) × 600 ميكرومتر (عرض). (ه) نظرة عامة على الجدول الزمني للتجربة والخطوات المطلوبة لإعداد رقاقة الجهاز المفتوحة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الجدول التكميلي 1: الجلد. يقدم الجدول ملخصا للخطوات اليومية الرئيسية ومعلمات التمدد والتدفق المستخدمة خلال المراحل الثلاث لثقافة رقاقة الجلد المفتوحة (النمو والانتشار والتمايز). يوفر الجدول أيضا قائمة بالمواد والتركيبات المتوسطة والتعليمات حول كيفية تحضير الوسائط اللازمة لهذا البروتوكول. تم تحسين تكوين الوسائط الثلاثة للمراحل المختلفة للبروتوكول. على وجه التحديد ، تم تحسين Medium I لمرحلة البذر وزراعة الخلايا الكيراتينية المبكرة. تم تحسين الوسط الثاني للانتشار والتمايز المبكر (تشكيل ظهارة طبقية). تم تحسين وسط ALI للحفاظ على الخلايا الكيراتينية في واجهة الهواء السائل حتى يتم إنتاج بشرة متمايزة تماما. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الجدول التكميلي 2: الحويصلات الهوائية. يقدم الجدول ملخصا للخطوات اليومية الرئيسية ومعلمات التمدد والتدفق المستخدمة خلال المراحل الثلاث لثقافة رقاقة الحويصلات الهوائية المفتوحة (النمو والانتشار والتمايز). يوفر الجدول أيضا قائمة بالمواد والتركيبات المتوسطة والتعليمات حول كيفية تحضير الوسائط اللازمة لهذا البروتوكول. تم تحسين تكوين الوسيطين للمراحل المختلفة للبروتوكول. يرجى ملاحظة أن إضافة المكملات الغذائية (KIAD) إلى وسط زراعة الخلايا أمر بالغ الأهمية لتحقيق التمايز الأمثل للخلايا الرئوية. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الجدول التكميلي 3: مجرى الهواء. يقدم الجدول ملخصا للخطوات اليومية الرئيسية ومعلمات التمدد والتدفق المستخدمة خلال المراحل الثلاث لثقافة رقاقة مجرى الهواء المكشوف (النمو والانتشار والتمايز). يوفر الجدول أيضا قائمة بالمواد والصيغة المتوسطة وتعليمات حول كيفية تحضير الوسيط اللازم لهذا البروتوكول. تم تحسين تكوين الوسط للحفاظ على خلايا مجرى الهواء في واجهة الهواء السائل ، والتي بدورها تحفز التمايز النهائي وتحفز إنتاج المخاط. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الجدول التكميلي 4: الأمعاء. يقدم الجدول ملخصا للخطوات اليومية الرئيسية ومعلمات التمدد والتدفق المستخدمة خلال المراحل الثلاث لثقافة رقاقة الأمعاء المفتوحة (النمو والانتشار والتمايز). يوفر الجدول أيضا قائمة بالمواد والتركيبات المتوسطة والتعليمات حول كيفية تحضير الوسائط اللازمة لهذا البروتوكول. تم تحسين تركيبات كلا الوسائطين للمراحل المختلفة للبروتوكول. على وجه التحديد ، تم تحسين وسط التمدد المكمل بمثبطات CHIR و ROCK للبذر والمرحلة المبكرة من الثقافة لأنه يعزز بقاء ونمو الجزء العضوي القولوني كطبقة أحادية. تم تحسين وسط التمدد للانتشار والتمايز المبكر للطبقة الظهارية الأحادية. تم تحسين وسيط التمايز للتمايز النهائي للطبقة الأحادية الظهارية قبل التعرض لواجهة الهواء والسائل. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تمثل رقاقة Open-Top منصة تمكينية للتحقيق في التفاعل الخلوي المعقد الذي يحدث بين البطانة والسدى والظهارة في بيئة دقيقة خاضعة للرقابة ، في الوقت الفعلي. توفر هذه التقنية مزايا حاسمة على الثقافات العضوية والعضوية التقليدية ، مثل دمج الإشارات الفيزيائية والكيميائية الحيوية ذات الصلة بإعادة تكوين البيئة المكروية للأنسجة البشرية ، بما في ذلك القص السائل (التدفق) ، والتمدد الدوري ، وإعادة بناء تضاريس السطح الظهاري التي تتحقق عن طريق التنميط المجهري. تعمل الخلايا البشرية التي تنمو داخل هذه المنصة في تآزر لتلخيص الوظائف الخاصة بالأنسجة التي يمكن تحليلها عبر التقنيات التقليدية ، بما في ذلك الكيمياء النسيجية المناعية والمقايسات الكيميائية الحيوية باستخدام سوائل التدفق الخارجي (أو النفايات السائلة) من الأجزاء العلوية و / أو السفلية. يسمح التصميم الحالي بالوصول السهل إلى الطبقة الظهارية ، حيث تنمو الخلايا في اتصال مباشر مع الخلايا الليفية الخاصة بالأنسجة والخلايا اللحمية الأخرى ، مما يحاكي البنية متعددة الخلايا للأنسجة الظهارية. والجدير بالذكر أن النموذج الأولي لشريحة Open-Top يقدم حلا قابلا للتطبيق للتحديات الشائعة المرتبطة باستخدام منصات الجهاز على الرقاقة الأخرى. في حين أنه يتيح دمج عدة أنواع مختلفة من الخلايا داخل مقصورة انسجة مما يؤدي إلى إنشاء أنسجة 3D معقدة للغاية ، فإنه يسمح أيضا باستخراج سهل لتركيبات الأنسجة المنشأة من جهاز الرقاقة لتحليل المصب ، بما في ذلك تلطيخ H& E التقليدي.
يقدم التصميم الحالي بعض القيود. على سبيل المثال ، يكون الغشاء المرن المتداخل بين القناة الدقيقة الوعائية والمقصورة اللحمية (هيدروجيل) للنموذج الأولي لشريحة Open-Top أكثر سمكا (≈ 50 ميكرومتر مقابل ≈ 1 ميكرومتر) من الفراغ الخلالي الذي يفصل الأنسجة البطانية عن السدى في الأعضاء البشرية الأصلية. على الرغم من أن الغشاء المرن لا يمثل حاجزا ماديا أمام انتشار الجزيئات الكبيرة ، مثل الهرمونات وعوامل paracrine الأخرى التي تتوسط الحديث المتبادل بين الخلايا بين الأنسجة ، إلا أنه قد يحد من التفاعلات المباشرة بين الخلايا الخلوية وهجرة الخلايا من الأوعية الدموية إلى المقصورة اللحمية. أخيرا ، النموذج الأولي لشريحة Open-Top مصنوع من PDMS ، والذي من المعروف أنه يمتص عددا كبيرا من المركبات الكارهة للماء. يتم مشاركة هذا القيد من قبل العديد من المنصات القائمة على PDMS والتي يمكن أن تكون عقبة خطيرة في التطبيقات المخصصة لاختبار الديناميكا الدوائية والحرائك الدوائية للمركبات العلاجية الصغيرة27.
أحد التحديات الرئيسية لدمج الهلاميات المائية 3D في جهاز الموائع الدقيقة مثل رقاقة Open-Top ، هو أن PDMS لا يوفر ركيزة مثالية لربط البروتينات أو الخلايا البشرية. وبالتالي ، فإن الوظائف الكيميائية لسطح PDMS هي خطوة حاسمة في هذا البروتوكول المطلوب لضمان طلاء ECM المناسب والتصاق الهيدروجيل بغرفة الهلام لنموذج رقاقة Open-Top. لتحقيق أفضل النتائج ، يجب دائما حماية عامل التشابك في حل ER1 من التعرض المباشر للضوء. مؤشر مهم على الحالة التفاعلية للرابط المتشابك هو لونه. في الواقع ، يخضع الرابط المتشابك في ER1 لانتقال اللون من البرتقالي اللامع إلى البني الداكن عندما يتأكسد. يمكن استخدام انتقال اللون كمؤشر بعد خطوة تنشيط الأشعة فوق البنفسجية للتحقق مما إذا كان المحلول قد تفاعل بشكل فعال مع سطح PDMS. أثناء تحضير محلول التشابك ، يجب مراقبة انتقال اللون للتأكد من أن التعرض العرضي للضوء المباشر لا يؤدي إلى تبييض المركب الكيميائي في المحلول. لحماية محلول الربط المتشابك وتجنب أي تبييض ضوئي غير مرغوب فيه ، نقترح تغليف رقائق الألومنيوم ، حوالي 15 سم × 15 سم ، حول أنبوب مخروطي 15 مل أو باستخدام أنبوب كهرماني متوفر في السوق. يسمح استخدام ER1 بطريقة بسيطة وفعالة لتحقيق الأداء الوظيفي السريع لأسطح PDMS ؛ ومع ذلك ، هناك جزيئات أخرى يمكن استخدامها بدلا من ER1. على سبيل المثال ، الروابط المتشابكة الكيميائية 3-aminopropyl-trimethoxysilane (APTMES) ليست حساسة للضوء مثل ER1 ويمكن استخدامها لتحقيق نتائج مماثلة مع بضع خطوات إضافية كما وصفنا سابقا في مكان آخر28,29. بغض النظر عن الجزيء المفضل ، فإن أحد القيود الرئيسية في العمل مع رابط متشابك كيميائي هو وجود بقايا متبقية ، والتي يمكن أن تحفز السمية الخلوية. بعد تفاعل التنشيط ، من المهم شطف أسطح الموائع الدقيقة بكميات وفيرة من محلول الغسيل.
نظرا لأن فقاعات الهواء تميل إلى التكون والنمو داخل الواجهات الكارهة للماء للرقائق والأنابيب والموصلات ، فمن المهم تقييم ما إذا كان مسار الموائع الدقيقة خاليا من فقاعات الهواء قبل بدء تدفق السوائل. يمكن للفقاعات بالفعل تعطيل التدفق وحتى قتل الخلايا عند توصيل الرقائق بالتدفق. إن تحضير مكونات الموائع الدقيقة قبل بدء تدفق السوائل سيقلل من خطر توليد فقاعات الهواء ويساعد على تحقيق نتائج مثالية وقابلة للتكرار. إذا لم تكن دورة التحضير الموصوفة في هذا البروتوكول كافية ، فإن شطف أنابيب الموائع الدقيقة بالإيثانول (5 دقائق) ، ثم باستخدام HBSS (20 دقيقة) سيخفف من خطر توليد فقاعات هواء داخل الموصلات السائلة.
على الرغم من قيوده ، يمتلك PDMS مزيجا نادرا من الخصائص الكيميائية التي مكنت من تصنيع أجهزة الموائع الدقيقة عالية التوافق الحيوي والشفافية والمرنة. كل هذه الخصائص جعلت PDMS المادة الأكثر تطبيقا على نطاق واسع لبناء نماذج Organ-on-Chip على مدار العقد الماضي. تشير التطورات الحديثة في مجالات علوم المواد والهندسة الكيميائية30,31 إلى أنه يمكن استبدال مكون PDMS لهذه المنصة في المستقبل القريب ببوليمرات اصطناعية جديدة أو مواد حيوية. إذا تم تحقيقه بنجاح ، يمكن أن يتيح تلخيص الخصائص الخاصة بالأنسجة ، بما في ذلك المسامية ، وتكوين ECM للفضاء الخلالي مما يوفر محاكاة أقرب للأنسجة الأصلية البشرية ، ونماذج أكثر تقدما لدراسات علم الأدوية. نتوقع أن التطور المستقبلي لتصميم الشريحة المفتوحة سيمكن من نمذجة الأنسجة والأعضاء البشرية بمستوى غير مسبوق من التفاصيل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن المؤلفون عن المصالح المالية / العلاقات الشخصية التالية ، والتي يمكن اعتبارها مصالح متنافسة محتملة: فارون أنطونيو هو موظف سابق في شركة Emulate Inc. وقد يمتلك حصة في الأسهم في Emulate.
Acknowledgments
اي
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x EMEM | Lonza | 12-684F | Medium; Stroma |
| 18 Gauge needle | MicroGroup | 316H18RW | Tube stainless steel 316 welded, 18RW Full Hard |
| 19 Gauge needle | MicroGroup | 316H19RW | Tube stainless steel 316 welded, 19RW Full Hard |
| 2-Stop PharMed BPT | Cole-Palmer | EW-95723-12 | Tube, 0.25 mm, 12/pack |
| 70% ethanol and wipes | - | - | For surface sterilization |
| 8-Bromoadenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt (8-Br-cAMP) | Sigma | B7880 | Medium supplement |
| A-83-01 | Tocris | 2939 | |
| Adenine | Sigma | A9795 | |
| Advanced DMEM/F12 | Thermo | 12634010 | |
| Airway Epithelial Cells | Lifeline Cell Technology | FC-0016 | |
| Aluminum foil | - | - | - |
| Alveolar cells | Cell Biologics | H6621 | |
| Anti-ABCA3 | ABCAM | ab24751 | Mouse monoclonal antibody [3C9] |
| Anti-Aquaporin5 Alexa Fluor 647 | ABCAM | ab215225 | Rabbit monoclonal antibody [EPR3747] |
| Anti-Aquaporin5 | ABCAM | ab92320 | Rabbit monoclonal antibody [EPR3747] |
| Anti-beta IV Tubulin | ABCAM | ab11315 | Mouse monoclonal antibody [ONS.1A6] |
| Anti-CD31 (PECAM-1) | ABCAM | ab9498 | Mouse monoclonal [JC/70A] antibody |
| Anti-CK5 | ABCAM | ab75869 | Rabbit recombinant monoclonal [AY1E6] |
| Anti-Cytokeratin 10 | ThermoFisher | MA5-13705 | Mouse monoclonal antibody (DE-K10) |
| Anti-Cytokeratin 14 | ABCAM | ab7800 | Mouse monoclonal antibody |
| Anti-E-Cadherin | ABCAM | ab1416 | Mouse monoclonal antibody |
| Anti-Filaggrin | ThermoFisher | PA5-79267 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-HTI-56 | Terrace Biotech | TB-29AHT1-56 | Mouse monoclonal antibody (IgG1) |
| Anti-HTII-280 | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | Mouse monoclonal antibody (IgM) |
| Anti-Involucrin | ThermoFisher | MA5-11803 | Mouse monoclonal antibody (SY5) |
| Anti-Isoforms TA p63-α, -β, -γ | Biolengend | 618902 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Ki67 | ABCAM | ab8191 | Mouse monoclonal antibody [B126.1] |
| Anti-LAMP3 | ABCAM | ab111090 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Mature SP-B | Seven Hill | WRAB-48604 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-MUC5AC | ThermoFisher | PA5-34612 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Mucin-2 | SantaCruz Biotechnology | sc-7314 | Mouse monoclonal antibody (IgG1) |
| Anti-p63 | Dako | GA662 | Mouse monoclonal antibody p63 Protein (Dako Omnis) Clone DAK-p63 |
| Anti-PCNA | ThermoFisher | PA5-32541 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Podoplanin (AT-1α) | ABCAM | ab128994 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Pro + Mature Surfactant Protein B | ABCAM | ab40876 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Surfactant C | Seven Hill | WRAB-9337 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Uteroglobin/SCGB1A1 | Hycult Biotech | HM2178 | Mouse monoclonal antibody [AY1E6] |
| Anti-VE-cadherin | ABCAM | ab33168 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-ZO-1 | ThermoFisher | 33-9100 | Mouse monoclonal antibody [1A12] |
| Ascorbic acid | Sigma | A4544 | |
| Aspirating pipettes | Corning / Falcon | 357558 | 2 mL, polystyrene, individually wrapped |
| Aspirating tips | - | - | Sterile (autoclaved) |
| B27 | Thermo | 17504044 | |
| Blocker BSA (10X) in PBS solution | ThermoFisher | 37525 | Blocker agent |
| Calcium Chloride | Sigma | C7902 | |
| CHIR 99021 | Tocris | 4423 | |
| Collagen I | Advanced Biomatrix | 5133 | 10 mg/mL (Stroma) |
| Collagen I | Advanced BioMatrix | 5005 | 3 mg/mL (Vascular ECM) |
| Collagen IV | Sigma | C5533 | |
| Collagen-IV | Sigma | C5533-5MG | Collagen from human placenta, 5 mg powder, reconstitute to 1 mg/mL |
| Colonic Fibroblasts | Cell Biologics | H6231 | |
| Colonic microvascular endothelial cells | Cell Biologics | H6203 | |
| Conical tubes | - | - | 15 mL and 50 mL polypropylene, sterile |
| Crosslinker (ER-1) | Emulate | 10461 | 5 mg powder |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | ThermoFisher | D3571 | DNA probe |
| Dermal fibroblasts | ATCC | PCS-201-010 | |
| Dermal microvascular endothelial cells | ATCC | CRL-3243 | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
| DMEM | ThermoFisher | 11054020 | |
| DMEM/F-12 | GIBCO | 11320082 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX | GIBCO | 10565-018 | Basal medium for ALI medium |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) | ABCAM | ab150105 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568) | ABCAM | ab175472 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) | ABCAM | ab150107 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | ABCAM | ab150073 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568) | ABCAM | ab175470 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 647) | ABCAM | ab150075 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Dulbecco’s PBS (DPBS-/-) (without Ca2+, Mg2+) | Corning | 21-031-CV | 1x |
| Epidermal Growth Factor (EGF) human, recombinant in E. coli | PromoCell | C-60170 | Medium supplement |
| F-12 Ham’s | Invitrogen | 21700-108 | For vascular ECM |
| FibriCol | Advanced BioMatrix | 5133-20ML | Collagen-I solution (10 mg/mL) |
| Fibronectin | Corning | 356008 | |
| Fibronectin, Human, Natural, | Corning | 47743-654 | human plasma fibronectin |
| Fine-tip precision tweezers | Aven | 18056USA | Technik Style 5B-SA Precision Stainless Steel Tweezers |
| Glutamax | Invitrogen | 21700-108 | |
| Glutamax | Invitrogen | 35050061 | |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 594) | ABCAM | ab150080 | Goat Anti-Mouse secondary antibody |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) | ABCAM | ab150115 | Goat Anti-Mouse secondary antibody |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (FITC) | ABCAM | ab6785 | Goat Anti-Mouse secondary antibody |
| Goat Anti-Mouse IgG1 Alexa Fluor 568 | ThermoFisher | A-21124 | Goat Anti-Mouse IgG1 secondary antibody |
| Goat Anti-Mouse IgM Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A-21042 | Goat Anti-Mouse IgM secondary antibody |
| Handheld vacuum aspirator | Corning | 4930 | - |
| Heat Inactivated HyClone FetalClone II Serum (FCS) | GE Healthcare Life Sciences | SH30066.03 | |
| Hemocytometer | - | - | - |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma | H3149 | |
| HEPES | Thermo | 15630080 | |
| Human [Leu15] - Gastrin | Sigma | G9145 | |
| Human colonoids | Obtained from clinical resections | Obtained from clinical resections | |
| Human EGF Recombinant Protein | Thermo | PHG0311L | |
| human epithelial growth factor | Thermo | PHG0311 | |
| HyClone FetalClone II Serum (U.S.) | GE Healthcare | SH30066.02HI | Sterile FBS heat-inactivated |
| Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt | Sigma | H4881 | |
| Hydrocortisone | PromoCell | C-64420 | Medium supplement |
| Ice bucket | - | - | - |
| Ismatec IPC-N | Cole-Palmer | EW-78000-41 | Low-Speed Digital Peristaltic Pump; q24-Channel (1 per 12 Chips) |
| ITES | BioWhittaker | 17-839Z | |
| Keratinocyte Growth Factor (KGF), also known as Basic Fibroblast Growth Factor 7 (FGF-7), human, recombinant in HEK | PromoCell | C-63821 | |
| Keratinocytes | ATCC | PCS-200-010 | |
| Laminin | Biolamina | CT521-0501 | |
| Laminin, 521 CTG (CT521) | Biolamina | CT521-0501 | human recombinant laminin 521 |
| Lung Fibroblast | Cell Biologics | H6013 | |
| Lung Fibroblast | Lifeline Cell Technology | FC-0049 | |
| Lung microvascular endothelial cells | Lonza | CC-2527 | |
| Lung smooth muscle cells | Lifeline Cell Technology | FC-0046 | |
| Manual counter | - | - | - |
| Masterflex (TPE) Transfer Tubing | Cole-Palmer | FV-96880-02 | PharMed BPT, 1/32" ID x 5/32" OD |
| Medium 199, no phenol red | Thermo | 11043023 | |
| Microcentrifuge tube | - | - | 1.5 mL, sterile |
| Microscope (with camera) | - | - | For bright-field imaging |
| N2 | Sigma | 17502001 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma | A5099 | |
| Noggin (HEK293T conditioned medium) | Sigma | N17001 | |
| Normal Goat Serum | ThermoFisher | 50062Z | Blocking solution |
| O-phosphosrylethanolamine | Sigma | P0503 | |
| Paraformaldehyde (4% wt/vol) | EMS | 15710 | Fixing agent |
| Penicillin Streptomycin | GIBCO | 15140122 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P4333 | 10,000 U/mL; 10 mg/mL |
| Pipette tips | - | - | P20, P200, and P1000 sterile, low adhesion |
| Pipette | Gilson | F167380 | P20, P200, and P1000 |
| PluriQ Serum Replacement (or alternatively KO Serum replacement) | AMSBIO (or Thermo) | N/A (or C1910828010) | |
| Poly-L-Lysine coated microscope glass slides | Sigma | P0425 | Glass slides |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| ProLong Gold | ThermoFisher | P36931 | Antifade Mountant with DAPI |
| Retinoic Acid | Sigma | R2625 | |
| ROCK inhibitor (Y27632) | Tocris | TB1254-GMP/10 | |
| R-spondin (HEK293T conditioned medium) | Sigma | SCC111 | |
| SAGM SingleQuots supplements | Lonza | CC-4124 | |
| SAGMTM Small Airway Epithelial Cell Growth medium BulletKitTM | Lonza | CC-4124 | Medium supplements |
| SB2001190 | Tocris | 1264/10 | |
| Serological pipettes | - | - | 2 mL, 5 mL, 10 mL, and 25 mL low endotoxin, sterile |
| Small Airway Epithelial Cell Growth medium (SAGM) | Lonza | CC-4124 | |
| Solvent Buffer (ER-2) | Emulate | 10462 | 25 mL bottle |
| Steriflip-HV | Millipore | SE1M003M00 | Sterile filtering conical tube |
| Sterilin 100 mm Square Petri Dishes | Thermo | 103 | Sterile, 1 per 6 chips |
| T25 flasks | - | - | - |
| T75 flasks | - | - | - |
| Tri-iodothyronine | Sigma | T5516 | |
| Triton X-100 (0.3% (vol/vol) | Sigma | T8787 | Permeabilization agent |
| Trypan blue | Sigma | 93595 | 0.4% solution |
| TrypEE solution | Sigma | 12604013 | Cell detaching solution |
| TWEEN-20 | Sigma | P2287 | Permeabilization agent |
| UV Light Oven (peak frequency 365nm, intensity of 100 µJ/cm2) | VWR | 21474-598 | UVP, Long Range UV, 365 nm 60Hz Model CL-1000L |
| Vacuum set-up | - | - | Minimum pressure: -70 kPa |
| Vascular Endothelial Growth Factor 165 (VEGF-165) human, recombinant in E. coli | PromoCell | C-64420 | |
| VEGF-165 | PromoCell | C-64420 | Medium supplement |
| Von Willebrand Factor conjugated FITC | ABCAM | ab8822 | Sheep polyclonal antibody |
| Water bath (or beads) | - | - | Set to 37 °C |
| Wnt3A (L-Wnt3A conditioned medium) | ATCC | CRL-2647 |
References
- Van Norman, G. A. Limitations of animal studies for predicting toxicity in clinical trials: Is it time to rethink our current approach. JACC: Basic to Translational Science. 4 (7), 845-854 (2019).
- Wange, R. L., Brown, P. C., Davis-Bruno, K. L. Implementation of the principles of the 3Rs of animal testing at CDER: Past, present and future. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 123, 104953 (2021).
- Mosig, A. S. Organ-on-chip models: New opportunities for biomedical research. Future Science OA. 3 (2), (2017).
- Alépée, N., et al. State-of-the-art of 3D cultures (organs-on-a-chip) in safety testing and pathophysiology. Altex. 31 (4), 441-477 (2014).
- MacArron, R., et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (3), 188-195 (2011).
- Hughes, J. P., Rees, S. S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L.
- Kitaeva, K. V., Rutland, C. S., Rizvanov, A. A., Solovyeva, V. V. Cell culture based in vitro test systems for anticancer drug screening. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 322 (2020).
- Mao, P., et al. Human alveolar epithelial type II cells in primary culture. Physiological Reports. 3 (2), 12288 (2015).
- Zaitseva, M., Vollenhoven, B. J., Rogers, P. A. W. In vitro culture significantly alters gene expression profiles and reduces differences between myometrial and fibroid smooth muscle cells. Molecular Human Reproduction. 12 (3), 187-207 (2006).
- Singh, A., Brito, I., Lammerding, J. Beyond tissue stiffness and bioadhesivity: Advanced biomaterials to model tumor microenvironments and drug resistance. Trends in Cancer. 4 (4), 281-291 (2018).
- Nawroth, J. C., et al. Stem cell-based Lung-on-Chips: The best of both worlds. Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 12-32 (2019).
- Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2d to 3d cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).
- Kapałczyńska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
- Sutherland, R. M., Inch, W. R., McCredie, J. A., Kruuv, J. A multi-component radiation survival curve using an in vitro tumour model. International Journal of Radiation Biology. 18 (5), 491-495 (1970).
- Chandra, P., Lee, S. J. Synthetic extracellular microenvironment for modulating stem cell behaviors. Biomarker Insights. 10, 105-116 (2015).
- Nicolas, J., et al. 3D extracellular matrix mimics: Fundamental concepts and role of materials chemistry to influence stem cell fate. Biomacromolecules. 21 (6), 1968-1994 (2020).
- Brassard, J. A., Lutolf, M. P. Engineering stem cell self-organization to build better organoids. Cell Stem Cell. 24 (6), 860-876 (2019).
- Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. Designing materials to direct stem-cell fate. Nature. 462 (7272), 433-441 (2009).
- Mantha, S., et al. Smart hydrogels in tissue engineering and regenerative medicine. Materials. 12 (20), 3323 (2019).
- Langhans, S. A. Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 6 (2018).
- Li, H., et al. Biomechanical cues as master regulators of hematopoietic stem cell fate. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (16), 5881-5902 (2021).
- Donoghue, L., Nguyen, K. T., Graham, C., Sethu, P. Tissue chips and microphysiological systems for disease modeling and drug testing. Micromachines. 12 (2), 139 (2021).
- Ma, C., Peng, Y., Li, H., Chen, W. Organ-on-a-chip: A new paradigm for drug development. Trends in Pharmacological Sciences. 42 (2), 119-133 (2021).
- Varone, A., et al. A novel organ-chip system emulates three-dimensional architecture of the human epithelia and the mechanical forces acting on it. Biomaterials. 275, 120957 (2021).
- Hassell, B. A., et al. Human organ chip models recapitulate orthotopic lung cancer growth, therapeutic responses, and tumor dormancy in vitro. Cell Reports. 21 (2), 508-516 (2017).
- Sadeghipour, A., Babaheidarian, P.
- Grant, J., et al. Simulating drug concentrations in PDMS microfluidic organ chips. Lab on a Chip. 21 (18), 3509-3519 (2021).
- Barrile, R., et al. Organ-on-chip recapitulates thrombosis Induced by an anti-CD154 monoclonal antibody: Translational potential of advanced microengineered systems. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 104 (6), 1240-1248 (2018).
- Jain, A., et al. Primary human lung alveolus-on-a-chip model of intravascular thrombosis for assessment of therapeutics. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 103 (2), 332-340 (2018).
- Campbell, S. B., Wu, Q., Yazbeck, J., Liu, C., Okhovatian, S., Radisic, M. Beyond polydimethylsiloxane: Alternative materials for fabrication of organ-on-a-chip devices and microphysiological systems. ACS Biomaterials Science and Engineering. 7 (7), 2880-2899 (2021).
- Pun, S., Haney, L. C., Barrile, R. Modelling human physiology on-chip: Historical perspectives and future directions. Micromachines. 12 (10), 1250 (2021).
