Summary
Het huidige protocol beschrijft de mogelijkheden en de essentiële kweekmodaliteiten van de Open-Top Organ-Chip voor de succesvolle vestiging en rijping van organ-on-chip culturen van volledige dikte van primaire weefsels (huid, alveolus, luchtwegen en darm), waardoor de mogelijkheid wordt geboden om verschillende functionele aspecten van de menselijke epitheliale / mesenchymale en vasculaire niche-interface in vitro te onderzoeken.
Abstract
Bijna alle menselijke organen zijn bekleed met epitheelweefsels, bestaande uit een of meerdere lagen van nauw verbonden cellen georganiseerd in driedimensionale (3D) structuren. Een van de belangrijkste functies van epithelia is de vorming van barrières die de onderliggende weefsels beschermen tegen fysieke en chemische beledigingen en infectieuze agentia. Bovendien bemiddelen epithelia het transport van voedingsstoffen, hormonen en andere signaalmoleculen, waardoor vaak biochemische gradiënten ontstaan die de celpositionering en compartimentering in het orgaan sturen. Vanwege hun centrale rol bij het bepalen van de structuur en functie van het orgaan, zijn epithelia belangrijke therapeutische doelen voor veel menselijke ziekten die niet altijd worden vastgelegd door diermodellen. Naast de voor de hand liggende verschillen tussen soorten, wordt het uitvoeren van onderzoek naar barrièrefunctie en transporteigenschappen van epithelia bij dieren verder verergerd door de moeilijkheid om toegang te krijgen tot deze weefsels in een levend systeem. Hoewel tweedimensionale (2D) menselijke celculturen nuttig zijn voor het beantwoorden van fundamentele wetenschappelijke vragen, leveren ze vaak slechte in vivo voorspellingen op. Om deze beperkingen te overwinnen, is in het afgelopen decennium een overvloed aan micro-engineered biomimetische platforms, bekend als organen-op-een-chip, naar voren gekomen als een veelbelovend alternatief voor traditionele in vitro en dierproeven. Hier beschrijven we een Open-Top Organ-Chip (of Open-Top Chip), een platform dat is ontworpen voor het modelleren van orgaanspecifieke epitheelweefsels, waaronder huid, longen en de darmen. Deze chip biedt nieuwe mogelijkheden voor het reconstitueren van de meercellige architectuur en functie van epitheelweefsels, inclusief de mogelijkheid om een 3D-stromale component te recreëren door weefselspecifieke fibroblasten en endotheelcellen op te nemen in een mechanisch actief systeem. Deze Open-Top Chip biedt een ongekend hulpmiddel voor het bestuderen van epitheliale / mesenchymale en vasculaire interacties op meerdere resolutieschalen, van enkele cellen tot meerlaagse weefselconstructen, waardoor moleculaire dissectie van de intercellulaire overspraak van geëpitheliseerde organen in gezondheid en ziekte mogelijk wordt.
Introduction
Historisch gezien hebben wetenschappers vertrouwd op preklinische dierproeven voor het ontdekken van geneesmiddelen, maar een groeiend aantal van deze methoden is in twijfel getrokken vanwege de slechte correlatie met menselijke uitkomst1. De implementatie van de "3V's"-principes om dierproeven te vervangen, te verminderen en te verfijnen, spoort wetenschappers aan om nieuwe in vitro alternatieve methoden te vinden ter ondersteuning van de risicobeoordeling van preklinische geneesmiddelen en chemische toxicologie2. Veel in vitro modellen die tot nu toe zijn ontwikkeld, missen echter de biologische architectuur, cellulaire complexiteit en mechanische omgeving die nodig zijn om de dynamische aard van menselijke levende organen samen te vatten 3,4.
Conventionele in vitro preklinische systemen maken meestal gebruik van 2D-monoculturen van menselijke cellen die op een stijf plastic oppervlak zijn gekweekt. Deze methoden bieden een hulpmiddel voor het uitvoeren van eenvoudige mechanistische studies en maken een snelle screening van kandidaat-geneesmiddelen mogelijk. Vanwege hun relatief lage kosten en hoge robuustheid worden 2D-modellen vaak gecombineerd met automatische high-throughput-systemen en gebruikt voor de snelle identificatie van potentiële kandidaat-geneesmiddelen in de vroege fase van het ontwikkelingsproces van geneesmiddelen 5,6. Dergelijke 2D-modellen bieden echter geen translationele benadering voor het modelleren van weefselniveau, orgaanniveau of systemische reacties op therapeutische kandidaten, wat nodig is voor nauwkeurige voorspellingen van de veiligheid en werkzaamheid van geneesmiddelen tijdens de preklinische fase van hun ontwikkeling. Platte celculturen recapituleren de inheemse weefselmicro-omgeving niet, inclusief het complexe meercellige samenspel, biomechanische eigenschappen en driedimensionale (3D) architectuur van menselijke weefsels7. Cellen die op een plat oppervlak groeien, krijgen vaak geen volwassen fenotype en kunnen daarom niet reageren op farmacologische stimuli zoals ze zouden doen in het inheemse weefsel. Primaire menselijke alveolaire epitheelcellen die in vitro zijn gekweekt, vertonen bijvoorbeeld een plaveiselfenotype en verliezen belangrijke fenotypische markers, waaronder oppervlakteactieve eiwitten C en B (SP-C en SP-B)8. Naast onvoldoende differentiatie worden primaire cellen vaak ongevoelig voor biologische stressoren in vitro, omdat bepaalde biochemische routes geassocieerd met weefselontsteking niet-functioneel worden9. Een dergelijk verlies van celfunctie lijkt voornamelijk geassocieerd te zijn met het gebruik van stijve substraten en het gebrek aan oplosbare factoren die van nature worden vrijgegeven door weefselspecifieke stromale cellen zoals longfibroblasten en gladde spiercellen10,11.
Het inzicht dat het gebrek aan chemo-fysieke en biologische complexiteit het fysiologische gedrag van cellen in vitro beperkt, heeft de ontwikkeling van meer geavanceerde meercellige modellen bevorderd, waarvan is bewezen dat ze de complexiteit van menselijke weefsels buiten het lichaam beter vastleggen12,13. Sinds de creatie van de eerste co-cultuurmodellen in de vroege jaren 197014, heeft de introductie van synthetische en natuurlijke hydrogels het vermogen om inheemse weefselmicro-omgevingen na te bootsen aanzienlijk verbeterd en is het een waardevol hulpmiddel geworden voor het stimuleren van cellulaire differentiatie, het begeleiden van de zelforganisatie van cellen in weefselachtige structuren en het herstel van inheemse weefselfuncties15,16. Wanneer menselijke cellen bijvoorbeeld in de juiste 3D-steiger worden gekweekt, kunnen ze zichzelf rangschikken in functionele structuren zoals sferoïden of organoïden, waardoor stamcelmarkers tot expressie komen en zijn ze in staat tot zelfvernieuwing17. Menselijke cellen (inclusief stamcellen) daarentegen, wanneer ze op traditionele 2D-substraten worden gekweekt, verouderen snel en ondergaan senescentie na een paar passages18. Bovendien kunnen hydrogels worden "aangepast" aan specifieke weefseleigenschappen zoals porositeit, poriegrootte, vezeldikte, visco-elasticiteit, topografie en stijfheid of verder worden ontwikkeld met weefselafgeleide cellulaire componenten en / of bioactieve moleculen die emulatie van de fysiologische of pathologische omstandigheden mogelijk maken19,20. Ondanks hun enorme potentieel voor het testen van geneesmiddelen, geven 3D-hydrogel-gebaseerde modellen die worden gebruikt in farmaceutisch onderzoek de complexe cytoarchitectuur van de in vivo weefsels niet volledig samen en missen ze belangrijke hemodynamische en mechanische stimuli die normaal aanwezig zijn in het menselijk lichaam, waaronder hydrostatische druk, cyclische rek en vloeistofafschuiving21.
Microfysiologische systemen (MPS'en) zoals Organs-on-chips (OOC's) zijn onlangs naar voren gekomen als hulpmiddelen die in staat zijn om complexe fysiologische reacties in vitro vast te leggen 22,23. Deze modellen maken vaak gebruik van microfluïdische platforms, die het mogelijk maken om de dynamische micro-omgeving van levende organen te modelleren.
We hebben de principes van 3D-weefselbio-engineering en mechanobiologie gecombineerd om een Open-Top Chip-model van complex menselijk epitheelweefsel te creëren. Dit stelde ons in staat om de meercellige en dynamische micro-omgeving van epitheelweefsels nauwkeurig samen te vatten. Dit omvat weefselspecifieke biochemische en biomechanische signalen die van nature aanwezig zijn in levende organen, maar vaak worden verwaarloosd door traditionele in vitro modellen24. De Open-Top Chip bevat twee compartimenten: een vasculair compartiment (figuur 1A) en een stromaal compartiment (figuur 1B) gescheiden door een poreus membraan, waardoor de diffusie van voedingsstoffen tussen de twee kamers mogelijk is (figuur 1C). Het vasculaire compartiment wordt blootgesteld aan een continue vloeistofstroom om fysiologische schuifspanning te recapituleren, terwijl het rekbare ontwerp van de stromale kamer het mogelijk maakt om de mechanische belasting te modelleren die gepaard gaat met ademhalingsbewegingen of intestinale peristaltiek. Het stromale compartiment herbergt de afstembare 3D-hydrogelsteiger die is ontworpen om de fysiologische groei van weefselspecifieke fibroblasten te ondersteunen. Het bezit een verwijderbaar deksel dat de oprichting van een lucht-vloeistofinterface vergemakkelijkt, een aandoening die een grotere emulatie van de menselijke fysiologie van slijmvliesweefsels mogelijk maakt, evenals directe toegang tot het weefsel voor het rechtstreeks toedienen van geneesmiddelen op de epitheellaag. Aanvullende figuur 1 toont enkele van de belangrijkste componenten van het open-top chipontwerp, waaronder afmetingen en biologische compartimenten (aanvullende figuur 1A-D), evenals de belangrijkste technische stappen die in dit protocol worden beschreven (aanvullende figuur 1E).
Perfusie van de Open-Top Chip wordt bereikt met een programmeerbare peristaltische pomp (Figuur 1D). De peristaltische pompopstelling maakt het mogelijk om 12 Open-Top Chips tegelijkertijd te perfuseren. De meeste incubators kunnen twee opstellingen huisvesten die de kweek van maximaal 24 chips per incubator mogelijk maken. Mechanisch rekken wordt bereikt met behulp van een op maat gemaakte programmeerbare vacuümdrukregelaar (figuur 1E). Het bestaat uit een elektro-pneumatische vacuümregelaar die elektronisch wordt bestuurd door een digitaal-naar-analoog converter. Met andere woorden, de elektro-pneumatische vacuümregelaar genereert een sinusoïdaal vacuümprofiel met een amplitude en frequentie die door de gebruiker wordt bepaald. Cyclische spanning variërend van 0% tot 15% wordt gegenereerd door negatieve druk toe te passen op het vacuümkanaal van de Open-Top Chip met een amplitude variërend van 0 tot -90 kPa en een frequentie van 0,2 Hz. Het is een op maat gemaakt systeem dat gelijkwaardig is aan de in de handel verkrijgbare Flexcell Strain Unit die eerder is aangenomen en beschreven in andere papers25. Om de mechanische weefselvervorming na te bootsen die bijvoorbeeld gepaard gaat met de ademhalingsbeweging van de long of de peristaltiek van de darm, past de pneumatische actuator sinusoïdale vacuüm / rekgolven toe waarvan de grootte en amplitude kunnen worden aangepast aan het fysiologische niveau van spanning en frequentie dat menselijke cellen ervaren in hun oorspronkelijke weefsel.
Hier beschrijven we een efficiënte en reproduceerbare methode voor het engineeren en kweken van organotypische epitheelequivalenten op een prototype Open-Top Chip-platform. Het maakt het genereren van complexe orgaanmodellen zoals huid, alveolus, luchtwegen en dikke darm mogelijk, terwijl een vasculaire vloeistofstroom en mechanische stretching worden geïntegreerd. We zullen de belangrijkste technische aspecten schetsen waarmee rekening moet worden gehouden bij het implementeren van principes van tissue engineering voor het genereren van complexe epitheliale modellen. We bespreken de voordelen en mogelijke beperkingen van het huidige ontwerp.
Een overzicht van de belangrijkste stappen die worden gebruikt om weefsel- en orgaanrijping te bereiken, inclusief stromings- en rekparameters, wordt weergegeven in: Figuur 2 voor de huid, Figuur 3 voor de alveolus, Figuur 4 voor de luchtwegen en Figuur 5 voor de darm. Aanvullende informatie over de samenstelling van de media en de reagentia die worden gebruikt voor het kweken van de verschillende orgaanmodellen is opgenomen in de aanvullende tabellen (aanvullende tabel 1 voor de huid; aanvullende tabel 2 voor de alveolus; Aanvullende tabel 3 voor de luchtwegen en aanvullende tabel 4 voor de darm).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Menselijke colonoïden werden verkregen uit darmresecties in overeenstemming met de richtlijnen van het Institutional Biosafety Committee van het Cincinnati Children's hospital (IBC 2017-2011).
1. Surface-activering
- Voorbereiding van activeringsbuffer
- Plaats de crosslinker- en oplosmiddelbufferreagentia onder de bioveiligheidskast (BSC) en laat ze gedurende 10 minuten voor gebruik bij kamertemperatuur (RT) balanceren.
- Reconstitueer 5 mg crosslinker in 5 ml van de oplosmiddelbuffer met behulp van een steriele lichtondoordringbare container of een transparante conische buis van 15 ml gewikkeld in aluminiumfolie om de crosslinker-oplossing te beschermen tegen directe blootstelling aan licht.
- Draai de oplossing gedurende 1 minuut om alle klonten te verwijderen en pipetteer vervolgens 50 μL van de crosslinkeroplossing rechtstreeks in het onderste kanaal van de chip en 150 μL in de open bovenkamer.
- Verwijder overtollige crosslinking-oplossing van het oppervlak van de chip met behulp van een aspirator. Pipetteer vervolgens 50 μL van de crosslinking-oplossing rechtstreeks in het onderste kanaal van de chip en 150 μL in de open kamer om eventuele resterende luchtbel te verwijderen.
- Activering met UV-crosslinking machine
- Verwijder voorzichtig het deksel van de chip onder de BSC en bewaar het in een steriele container.
- Breng de chips met de crosslinker-oplossing over in een petrischaaltje, sluit de petrischaal om besmetting te voorkomen en plaats de schaal met de chips onder de UV-crosslinkingmachine.
OPMERKING: Verwijder het deksel van de petrischaal om de UV-blootstelling te maximaliseren. - Stel de UV-crosslinkingmachine met een piekgolflengte van 365 nm in op een intensiteit van 100 μJ/cm2 en schakel het UV-licht gedurende 20 minuten in.
OPMERKING: Na 20 minuten UV-behandeling ziet de crosslinker-oplossing er donkerder (bruin) uit. - Breng de chips terug onder de BSC en zuig de geoxideerde crosslinker-oplossing op. Spoel vervolgens alle chips drie keer met de oplosmiddelbuffer en laat de chips gedurende 5-10 minuten onder de BSC drogen om de chemische functionalisatie van het polydimethylsiloxaan (PDMS) -oppervlak te voltooien.
2. Bereiding van het stroma-equivalent
- Voorbereiding van 10x reconstructiebuffer (100 ml)
- Los 2,2 g natriumbicarbonaat op in 75 ml 0,067 M NaOH in dubbel gedestilleerd water.
- Voeg 4,76 g HEPES toe en breng het volume op 100 ml met dubbel gedestilleerd water.
- Steriele filter de oplossing onder de BSC met behulp van een steriel wegwerpfilter met een membraan van 0,22 μm.
OPMERKING: De oplossing is ongeveer 6 maanden stabiel bij opslag bij 4 °C.
- Schatting van het volume van de pre-geloplossing
- Vermenigvuldig het aantal chips dat nodig is voor het experiment met 150 μL (binnenvolume van de centrale open kamer) om de hoeveelheid pre-geloplossing te schatten die nodig is voor het experiment:
Benodigd volume = (Aantal chips x 150) μL - Bereid de collageen pre-gel oplossing op ijs door het mengen: 1 volume van 10x EMEM met de cellen van uw keuze, 1 volume van 10x reconstructie buffer (zie stap 2.1), 8 volumes collageen I oplossing (10 mg/ml) en 1 μL van 1 N NaOH oplossing voor elke mg collageen I.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om een extra +15% volume voor te bereiden om rekening te houden met experimentele fouten; Het voorbeeld beschreven in paragraaf 2.2 biedt een gedetailleerde stapsgewijze procedure voor het bereiden van voldoende pre-gel oplossing voor 12 chips en een extra volume van 15%.
- Vermenigvuldig het aantal chips dat nodig is voor het experiment met 150 μL (binnenvolume van de centrale open kamer) om de hoeveelheid pre-geloplossing te schatten die nodig is voor het experiment:
- Bereiding van pre-gel oplossing voor het stroma-equivalent (voor 12 chips)
- Breng de volgende oplossingen onder de BSC op ijs: 10x EMEM; 10x Reconstructiebuffer (zie stap 2.1); Collageen I-oplossing (10 mg / ml); en steriele 1 N NaOH-oplossing.
- Kweek weefselspecifieke mesenchymale cellen zoals voorgeschreven door de providers tot 80% -90% confluent en dissocieer vervolgens de cellen met behulp van trypsine of andere methoden zoals aanbevolen door de celprovider. Verzamel de cellen in een pellet door centrifugeren bij 250 x g gedurende 5 minuten bij 24 °C.
- Resuspendeer de celpellet in 225 μL ijskoude 10x EMEM en voeg 225 μL ijskoude 10x reconstructiebuffer toe (zie stap 2.1). Meng de oplossing door voorzichtig op en neer te pipetteren en voeg vervolgens 1.800 μL ijskoude collageen I-oplossing toe.
- Pipetteer 5-6 keer op en neer, vermijd bubbels om de pre-gel-oplossing te mengen terwijl je op ijs bent.
- Opname van het stroma-equivalent op chip (voor 12 chips)
- Neutraliseer de pre-gel oplossing met 18 μL van 1 N NaOH. Meng voorzichtig door 5-6 keer op en neer te pipetteren en pipetteer vervolgens 150 μL celbeladen hydrogel in de centrale kamer van de Open-Top Chip om bubbels te vermijden.
OPMERKING: Als micropatterning vereist is, ga dan naar de volgende stap (sectie 3). - Groepeer de chips in afzonderlijke petrischalen, inclusief een centrifugebuisdop gevuld met 2 ml steriele ddH 2 O in elke petrischaal, en incuber de pettilisalen in de incubator bij 37 °C, 5% CO2.
OPMERKING: Na 90 minuten is de met cellen beladen hydrogel volledig gepolymeriseerd.
- Neutraliseer de pre-gel oplossing met 18 μL van 1 N NaOH. Meng voorzichtig door 5-6 keer op en neer te pipetteren en pipetteer vervolgens 150 μL celbeladen hydrogel in de centrale kamer van de Open-Top Chip om bubbels te vermijden.
3. Micropatterning van het oppervlak (optioneel)
- Voer oppervlaktemicropatterning van de stromale hydrogel uit na het pipetteren van de geneutraliseerde collageenhydrogel (nog steeds in vloeibare toestand) met behulp van 3D-geprinte stempels.
OPMERKING: De 3D-geprinte stempels kunnen worden verkregen in verschillende aanpasbare ontwerpen, zoals eerder elders beschreven24. - Pipetteer 20 μL van de geneutraliseerde collageen I pre-gel oplossing op het patroonoppervlak van een steriele 3D-geprinte stempel en steek de stempel in (bovenop) van de open kamer terwijl de stromale hydrogel nog in vloeibare vorm is.
- Verwijder eventuele resten van de hydrogel die van de bovenkant van de open kamer kunnen morsen met behulp van een aspirator (of een pipet). Groepeer alle chips in afzonderlijke petrischalen en voeg een centrifuge 15 ml conische buisdop gevuld met 2 ml steriele ddH2O toe in elke petrischaal.
- Incubeer alle petrischalen bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 90 minuten, en breng de chips vervolgens terug onder de BSC en verwijder voorzichtig de stempels met een precisiepincet om het risico op beschadiging van de hydrogel te verminderen.
4. Coating van het epitheliale en vasculaire oppervlak met weefselspecifieke ECM-eiwitten
- Coating van de vasculaire microfluïdische kamer met extracellulaire matrixeiwitten
- Vermenigvuldig het aantal chips dat nodig is voor het experiment met 20 μL (volume van het vasculaire kanaal) om het volume vasculaire ECM-coatingoplossing te schatten dat nodig is voor het experiment:
Benodigd volume = (Aantal chips x 20) μL
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om een extra volume van 15% voor te bereiden om rekening te houden met experimentele fouten. - Bereid de vasculaire ECM-coatingoplossing voor alle chips (bijvoorbeeld 300 μL per 12 chips) met behulp van ijskoude PBS of HBSS.
OPMERKING: Raadpleeg de specifieke orgaanprotocoltabel in de sectie aanvullende materialen (aanvullende tabel 1 voor de huid; aanvullende tabel 2 voor de alveolus; Aanvullende tabel 2 voor de luchtwegen en aanvullende tabel 4 voor de darm) om de specifieke reagentia en de aanbevolen ECM-samenstelling te identificeren. - Pipetteer 20 μL vasculaire ECM-coatingoplossing in het vasculaire kanaal van elke chip.
- Vermenigvuldig het aantal chips dat nodig is voor het experiment met 20 μL (volume van het vasculaire kanaal) om het volume vasculaire ECM-coatingoplossing te schatten dat nodig is voor het experiment:
- Het apicale oppervlak van het stromale equivalent bedekken met extracellulaire matrixeiwitten
- Vermenigvuldig het aantal chips dat nodig is voor het experiment met 50 μL (volume van het vasculaire kanaal) om het volume epitheliale ECM-coatingoplossing te schatten dat nodig is voor het experiment:
Benodigd volume = (Aantal chips x 50) μL
OPMERKING: het wordt aanbevolen om een extra volume van 15% voor te bereiden om rekening te houden met experimentele fouten. - Bereid voldoende ECM-coatingoplossing voor alle chips (bijvoorbeeld 750 μL per 12 chips) in ijskoude PBS of HBSS en breng 50 μL epitheliale ECM-coatingoplossing direct over op het hydrogeloppervlak.
OPMERKING: Raadpleeg de specifieke orgaanprotocoltabel in de sectie aanvullende materialen (aanvullende tabel 1 voor de huid; aanvullende tabel 2 voor de alveolus; Aanvullende tabel 2 voor de luchtwegen en aanvullende tabel 4 voor de darm) om de specifieke reagentia en de aanbevolen ECM-samenstelling te identificeren. - Groepeer de chips in afzonderlijke petrischalen, inclusief een centrifuge 15 ml conische buisdop gevuld met 2 ml steriele ddH 2O in elke petrischaal, en incuber de petrischalen in de incubator bij 37 °C, 5% CO 2 gedurende2 uur voordat u doorgaat met het zaaien van epitheelcellen.
- Vermenigvuldig het aantal chips dat nodig is voor het experiment met 50 μL (volume van het vasculaire kanaal) om het volume epitheliale ECM-coatingoplossing te schatten dat nodig is voor het experiment:
5. Epitheelcellen zaaien op het stromale equivalent
- Epitheelcelkweek
- Kweek weefselspecifieke epitheelcellen zoals voorgeschreven door de providers tot 80% -90% confluent.
- Dissocieer de cellen met behulp van proteolytische enzymprocedures zoals aanbevolen door de celleverancier.
OPMERKING: Voor de beste resultaten, oogst epitheelcellen bij lage doorgang (P1-P2) tijdens de actieve groeifase wanneer ze tussen 70% -90% confluentie bereiken. - Eenmaal gedissocieerd, centrifugeer de cellen en verzamel ze als een pellet.
- Suspendeerde de epitheelcellen terug naar de juiste cel-/fragmentdichtheid zoals aangegeven in de specifieke orgaanprotocoltabel.
OPMERKING: In deze studie werd celoplossing gebruikt met een dichtheid van 3 x 10 6 cellen / ml voor de huid, 1 x 10 6 cellen / ml voor de alveolus, 6 x 106 cellen / ml voor de luchtwegen en 8 x 106 fragmenten / ml voor de darm.
- Epitheelcel zaaien
- Breng de chips van de incubator over naar de BSC. Zuig de coatingoplossing uit het vaatkanaal en spoel het vasculaire microfluïdische kanaal driemaal met 50 μL vers endotheelcelkweekmedium.
- Zuig de coatingoplossing op van het hydrogeloppervlak en spoel het stromale oppervlak driemaal af met 100 μL vers epitheelcelkweekmedium om overtollige coatingoplossing te verwijderen.
- Zuig het stijgende medium aan en zaai het hydrogeloppervlak met 50 μL van de epitheelcelsuspensie met behulp van de juiste celdichtheid, zoals aangegeven in de aanvullende tabellen, en breng de chips vervolgens gedurende 2 uur (of 's nachts voor colonoïden) terug in de couveuse.
- Spoel het hydrogeloppervlak voorzichtig tweemaal af met het celkweekmedium om celresten te verwijderen. Ververs ten slotte het medium door autoclaveren in verzegelde autoclaveerbare containers en sluit de chips aan op de peristaltische pomp.
6. Chips verbinden met flow
- Voorbereiding van de vloeibare delen
- Snijd 2 inch biocompatibele polypropyleen-gebaseerde thermoplastische elastomeer (TPE) transferbuis (Table of Materials) om de korte microfluïdische slang voor te bereiden die nodig is voor het aansluiten van de chips op de mediareservoirs.
- Snijd 7,5 inch biocompatibele TPE-overdrachtsbuizen om de lange microfluïdische slang te produceren.
- Bereid voldoende metalen connectoren van 18 G en 19 G voor (materiaaltabel).
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de slangen en connectoren beschreven in stap 6.1.1 en 6.1.2 ten minste 1 dag voor te bereiden en te steriliseren voordat u de Open-Top Chips op de peristaltische pompen aansluit. - Doorboor het deksel van elk medium reservoirs met een 4-inch hypodermische naald (Table of Materials).
- Medium ontgassen
- Laat het celkweekmedium in evenwicht komen tot kamertemperatuur (RT).
- Breng het benodigde volume medium over in een conische filterbuis.
- Pas een negatieve vacuümdruk van -20 PSI toe om het medium te ontgassen (vacuümgestuurde filtratie).
OPMERKING: Als er geen vacuüm beschikbaar is, kan het celkweekmedium 's nachts in de couveuse worden gebalanceerd om vergelijkbare resultaten te bereiken.
- Bereid de Open-Top Chip voor op vloeistofstroom
- Breng de chips en de steriele vloeibare delen onder de BSC en lijn het deksel (bovenste gedeelte) van de Open-Top Chip uit voor het afdichten van het Open-Top Chip-prototype voordat u de vloeistofstroom start.
- Pipetteer 200 μL van het ontgaste celkweekmedium (zie orgaanspecifieke tabellen) in de inlaatpoort van zowel het bovenste als het onderste kanaal van de chip, waarbij u erop let dat bellen worden vermeden.
- Pipetteer 300 μL van het kweekmedium in de korte microfluïdische slang om het binnenoppervlak van de buizen te primen en de korte slang te verbinden met de inlaten van de bovenste en onderste kanalen van de chip.
- Verbind en prime de microfluïdische oppervlakken
- Plaats de middelgrote reservoirs in het landbouwrek, sluit de hypodermische naald aan op de onderste inlaat van de chips en plaats ten slotte alle chips in de behuizingsdrager (s) in de incubator.
- Sluit de chips aan op de peristaltische pomp en inspecteer vervolgens alle connectoren om er zeker van te zijn dat alle chips correct zijn aangesloten en dat er geen zichtbare lekkage van celkweekmedia is.
- Gebruik de Purge-knop op de pomp en houd deze ongeveer 15 s vast of totdat de druppels van het celkweekmedium aan het einde van de uitstroomslang verschijnen.
- Gebruik het besturingssysteem op de pomp om het juiste orgaan-spaandebiet in te stellen (figuur 2, figuur 3, figuur 4 en figuur 5).
7. Onderhoud van chips
- Onderhoud van orgelchips
- Bereid vers celkweekmedium voor het epitheel en/of endotheel en voer de ontgassingsstappen uit (zoals eerder beschreven in stap 6.2).
- Pauzeer de peristaltische pomp, koppel de chips voorzichtig los van de pomp en haal de drager(s) van de chipbehuizing eruit. Breng de chips over van de incubator naar de BSC en verwijder het volume media dat overblijft in de reservoirs.
- Vervang de celkweekmedia naar de bovenste en onderste inlaatreservoirs door 5 ml verse celkweekmedia en plaats de drager(s) van de chipbehuizing terug in de incubator. Sluit de chips aan op de peristaltische pomp en start de stroom opnieuw op.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de Purge-functie te gebruiken om het medium snel naar het vaatcompartiment te verversen en het risico op luchtbellen te verminderen. - Herhaal stap 7.1.1-7.1.3 om de dag, zoals beschreven in figuur 2, figuur 3, figuur 4 en figuur 5.
- Totstandbrenging van een lucht-vloeistofinterface (ALI)
- Pauzeer de peristaltische pomp, koppel de chips voorzichtig los van de pomp en haal de drager(s) van de chipbehuizing eruit. Breng de chips over van de incubator naar de bioveiligheidskast en verwijder het volume medium dat overblijft in het bovenste reservoir.
- Zuig voorzichtig al het medium uit het bovenste microfluïdische kanaal en klem de korte microfluïdische slang die is aangesloten op de bovenste inlaten met behulp van bindmiddelclips om mediaverdamping en onderhoud van ALI te verminderen.
- Plaats de Open-Top Chip op de behuizingsdrager(s) terug in de incubator en sluit de chips opnieuw aan op de peristaltische pomp.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de Purge-functie te gebruiken om het medium snel naar het vaatcompartiment te verversen en het risico op luchtbellen te verminderen. - Hervat de stroom door de peristaltische pomp te starten.
- Stretchen (optioneel)
- Pauzeer de peristaltische pomp en sluit de vacuümpoorten van de chips aan op de vacuümmodule met behulp van twee lange microfluïdische buizen per chip.
- Gebruik de vacuümmodule om de stretchinstelling aan te passen aan de aanbevolen toestand voor elk orgaan, zoals gespecificeerd in de orgaanprotocoltabellen: Aanvullende tabel 1 voor de huid; aanvullende tabel 2 voor de alveolus; Aanvullende tabel 2 voor de luchtwegen; en aanvullende tabel 4 voor de darm.
- Inspecteer visueel de buisverbindingen om er zeker van te zijn dat alle chips goed zijn aangesloten en dat er geen zichtbare druppels medium druppelen.
- Hervat de stroom door de peristaltische pomp te starten.
8. Zaaien van endotheelcellen in het vaatcompartiment
- Bereid cellen en chips voor op het zaaien van vasculaire cellen
- Kweek de weefselspecifieke endotheelcellen zoals voorgeschreven door de providers tot 80% -90% confluent. Dissocieer de cellen met behulp van een proteolytische enzymprocedure (zoals aanbevolen door de leverancier) en resuspensie ten slotte de endotheelcellen in een oplossing van 3 x 106 cellen / ml.
OPMERKING: Voor de beste resultaten, oogst de endotheelcellen bij lage doorgang (P2-P4) tijdens de actieve groeifase wanneer ze tussen 70% -90% confluentie bereiken. - Pauzeer de peristaltische pomp. Breng de chips over van de incubator naar de BSC, koppel de chips los van de mediareservoirs en eventuele aangesloten buizen en groepeer de chips vervolgens in afzonderlijke petrischalen.
- Vernieuw het celkweekmedium van het epitheelcompartiment met vers epitheelcelkweekmedium. Spoel het vaatkanaal tweemaal met vers endotheelcelkweekmedium en zuig het medium vervolgens uit het vaatcompartiment.
- Kweek de weefselspecifieke endotheelcellen zoals voorgeschreven door de providers tot 80% -90% confluent. Dissocieer de cellen met behulp van een proteolytische enzymprocedure (zoals aanbevolen door de leverancier) en resuspensie ten slotte de endotheelcellen in een oplossing van 3 x 106 cellen / ml.
- Zaaien van endotheelcellen
- Zaai het onderste (vasculaire) kanaal met 25 μL endotheelcelsuspensie (3 x 106 cellen / ml), draai de chips ondersteboven om endotheelcellen te laten hechten aan het bovenoppervlak van de microfluïdische kamer.
OPMERKING: Voeg 50 μL van de celsuspensie per chip toe (600 μL per 12 chips). - Groepeer de chips in petrischaaltjes. Plaats ze terug in de couveuse bij 37 °C, 5% CO2, en laat de endotheelcellen zich gedurende 1 uur hechten.
- Breng na 1 uur de chips over van de incubator naar de BSC. Spoel het vaatkanaal tweemaal met endotheelcelkweekmedium om cellulair afval te verwijderen.
- Herhaal stap 8.2.1-8.2.2 om het vaatkanaal opnieuw te bezaaien met endotheelcellen en leg de chips plat om de hechting van de endotheelcellen aan het onderoppervlak van het vasculaire kanaal te vergemakkelijken.
- Zaai het onderste (vasculaire) kanaal met 25 μL endotheelcelsuspensie (3 x 106 cellen / ml), draai de chips ondersteboven om endotheelcellen te laten hechten aan het bovenoppervlak van de microfluïdische kamer.
- Sluit de chip opnieuw aan om te stromen
- Vul het vasculaire mediumreservoir met het ontgaste vasculaire celkweekmedium onder de BSC.
- Plaats de chips terug in de drager(s) van de chipbehuizing en sluit de chips opnieuw aan op de mediumreservoirs aan het ene uiteinde op de peristaltische pomp aan het andere uiteinde.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de Purge-functie te gebruiken om het medium snel naar het vaatcompartiment te verversen en het risico op luchtbellen te verminderen. - Inspecteer visueel de microfluïdische verbindingen om er zeker van te zijn dat alle chips goed zijn aangesloten en dat er geen zichtbare druppels medium druppelen. Hervat vervolgens de vloeistofstroom door de peristaltische pomp te starten.
9. Gemeenschappelijke eindpunttests
- Koppel chips los voor endpoint assays
- Pauzeer de peristaltische pomp, koppel de chips voorzichtig los van de pomp en haal de drager(s) van de chipbehuizing eruit. Breng de drager(s) van de chipbehuizing over van de incubator naar de BSC en maak de chips vrij.
- Was de centrale kamer van de Open-Top Chip voorzichtig met het epitheelcelkweekmedium en het vaatkanaal met het endotheelkweekmedium tweemaal om cellulair vuil te verwijderen.
- Verwijder het deksel van de Open-Top Chip om met een pincet toegang te krijgen tot het apicale compartiment van de chip.
- Immunostaining voor fluorescentiemicroscopie
- Ga verder met conventionele monsterfixatie, permeabilisatie en blokkering.
OPMERKING: In deze studie werden de monsters gefixeerd in 200 μL van 4% paraformaldehyde (PFA) gedurende 1 uur, gevolgd door spoelen met PBS, permeabilisatie in 0,1% Triton X-100 gedurende 40 minuten en blokkering in 1% runderserumalbumine gedurende 1 uur. - Incubeer de chips met primaire antilichamen (Table of Materials) bij 4 °C gedurende een nacht. en was vervolgens zowel epitheliale als endotheelcompartimenten van de chips tweemaal met 200 μL PBS. Ga vervolgens verder met de juiste secundaire antilichamen gedurende 2 uur.
OPMERKING: Verdun de primaire antilichamen en secundaire antilichamen in PBS + 1% BSA bij een verdunning van 1:100 (primair antilichaam) en 1:200 (secundair antilichaam).
- Ga verder met conventionele monsterfixatie, permeabilisatie en blokkering.
- Immunohistochemie
- Haal de stromale equivalenten uit de hoofdkamer van de Open-Top Chip met een pincet, verzamel ze in een buis van 1,5 ml gevuld met 10% neutraal gebufferde formaline en incubeer gedurende ten minste 24 uur.
- Breng het vaste stromale equivalent over naar de weefselprocessor en volg de onderstaande stappen om optimale uitdroging van het monster te bereiken.
- Dompel de hydrogel gedurende 90 minuten onder in 70% ethanol.
- Verwijder de 70% ethanol en dompel de hydrogel gedurende 90 minuten onder in 80% ethanol.
- Verwijder de 80% ethanol en dompel de hydrogel gedurende 90 minuten onder in 95% ethanol.
- Verwijder de 95% ethanol en dompel de hydrogel twee keer 90 min onder in 100% ethanol.
- Verwijder de 100% ethanol en dompel de hydrogel tweemaal 120 minuten onder in een oplossing van xyleen.
- Verwijder de xyleenoplossing en infiltreer de verwerkte stromale equivalenten in paraffine gedurende 120 minuten (~ 2 uur) tweemaal.
- Integreer de geïnfiltreerde stromale equivalenten in het doorsneden van paraffineblokken.
- Op dit punt kunnen de stromale equivalenten worden gesegmenteerd als paraffineblokken met behulp van een microtoom en verwerkt volgens conventionele histologische technieken26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Micropatterning van het oppervlak
Micropatterning van de extracellulaire matrix (ECM) kan worden gebruikt om de ruimtelijke configuratie van de intestinale crypte-interface te repliceren. De Open-Top Chip-configuratie kan worden aangepast om microgepatterde stempels te integreren die speciaal zijn ontworpen om de natuurlijke topografie van de colonepitheel-stroma-interface (figuur 6A, B) en de darmcrypten op micrometerschaal na te bootsen (figuur 6C-E). Houd er rekening mee dat we een plat (niet gedessineerd) oppervlak hebben gebruikt voor de huid-, luchtweg- en alveolus-modellen. De stempel werd in dit geval gebruikt om een uniform hydrogeloppervlak te verkrijgen om epitheelcellen te zaaien. We kozen voor een ontwerp dat de natuurlijke architectuur van het menselijke darmslijmvlies kon nabootsen, bestaande uit de afwisseling van positieve en negatieve koepels die de darmcrypten nabootsen.
Orgel-modellen
We kweekten en differentieerden vier verschillende epithelia (huid, alveolus, luchtwegen en darm) met behulp van het Open-Top Chip-prototype om de veelzijdigheid van dit biomimetische platform te bewijzen. Histologische secties van de orgaanchips bevestigen de aanwezigheid van epitheelcellen die fenotypisch onderscheiden en representatief zijn voor: een gestratificeerd epitheel in het geval van de huid (figuur 7), pseudo-gestratificeerd kolomepitheel in het geval van de luchtweg (figuur 8 en aanvullende video 1); eenvoudig plaveiselepitheel in het geval van de alveolus (figuur 9); en eenvoudig zuilvormig epitheel in het geval van de darm (figuur 10). Huid-, luchtweg- en alveolaire cellen werden allemaal verkregen van commercieel verkrijgbare leveranciers (zoals gespecificeerd in de materiaaltabel).
Figuur 1: Schema van de Open-Top Chip en de microfluïdische opstelling die in dit onderzoek is gebruikt. (A-C) Top-view, laag-voor-laag projectie en 3D-rendering met het prototype Open-Top Chip-ontwerp bestaande uit het verwijderbare bovenste deksel met omhuld micro-fluïdisch kanaal (blauw), de twee semi-maan vacuümkanalen naast de kweekkamer (grijs) en de onderste spiraalvormige endotheliale micro-fluïdische kanalen (magenta). (D) Op maat gemaakte chiphouder (ook wel "Farm-systeem" genoemd) inclusief de chiphuisdrager (rode pijl), de peristaltische pomp en reservoirs (gele pijl) gerangschikt in een configuratie die past in een gemeenschappelijke celkweekincubator. € Pneumatische actuator, het instrument dat de negatieve druk regelt die wordt uitgeoefend op het vacuümkanaal van de chips, dat wordt gebruikt om de cyclische mechanische kracht te genereren die cellen ervaren tijdens ademhaling of peristaltiekbeweging (stretch). Dit cijfer is aangepast met toestemming van Varone et al.24. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Technisch overzicht van het open-top skin-chip protocol. (A) Schema met de volgorde van acties voor het open-top skin-chip preparaat en (B) het verstrekken van de belangrijkste biologische stap van de open-top skin-chip cultuur. In de beginfase van de chipvoorbereiding worden mesenchymale cellen (fibroblasten) ingebed in de gel en geladen in de Open-Top Chip om de stromale laag te vormen, die gedurende 2-4 uur is bedekt en bezaaid met epitheelcellen. Zodra de epitheelcellen een compacte monolaag hebben gevormd, worden ze blootgesteld aan lucht (ALI). Het biologische systeem wordt onder ALI-regime gehouden totdat het op dag 14 wordt opgeofferd voor analyse. Mechanisch rekken kan worden toegepast terwijl het systeem onder stroom is en bij ALI. Het uitrekken wordt bewaard totdat de weefsels worden opgeofferd voor analyse. Aanvullende informatie over mediasamenstelling, specifieke reagentia en celtypen is te vinden in aanvullende tabel 1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Technisch overzicht van het open-top alveolus-chip protocol. (A) Schema met de volgorde van acties voor het open-top alveolus-chip preparaat en (B) het verstrekken van de belangrijkste biologische stap van de open-top alveolus-chip cultuur. In de beginfase van de chipvoorbereiding worden mesenchymale cellen (fibroblasten) ingebed in de gel en geladen in de Open-Top Chip om de stromale laag te vormen, die gedurende 2-4 uur wordt gecoat en bezaaid met luchtwegepitheelcellen in een medium aangevuld met KIAD (zie aanvullende tabel 2). EGF-aangevuld medium wordt gedurende ~ 4 dagen gehandhaafd om de groei van epitheelcellen te ondersteunen. Het epitheel wordt vervolgens gedurende ~ 10 dagen blootgesteld aan lucht (ALI) om volledige weefselrijping te bereiken. Pulmonale microvasculaire endotheelcellen worden op dag 14 gezaaid en het biologische systeem wordt onder ALI- en stroomregime gehouden totdat het op dag 21 wordt opgeofferd voor analyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Technisch overzicht van het open-top airway-chip protocol. (A) Schema met de volgorde van acties voor de open-top airway-chip voorbereiding en (B) het verstrekken van de belangrijkste biologische stap van de open-top airway-chip cultuur. In de beginfase van de chipvoorbereiding worden mesenchymale cellen (fibroblasten en/of gladde spiercellen) ingebed in de gel en geladen in de Open-Top Chip om de stromale laag te vormen, die gedurende 2-4 uur wordt gecoat en bezaaid met epitheelcellen in medium aangevuld met EGF (zie aanvullende tabel 3). EGF-aangevuld medium wordt gedurende ~ 4 dagen gehandhaafd om de groei van epitheelcellen te ondersteunen. Het epitheel wordt vervolgens gedurende ~ 10 dagen blootgesteld aan lucht (ALI) om volledige weefselrijping te bereiken. Pulmonale microvasculaire endotheelcellen worden op dag 14 gezaaid en het biologische systeem wordt onder ALI- en stroomregime gehouden totdat het op dag 21 wordt opgeofferd voor analyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Technisch overzicht van het open-top darm-chip protocol. (A) Schema met de volgorde van acties voor het open-top darm-chip preparaat en (B) het verstrekken van de belangrijkste biologische stap van de open-top darm-chip cultuur. In de beginfase van de chipvoorbereiding worden mesenchymale cellen (colonfibroblasten) ingebed in de gel en geladen in de Open-Top Chip om de stromale laag te vormen, die gedurende 2-4 uur wordt gecoat en bezaaid met fragmenten van epitheliale colonoïden verkregen uit klinische resecties. Celkweekmedium, inclusief supplementen (ROCK en CHIR, zie aanvullende tabel 4) is vereist tijdens de zaaistap om de levensvatbaarheid van colonoïde cellen en fysiologische morfologie te behouden. Verschillende media worden vervolgens gebruikt om de expansie (dag 1 tot 6) en rijping (dag 6 tot 9) van het colonepitheel aan te sturen. Colonmicrovasculaire endotheelcellen worden op dag 6 gezaaid met behulp van een endotheelcelkweekmedium (EGM2 MV) en vervolgens gedurende maximaal 10 dagen onder stroom gekweekt met een epitheelexpansiemedium. Het epitheel wordt vanaf dag 10 blootgesteld aan ALI om de rijping van epitheelcellen verder te bevorderen. Mechanische stretching kan vanaf dag 13 op het systeem worden toegepast en worden gehandhaafd tot dag 16, wanneer het orgaanmodel wordt opgeofferd voor eindpuntanalyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Micropattern stamping. (A) Het zij- en bovenaanzicht van de stempel met microschaaltextuur (500 μm hoog en 250 μm breedte pillar-array) wordt gebruikt om de coloncrypteweefselinterface en het boven- en zijaanzicht van de stempel-chipassemblage na te bootsen, waarbij de pasvorm van de twee elementen wordt getoond wanneer deze worden gebruikt om het geloppervlak te gieten. (B) Schuine zijaanzicht met de stempel en chip interfacing. (C-E) Afbeeldingen van het micropatterned geloppervlak met en zonder cellen. Schaalstaven: 200 μm. Dit cijfer is aangepast met toestemming van Varone et al.24. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Representatieve gegevens verkregen met de open-top skin-chip. (A) Schema met de volgorde van actie voor het open-top skin-chip-preparaat en met de belangrijkste biologische stappen van de open-top skin-chip cultuur. (B) PCNA Cytokeratine 14, Cytokeratine10, Involucrine en Fillagrin fluorescentiekleuring en H&E met volwassen meerlagige gestratificeerde epidermis gedifferentieerd op de chip. Schaalstaven: 100 μm. (C) Bovenaanzichtfoto van de Skin-Chip (Schaalstaven: 5 mm) en H&E-doorsnede (Schaalstaven: 100 μm) die de aanwezigheid van de fibroblasten in de huidlaag laten zien. (D) PECAM-1, VE-Cadherine en Von Willebrand fluorescentiekleuring die differentiatie van menselijke microvasculaire endotheelcellen laat zien die samen in de open-top skin-chip zijn gekweekt. Schaalbalken: 20 μm. (E) 3D Cartoon concept rendering van de open-top skin-chip. Dit cijfer is aangepast met toestemming van Varone et al.24. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: Representatieve gegevens verkregen met de open-top luchtweg-chip. (A) Schema met de volgorde van actie voor de open-top luchtweg-chip voorbereiding en het verstrekken van de belangrijkste biologische stap van de Open-Top Airway-Chip cultuur. (B) MUC5AC (bokaal), α en β-tubuline (ciiliated cellen), Clara Cell eiwit 16 (Club Cells), p63 (Basale / voorlopercellen) en ZO-1 fluorescentiekleuring die volwassen luchtwegepitheel laten zien. Schaalbalken: 20 μm. (C) Video/afbeelding met fasecontrast die de aanwezigheid van kloppende trilharen laat zien. Schaalstaven: 50 μm. (D) H&E-kleuring (schaalstaven: 20 μm) en TEM-afbeelding (schaalbalken: 5 μm) met volwassen pseudo-gestratificeerd epitheel gedifferentieerd op de chip. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 9: Representatieve gegevens verkregen met de open-top alveolus-chip. (A) Schema met de volgorde van actie voor het open-top alveolus-chippreparaat en met de belangrijkste biologische stap van de open-top alveolus-chipcultuur. (B) Type I (HTI-56, AT1-α), Type II (HTII-280, LAMP3, ABCA3, oppervlakteactieve stof (C) en E-cadherine fluorescentiekleuring die de aanwezigheid van rijpe pneumocyten op de chip aantoont. Schaalstaven: 20 μm. (C) SEM- en TEM-afbeelding die de aanwezigheid van microvilli en lysosomale blaasjes toont die wijzen op een volwassen alveolair fenotype. Schaalstaven: 5 μm. (D) H&E-doorsnede (schaalstaven: 5 μm) die de aanwezigheid bevestigen van platte, plaveiselcellen die consistent zijn met type I-fenotype en kubusvormige, geplaveide cellen die coherent zijn met type II-fenotype, en (E) die de aanwezigheid van de fibroblasten in de huidlaag aantonen (schaalstaven: 10 μm). (F) 3D cartoon concept rendering van de open-top alveolus-chip. Dit cijfer is aangepast met toestemming van Varone et al.24. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 10: Representatieve gegevens verkregen met de open-top darm-chip. (A) Schema met de volgorde van actie voor het Open-Top Intestine-Chip-preparaat en de belangrijkste biologische stap van de Open-Top Intestine-Chip-cultuur. (B) Schuine zijaanzicht met de stempel- en chipassemblage tijdens de gelgietfase, het cartoonconcept van de micropatterned gel en fasecontrastafbeeldingen van een crypte-achtige structuur micropattern op het geloppervlak en bezaaid met colonoïden op twee verschillende hoogten. Schaalstaven: 200 μm. (C) Mucine 2- en E-Cadherin-fluorescentiekleuring die de aanwezigheid van enterocyten en volwassen bokaalcellen op de chip aantoont. Schaalstaven: 200 μm. (D) H&E-doorsnede van een crypte-achtige structuur die de aanwezigheid van de fibroblasten in de huidlaag aantoont en de aanwezigheid van een eenvoudig kolomepitheel bevestigt. Schaalstaven: 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende video 1: Video met fasecontrast die kloppende trilharen laat zien. Schaalstaven: 100 μm. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 1: Open-top chipassemblage. (A) Schema met de driedimensionale weergave van de Open-Top Chip-assemblage en de cartoonweergave van de open-top skin-chip met de verschillende biologische compartimenten gemarkeerd en inclusief epitheliaal (blauw), dermaal (geel) en vasculair (rood). (B) Het geassembleerde microfluïdische platform heeft een formaat van 35 mm x 17 mm, een weefselkweekgebied van 0,32 cm2, een microfluïdisch kanaal met spiraal aan de onderkant en een kamerdeksel met een microfluïdisch kanaal. (C) Het platform bestaat uit een kamer met een schuine wand van 5 graden, met een diameter van 6 mm ter hoogte van het membraan en 5,7 mm aan de bovenkant van de PDMS-kamerwand en een hoogte van 4 mm en breedte. Het poreuze membraan is 50 μm dik en de poriën hebben een diameter van 7 μm. (D) Het onderste spiraalvormige microfluïdische kanaal heeft doorsnedeafmetingen van 400 μm (hoogte) x 600 μm (breedte). (E) Een overzicht van de tijdlijn van het experiment en de stappen die nodig zijn voor het voorbereiden van de Open-Top Organ-Chip. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende tabel 1: Huid. De tabel geeft een overzicht van de belangrijkste dagelijkse stappen en de rek- en stroomparameters die worden gebruikt tijdens de drie fasen van de Open-Top Skin-Chip-cultuur (groei, proliferatie en differentiatie). De tabel bevat ook de lijst met materialen, de mediumformuleringen en instructies voor het bereiden van de media die nodig zijn voor dit protocol. De samenstelling van de drie media is geoptimaliseerd voor de verschillende fasen van het protocol. In het bijzonder is Medium I geoptimaliseerd voor de zaai- en vroege keratinocytencultuurfase. Medium II is geoptimaliseerd voor proliferatie en vroege differentiatie (vorming van een gestratificeerd epitheel). Het ALI-medium is geoptimaliseerd voor het handhaven van keratinocyten op een lucht-vloeistof interface totdat een volledig gedifferentieerde epidermis wordt geproduceerd. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende tabel 2: Alveolus. De tabel geeft een overzicht van de belangrijkste dagelijkse stappen en de rek- en stromingsparameters die worden gebruikt tijdens de drie fasen van de open-top alveolus-chipcultuur (groei, proliferatie en differentiatie). De tabel bevat ook de lijst met materialen, de mediumformuleringen en instructies voor het bereiden van de media die nodig zijn voor dit protocol. De samenstelling van de twee media is geoptimaliseerd voor de verschillende fasen van het protocol. Houd er rekening mee dat de toevoeging van supplementen (KIAD) aan het celkweekmedium van cruciaal belang is om een optimale differentiatie van de pneumocyten te bereiken. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende tabel 3: Luchtweg. De tabel geeft een samenvatting van de belangrijkste dagelijkse stappen en de rek- en stromingsparameters die worden gebruikt tijdens de drie fasen van de open-top luchtwegchipcultuur (groei, proliferatie en differentiatie). De tabel bevat ook de lijst met materialen, de mediumformulering en instructies voor het bereiden van het medium dat nodig is voor dit protocol. De samenstelling van het medium is geoptimaliseerd voor het handhaven van luchtwegcellen op de lucht-vloeistofinterface, wat op zijn beurt terminale differentiatie induceert en de productie van slijm stimuleert. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende tabel 4: Darm. De tabel geeft een samenvatting van de belangrijkste dagelijkse stappen en de rek- en stromingsparameters die worden gebruikt tijdens de drie fasen van de open-top darm-chipcultuur (groei, proliferatie en differentiatie). De tabel bevat ook de lijst met materialen, de mediumformuleringen en instructies voor het bereiden van de media die nodig zijn voor dit protocol. De samenstellingen van beide media zijn geoptimaliseerd voor de verschillende fasen van het protocol. In het bijzonder is het expansiemedium aangevuld met de CHIR- en ROCK-remmers geoptimaliseerd voor het zaaien en de vroege fase van de kweek omdat het de overleving en groei van het colonorganoïdefragment als monolaag bevordert. Het expansiemedium is geoptimaliseerd voor de proliferatie en vroege differentiatie van epitheel monolaag. Het differentiatiemedium is geoptimaliseerd voor terminale differentiatie van de epitheelmonolaag vóór blootstelling aan de lucht-vloeistofinterface. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De Open-Top Chip vertegenwoordigt een faciliterend platform voor het onderzoeken van het complexe cellulaire samenspel tussen endotheel, stroma en epitheel in een gecontroleerde micro-omgeving, in realtime. Deze technologie biedt cruciale voordelen ten opzichte van conventionele organotypische en organoïde culturen, zoals de integratie van fysieke en biochemische signalen die relevant zijn voor het reconstitueren van de micro-omgeving van menselijk weefsel, inclusief fluidic shear (flow), cyclisch stretchen en reconstructie van de epitheliale oppervlaktetopografie bereikt via micropatterning. Menselijke cellen die binnen dit platform groeien, werken in synergie om weefselspecifieke functies samen te vatten die kunnen worden geanalyseerd via conventionele technieken, waaronder immuunhistochemie en biochemische testen met behulp van de uitstroomvloeistoffen (of effluenten) uit de bovenste en / of onderste compartimenten. Het huidige ontwerp biedt gemakkelijke toegang tot de epitheellaag, waar cellen groeien in direct contact met weefselspecifieke fibroblasten en andere stromale cellen, waardoor de meercellige architectuur van epitheelweefsels wordt nagebootst. Met name het Open-Top Chip-prototype biedt een haalbare oplossing voor veelvoorkomende uitdagingen in verband met het gebruik van andere organ-on-chip-platforms. Hoewel het de integratie van verschillende celtypen in een stromaal compartiment mogelijk maakt, wat leidt tot de creatie van zeer complexe 3D-weefsels, maakt het ook eenvoudige extractie van de gevestigde weefselconstructies uit het chipapparaat mogelijk voor downstream-analyse, inclusief conventionele H &E-kleuring.
Het huidige ontwerp vertoont een paar beperkingen. Het elastische membraan tussen het vasculaire microkanaal en het stromale compartiment (hydrogel) van het prototype Open-Top Chip is bijvoorbeeld aanzienlijk dikker (≈ 50 μm versus ≈ 1 μm) dan de interstitiële ruimte die endotheelweefsels scheidt van het stroma in de inheemse menselijke organen. Hoewel het elastische membraan geen fysieke barrière vormt voor de diffusie van grote moleculen, zoals hormonen en andere paracriene factoren die de intercellulaire overspraak tussen weefsels bemiddelen, kan het de directe, cel-celinteracties en de migratie van cellen van het vasculaire naar het stromale compartiment beperken. Ten slotte is het prototype Open-Top Chip gemaakt van PDMS, waarvan bekend is dat het een groot aantal hydrofobe verbindingen absorbeert. Deze beperking wordt gedeeld door veel op PDMS gebaseerde platforms die een ernstig obstakel kunnen vormen in toepassingen die bedoeld zijn voor het testen van de farmacodynamiek en farmacokinetiek van kleine therapeutische verbindingen27.
Een van de belangrijkste uitdagingen van het integreren van 3D-hydrogels in een microfluïdisch apparaat zoals de Open-Top Chip, is dat het PDMS geen optimaal substraat biedt voor de binding van menselijke eiwitten of cellen. Chemische functionalisatie van het PDMS-oppervlak is daarom een kritieke stap in dit protocol die nodig is om een goede ECM-coating en hydrogel-hechting aan de gelkamer van het Open-Top Chip-model te garanderen. Om optimale resultaten te bereiken, moet het crosslinkmiddel in de ER1-oplossing altijd worden beschermd tegen directe blootstelling aan licht. Een belangrijke indicator van de reactieve status van de crosslinker is de kleur. De crosslinker in de ER1 ondergaat in feite een kleurovergang van briljant oranje naar donkerbruin wanneer deze oxideert. De kleurovergang kan worden gebruikt als indicator na de UV-activeringsstap om te controleren of de oplossing effectief heeft gereageerd met het PDMS-oppervlak. Tijdens de bereiding van de crosslinkeroplossing moet de kleurovergang worden gecontroleerd om ervoor te zorgen dat een accidentele blootstelling aan direct licht de chemische verbinding in de oplossing niet fotobleekt. Om de crosslinker-oplossing te beschermen en ongewenste fotobleaching te voorkomen, raden we aan aluminiumfolie, ongeveer 15 cm x 15 cm, rond een conische buis van 15 ml te wikkelen of een amberkleurige buis te gebruiken die op de markt verkrijgbaar is. Het gebruik van de ER1 maakt een eenvoudige en effectieve methode mogelijk voor het bereiken van een snelle functionalisering van de PDMS-oppervlakken; er zijn echter andere moleculen die kunnen worden gebruikt in plaats van ER1. De chemische crosslinkers 3-aminopropyl-trimethoxysilaan (APTMES) is bijvoorbeeld niet zo lichtgevoelig als de ER1 en kan worden gebruikt om vergelijkbare resultaten te bereiken met een paar extra stappen zoals we eerder elders hebben beschreven28,29. Onafhankelijk van het molecuul van keuze, is een van de belangrijkste beperkingen bij het werken met een chemische crosslinker de aanwezigheid van overgebleven residuen, die cytotoxiciteit kunnen induceren. Na de activeringsreactie is het belangrijk om de microfluïdische oppervlakken te spoelen met overvloedige hoeveelheden wasoplossing.
Omdat luchtbellen de neiging hebben zich te vormen en te groeien binnen de hydrofobe interfaces van de chips, slangen en connectoren, is het belangrijk om te beoordelen of het microfluïdische pad vrij is van luchtbellen voordat de vloeistofstroom wordt gestart. Bubbels kunnen inderdaad de stroom verstoren en zelfs de cellen doden wanneer chips zijn verbonden met de stroom. Het primen van de microfluïdische componenten voordat de vloeistofstroom wordt gestart, vermindert het risico op het genereren van luchtbellen en helpt optimale en reproduceerbare resultaten te bereiken. Als de primingcyclus beschreven in dit protocol niet voldoende was, zal het spoelen van de microfluïdische buizen met ethanol (5 min) en vervolgens met HBSS (20 min) het risico op het genereren van luchtbellen in de vloeibare connectoren verder verminderen.
Ondanks zijn beperkingen bezit PDMS een zeldzame combinatie van chemische eigenschappen die de fabricage van zeer biocompatibele, transparante en elastische microfluïdische apparaten mogelijk heeft gemaakt. Al deze eigenschappen hebben PDMS het afgelopen decennium tot het meest breed toegepaste materiaal gemaakt voor de constructie van de Organ-on-Chip-modellen. Recente ontwikkelingen op het gebied van materiaalkunde en chemische technologie30,31 suggereren dat de PDMS-component van dit platform in de nabije toekomst kan worden vervangen door nieuwe synthetische polymeren of biomaterialen. Als het met succes wordt bereikt, kan het recapitulatie van weefselspecifieke eigenschappen mogelijk maken, waaronder porositeit, ECM-samenstelling van de interstitiële ruimte die nauwere mimiek biedt aan menselijke inheemse weefsels, en meer geavanceerde modellen voor farmacologische studies. We verwachten dat de toekomstige evolutie van het Open-Top Chip-ontwerp het mogelijk zal maken om menselijke weefsels en organen met een ongekend detailniveau te modelleren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren de volgende financiële belangen/persoonlijke relaties, die kunnen worden beschouwd als potentiële concurrerende belangen: Varone Antonio is een voormalige werknemer van Emulate Inc. en kan een aandelenbelang in Emulate houden.
Acknowledgments
Geen
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x EMEM | Lonza | 12-684F | Medium; Stroma |
| 18 Gauge needle | MicroGroup | 316H18RW | Tube stainless steel 316 welded, 18RW Full Hard |
| 19 Gauge needle | MicroGroup | 316H19RW | Tube stainless steel 316 welded, 19RW Full Hard |
| 2-Stop PharMed BPT | Cole-Palmer | EW-95723-12 | Tube, 0.25 mm, 12/pack |
| 70% ethanol and wipes | - | - | For surface sterilization |
| 8-Bromoadenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt (8-Br-cAMP) | Sigma | B7880 | Medium supplement |
| A-83-01 | Tocris | 2939 | |
| Adenine | Sigma | A9795 | |
| Advanced DMEM/F12 | Thermo | 12634010 | |
| Airway Epithelial Cells | Lifeline Cell Technology | FC-0016 | |
| Aluminum foil | - | - | - |
| Alveolar cells | Cell Biologics | H6621 | |
| Anti-ABCA3 | ABCAM | ab24751 | Mouse monoclonal antibody [3C9] |
| Anti-Aquaporin5 Alexa Fluor 647 | ABCAM | ab215225 | Rabbit monoclonal antibody [EPR3747] |
| Anti-Aquaporin5 | ABCAM | ab92320 | Rabbit monoclonal antibody [EPR3747] |
| Anti-beta IV Tubulin | ABCAM | ab11315 | Mouse monoclonal antibody [ONS.1A6] |
| Anti-CD31 (PECAM-1) | ABCAM | ab9498 | Mouse monoclonal [JC/70A] antibody |
| Anti-CK5 | ABCAM | ab75869 | Rabbit recombinant monoclonal [AY1E6] |
| Anti-Cytokeratin 10 | ThermoFisher | MA5-13705 | Mouse monoclonal antibody (DE-K10) |
| Anti-Cytokeratin 14 | ABCAM | ab7800 | Mouse monoclonal antibody |
| Anti-E-Cadherin | ABCAM | ab1416 | Mouse monoclonal antibody |
| Anti-Filaggrin | ThermoFisher | PA5-79267 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-HTI-56 | Terrace Biotech | TB-29AHT1-56 | Mouse monoclonal antibody (IgG1) |
| Anti-HTII-280 | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | Mouse monoclonal antibody (IgM) |
| Anti-Involucrin | ThermoFisher | MA5-11803 | Mouse monoclonal antibody (SY5) |
| Anti-Isoforms TA p63-α, -β, -γ | Biolengend | 618902 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Ki67 | ABCAM | ab8191 | Mouse monoclonal antibody [B126.1] |
| Anti-LAMP3 | ABCAM | ab111090 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Mature SP-B | Seven Hill | WRAB-48604 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-MUC5AC | ThermoFisher | PA5-34612 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Mucin-2 | SantaCruz Biotechnology | sc-7314 | Mouse monoclonal antibody (IgG1) |
| Anti-p63 | Dako | GA662 | Mouse monoclonal antibody p63 Protein (Dako Omnis) Clone DAK-p63 |
| Anti-PCNA | ThermoFisher | PA5-32541 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Podoplanin (AT-1α) | ABCAM | ab128994 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Pro + Mature Surfactant Protein B | ABCAM | ab40876 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Surfactant C | Seven Hill | WRAB-9337 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Uteroglobin/SCGB1A1 | Hycult Biotech | HM2178 | Mouse monoclonal antibody [AY1E6] |
| Anti-VE-cadherin | ABCAM | ab33168 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-ZO-1 | ThermoFisher | 33-9100 | Mouse monoclonal antibody [1A12] |
| Ascorbic acid | Sigma | A4544 | |
| Aspirating pipettes | Corning / Falcon | 357558 | 2 mL, polystyrene, individually wrapped |
| Aspirating tips | - | - | Sterile (autoclaved) |
| B27 | Thermo | 17504044 | |
| Blocker BSA (10X) in PBS solution | ThermoFisher | 37525 | Blocker agent |
| Calcium Chloride | Sigma | C7902 | |
| CHIR 99021 | Tocris | 4423 | |
| Collagen I | Advanced Biomatrix | 5133 | 10 mg/mL (Stroma) |
| Collagen I | Advanced BioMatrix | 5005 | 3 mg/mL (Vascular ECM) |
| Collagen IV | Sigma | C5533 | |
| Collagen-IV | Sigma | C5533-5MG | Collagen from human placenta, 5 mg powder, reconstitute to 1 mg/mL |
| Colonic Fibroblasts | Cell Biologics | H6231 | |
| Colonic microvascular endothelial cells | Cell Biologics | H6203 | |
| Conical tubes | - | - | 15 mL and 50 mL polypropylene, sterile |
| Crosslinker (ER-1) | Emulate | 10461 | 5 mg powder |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | ThermoFisher | D3571 | DNA probe |
| Dermal fibroblasts | ATCC | PCS-201-010 | |
| Dermal microvascular endothelial cells | ATCC | CRL-3243 | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
| DMEM | ThermoFisher | 11054020 | |
| DMEM/F-12 | GIBCO | 11320082 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX | GIBCO | 10565-018 | Basal medium for ALI medium |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) | ABCAM | ab150105 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568) | ABCAM | ab175472 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) | ABCAM | ab150107 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | ABCAM | ab150073 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568) | ABCAM | ab175470 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 647) | ABCAM | ab150075 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Dulbecco’s PBS (DPBS-/-) (without Ca2+, Mg2+) | Corning | 21-031-CV | 1x |
| Epidermal Growth Factor (EGF) human, recombinant in E. coli | PromoCell | C-60170 | Medium supplement |
| F-12 Ham’s | Invitrogen | 21700-108 | For vascular ECM |
| FibriCol | Advanced BioMatrix | 5133-20ML | Collagen-I solution (10 mg/mL) |
| Fibronectin | Corning | 356008 | |
| Fibronectin, Human, Natural, | Corning | 47743-654 | human plasma fibronectin |
| Fine-tip precision tweezers | Aven | 18056USA | Technik Style 5B-SA Precision Stainless Steel Tweezers |
| Glutamax | Invitrogen | 21700-108 | |
| Glutamax | Invitrogen | 35050061 | |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 594) | ABCAM | ab150080 | Goat Anti-Mouse secondary antibody |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) | ABCAM | ab150115 | Goat Anti-Mouse secondary antibody |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (FITC) | ABCAM | ab6785 | Goat Anti-Mouse secondary antibody |
| Goat Anti-Mouse IgG1 Alexa Fluor 568 | ThermoFisher | A-21124 | Goat Anti-Mouse IgG1 secondary antibody |
| Goat Anti-Mouse IgM Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A-21042 | Goat Anti-Mouse IgM secondary antibody |
| Handheld vacuum aspirator | Corning | 4930 | - |
| Heat Inactivated HyClone FetalClone II Serum (FCS) | GE Healthcare Life Sciences | SH30066.03 | |
| Hemocytometer | - | - | - |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma | H3149 | |
| HEPES | Thermo | 15630080 | |
| Human [Leu15] - Gastrin | Sigma | G9145 | |
| Human colonoids | Obtained from clinical resections | Obtained from clinical resections | |
| Human EGF Recombinant Protein | Thermo | PHG0311L | |
| human epithelial growth factor | Thermo | PHG0311 | |
| HyClone FetalClone II Serum (U.S.) | GE Healthcare | SH30066.02HI | Sterile FBS heat-inactivated |
| Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt | Sigma | H4881 | |
| Hydrocortisone | PromoCell | C-64420 | Medium supplement |
| Ice bucket | - | - | - |
| Ismatec IPC-N | Cole-Palmer | EW-78000-41 | Low-Speed Digital Peristaltic Pump; q24-Channel (1 per 12 Chips) |
| ITES | BioWhittaker | 17-839Z | |
| Keratinocyte Growth Factor (KGF), also known as Basic Fibroblast Growth Factor 7 (FGF-7), human, recombinant in HEK | PromoCell | C-63821 | |
| Keratinocytes | ATCC | PCS-200-010 | |
| Laminin | Biolamina | CT521-0501 | |
| Laminin, 521 CTG (CT521) | Biolamina | CT521-0501 | human recombinant laminin 521 |
| Lung Fibroblast | Cell Biologics | H6013 | |
| Lung Fibroblast | Lifeline Cell Technology | FC-0049 | |
| Lung microvascular endothelial cells | Lonza | CC-2527 | |
| Lung smooth muscle cells | Lifeline Cell Technology | FC-0046 | |
| Manual counter | - | - | - |
| Masterflex (TPE) Transfer Tubing | Cole-Palmer | FV-96880-02 | PharMed BPT, 1/32" ID x 5/32" OD |
| Medium 199, no phenol red | Thermo | 11043023 | |
| Microcentrifuge tube | - | - | 1.5 mL, sterile |
| Microscope (with camera) | - | - | For bright-field imaging |
| N2 | Sigma | 17502001 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma | A5099 | |
| Noggin (HEK293T conditioned medium) | Sigma | N17001 | |
| Normal Goat Serum | ThermoFisher | 50062Z | Blocking solution |
| O-phosphosrylethanolamine | Sigma | P0503 | |
| Paraformaldehyde (4% wt/vol) | EMS | 15710 | Fixing agent |
| Penicillin Streptomycin | GIBCO | 15140122 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P4333 | 10,000 U/mL; 10 mg/mL |
| Pipette tips | - | - | P20, P200, and P1000 sterile, low adhesion |
| Pipette | Gilson | F167380 | P20, P200, and P1000 |
| PluriQ Serum Replacement (or alternatively KO Serum replacement) | AMSBIO (or Thermo) | N/A (or C1910828010) | |
| Poly-L-Lysine coated microscope glass slides | Sigma | P0425 | Glass slides |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| ProLong Gold | ThermoFisher | P36931 | Antifade Mountant with DAPI |
| Retinoic Acid | Sigma | R2625 | |
| ROCK inhibitor (Y27632) | Tocris | TB1254-GMP/10 | |
| R-spondin (HEK293T conditioned medium) | Sigma | SCC111 | |
| SAGM SingleQuots supplements | Lonza | CC-4124 | |
| SAGMTM Small Airway Epithelial Cell Growth medium BulletKitTM | Lonza | CC-4124 | Medium supplements |
| SB2001190 | Tocris | 1264/10 | |
| Serological pipettes | - | - | 2 mL, 5 mL, 10 mL, and 25 mL low endotoxin, sterile |
| Small Airway Epithelial Cell Growth medium (SAGM) | Lonza | CC-4124 | |
| Solvent Buffer (ER-2) | Emulate | 10462 | 25 mL bottle |
| Steriflip-HV | Millipore | SE1M003M00 | Sterile filtering conical tube |
| Sterilin 100 mm Square Petri Dishes | Thermo | 103 | Sterile, 1 per 6 chips |
| T25 flasks | - | - | - |
| T75 flasks | - | - | - |
| Tri-iodothyronine | Sigma | T5516 | |
| Triton X-100 (0.3% (vol/vol) | Sigma | T8787 | Permeabilization agent |
| Trypan blue | Sigma | 93595 | 0.4% solution |
| TrypEE solution | Sigma | 12604013 | Cell detaching solution |
| TWEEN-20 | Sigma | P2287 | Permeabilization agent |
| UV Light Oven (peak frequency 365nm, intensity of 100 µJ/cm2) | VWR | 21474-598 | UVP, Long Range UV, 365 nm 60Hz Model CL-1000L |
| Vacuum set-up | - | - | Minimum pressure: -70 kPa |
| Vascular Endothelial Growth Factor 165 (VEGF-165) human, recombinant in E. coli | PromoCell | C-64420 | |
| VEGF-165 | PromoCell | C-64420 | Medium supplement |
| Von Willebrand Factor conjugated FITC | ABCAM | ab8822 | Sheep polyclonal antibody |
| Water bath (or beads) | - | - | Set to 37 °C |
| Wnt3A (L-Wnt3A conditioned medium) | ATCC | CRL-2647 |
References
- Van Norman, G. A. Limitations of animal studies for predicting toxicity in clinical trials: Is it time to rethink our current approach. JACC: Basic to Translational Science. 4 (7), 845-854 (2019).
- Wange, R. L., Brown, P. C., Davis-Bruno, K. L. Implementation of the principles of the 3Rs of animal testing at CDER: Past, present and future. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 123, 104953 (2021).
- Mosig, A. S. Organ-on-chip models: New opportunities for biomedical research. Future Science OA. 3 (2), (2017).
- Alépée, N., et al. State-of-the-art of 3D cultures (organs-on-a-chip) in safety testing and pathophysiology. Altex. 31 (4), 441-477 (2014).
- MacArron, R., et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (3), 188-195 (2011).
- Hughes, J. P., Rees, S. S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L.
- Kitaeva, K. V., Rutland, C. S., Rizvanov, A. A., Solovyeva, V. V. Cell culture based in vitro test systems for anticancer drug screening. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 322 (2020).
- Mao, P., et al. Human alveolar epithelial type II cells in primary culture. Physiological Reports. 3 (2), 12288 (2015).
- Zaitseva, M., Vollenhoven, B. J., Rogers, P. A. W. In vitro culture significantly alters gene expression profiles and reduces differences between myometrial and fibroid smooth muscle cells. Molecular Human Reproduction. 12 (3), 187-207 (2006).
- Singh, A., Brito, I., Lammerding, J. Beyond tissue stiffness and bioadhesivity: Advanced biomaterials to model tumor microenvironments and drug resistance. Trends in Cancer. 4 (4), 281-291 (2018).
- Nawroth, J. C., et al. Stem cell-based Lung-on-Chips: The best of both worlds. Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 12-32 (2019).
- Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2d to 3d cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).
- Kapałczyńska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
- Sutherland, R. M., Inch, W. R., McCredie, J. A., Kruuv, J. A multi-component radiation survival curve using an in vitro tumour model. International Journal of Radiation Biology. 18 (5), 491-495 (1970).
- Chandra, P., Lee, S. J. Synthetic extracellular microenvironment for modulating stem cell behaviors. Biomarker Insights. 10, 105-116 (2015).
- Nicolas, J., et al. 3D extracellular matrix mimics: Fundamental concepts and role of materials chemistry to influence stem cell fate. Biomacromolecules. 21 (6), 1968-1994 (2020).
- Brassard, J. A., Lutolf, M. P. Engineering stem cell self-organization to build better organoids. Cell Stem Cell. 24 (6), 860-876 (2019).
- Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. Designing materials to direct stem-cell fate. Nature. 462 (7272), 433-441 (2009).
- Mantha, S., et al. Smart hydrogels in tissue engineering and regenerative medicine. Materials. 12 (20), 3323 (2019).
- Langhans, S. A. Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 6 (2018).
- Li, H., et al. Biomechanical cues as master regulators of hematopoietic stem cell fate. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (16), 5881-5902 (2021).
- Donoghue, L., Nguyen, K. T., Graham, C., Sethu, P. Tissue chips and microphysiological systems for disease modeling and drug testing. Micromachines. 12 (2), 139 (2021).
- Ma, C., Peng, Y., Li, H., Chen, W. Organ-on-a-chip: A new paradigm for drug development. Trends in Pharmacological Sciences. 42 (2), 119-133 (2021).
- Varone, A., et al. A novel organ-chip system emulates three-dimensional architecture of the human epithelia and the mechanical forces acting on it. Biomaterials. 275, 120957 (2021).
- Hassell, B. A., et al. Human organ chip models recapitulate orthotopic lung cancer growth, therapeutic responses, and tumor dormancy in vitro. Cell Reports. 21 (2), 508-516 (2017).
- Sadeghipour, A., Babaheidarian, P.
- Grant, J., et al. Simulating drug concentrations in PDMS microfluidic organ chips. Lab on a Chip. 21 (18), 3509-3519 (2021).
- Barrile, R., et al. Organ-on-chip recapitulates thrombosis Induced by an anti-CD154 monoclonal antibody: Translational potential of advanced microengineered systems. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 104 (6), 1240-1248 (2018).
- Jain, A., et al. Primary human lung alveolus-on-a-chip model of intravascular thrombosis for assessment of therapeutics. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 103 (2), 332-340 (2018).
- Campbell, S. B., Wu, Q., Yazbeck, J., Liu, C., Okhovatian, S., Radisic, M. Beyond polydimethylsiloxane: Alternative materials for fabrication of organ-on-a-chip devices and microphysiological systems. ACS Biomaterials Science and Engineering. 7 (7), 2880-2899 (2021).
- Pun, S., Haney, L. C., Barrile, R. Modelling human physiology on-chip: Historical perspectives and future directions. Micromachines. 12 (10), 1250 (2021).
