Summary
O presente protocolo descreve as capacidades e as modalidades de cultura essenciais do Open-Top Organ-Chip para o estabelecimento e maturação bem-sucedidos de culturas organ-on-chip de espessura total de tecidos primários (pele, alvéolo, vias aéreas e intestino), proporcionando a oportunidade de investigar diferentes aspectos funcionais da interface epitelial/mesenquimal e vascular humana in vitro.
Abstract
Quase todos os órgãos humanos são revestidos por tecidos epiteliais, compreendendo uma ou várias camadas de células fortemente conectadas organizadas em estruturas tridimensionais (3D). Uma das principais funções do epitélio é a formação de barreiras que protegem os tecidos subjacentes contra insultos físicos e químicos e agentes infecciosos. Além disso, os epitélios mediam o transporte de nutrientes, hormônios e outras moléculas sinalizadoras, muitas vezes criando gradientes bioquímicos que guiam o posicionamento celular e a compartimentalização dentro do órgão. Devido ao seu papel central na determinação da estrutura e função do órgão, os epitélios são importantes alvos terapêuticos para muitas doenças humanas que nem sempre são capturadas por modelos animais. Além das óbvias diferenças espécie-espécie, a realização de pesquisas sobre a função de barreira e as propriedades de transporte de epitélios em animais é agravada pela dificuldade de acesso a esses tecidos em um sistema vivo. Embora as culturas de células humanas bidimensionais (2D) sejam úteis para responder a perguntas científicas básicas, elas geralmente produzem previsões in vivo pobres. Para superar essas limitações, na última década, uma infinidade de plataformas biomiméticas microprojetadas, conhecidas como organs-on-a-chip, emergiram como uma alternativa promissora aos testes tradicionais in vitro e em animais. Aqui, descrevemos um Open-Top Organ-Chip (ou Open-Top Chip), uma plataforma projetada para modelar tecidos epiteliais específicos de órgãos, incluindo pele, pulmões e intestinos. Este chip oferece novas oportunidades para reconstituir a arquitetura multicelular e a função dos tecidos epiteliais, incluindo a capacidade de recriar um componente estromal 3D incorporando fibroblastos tecido-específicos e células endoteliais dentro de um sistema mecanicamente ativo. Este Open-Top Chip fornece uma ferramenta inédita para estudar interações epiteliais/mesenquimais e vasculares em múltiplas escalas de resolução, desde células únicas até construções de tecido multicamadas, permitindo assim a dissecção molecular do crosstalk intercelular de órgãos epitelizados na saúde e na doença.
Introduction
Historicamente, os cientistas têm confiado em testes pré-clínicos em animais para a descoberta de drogas, mas um número crescente desses métodos tem sido questionado devido à fraca correlação com o resultado humano1. A implementação dos princípios dos "3Rs" para substituir, reduzir e refinar a experimentação animal insta os cientistas a encontrar novos métodos alternativos in vitro para apoiar a avaliação pré-clínica de risco toxicológico de drogas e produtos químicos2. No entanto, muitos modelos in vitro desenvolvidos até o momento carecem da arquitetura biológica, complexidade celular e ambiente mecânico necessários para recapitular a natureza dinâmica dos órgãos vivos humanos 3,4.
Os sistemas pré-clínicos in vitro convencionais tipicamente empregam monoculturas 2D de células humanas cultivadas em uma superfície plástica rígida. Esses métodos fornecem uma ferramenta para a realização de estudos mecanísticos simples e permitem a triagem rápida de candidatos a drogas. Devido ao seu custo relativamente baixo e alta robustez, os modelos 2D são frequentemente emparelhados com sistemas automáticos de alto rendimento e usados para a rápida identificação de potenciais candidatos a fármacos durante a fase inicial do processo de desenvolvimento de fármacos 5,6. No entanto, tais modelos 2D não fornecem uma abordagem translacional para modelar respostas em nível de tecido, órgão ou sistêmica a candidatos terapêuticos, o que é necessário para previsões precisas de segurança e eficácia de medicamentos durante o estágio pré-clínico de seu desenvolvimento. As culturas de células planas não recapitulam o microambiente do tecido nativo, incluindo a complexa interação multicelular, as propriedades biomecânicas e a arquitetura tridimensional (3D) dos tecidos humanos7. As células que crescem em uma superfície plana muitas vezes não adquirem um fenótipo maduro e, portanto, não podem responder aos estímulos farmacológicos como responderiam no tecido nativo. Por exemplo, células epiteliais alveolares humanas primárias cultivadas in vitro exibem um fenótipo escamoso e perdem marcadores fenotípicos chave, incluindo as proteínas C e B do surfactante (SP-C e SP-B)8. Além da diferenciação insuficiente, as células primárias frequentemente tornam-se insensíveis a estressores biológicos in vitro, à medida que certas vias bioquímicas associadas à inflamação tecidual tornam-se nãofuncionais9. Essa perda da função celular parece estar primariamente associada ao uso de substratos rígidos, bem como à falta de fatores solúveis liberados naturalmente pelas células estromais tecido-específicas, como fibroblastos pulmonares e células musculareslisas10,11.
A compreensão de que a falta de complexidade físico-química e biológica limita o comportamento fisiológico das células in vitro tem fomentado o desenvolvimento de modelos multicelulares mais sofisticados, que têm demonstrado captar melhor a complexidade dos tecidos humanos fora do organismo12,13. Desde a criação dos primeiros modelos de co-cultura no início da década de 197014, a introdução de hidrogéis sintéticos e naturais melhorou significativamente a capacidade de mimetizar microambientes de tecidos nativos e tornou-se uma ferramenta inestimável para impulsionar a diferenciação celular, orientar a auto-organização das células em estruturas semelhantes a tecidos e restaurar as funções dos tecidos nativos15,16. Por exemplo, quando cultivadas no arcabouço 3D apropriado, as células humanas podem se auto-organizar em estruturas funcionais, como esferoides ou organoides, expressando marcadores de células-tronco, e são capazes de se auto-renovar17. Em contraste, as células humanas (incluindo células-tronco), quando cultivadas em substratos 2D tradicionais, envelhecem rapidamente e sofrem senescência após algumas passagens18. Além disso, os hidrogéis podem ser "adaptados" para corresponder a propriedades específicas do tecido, como porosidade, tamanho dos poros, espessura da fibra, viscoelasticidade, topografia e rigidez, ou ainda projetados com componentes celulares derivados do tecido e/ou moléculas bioativas, permitindo a emulação das condições fisiológicas ou patológicas19,20. Apesar de seu enorme potencial para testes de fármacos, os modelos 3D baseados em hidrogel utilizados em pesquisas farmacêuticas não recapitulam completamente a complexa citoarquitetura dos tecidos in vivo e carecem de importantes estímulos hemodinâmicos e mecânicos normalmente presentes no corpo humano, incluindo pressão hidrostática, estiramento cíclico e cisalhamento de fluidos21.
Sistemas microfisiológicos (MPSs) como os Organs-on-chips (OOCs) têm emergido recentemente como ferramentas capazes de captar respostas fisiológicas complexas in vitro22,23. Esses modelos frequentemente empregam o uso de plataformas microfluídicas, que permitem a modelagem do microambiente dinâmico de órgãos vivos.
Combinamos os princípios da bioengenharia de tecidos 3D e da mecanobiologia para criar um modelo Open-Top Chip de tecido epitelial humano complexo. Isso nos permitiu recapitular de perto o microambiente multicelular e dinâmico dos tecidos epiteliais. Isso inclui pistas bioquímicas e biomecânicas tecido-específicas naturalmente presentes em órgãos vivos, mas frequentemente negligenciadas pelos modelos in vitro tradicionais24. O Open-Top Chip incorpora dois compartimentos: um compartimento vascular (Figura 1A) e um compartimento estromal (Figura 1B) separados por uma membrana porosa, permitindo a difusão de nutrientes entre as duas câmaras (Figura 1C). O compartimento vascular é exposto ao fluxo contínuo de fluido para recapitular a tensão fisiológica de cisalhamento, enquanto o desenho esticável da câmara estromal permite a modelagem do estiramento mecânico associado aos movimentos respiratórios ou peristaltismo intestinal. O compartimento estromal abriga o arcabouço de hidrogel 3D ajustável projetado para suportar o crescimento fisiológico de fibroblastos específicos do tecido. Possui tampa removível que facilita o estabelecimento de uma interface ar-líquido, condição que permite maior emulação da fisiologia humana dos tecidos mucosos e acesso direto ao tecido para administração de fármacos diretamente na camada epitelial. A Figura 1 Suplementar captura alguns dos principais componentes do projeto do Open-Top Chip, incluindo dimensões e compartimentos biológicos (Figura Suplementar 1A-D), bem como as principais etapas técnicas descritas neste protocolo (Figura 1E Suplementar).
A perfusão do Open-Top Chip é realizada com bomba peristáltica programável (Figura 1D). A configuração da bomba peristáltica permite que 12 chips de topo aberto sejam perfundidos simultaneamente. A maioria das incubadoras pode abrigar duas configurações que permitem a cultura de até 24 chips por incubadora. O alongamento mecânico é obtido usando um regulador de pressão de vácuo programável sob medida (Figura 1E). Consiste em um regulador de vácuo eletropneumático controlado eletronicamente por um conversor digital-analógico. Em outras palavras, o regulador de vácuo eletropneumático gera um perfil de vácuo senoidal com amplitude e frequência determinadas pelo usuário. A deformação cíclica que varia de 0% a 15% é gerada pela aplicação de pressão negativa no canal de vácuo do Open-Top Chip em uma amplitude que varia de 0 a -90 kPa e uma frequência de 0,2 Hz. Trata-se de um sistema sob medida, equivalente à Unidade de Deformação Flexcell disponível comercialmente anteriormente adotada e descrita em outros trabalhos25. Para mimetizar a deformação mecânica do tecido associada, por exemplo, ao movimento respiratório do pulmão ou ao peristaltismo do intestino, o atuador pneumático aplica ondas de vácuo/deformação sinusoidais cuja magnitude e amplitude podem ser ajustadas para corresponder ao nível fisiológico de deformação e frequência que as células humanas experimentam em seu tecido nativo.
Aqui, descrevemos um método eficiente e reprodutível para engenharia e cultivo de equivalentes de epitélio organotípico em um protótipo de plataforma Open-Top Chip. Permite a geração de modelos complexos de órgãos, como pele, alvéolo, vias aéreas e cólon, integrando fluxo de fluido vascular e alongamento mecânico. Descreveremos os principais aspectos técnicos que devem ser considerados na implementação dos princípios da engenharia de tecidos para a geração de modelos epiteliais complexos. Discutiremos as vantagens e possíveis limitações do desenho atual.
Uma visão geral das principais etapas utilizadas para alcançar a maturação dos tecidos e órgãos, incluindo os parâmetros de fluxo e estiramento, é relatada em: Figura 2 para a pele, Figura 3 para o alvéolo, Figura 4 para a via aérea e Figura 5 para o intestino. Informações adicionais sobre a composição dos meios e os reagentes utilizados para a cultura dos diferentes modelos de órgãos estão incluídas nas tabelas complementares (Tabela Suplementar 1 para a pele; Tabela Suplementar 2 para o alvéolo; Tabela Suplementar 3 para via aérea e Tabela Suplementar 4 para intestino).
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Protocol
Os colonoides humanos foram obtidos de ressecções intestinais de acordo com as diretrizes do Comitê Institucional de Biossegurança do Hospital Infantil de Cincinnati (IBC 2017-2011).
1. Ativação de superfície
- Preparação do buffer de ativação
- Coloque o reticulante e os reagentes tampão de solvente sob a cabine de biossegurança (BSC) e deixe-os se equilibrar à temperatura ambiente (TR) por 10 minutos antes do uso.
- Reconstituir 5 mg de reticulante em 5 mL do tampão de solvente usando um recipiente estéril impermeável à luz ou um tubo cônico transparente de 15 mL envolto em folha de alumínio para proteger a solução de reticulante da exposição direta à luz.
- Vórtice a solução por 1 min para remover todos os aglomerados e, em seguida, pipete 50 μL da solução reticulante diretamente no canal inferior do cavaco e 150 μL na câmara de topo aberto.
- Remova qualquer excesso de solução de reticulação da superfície do cavaco usando um aspirador. Em seguida, pipetar 50 μL adicionais da solução de reticulação diretamente no canal inferior do cavaco e 150 μL na câmara de topo aberto para remover qualquer bolha de ar restante.
- Ativação com máquina de reticulação UV
- Retire delicadamente a tampa do cavaco sob o BSC e guarde-a em um recipiente estéril.
- Transfira os cavacos que contêm a solução de reticulante para uma placa de Petri, feche a placa de Petri para evitar contaminação e coloque a placa com os cavacos sob a máquina de reticulação UV.
NOTA: Remova a tampa da placa de Petri para maximizar a exposição aos raios UV. - Ajuste a máquina de reticulação UV com um comprimento de onda de pico de 365 nm a uma intensidade de 100 μJ/cm2 e ligue a luz UV por 20 minutos.
NOTA: Após 20 minutos de tratamento UV, a solução de reticulante ficará mais escura (marrom). - Traga os cavacos de volta sob o BSC e aspirar a solução de reticulante oxidado. Em seguida, enxágue todos os cavacos três vezes com o tampão de solvente e deixe os cavacos secar sob o BSC por 5-10 min para completar a funcionalização química da superfície do polidimetilsiloxano (PDMS).
2. Preparação do equivalente do estroma
- Preparo de tampão de reconstrução 10x (100 mL)
- Dissolver 2,2 g de bicarbonato de sódio em 75 mL de NaOH 0,067 M em água bidestilada.
- Adicionar 4,76 g de HEPES e elevar o volume para 100 mL com água bidestilada.
- Filtrar estéril a solução sob o BSC usando um filtro estéril descartável com membrana de 0,22 μm.
NOTA: A solução é estável durante cerca de 6 meses quando armazenada a 4 °C.
- Estimativa do volume da solução pré-gel
- Multiplique o número de chips necessários para o experimento por 150 μL (volume interno da câmara central de topo aberto) para estimar a quantidade de solução pré-gel necessária para o experimento:
Volume necessário = (Número de cavacos x 150) μL - Preparar a solução pré-gel de colagénio no gelo misturando: 1 volume de EMEM 10x contendo as células de escolha, 1 volume de tampão de reconstrução 10x (ver passo 2.1), 8 volumes de solução de colagénio I (10 mg/ml) e 1 μL de solução de NaOH 1 N para cada mg de colagénio I.
NOTA: Recomenda-se preparar um volume extra de +15% para contabilizar erros experimentais; O exemplo descrito na secção 2.2 fornece um procedimento passo a passo detalhado para preparar uma solução de pré-gel suficiente para 12 chips e um volume extra de 15%.
- Multiplique o número de chips necessários para o experimento por 150 μL (volume interno da câmara central de topo aberto) para estimar a quantidade de solução pré-gel necessária para o experimento:
- Preparação de solução de pré-gel para o equivalente estroma (para 12 chips)
- Traga as seguintes soluções sob o BSC no gelo: 10x EMEM; 10x Buffer de reconstrução (ver passo 2.1); Solução de colágeno I (10 mg/mL); e solução estéril de NaOH 1 N.
- Cultivar células mesenquimais tecido-específicas conforme indicado pelos provedores até 80%-90% confluentes e, em seguida, dissociar as células usando tripsina ou outros métodos, conforme recomendado pelo provedor de células. Recolher as células num pellet por centrifugação a 250 x g durante 5 min a 24 °C.
- Ressuspender o pellet de células em 225 μL de EMEM 10x gelado e adicionar 225 μL de tampão de reconstrução 10x gelado (ver passo 2.1). Misture a solução pipetando suavemente para cima e para baixo e, em seguida, adicione 1.800 μL de solução de colágeno I gelada.
- Pipetar para cima e para baixo 5-6 vezes, evitando bolhas para misturar a solução de pré-gel enquanto estiver no gelo.
- Incorporação do equivalente estroma no cavaco (para 12 chips)
- Neutralizar a solução pré-gel com 18 μL de NaOH 1N. Misture suavemente pipetando para cima e para baixo 5-6 vezes e, em seguida, pipete 150 μL de hidrogel carregado de células para a câmara central do Open-Top Chip evitando bolhas.
NOTA: Se a micropadronização for necessária, passe para a próxima etapa (seção 3). - Agrupar os cavacos em placas de Petri separadas, incluindo uma tampa de tubo de centrífuga preenchida com 2 mL de ddH 2 O estéril em cada placa de Petri, e incubar a(s) placa(s) de Petri na incubadora a 37 °C, 5% CO2.
NOTA: Após 90 min, o hidrogel carregado de células será completamente polimerizado.
- Neutralizar a solução pré-gel com 18 μL de NaOH 1N. Misture suavemente pipetando para cima e para baixo 5-6 vezes e, em seguida, pipete 150 μL de hidrogel carregado de células para a câmara central do Open-Top Chip evitando bolhas.
3. Micropadronização de superfície (opcional)
- Realizar micropadronização de superfície do hidrogel estromal após pipetar o hidrogel de colágeno neutralizado (ainda em seu estado líquido) usando carimbos impressos em 3D.
NOTA: Os selos impressos em 3D podem ser obtidos em vários desenhos personalizáveis, conforme descrito anteriormente em outro artigo24. - Pipetar 20 μL da solução pré-gel de colágeno I neutralizado na superfície padronizada de um carimbo estéril impresso em 3D e inserir o carimbo dentro (em cima) da câmara de topo aberto enquanto o hidrogel estromal ainda estiver na forma líquida.
- Remova qualquer resíduo do hidrogel que possa derramar do topo da câmara aberta usando um aspirador (ou uma pipeta). Agrupe todos os chips em placas de Petri separadas e inclua uma tampa de tubo cônico de 15 mL de centrífuga preenchida com 2 mL de ddH2O estéril em cada placa de Petri.
- Incubar todas as placas de Petri a 37 °C, 5% CO2 por 90 min, e então trazer os cavacos de volta sob o BSC e remover suavemente os carimbos usando pinças de precisão para reduzir o risco de danificar o hidrogel.
4. Revestimento da superfície epitelial e vascular com proteínas tecido-específicas da MEC
- Revestimento da câmara microfluídica vascular com proteínas da matriz extracelular
- Multiplique o número de chips necessários para o experimento por 20 μL (volume do canal vascular) para estimar o volume de solução de revestimento de ECM vascular necessário para o experimento:
Volume necessário = (Número de chips x 20) μL
NOTA: Recomenda-se preparar um volume extra de 15% para contabilizar erros experimentais. - Prepare a solução de revestimento vascular ECM para todos os chips (por exemplo, 300 μL por 12 chips) usando PBS ou HBSS gelados.
NOTA: Consulte a tabela de protocolo de órgão específico na seção de materiais complementares (Tabela Suplementar 1 para a pele; Tabela Suplementar 2 para o alvéolo; Tabela Suplementar 2 para via aérea e Tabela Suplementar 4 para intestino) para identificar os reagentes específicos e a composição recomendada da MEC. - Pipetar 20 μL da solução de revestimento vascular da MEC para o canal vascular de cada chip.
- Multiplique o número de chips necessários para o experimento por 20 μL (volume do canal vascular) para estimar o volume de solução de revestimento de ECM vascular necessário para o experimento:
- Revestimento da superfície apical do equivalente estromal com proteínas da matriz extracelular
- Multiplique o número de chips necessários para o experimento por 50 μL (volume do canal vascular) para estimar o volume de solução de revestimento epitelial de MEC necessário para o experimento:
Volume necessário = (Número de cavacos x 50) μL
NOTA: recomenda-se preparar um volume extra de 15% para contabilizar erros experimentais. - Prepare solução de revestimento ECM suficiente para todos os cavacos (por exemplo, 750 μL por 12 chips) em PBS ou HBSS gelado e transfira 50 μL de solução de revestimento ECM epitelial diretamente sobre a superfície do hidrogel.
NOTA: Consulte a tabela de protocolo de órgão específico na seção de materiais complementares (Tabela Suplementar 1 para a pele; Tabela Suplementar 2 para o alvéolo; Tabela Suplementar 2 para via aérea e Tabela Suplementar 4 para intestino) para identificar os reagentes específicos e a composição recomendada da MEC. - Agrupar os cavacos em placas de Petri separadas, incluindo uma tampa de tubo cônico de 15 mL de centrífuga preenchida com 2 mL de ddH 2 O estéril em cada placa de Petri, e incubar a(s) placa(s) de Petri na incubadora a 37 °C, 5% CO 2 por2h antes de prosseguir com a semeadura de células epiteliais.
- Multiplique o número de chips necessários para o experimento por 50 μL (volume do canal vascular) para estimar o volume de solução de revestimento epitelial de MEC necessário para o experimento:
5. Semeando células epiteliais no equivalente estromal
- Cultura de células epiteliais
- Cultura de células epiteliais tecido-específicas conforme orientação dos profissionais até 80%-90% confluentes.
- Dissociar as células usando procedimentos enzimáticos proteolíticos conforme recomendado pelo provedor de células.
NOTA: Para melhores resultados, colher células epiteliais em baixa passagem (P1-P2) durante a fase de crescimento ativo quando atingem entre 70%-90% de confluência. - Uma vez dissociadas, centrifugar as células e coletá-las como um pellet.
- Ressuspender as células epiteliais até a densidade de células/fragmentos apropriada, conforme indicado na tabela de protocolos de órgãos específicos.
OBS: Neste estudo, utilizou-se solução celular na densidade de 3 x 10 6 células/mL para a pele, 1 x 10 6 células/mL para o alvéolo, 6 x 10 6 células/mL para a via aérea e 8 x 10 6 fragmentos/mL para o intestino.
- Semeadura de células epiteliais
- Transfira os cavacos da incubadora para o BSC. Aspirar a solução de revestimento do canal vascular e lavar o canal microfluídico vascular três vezes com 50 μL de meio de cultura de células endoteliais fresco.
- Aspirar a solução de revestimento da superfície do hidrogel e enxaguar a superfície do estroma três vezes com 100 μL de meio de cultura de células epiteliais fresco para remover qualquer excesso de solução de revestimento.
- Aspirar o meio ascendente e semear a superfície do hidrogel com 50 μL da suspensão de células epiteliais usando densidade celular apropriada, conforme indicado nas tabelas suplementares, e então transferir os cavacos de volta para a incubadora por 2 h (ou durante a noite para colonoides).
- Enxaguar suavemente a superfície do hidrogel com o meio de cultura celular duas vezes para remover os detritos celulares. Finalmente, renove o meio autoclavando em recipientes autoclaváveis selados e conecte os cavacos à bomba peristáltica.
6. Conectando chips ao fluxo
- Preparação das peças fluídicas
- Corte 2 polegadas de tubulação de transferência de elastômero termoplástico (TPE) à base de polipropileno biocompatível (Tabela de Materiais) para preparar a tubulação microfluídica curta necessária para conectar os cavacos aos reservatórios de mídia.
- Corte 7,5 polegadas de tubo de transferência TPE biocompatível para produzir a tubulação microfluídica longa.
- Prepare conectores metálicos suficientes de 18 G e 19 G (Tabela de Materiais).
NOTA: Recomenda-se preparar e esterilizar a tubulação e os conectores descritos nas etapas 6.1.1 e 6.1.2 pelo menos 1 dia antes de conectar os chips de topo aberto às bombas peristálticas. - Perfurar a tampa de cada reservatório médio com uma agulha hipodérmica de 4 polegadas (Tabela de Materiais).
- Desgaseificação média
- Permitir que o meio de cultura celular se equilibre à temperatura ambiente (TR).
- Transfira o volume de meio necessário para um tubo de filtragem cônico.
- Aplicar uma pressão de vácuo negativa de -20 PSI para desgaseificar o meio (filtração a vácuo).
NOTA: Se um vácuo não estiver disponível, o meio de cultura celular pode ser deixado para se equilibrar na incubadora durante a noite para alcançar resultados semelhantes.
- Prepare o Chip de topo aberto para o fluxo de fluido
- Traga os cavacos e as peças fluídicas estéreis sob o BSC e alinhe a tampa (parte superior) do Open-Top Chip para selar o protótipo do Open-Top Chip antes de iniciar o fluxo de fluido.
- Pipetar 200 μL do meio de cultura celular desgaseificado (ver tabelas específicas de órgãos) para a porta de entrada dos canais superior e inferior do chip, prestando atenção para evitar bolhas.
- Pipetar 300 μL do meio de cultura para dentro da tubulação microfluídica curta para preparar a superfície interna dos tubos e conectar a tubulação curta às entradas dos canais superior e inferior do cavaco.
- Conecte e prima as superfícies microfluídicas
- Posicione os reservatórios médios no rack da fazenda, conecte a agulha hipodérmica à entrada inferior dos cavacos e, finalmente, acomode todos os cavacos no(s) portador(es) da carcaça dentro da incubadora.
- Conecte os chips à bomba peristáltica e, em seguida, inspecione todos os conectores para garantir que todos os chips estejam conectados corretamente e que não haja vazamento visível de mídia de cultura celular.
- Use o botão Purge na bomba e segure-o por cerca de 15 s ou até que as gotículas do meio de cultura celular apareçam no final da tubulação de saída.
- Use o sistema de controle na bomba para definir a vazão de chip de órgão apropriada (Figura 2, Figura 3, Figura 4 e Figura 5).
7. Manutenção de cavacos
- Manutenção de chips de órgãos
- Preparar meio de cultura de células frescas para o epitélio e/ou endotélio e realizar as etapas de desgaseificação (conforme descrito anteriormente na etapa 6.2).
- Pause a bomba peristáltica, desconecte cuidadosamente os cavacos da bomba e extraia o(s) portador(es) da carcaça do chip. Transfira os cavacos da incubadora para o BSC e retire o volume de meio deixado nos reservatórios.
- Substitua o meio de cultura celular para os reservatórios de entrada superior e inferior por 5 mL de meio de cultura de células fresco e coloque o(s) carcaça(s) de cavaco de volta na incubadora. Conecte os cavacos à bomba peristáltica e reinicie o fluxo.
NOTA: Recomenda-se usar a função Purge para refrescar rapidamente o meio para o compartimento vascular e reduzir o risco de bolhas de ar. - Repita as etapas 7.1.1-7.1.3 a cada dois dias, conforme Figura 2, Figura 3, Figura 4 e Figura 5.
- Estabelecimento de interface ar-líquido (ALI)
- Pause a bomba peristáltica, desconecte cuidadosamente os cavacos da bomba e extraia o(s) portador(es) da carcaça do chip. Transfira os cavacos da incubadora para o gabinete de biossegurança e retire o volume de meio deixado no reservatório superior.
- Aspirar suavemente todo o meio do canal microfluídico superior e prender o tubo microfluídico curto conectado às entradas superiores usando clipes aglutinantes para reduzir a evaporação do meio e a manutenção do ALI.
- Coloque o Chip Open-Top no(s) portador(es) da carcaça de volta para a incubadora e reconecte os chips à bomba peristáltica.
NOTA: Recomenda-se usar a função Purge para refrescar rapidamente o meio para o compartimento vascular e reduzir o risco de bolhas de ar. - Retome o fluxo ligando a bomba peristáltica.
- Alongamento (Opcional)
- Pause a bomba peristáltica e conecte as portas de vácuo dos chips ao módulo de vácuo usando dois longos tubos microfluídicos por chip.
- Use o módulo de vácuo para ajustar o ajuste de alongamento à condição recomendada para cada órgão, conforme especificado nas tabelas de protocolo do órgão: Tabela Suplementar 1 para a pele; Tabela Suplementar 2 para o alvéolo; Tabela Suplementar 2 para via aérea; e Tabela Suplementar 4 para o intestino.
- Inspecione visualmente as conexões do tubo para se certificar de que todos os chips estão conectados corretamente e não há gotículas visíveis de gotejamento médio.
- Retome o fluxo ligando a bomba peristáltica.
8. Semeando células endoteliais no compartimento vascular
- Preparar células e chips para semeadura de células vasculares
- Cultivar as células endoteliais tecido-específicas conforme orientação dos profissionais até 80%-90% confluentes. Dissociar as células usando um procedimento enzimático proteolítico (conforme recomendado pelo provedor) e, finalmente, ressuspender as células endoteliais em uma solução de 3 x 106 células/mL.
NOTA: Para melhores resultados, colher as células endoteliais em baixa passagem (P2-P4) durante a fase de crescimento ativo quando atingirem entre 70%-90% de confluência. - Pause a bomba peristáltica. Transfira os cavacos da incubadora para o BSC, desconecte os cavacos dos reservatórios de mídia e de qualquer tubulação conectada e, em seguida, agrupe os cavacos em placas de Petri separadas.
- Atualizar o meio de cultura celular do compartimento epitelial com meio de cultura de células epiteliais fresco. Enxaguar o canal vascular com meio de cultura de células endoteliais fresco duas vezes e, em seguida, aspirar o meio do compartimento vascular.
- Cultivar as células endoteliais tecido-específicas conforme orientação dos profissionais até 80%-90% confluentes. Dissociar as células usando um procedimento enzimático proteolítico (conforme recomendado pelo provedor) e, finalmente, ressuspender as células endoteliais em uma solução de 3 x 106 células/mL.
- Semeadura de células endoteliais
- Semeando o canal inferior (vascular) com 25 μL de suspensão de células endoteliais (3 x 106 células/mL), vire os chips de cabeça para baixo para permitir que as células endoteliais se fixem à superfície superior da câmara microfluídica.
NOTA: Adicionar 50 μL da suspensão celular por chip (600 μL por 12 chips). - Agrupe as batatas fritas em placas de Petri. Colocá-los novamente na incubadora a 37 °C, 5% CO2, e deixar as células endoteliais se fixarem por 1 h.
- Após 1 h, transfira os cavacos da incubadora para o BSC. Enxaguar o canal vascular com meio de cultura de células endoteliais duas vezes para remover debris celulares.
- Repetir os passos 8.2.1-8.2.2 para semear novamente o canal vascular com células endoteliais e colocar os chips planos para facilitar a adesão das células endoteliais à superfície inferior do canal vascular.
- Semeando o canal inferior (vascular) com 25 μL de suspensão de células endoteliais (3 x 106 células/mL), vire os chips de cabeça para baixo para permitir que as células endoteliais se fixem à superfície superior da câmara microfluídica.
- Reconecte o chip ao fluxo
- Preencher o reservatório do meio vascular com o meio de cultura de células vasculares desgaseificado sob o BSC.
- Coloque os cavacos de volta dentro da(s) carcaça(s) de cavacos e reconecte os chips aos reservatórios médios de uma extremidade à bomba peristáltica na outra extremidade.
NOTA: Recomenda-se usar a função Purge para refrescar rapidamente o meio para o compartimento vascular e reduzir o risco de bolhas de ar. - Inspecione visualmente as conexões microfluídicas para se certificar de que todos os chips estão conectados corretamente e não há gotículas visíveis de gotejamento médio. Em seguida, retome o fluxo de fluido ligando a bomba peristáltica.
9. Ensaios de desfechos comuns
- Desconectar chips para ensaios de endpoint
- Pause a bomba peristáltica, desconecte cuidadosamente os cavacos da bomba e extraia o(s) portador(es) da carcaça do chip. Transfira o(s) portador(es) da carcaça do chip da incubadora para o BSC e libere os chips.
- Lavar suavemente a câmara central do Open-Top Chip com o meio de cultura de células epiteliais e o canal vascular com o meio de cultura endotelial duas vezes para remover quaisquer debris celulares.
- Remova a tampa do chip de topo aberto para acessar o compartimento apical do chip usando uma pinça.
- Imunomarcação para microscopia de fluorescência
- Proceder com a fixação convencional da amostra, permeabilização e bloqueio.
OBS: Neste estudo, as amostras foram fixadas em 200 μL de paraformaldeído (PFA) a 4% por 1 h seguido de enxágue com PBS, permeabilização em Triton X-100 0,1% por 40 min e bloqueio em albumina de soro bovino a 1% por 1 h. - Incubar os chips com anticorpos primários (Tabela de Materiais) a 4 °C durante a noite. e, em seguida, lavar os compartimentos epitelial e endotelial dos chips com 200 μL de PBS duas vezes. Em seguida, prossiga com os anticorpos secundários apropriados por 2 h.
NOTA: Diluir os anticorpos primários e os anticorpos secundários em PBS + 1% BSA numa diluição de 1:100 (anticorpo primário) e 1:200 (anticorpo secundário).
- Proceder com a fixação convencional da amostra, permeabilização e bloqueio.
- Imuno-histoquímica
- Extrair os equivalentes estromais da câmara principal do Open-Top Chip usando uma pinça, coletá-los em um tubo de 1,5 mL preenchido com formalina tamponada neutra a 10% e incubar por pelo menos 24 horas.
- Transfira o estroma fixo equivalente ao processador de tecido e siga as etapas abaixo para obter a desidratação ideal da amostra.
- Submergir o hidrogel em etanol 70% por 90 min.
- Retire o etanol 70% e submerja o hidrogel em etanol 80% por 90 min.
- Retire o etanol 80% e submerja o hidrogel em etanol 95% por 90 min.
- Retire o etanol 95% e submerja o hidrogel em etanol 100% por 90 min duas vezes.
- Retire o etanol 100% e submerja o hidrogel em uma solução de xileno por 120 min duas vezes.
- Remover a solução de xileno e infiltrar os equivalentes estromais processados em cera de parafina por 120 min (~2 h) duas vezes.
- Incorpore os equivalentes estromais infiltrados em blocos de parafina seccionados.
- Nesse ponto, os equivalentes estromais podem ser seccionados como blocos de parafina em micrótomo e processados de acordo com técnicas histológicasconvencionais26.
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Representative Results
Micropadronização de superfície
A micropadronização da matriz extracelular (MEC) pode ser usada para replicar a configuração espacial da interface das criptas intestinais. A configuração do Open-Top Chip pode ser modificada para integrar carimbos micropadronizados projetados especificamente para mimetizar a topografia natural da interface epitélio-estroma colônico (Figura 6A,B) e as criptas intestinais em escala micrométrica (Figura 6C-E). Por favor, note que usamos uma superfície plana (não padronizada) para a pele, vias aéreas e modelos de alvéolos. O carimbo foi utilizado neste caso para obter uma superfície de hidrogel uniforme para semear células epiteliais. Optou-se por um desenho que pudesse mimetizar a arquitetura natural da mucosa intestinal humana, consistindo na alternância de cúpulas positivas e negativas mimetizando as criptas intestinais.
Modelos de órgãos
Cultivamos e diferenciamos quatro epitélios diferentes (pele, alvéolo, vias aéreas e intestino) usando o protótipo Open-Top Chip para provar a versatilidade dessa plataforma biomimética. Cortes histológicos dos chips orgânicos confirmam a presença de células epiteliais fenotipicamente distintas e representativas de: epitélio estratificado no caso da pele (Figura 7), epitélio colunar pseudoestratificado no caso da via aérea (Figura 8 e Vídeo Suplementar 1), epitélio escamoso simples no caso dos alvéolos (Figura 9), e epitélio colunar simples no intestino (Figura 10). Células da pele, das vias aéreas e alveolares foram obtidas de fornecedores comercialmente disponíveis (conforme especificado na Tabela de Materiais).
Figura 1: Esquema do Open-Top Chip e o setup microfluídico utilizado neste estudo. (A-C) Vista superior, projeção camada por camada e renderização 3D mostrando o protótipo do design Open-Top Chip compreendendo a tampa superior removível com canal microfluídico envolto (azul), os dois canais de vácuo semilunar ao lado da câmara de cultura (cinza) e os canais microfluídicos endoteliais espirais inferiores (magenta). (D) Suporte de cavaco feito sob medida (também chamado de "Sistema de fazenda"), incluindo o porta-carcaças de cavacos (seta vermelha), a bomba peristáltica e reservatórios (seta amarela) dispostos em uma configuração que se encaixa em uma incubadora comum de cultura de células. € Atuador pneumático, o instrumento que controla a pressão negativa aplicada ao canal de vácuo dos cavacos, que é usado para gerar a experiência das células de força mecânica cíclica durante a respiração ou o movimento do peristaltismo (stretch). Esse número foi adaptado com permissão de Varone et al.24. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Visão geral técnica do protocolo de chip cutâneo de topo aberto. (A) Esquema mostrando a sequência de ações para a preparação de chips cutâneos de topo aberto e (B) fornecendo a etapa biológica chave da cultura de chips de pele de topo aberto. Na fase inicial da preparação do chip, as células mesenquimais (fibroblastos) são incorporadas ao gel e carregadas no Chip de Topo Aberto para formar a camada estromal, que é revestida por 2-4 h e semeada com células epiteliais. Uma vez que as células epiteliais tenham formado uma monocamada compacta, elas são expostas ao ar (LPA). O sistema biológico é mantido sob regime de LPA até ser sacrificado para análise no dia 14. O alongamento mecânico pode ser aplicado enquanto o sistema está sob escoamento e na ALI. O alongamento é mantido até que os tecidos sejam sacrificados para análise. Informações adicionais sobre a composição dos meios, reagentes específicos e tipos celulares podem ser encontradas na Tabela Suplementar 1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Visão geral técnica do protocolo de alvéolo-chip de topo aberto. (A) Esquema mostrando a sequência de ações para a preparação de alvéolo-chip de topo aberto e (B) fornecendo a etapa biológica chave da cultura de alvéolo-chip de topo aberto. Na fase inicial da preparação do chip, as células mesenquimais (fibroblastos) são incorporadas ao gel e carregadas no Open-Top Chip para formar a camada estromal, que é revestida por 2-4 h e semeada com células epiteliais das vias aéreas em um meio suplementado com KIAD (ver Tabela Suplementar 2). O meio suplementado com EGF é mantido por ~4 dias para apoiar o crescimento das células epiteliais. O epitélio é então exposto ao ar (LPA) por ~10 dias para atingir a maturação completa do tecido. As células endoteliais microvasculares pulmonares são semeadas no 14º dia, e o sistema biológico é mantido sob LPA e regime de fluxo até ser sacrificado para análise no 21º dia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Visão geral técnica do protocolo open-top airway-chip . (A) Esquemático mostrando a sequência de ações para a preparação de chips de vias aéreas de topo aberto e (B) fornecendo a etapa biológica chave da cultura de chip de via aérea de topo aberto. Na fase inicial da preparação do chip, as células mesenquimais (fibroblastos e/ou células musculares lisas) são incorporadas ao gel e carregadas no Open-Top Chip para formar a camada estromal, que é revestida por 2-4 h e semeada com células epiteliais em meio suplementado com EGF (ver Tabela Suplementar 3). O meio suplementado com EGF é mantido por ~4 dias para apoiar o crescimento das células epiteliais. O epitélio é então exposto ao ar (LPA) por ~10 dias para atingir a maturação completa do tecido. As células endoteliais microvasculares pulmonares são semeadas no 14º dia, e o sistema biológico é mantido sob LPA e regime de fluxo até ser sacrificado para análise no 21º dia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Visão geral técnica do protocolo de chip de intestino de topo aberto. (A) Esquema mostrando a sequência de ações para a preparação de chips intestinais de topo aberto e (B) fornecendo a etapa biológica chave da cultura de chips intestinais de topo aberto. Na fase inicial da preparação do chip, as células mesenquimais (fibroblastos colônicos) são embutidas no gel e carregadas no Open-Top Chip para formar a camada estromal, que é revestida por 2-4 h e semeada com fragmentos de colonoides epiteliais obtidos de ressecções clínicas. Meio de cultura celular, incluindo suplementos (ROCK e CHIR, ver Tabela Suplementar 4) é necessário durante a etapa de semeadura para manter a viabilidade das células colonoides e a morfologia fisiológica. Diferentes meios são então usados para conduzir a expansão (dia 1 a 6) e maturação (dia 6 a 9) do epitélio colônico. As células endoteliais microvasculares do cólon são semeadas no dia 6 usando um meio de cultura de células endoteliais (EGM2 MV) e, em seguida, cultivadas sob fluxo com um meio de expansão epitelial por até mais 10 dias. O epitélio é exposto à LPA a partir do 10º dia para promover ainda mais a maturação das células epiteliais. O alongamento mecânico pode ser aplicado ao sistema a partir do 13º dia e mantido até o 16º dia, quando o órgão-modelo é sacrificado para análise dos desfechos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Estampagem de micropadrões. (A) A vista lateral e superior do carimbo mostrando textura em microescala (500 μm de altura e 250 μm de largura pillar-array) é usada para recriar a interface de tecido da cripta colônica e a vista superior e lateral do conjunto carimbo-chip, mostrando o encaixe dos dois elementos quando usados para moldar a superfície do gel. (B) Vista lateral angulada mostrando a interface do carimbo e do chip. (C-E) Imagens da superfície do gel micropadronizado com e sem células. Barras de escala: 200 μm. Esse número foi adaptado com permissão de Varone et al.24. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Dados representativos obtidos com o chip cutâneo de topo aberto. (A) Esquema mostrando a sequência de ação para a preparação de chips cutâneos de topo aberto e fornecendo as principais etapas biológicas da cultura de chips cutâneos de topo aberto. (B) PCNA Citoqueratina 14, Citoqueratina10, Involucrina e Fillagrina e coloração de fluorescência e H&E mostrando epiderme madura estratificada multicamadas diferenciada no Chip. Barras de escala: 100 μm. (C) Imagem de vista superior do Skin-Chip (Barras de escala: 5 mm) e da seção transversal H&E (Barras de escala: 100 μm) mostrando a presença dos fibroblastos no interior da camada dérmica. (D) Coloração de fluorescência para PECAM-1, VE-Caderina e Von Willebrand mostrando diferenciação de células endoteliais microvasculares humanas co-cultivadas no chip cutâneo aberto. Barras de escala: 20 μm. (E) Renderização do conceito 3D Cartoon do chip de pele aberto. Esse número foi adaptado com permissão de Varone et al.24. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: Dados representativos obtidos com o chip de via aérea de topo aberto. (A) Esquemático mostrando a sequência de ação para a preparação de chips de vias aéreas de topo aberto e fornecendo a etapa biológica chave da cultura de chip de via aérea de topo aberto. (B) MUC5AC (Calde), α e β-Tubulina (Células Ciliadas), Proteína Clara 16 (Células Club), p63 (Células Basais/Progenitoras) e Coloração por Fluorescência ZO-1 mostrando epitélio maduro das vias aéreas. Barras de escala: 20 μm. (C) Vídeo/imagem de contraste de fase mostrando a presença de cílios batendo. Barras de escala: 50 μm. (D) Coloração H&E (Barras de escala: 20 μm) e imagem de MET (Barras de escala: 5 μm) mostrando epitélio pseudoestratificado maduro diferenciado no chip. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9: Dados representativos obtidos com o alvéolo-chip de topo aberto. (A) Esquema mostrando a sequência de ação para a preparação de alvéolo-chip de topo aberto e fornecendo a etapa biológica chave da cultura de alvéolo-chip de topo aberto. (B) Coloração por fluorescência tipo I (HTI-56, AT1-α), tipo II (HTII-280, LAMP3, ABCA3, surfactante (C) e E-caderina, mostrando a presença de pneumócitos maduros no chip. Barras de escala: 20 μm. (C) Imagem de MEV e ETM mostrando a presença de microvilosidades e vesículas lisossômicas evidenciando fenótipo alveolar maduro. Barras de escala: 5 μm. (D) Corte transversal de H&E (barras de escala: 5 μm) confirmando a presença de células escamosas planas consistentes com o fenótipo Tipo I e células cuboidais, semelhantes a paralelepípedos, coerentes com o fenótipo Tipo II, e (E) mostrando a presença dos fibroblastos no interior da camada dérmica (barras de escala: 10 μm). (F) Renderização do conceito de desenho animado 3D do alvéolo-chip de topo aberto. Esse número foi adaptado com permissão de Varone et al.24. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 10: Dados representativos obtidos com o chip intestinal aberto. (A) Esquema mostrando a sequência de ação para a preparação Open-Top Intestine-Chip e fornecendo a etapa biológica chave da cultura Open-Top Intestine-Chip. (B) Vista lateral angulada mostrando a montagem Stamp e Chip durante a fase de fundição do gel, o conceito de desenho animado do gel micropadronizado e imagens de contraste de fase de uma estrutura semelhante a uma cripta micropadronizada na superfície do gel e semeada com colonóides em duas alturas diferentes. Barras de escala: 200 μm. (C) Coloração de fluorescência de Mucina 2 e E-Caderina mostrando a presença de enterócitos e células caliciformes maduras no Chip. Barras de escala: 200 μm. (D) Corte transversal de H&E de uma estrutura semelhante a cripta mostrando a presença dos fibroblastos no interior da camada dérmica e confirmando a presença de um epitélio colunar simples. Barras de escala: 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Vídeo Suplementar 1: Vídeo com contraste de fase mostrando cílios batendo. Barras de escala: 100 μm. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura suplementar 1: Montagem do chip de topo aberto. (A) Esquema mostrando a renderização tridimensional do conjunto Open-Top Chip e a renderização em desenho animado do chip cutâneo de topo aberto com os diferentes compartimentos biológicos destacados, incluindo epitelial (azul), dérmico (amarelo) e vascular (vermelho). (B) A plataforma microfluídica montada tem formato de 35 mm x 17 mm, área de cultura de tecidos de 0,32cm2, canal microfluídico espiral de fundo e tampa de câmara com canal microfluídico. (C) A plataforma é composta por uma câmara com uma parede angulada de 5 graus, que tem um diâmetro de 6 mm ao nível da membrana e 5,7 mm no topo da parede da câmara PDMS e uma altura de 4 mm e largura. A membrana porosa tem 50 μm de espessura e os poros têm 7 μm de diâmetro. (D) O canal microfluídico em forma de espiral inferior tem dimensões de seção transversal de 400 μm (altura) x 600 μm (largura). (E) Uma visão geral do cronograma do experimento e as etapas necessárias para preparar o Open-Top Organ-Chip. Clique aqui para baixar este arquivo.
Tabela Suplementar 1: Pele. A tabela fornece um resumo das principais etapas diárias e dos parâmetros de alongamento e fluxo usados durante as três fases da cultura Open-Top Skin-Chip (crescimento, proliferação e diferenciação). A tabela também fornece a lista de materiais, as formulações do meio e instruções sobre como preparar a mídia necessária para este protocolo. A composição dos três meios é otimizada para as diferentes fases do protocolo. Especificamente, o Meio I é otimizado para a fase de semeadura e cultura precoce de queratinócitos. O meio II é otimizado para proliferação e diferenciação precoce (formação de epitélio estratificado). O meio ALI é otimizado para manter os queratinócitos em uma interface ar-líquido até que uma epiderme totalmente diferenciada seja produzida. Clique aqui para baixar este arquivo.
Tabela Suplementar 2: Alvéolo. A tabela fornece um resumo das principais etapas diárias e dos parâmetros de alongamento e fluxo usados durante as três fases da cultura de alvéolo de topo aberto (crescimento, proliferação e diferenciação). A tabela também fornece a lista de materiais, as formulações do meio e instruções sobre como preparar a mídia necessária para este protocolo. A composição das duas mídias é otimizada para as diferentes fases do protocolo. Por favor, note que a adição de suplementos (KIAD) ao meio de cultura celular é fundamental para alcançar a diferenciação ideal dos pneumócitos. Clique aqui para baixar este arquivo.
Tabela Suplementar 3: Via aérea. A tabela fornece um resumo das principais etapas diárias e dos parâmetros de alongamento e fluxo usados durante as três fases da cultura de chip de vias aéreas de topo aberto (crescimento, proliferação e diferenciação). A tabela também fornece a lista de materiais, a formulação do meio e instruções sobre como preparar o meio necessário para este protocolo. A composição do meio é otimizada para manter as células das vias aéreas na interface ar-líquido, que, por sua vez, induz a diferenciação terminal e estimula a produção de muco. Clique aqui para baixar este arquivo.
Tabela Suplementar 4: Intestino. A tabela fornece um resumo das principais etapas diárias e dos parâmetros de alongamento e fluxo usados durante as três fases da cultura de chip de intestino de topo aberto (crescimento, proliferação e diferenciação). A tabela também fornece a lista de materiais, as formulações do meio e instruções sobre como preparar a mídia necessária para este protocolo. As composições de ambas as mídias são otimizadas para as diferentes fases do protocolo. Especificamente, o meio de expansão suplementado com os inibidores CHIR e ROCK é otimizado para a fase inicial e semeadura do cultivo, pois promove a sobrevivência e o crescimento do fragmento organoide colônico como monocamada. O meio de expansão é otimizado para a proliferação e diferenciação precoce da monocamada de epitélio. O meio de diferenciação é otimizado para diferenciação terminal da monocamada de epitélio antes da exposição à interface ar-líquido. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
O Open-Top Chip representa uma plataforma capacitadora para investigar a complexa interação celular que ocorre entre endotélio, estroma e epitélio em um microambiente controlado, em tempo real. Essa tecnologia oferece vantagens críticas sobre as culturas organotípicas e organoides convencionais, como a integração de pistas físicas e bioquímicas relevantes para a reconstituição do microambiente tecidual humano, incluindo cisalhamento fluídico (fluxo), estiramento cíclico e reconstrução da topografia da superfície epitelial obtida via micropadronização. As células humanas que crescem dentro dessa plataforma atuam em sinergia para recapitular funções tecido-específicas que podem ser analisadas através de técnicas convencionais, incluindo ensaios imunohistoquímicos e bioquímicos usando os fluidos de saída (ou efluentes) dos compartimentos superior e/ou inferior. O desenho atual permite fácil acesso à camada epitelial, onde as células crescem em contato direto com fibroblastos tecido-específicos e outras células estromais, mimetizando a arquitetura multicelular dos tecidos epiteliais. Notavelmente, o protótipo Open-Top Chip oferece uma solução viável para desafios comuns associados ao uso de outras plataformas organ-on-chip. Embora permita a incorporação de vários tipos diferentes de células dentro de um compartimento estromal levando à criação de tecidos 3D muito complexos, também permite a fácil extração das construções de tecido estabelecidas do dispositivo de chip para análise a jusante, incluindo a coloração convencional de H&E.
O desenho atual apresenta algumas limitações. Por exemplo, a membrana elástica interposta entre o microcanal vascular e o compartimento estromal (hidrogel) do protótipo Open-Top Chip é consideravelmente mais espessa (≈ 50 μm versus ≈ 1 μm) do que o espaço intersticial que separa os tecidos endoteliais do estroma nos órgãos humanos nativos. Embora a membrana elástica não represente uma barreira física à difusão de moléculas grandes, como hormônios e outros fatores parácrinos que medeiam o crosstalk intercelular entre os tecidos, ela pode limitar as interações diretas célula-célula e a migração de células do compartimento vascular para o estromal. Finalmente, o protótipo Open-Top Chip é feito de PDMS, que é conhecido por absorver um grande número de compostos hidrofóbicos. Essa limitação é compartilhada por muitas plataformas baseadas em PDMS que podem ser um sério obstáculo em aplicações destinadas a testar a farmacodinâmica e farmacocinética de pequenos compostos terapêuticos27.
Um dos principais desafios da integração de hidrogéis 3D em um dispositivo microfluídico como o Open-Top Chip, é que o PDMS não fornece um substrato ideal para a ligação de proteínas ou células humanas. A funcionalização química da superfície do PDMS é, portanto, uma etapa crítica neste protocolo que é necessária para garantir o revestimento ECM adequado e a adesão do hidrogel à câmara de gel do modelo Open-Top Chip. Para obter os melhores resultados, o agente de reticulação na solução ER1 deve estar sempre protegido da exposição direta à luz. Um indicador importante do status reativo do reticulante é sua cor. O reticulante no ER1, na verdade, sofre uma transição de cor de laranja brilhante para marrom escuro quando oxida. A transição de cor pode ser usada como um indicador após a etapa de ativação UV para verificar se a solução reagiu efetivamente com a superfície PDMS. Durante a preparação da solução de reticulante, a transição de cor deve ser monitorizada para garantir que uma exposição acidental à luz direta não fotobranqueie o composto químico na solução. Para proteger a solução reticulante e evitar qualquer fotoclareamento indesejado, sugerimos envolver papel alumínio, aproximadamente 15 cm x 15 cm, em torno de um tubo cônico de 15 mL ou usar um tubo âmbar disponível no mercado. O uso do ER1 permite um método simples e eficaz para alcançar a rápida funcionalização das superfícies do PDMS; no entanto, existem outras moléculas que podem ser usadas no lugar de ER1. Por exemplo, o reticulante químico 3-aminopropil-trimetoxisilano (APTMES) não é tão fotossensível quanto o ER1 e pode ser usado para obter resultados semelhantes com alguns passos adicionais, como já descrevemos anteriormente28,29. Independentemente da molécula de escolha, uma das principais limitações no trabalho com um reticulante químico é a presença de restos de resíduos, que podem induzir citotoxicidade. Após a reação de ativação, é importante enxaguar as superfícies microfluídicas com volumes abundantes de solução de lavagem.
Como as bolhas de ar tendem a se formar e crescer dentro das interfaces hidrofóbicas dos chips, tubos e conectores, é importante avaliar se o caminho microfluídico está livre de bolhas de ar antes de iniciar o fluxo de fluido. As bolhas podem, de fato, interromper o fluxo e até matar as células quando os chips estão conectados ao fluxo. O condicionamento dos componentes microfluídicos antes de iniciar o fluxo de fluido reduzirá o risco de gerar bolhas de ar e ajudará a alcançar resultados ótimos e reprodutíveis. Se o ciclo de condicionamento descrito neste protocolo não foi suficiente, enxaguar os tubos microfluídicos com etanol (5 min) e, em seguida, com HBSS (20 min) atenuará ainda mais o risco de gerar bolhas de ar dentro dos conectores fluídicos.
Apesar de suas limitações, o PDMS possui uma rara combinação de propriedades químicas que permitiu a fabricação de dispositivos microfluídicos altamente biocompatíveis, transparentes e elásticos. Todas essas propriedades fizeram do PDMS o material mais amplamente aplicado para a construção dos modelos Organ-on-Chip na última década. Avanços recentes nos campos da ciência dos materiais e da engenharia química30,31 sugerem que o componente PDMS dessa plataforma poderia ser substituído em um futuro próximo por novos polímeros sintéticos ou biomateriais. Se alcançada com sucesso, poderá permitir a recapitulação de propriedades tecido-específicas, incluindo porosidade, composição da MEC do espaço intersticial proporcionando mimetismo mais próximo aos tecidos nativos humanos e modelos mais avançados para estudos farmacológicos. Prevemos que a evolução futura do design do Open-Top Chip permitirá a modelagem de tecidos e órgãos humanos com um nível de detalhe sem precedentes.
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Disclosures
Os autores declaram os seguintes interesses financeiros/relações pessoais, que podem ser considerados como potenciais interesses concorrentes: Varone Antonio é um ex-funcionário da Emulate Inc.
Acknowledgments
Nenhum
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
10x EMEM | Lonza | 12-684F | Medium; Stroma |
18 Gauge needle | MicroGroup | 316H18RW | Tube stainless steel 316 welded, 18RW Full Hard |
19 Gauge needle | MicroGroup | 316H19RW | Tube stainless steel 316 welded, 19RW Full Hard |
2-Stop PharMed BPT | Cole-Palmer | EW-95723-12 | Tube, 0.25 mm, 12/pack |
70% ethanol and wipes | - | - | For surface sterilization |
8-Bromoadenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt (8-Br-cAMP) | Sigma | B7880 | Medium supplement |
A-83-01 | Tocris | 2939 | |
Adenine | Sigma | A9795 | |
Advanced DMEM/F12 | Thermo | 12634010 | |
Airway Epithelial Cells | Lifeline Cell Technology | FC-0016 | |
Aluminum foil | - | - | - |
Alveolar cells | Cell Biologics | H6621 | |
Anti-ABCA3 | ABCAM | ab24751 | Mouse monoclonal antibody [3C9] |
Anti-Aquaporin5 Alexa Fluor 647 | ABCAM | ab215225 | Rabbit monoclonal antibody [EPR3747] |
Anti-Aquaporin5 | ABCAM | ab92320 | Rabbit monoclonal antibody [EPR3747] |
Anti-beta IV Tubulin | ABCAM | ab11315 | Mouse monoclonal antibody [ONS.1A6] |
Anti-CD31 (PECAM-1) | ABCAM | ab9498 | Mouse monoclonal [JC/70A] antibody |
Anti-CK5 | ABCAM | ab75869 | Rabbit recombinant monoclonal [AY1E6] |
Anti-Cytokeratin 10 | ThermoFisher | MA5-13705 | Mouse monoclonal antibody (DE-K10) |
Anti-Cytokeratin 14 | ABCAM | ab7800 | Mouse monoclonal antibody |
Anti-E-Cadherin | ABCAM | ab1416 | Mouse monoclonal antibody |
Anti-Filaggrin | ThermoFisher | PA5-79267 | Rabbit polyclonal antibody |
Anti-HTI-56 | Terrace Biotech | TB-29AHT1-56 | Mouse monoclonal antibody (IgG1) |
Anti-HTII-280 | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | Mouse monoclonal antibody (IgM) |
Anti-Involucrin | ThermoFisher | MA5-11803 | Mouse monoclonal antibody (SY5) |
Anti-Isoforms TA p63-α, -β, -γ | Biolengend | 618902 | Rabbit polyclonal antibody |
Anti-Ki67 | ABCAM | ab8191 | Mouse monoclonal antibody [B126.1] |
Anti-LAMP3 | ABCAM | ab111090 | Rabbit polyclonal antibody |
Anti-Mature SP-B | Seven Hill | WRAB-48604 | Rabbit polyclonal antibody |
Anti-MUC5AC | ThermoFisher | PA5-34612 | Rabbit polyclonal antibody |
Anti-Mucin-2 | SantaCruz Biotechnology | sc-7314 | Mouse monoclonal antibody (IgG1) |
Anti-p63 | Dako | GA662 | Mouse monoclonal antibody p63 Protein (Dako Omnis) Clone DAK-p63 |
Anti-PCNA | ThermoFisher | PA5-32541 | Rabbit polyclonal antibody |
Anti-Podoplanin (AT-1α) | ABCAM | ab128994 | Rabbit polyclonal antibody |
Anti-Pro + Mature Surfactant Protein B | ABCAM | ab40876 | Rabbit polyclonal antibody |
Anti-Surfactant C | Seven Hill | WRAB-9337 | Rabbit polyclonal antibody |
Anti-Uteroglobin/SCGB1A1 | Hycult Biotech | HM2178 | Mouse monoclonal antibody [AY1E6] |
Anti-VE-cadherin | ABCAM | ab33168 | Rabbit polyclonal antibody |
Anti-ZO-1 | ThermoFisher | 33-9100 | Mouse monoclonal antibody [1A12] |
Ascorbic acid | Sigma | A4544 | |
Aspirating pipettes | Corning / Falcon | 357558 | 2 mL, polystyrene, individually wrapped |
Aspirating tips | - | - | Sterile (autoclaved) |
B27 | Thermo | 17504044 | |
Blocker BSA (10X) in PBS solution | ThermoFisher | 37525 | Blocker agent |
Calcium Chloride | Sigma | C7902 | |
CHIR 99021 | Tocris | 4423 | |
Collagen I | Advanced Biomatrix | 5133 | 10 mg/mL (Stroma) |
Collagen I | Advanced BioMatrix | 5005 | 3 mg/mL (Vascular ECM) |
Collagen IV | Sigma | C5533 | |
Collagen-IV | Sigma | C5533-5MG | Collagen from human placenta, 5 mg powder, reconstitute to 1 mg/mL |
Colonic Fibroblasts | Cell Biologics | H6231 | |
Colonic microvascular endothelial cells | Cell Biologics | H6203 | |
Conical tubes | - | - | 15 mL and 50 mL polypropylene, sterile |
Crosslinker (ER-1) | Emulate | 10461 | 5 mg powder |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | ThermoFisher | D3571 | DNA probe |
Dermal fibroblasts | ATCC | PCS-201-010 | |
Dermal microvascular endothelial cells | ATCC | CRL-3243 | |
Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
DMEM | ThermoFisher | 11054020 | |
DMEM/F-12 | GIBCO | 11320082 | |
DMEM/F-12, GlutaMAX | GIBCO | 10565-018 | Basal medium for ALI medium |
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) | ABCAM | ab150105 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568) | ABCAM | ab175472 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) | ABCAM | ab150107 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | ABCAM | ab150073 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568) | ABCAM | ab175470 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 647) | ABCAM | ab150075 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
Dulbecco’s PBS (DPBS-/-) (without Ca2+, Mg2+) | Corning | 21-031-CV | 1x |
Epidermal Growth Factor (EGF) human, recombinant in E. coli | PromoCell | C-60170 | Medium supplement |
F-12 Ham’s | Invitrogen | 21700-108 | For vascular ECM |
FibriCol | Advanced BioMatrix | 5133-20ML | Collagen-I solution (10 mg/mL) |
Fibronectin | Corning | 356008 | |
Fibronectin, Human, Natural, | Corning | 47743-654 | human plasma fibronectin |
Fine-tip precision tweezers | Aven | 18056USA | Technik Style 5B-SA Precision Stainless Steel Tweezers |
Glutamax | Invitrogen | 21700-108 | |
Glutamax | Invitrogen | 35050061 | |
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 594) | ABCAM | ab150080 | Goat Anti-Mouse secondary antibody |
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) | ABCAM | ab150115 | Goat Anti-Mouse secondary antibody |
Goat Anti-Mouse IgG H&L (FITC) | ABCAM | ab6785 | Goat Anti-Mouse secondary antibody |
Goat Anti-Mouse IgG1 Alexa Fluor 568 | ThermoFisher | A-21124 | Goat Anti-Mouse IgG1 secondary antibody |
Goat Anti-Mouse IgM Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A-21042 | Goat Anti-Mouse IgM secondary antibody |
Handheld vacuum aspirator | Corning | 4930 | - |
Heat Inactivated HyClone FetalClone II Serum (FCS) | GE Healthcare Life Sciences | SH30066.03 | |
Hemocytometer | - | - | - |
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma | H3149 | |
HEPES | Thermo | 15630080 | |
Human [Leu15] - Gastrin | Sigma | G9145 | |
Human colonoids | Obtained from clinical resections | Obtained from clinical resections | |
Human EGF Recombinant Protein | Thermo | PHG0311L | |
human epithelial growth factor | Thermo | PHG0311 | |
HyClone FetalClone II Serum (U.S.) | GE Healthcare | SH30066.02HI | Sterile FBS heat-inactivated |
Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt | Sigma | H4881 | |
Hydrocortisone | PromoCell | C-64420 | Medium supplement |
Ice bucket | - | - | - |
Ismatec IPC-N | Cole-Palmer | EW-78000-41 | Low-Speed Digital Peristaltic Pump; q24-Channel (1 per 12 Chips) |
ITES | BioWhittaker | 17-839Z | |
Keratinocyte Growth Factor (KGF), also known as Basic Fibroblast Growth Factor 7 (FGF-7), human, recombinant in HEK | PromoCell | C-63821 | |
Keratinocytes | ATCC | PCS-200-010 | |
Laminin | Biolamina | CT521-0501 | |
Laminin, 521 CTG (CT521) | Biolamina | CT521-0501 | human recombinant laminin 521 |
Lung Fibroblast | Cell Biologics | H6013 | |
Lung Fibroblast | Lifeline Cell Technology | FC-0049 | |
Lung microvascular endothelial cells | Lonza | CC-2527 | |
Lung smooth muscle cells | Lifeline Cell Technology | FC-0046 | |
Manual counter | - | - | - |
Masterflex (TPE) Transfer Tubing | Cole-Palmer | FV-96880-02 | PharMed BPT, 1/32" ID x 5/32" OD |
Medium 199, no phenol red | Thermo | 11043023 | |
Microcentrifuge tube | - | - | 1.5 mL, sterile |
Microscope (with camera) | - | - | For bright-field imaging |
N2 | Sigma | 17502001 | |
N-acetyl cysteine | Sigma | A5099 | |
Noggin (HEK293T conditioned medium) | Sigma | N17001 | |
Normal Goat Serum | ThermoFisher | 50062Z | Blocking solution |
O-phosphosrylethanolamine | Sigma | P0503 | |
Paraformaldehyde (4% wt/vol) | EMS | 15710 | Fixing agent |
Penicillin Streptomycin | GIBCO | 15140122 | |
Penicillin-streptomycin | Sigma | P4333 | 10,000 U/mL; 10 mg/mL |
Pipette tips | - | - | P20, P200, and P1000 sterile, low adhesion |
Pipette | Gilson | F167380 | P20, P200, and P1000 |
PluriQ Serum Replacement (or alternatively KO Serum replacement) | AMSBIO (or Thermo) | N/A (or C1910828010) | |
Poly-L-Lysine coated microscope glass slides | Sigma | P0425 | Glass slides |
Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
Progesterone | Sigma | P8783 | |
ProLong Gold | ThermoFisher | P36931 | Antifade Mountant with DAPI |
Retinoic Acid | Sigma | R2625 | |
ROCK inhibitor (Y27632) | Tocris | TB1254-GMP/10 | |
R-spondin (HEK293T conditioned medium) | Sigma | SCC111 | |
SAGM SingleQuots supplements | Lonza | CC-4124 | |
SAGMTM Small Airway Epithelial Cell Growth medium BulletKitTM | Lonza | CC-4124 | Medium supplements |
SB2001190 | Tocris | 1264/10 | |
Serological pipettes | - | - | 2 mL, 5 mL, 10 mL, and 25 mL low endotoxin, sterile |
Small Airway Epithelial Cell Growth medium (SAGM) | Lonza | CC-4124 | |
Solvent Buffer (ER-2) | Emulate | 10462 | 25 mL bottle |
Steriflip-HV | Millipore | SE1M003M00 | Sterile filtering conical tube |
Sterilin 100 mm Square Petri Dishes | Thermo | 103 | Sterile, 1 per 6 chips |
T25 flasks | - | - | - |
T75 flasks | - | - | - |
Tri-iodothyronine | Sigma | T5516 | |
Triton X-100 (0.3% (vol/vol) | Sigma | T8787 | Permeabilization agent |
Trypan blue | Sigma | 93595 | 0.4% solution |
TrypEE solution | Sigma | 12604013 | Cell detaching solution |
TWEEN-20 | Sigma | P2287 | Permeabilization agent |
UV Light Oven (peak frequency 365nm, intensity of 100 µJ/cm2) | VWR | 21474-598 | UVP, Long Range UV, 365 nm 60Hz Model CL-1000L |
Vacuum set-up | - | - | Minimum pressure: -70 kPa |
Vascular Endothelial Growth Factor 165 (VEGF-165) human, recombinant in E. coli | PromoCell | C-64420 | |
VEGF-165 | PromoCell | C-64420 | Medium supplement |
Von Willebrand Factor conjugated FITC | ABCAM | ab8822 | Sheep polyclonal antibody |
Water bath (or beads) | - | - | Set to 37 °C |
Wnt3A (L-Wnt3A conditioned medium) | ATCC | CRL-2647 |
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