Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Rekonstituering av cytoarkitektur og funksjon av humant epitelvev på en åpen organbrikke

Published: February 17, 2023 doi: 10.3791/64633
Automatic Translation
1, 2, 3, 2,3
1Merk Sharp & Dohme LLC, 2Department of Biomedical Engineering, University of Cincinnati, 3Center for Stem Cell and Organoid Medicine, Cincinnati Children's Hospital Medical Center

Summary

Denne protokollen beskriver evnene og de essensielle kulturmodalitetene til Open-Top Organ-Chip for vellykket etablering og modning av organ-on-chip-kulturer i full tykkelse av primære vev (hud, alveolus, luftveier og tarm), noe som gir mulighet til å undersøke forskjellige funksjonelle aspekter av det humane epitel-/mesenkymale og vaskulære nisjegrensesnittet in vitro.

Abstract

Nesten alle menneskelige organer er foret med epitelvev, bestående av ett eller flere lag av tett koblede celler organisert i tredimensjonale (3D) strukturer. En av hovedfunksjonene til epitel er dannelsen av barrierer som beskytter det understrekende vevet mot fysiske og kjemiske fornærmelser og smittsomme stoffer. I tillegg formidler epitel transporten av næringsstoffer, hormoner og andre signalmolekyler, og skaper ofte biokjemiske gradienter som styrer celleposisjonering og compartmentalization i orgelet. På grunn av deres sentrale rolle i å bestemme organstruktur og funksjon, er epitel viktige terapeutiske mål for mange menneskelige sykdommer som ikke alltid fanges opp av dyremodeller. Foruten de åpenbare art-til-art-forskjellene, blir det å gjennomføre forskningsstudier på barrierefunksjon og transportegenskaper til epitel hos dyr ytterligere forsterket av vanskeligheten med å få tilgang til disse vevene i et levende system. Mens todimensjonale (2D) menneskelige cellekulturer er nyttige for å svare på grunnleggende vitenskapelige spørsmål, gir de ofte dårlige in vivo-spådommer . For å overvinne disse begrensningene har det i løpet av det siste tiåret dukket opp en mengde mikrokonstruerte biomimetiske plattformer, kjent som organer-on-a-chip, som et lovende alternativ til tradisjonell in vitro og dyreforsøk. Her beskriver vi en Open-Top Organ-Chip (eller Open-Top Chip), en plattform designet for modellering av organspesifikke epitelvev, inkludert hud, lunger og tarmene. Denne brikken gir nye muligheter for å rekonstituere den multicellulære arkitekturen og funksjonen til epitelvev, inkludert muligheten til å gjenskape en 3D-stromalkomponent ved å inkorporere vevsspesifikke fibroblaster og endotelceller i et mekanisk aktivt system. Denne Open-Top-brikken gir et enestående verktøy for å studere epiteliale / mesenkymale og vaskulære interaksjoner på flere skalaer av oppløsning, fra enkeltceller til flerlags vevskonstruksjoner, og tillater dermed molekylær disseksjon av intercellulær krysssnakk av epitelialiserte organer i helse og sykdom.

Introduction

Historisk sett har forskere stolt på preklinisk dyreforsøk for narkotikaforskning, men et økende antall av disse metodene har blitt stilt spørsmål ved på grunn av dårlig korrelasjon med menneskelig utfall1. Implementeringen av "3Rs" -prinsippene for å erstatte, redusere og avgrense dyreforsøk oppfordrer forskere til å finne nye in vitro alternative metoder for å støtte preklinisk legemiddel- og kjemisk toksikologirisikovurdering2. Imidlertid mangler mange in vitro-modeller utviklet til dags dato den biologiske arkitekturen, cellulære kompleksiteten og det mekaniske miljøet som er nødvendig for å rekapitulere den dynamiske naturen til menneskelige levende organer 3,4.

Konvensjonelle in vitro prekliniske systemer bruker vanligvis 2D-monokulturer av humane celler dyrket på en stiv plastoverflate. Disse metodene gir et verktøy for å gjennomføre enkle mekanistiske studier og muliggjør rask screening av legemiddelkandidater. På grunn av deres relativt lave kostnader og høye robusthet, er 2D-modeller ofte parret med automatiske systemer med høy gjennomstrømning og brukes til rask identifisering av potensielle legemiddelkandidater i det tidlige stadiet av legemiddelutviklingsprosessen 5,6. Imidlertid gir slike 2D-modeller ikke en translasjonell tilnærming for modellering av vevsnivå, organnivå eller systemiske responser på terapeutiske kandidater, noe som er nødvendig for nøyaktige spådommer om legemiddelsikkerhet og effekt i det prekliniske stadiet av utviklingen. Flate cellekulturer rekapitulerer ikke det opprinnelige vevsmikromiljøet, inkludert det komplekse flercellede samspillet, biomekaniske egenskaper og tredimensjonal (3D) arkitektur av humant vev7. Celler som vokser på en flat overflate, får ofte ikke en moden fenotype og kan derfor ikke reagere på farmakologiske stimuli som de ville i det opprinnelige vevet. For eksempel utviser primære humane alveolære epitelceller dyrket in vitro en plateepitelfenotype og mister viktige fenotypiske markører, inkludert overflateaktive proteiner C og B (SP-C og SP-B)8. I tillegg til utilstrekkelig differensiering blir primære celler ofte ufølsomme for biologiske stressorer in vitro, da visse biokjemiske veier forbundet med vevsinflammasjon blir ikke-funksjonelle9. Slike tap av cellefunksjon synes først og fremst å være forbundet med bruk av stive substrater, samt mangel på løselige faktorer som naturlig frigjøres av vevsspesifikke stromale celler som lungefibroblaster og glatte muskelceller10,11.

Å forstå at mangelen på kjemofysisk og biologisk kompleksitet begrenser den fysiologiske oppførselen til celler in vitro, har fostret utviklingen av mer sofistikerte multicellulære modeller, som har vist seg å bedre fange kompleksiteten til menneskelig vev utenfor kroppen12,13. Siden etableringen av de første samkulturmodellene tidlig på 1970-tallet14, har innføringen av syntetiske og naturlige hydrogeler betydelig forbedret evnen til å etterligne innfødte vevsmikromiljøer og har blitt et uvurderlig verktøy for å drive cellulær differensiering, veilede selvorganisering av celler i vevlignende strukturer og restaurering av innfødte vevsfunksjoner15,16. For eksempel, når de vokser i riktig 3D-stillas, kan menneskelige celler selv ordne seg i funksjonelle strukturer som sfæroider eller organoider, uttrykke stamcellemarkører, og er i stand til selvfornyelse17. I motsetning til dette eldes menneskelige celler (inkludert stamceller), når de vokser på tradisjonelle 2D-substrater, raskt og gjennomgår aldring etter noen få passasjer18. I tillegg kan hydrogeler "skreddersys" for å matche spesifikke vevsegenskaper som porøsitet, porestørrelse, fibertykkelse, viskoelastisitet, topografi og stivhet eller videre konstruert med vevsavledede cellulære komponenter og / eller bioaktive molekyler som muliggjør emulering av de fysiologiske eller patologiske forholdene19,20. Til tross for deres enorme potensial for narkotikatesting, rekapitulerer ikke 3D-hydrogelbaserte modeller som brukes i farmasøytisk forskning fullt ut den komplekse cytoarkitekturen til in vivo-vevet og mangler viktige hemodynamiske og mekaniske stimuli som normalt er tilstede i menneskekroppen, inkludert hydrostatisk trykk, syklisk strekk og væskeskjær21.

Mikrofysiologiske systemer (MPS) som organer-on-chips (OOC) har nylig dukket opp som verktøy som er i stand til å fange komplekse fysiologiske responser in vitro22,23. Disse modellene benytter ofte bruk av mikrofluidiske plattformer, som muliggjør modellering av det dynamiske mikromiljøet i levende organer.

Vi har kombinert prinsippene for 3D-vevsbioengineering og mekanobiologi for å skape en Open-Top Chip-modell av komplekst humant epitelvev. Dette tillot oss å nøye rekapitulere det multicellulære og dynamiske mikromiljøet i epitelvev. Dette inkluderer vevsspesifikke biokjemiske og biomekaniske signaler som er naturlig tilstede i levende organer, men ofte neglisjert av tradisjonelle in vitro-modeller 24. Open-Top-brikken har to rom: et vaskulært rom (figur 1A) og et stromalrom (figur 1B) atskilt av en porøs membran, noe som muliggjør diffusjon av næringsstoffer mellom de to kamrene (figur 1C). Det vaskulære rommet er utsatt for kontinuerlig væskestrøm for å rekapitulere fysiologisk skjærspenning, mens den strekkbare utformingen av stromalkammeret muliggjør modellering av den mekaniske belastningen forbundet med pustebevegelser eller intestinal peristaltikk. Stromalrommet huser det justerbare 3D-hydrogelstillaset designet for å støtte den fysiologiske veksten av vevsspesifikke fibroblaster. Den har et avtagbart lokk som letter etableringen av en luft-væske-grensesnitt, en tilstand som tillater større emulering av human fysiologi av slimhinnevev, samt direkte tilgang til vevet for administrering av legemidler direkte på epitellaget. Tilleggsfigur 1 fanger opp noen av nøkkelkomponentene i Open-Top Chip-designet, inkludert dimensjoner og biologiske rom (tilleggsfigur 1A-D), samt de viktigste tekniske trinnene beskrevet i denne protokollen (tilleggsfigur 1E).

Perfusjon av Open-Top-brikken oppnås med en programmerbar peristaltisk pumpe (figur 1D). Det peristaltiske pumpeoppsettet gjør at 12 Open-Top Chips kan perfuseres samtidig. De fleste inkubatorer kan huse to oppsett som muliggjør kulturen på opptil 24 chips per inkubator. Mekanisk strekking oppnås ved hjelp av en skreddersydd programmerbar vakuumtrykkregulator (figur 1E). Den består av en elektro-pneumatisk vakuumregulator som styres elektronisk av en digital-til-analog-omformer. Med andre ord genererer den elektro-pneumatiske vakuumregulatoren en sinusformet vakuumprofil med en amplitude og frekvens som bestemmes av brukeren. Syklisk belastning fra 0% til 15% genereres ved å påføre undertrykk på vakuumkanalen til Open-Top-brikken med en amplitude fra 0 til -90 kPa og en frekvens på 0,2 Hz. Det er et skreddersydd system som tilsvarer den kommersielt tilgjengelige Flexcell Strain Unit som tidligere er vedtatt og beskrevet i andre artikler25. For å etterligne den mekaniske vevsdeformasjonen som for eksempel er forbundet med lungens pustebevegelse eller tarmens peristaltikk, bruker den pneumatiske aktuatoren sinusformede vakuum / tøyningsbølger hvis størrelse og amplitude kan justeres for å matche det fysiologiske nivået av belastning og frekvens som menneskelige celler opplever i sitt opprinnelige vev.

Her beskriver vi en effektiv og reproduserbar metode for konstruksjon og dyrking av organotypiske epitekvivalenter på en prototype Open-Top Chip-plattform. Det tillater generering av komplekse organmodeller som hud, alveolus, luftveier og tykktarm mens du integrerer en vaskulær væskestrøm og mekanisk strekking. Vi vil skissere viktige tekniske aspekter som må vurderes når man implementerer prinsipper for vevsteknikk for generering av komplekse epitelmodeller. Vi vil diskutere fordelene og mulige begrensninger ved dagens design.

En oversikt over de viktigste trinnene som brukes for å oppnå vevs- og organmodning, inkludert strømnings- og strekkparametere, er rapportert i: Figur 2 for huden, figur 3 for alveolus, figur 4 for luftveiene og figur 5 for tarmen. Ytterligere informasjon om mediesammensetning og reagenser brukt til dyrking av de ulike organmodellene er inkludert i tilleggstabellene (tilleggstabell 1 for hud; Supplerende tabell 2 for alveolus; Tilleggstabell 3 for luftveiene og tilleggstabell 4 for tarmen).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Humane kolonoider ble oppnådd fra tarmreseksjoner i samsvar med retningslinjene fra Institutional Biosafety Committee ved Cincinnati Children's hospital (IBC 2017-2011).

1. Aktivering av overflaten

  1. Klargjøring av aktiveringsbuffer
    1. Plasser tverrbinderen og løsemiddelbufferreagensene under biosikkerhetsskapet (BSC) og la dem balansere ved romtemperatur (RT) i 10 minutter før bruk.
    2. Rekonstituer 5 mg kryssbinder i 5 ml oppløsningsvæskebuffer ved hjelp av en steril, lysgjennomtrengelig beholder eller et gjennomsiktig 15 ml konisk rør innpakket i aluminiumsfolie for å beskytte kryssbinderløsningen mot direkte lyseksponering.
    3. Vortex løsningen i 1 min for å fjerne alle klumper, og deretter pipette 50 μL av tverrbindingsløsningen direkte inn i bunnkanalen på brikken og 150 μL inn i det åpne kammeret.
    4. Fjern overflødig tverrbindingsløsning fra overflaten av brikken ved hjelp av en aspirator. Deretter pipetterer ytterligere 50 μL av tverrbindingsløsningen direkte inn i bunnkanalen på brikken og 150 μL inn i det åpne kammeret for å fjerne eventuelle gjenværende luftbobler.
  2. Aktivering med UV-tverrbindingsmaskin
    1. Fjern lokket forsiktig fra brikken under BSC og oppbevar det i en steril beholder.
    2. Overfør sjetongene som inneholder tverrbindingsløsningen til en petriskål, lukk petriskålen for å unngå forurensning, og legg fatet med flisene under UV-tverrbindingsmaskinen.
      MERK: Fjern petriskållokket for å maksimere UV-eksponeringen.
    3. Sett UV-tverrbindingsmaskinen med en topp bølgelengde på 365 nm med en intensitet på 100 μJ / cm2, og slå på UV-lyset i 20 minutter.
      MERK: Etter 20 min UV-behandling vil crosslinker-løsningen se mørkere ut (brun).
    4. Ta sjetongene tilbake under BSC og aspirer den oksiderte tverrbindingsløsningen. Skyll deretter alle sjetongene tre ganger med løsningsmiddelbufferen og la flisene tørke under BSC i 5-10 minutter for å fullføre den kjemiske funksjonaliseringen av polydimetylsiloksan (PDMS) overflaten.

2. Forberedelse av stroma-ekvivalenten

  1. Klargjøring av 10x rekonstruksjonsbuffer (100 ml)
    1. Løs opp 2,2 g natriumbikarbonat i 75 ml 0,067 M NaOH i dobbeltdestillert vann.
    2. Tilsett 4,76 g HEPES og bring volumet til 100 ml ved bruk av dobbeltdestillert vann.
    3. Steril filtrer løsningen under BSC ved hjelp av et engangs sterilt flaskefilter med en 0,22 μm membran.
      MERK: Oppløsningen er stabil i ca. 6 måneder ved oppbevaring ved 4 °C.
  2. Estimering av volumet av pre-gel oppløsning
    1. Multipliser antall chips som trengs for forsøket med 150 μL (indre volum av det sentrale åpne kammeret) for å estimere mengden pre-gel-løsning som kreves for eksperimentet:
      Nødvendig volum = (antall chips x 150) μL
    2. Forbered kollagen-pre-gel-oppløsningen på is ved å blande: 1 volum 10x EMEM inneholdende de valgte cellene, 1 volum 10x rekonstruksjonsbuffer (se trinn 2.1), 8 volumer kollagen I-oppløsning (10 mg/ml) og 1 μL 1 N NaOH-oppløsning for hver mg kollagen I.
      MERK: Det anbefales å forberede et ekstra volum på +15% for å ta hensyn til eksperimentelle feil; Eksemplet beskrevet i avsnitt 2.2 gir en detaljert trinnvis prosedyre for å forberede nok pre-gel-løsning for 12 chips og et ekstra 15% volum.
  3. Fremstilling av pre-gel-løsning for stroma-ekvivalenten (for 12 chips)
    1. Bring følgende løsninger under BSC på is: 10x EMEM; 10x rekonstruksjonsbuffer (se trinn 2.1); Kollagen I oppløsning (10 mg/ml); og steril 1 N NaOH oppløsning.
    2. Kultur vevsspesifikke mesenkymale celler som instruert av leverandørene til 80% -90% sammenflytende, og dissocier deretter cellene ved hjelp av trypsin eller andre metoder som anbefalt av celleleverandøren. Samle cellene i en pellet ved sentrifugering ved 250 x g i 5 minutter ved 24 °C.
    3. Resuspender cellepelleten i 225 μL iskald 10x EMEM, og tilsett 225 μL iskald 10x rekonstruksjonsbuffer (se trinn 2.1). Bland løsningen ved å pipettere forsiktig opp og ned, og tilsett deretter 1,800 μL iskaldt kollagen I-løsning.
    4. Pipett opp og ned 5-6 ganger, unngå bobler for å blande pre-gel-løsningen mens du er på is.
  4. Inkorporering av stroma-ekvivalenten på chip (for 12 chips)
    1. Nøytraliser pre-geloppløsningen med 18 μL 1 N NaOH. Bland forsiktig ved å pipettere opp og ned 5-6 ganger, og deretter pipette 150 μL celleladet hydrogel inn i det sentrale kammeret i Open-Top Chip for å unngå bobler.
      MERK: Hvis mikromønster er nødvendig, kan du gå til neste trinn (avsnitt 3).
    2. Grupper chipsene i separate petriskåler, inkludert en sentrifugerørhette fylt med 2 ml steril ddH 2 O i hver petriskål, og rug petriskålen(e) i inkubatoren ved 37 °C, 5 % CO2.
      MERK: Etter 90 minutter vil den cellebelastede hydrogelen bli fullstendig polymerisert.

3. Mikromønster på overflaten (valgfritt)

  1. Utfør overflatemikromønster av stromalhydrogelen etter pipettering av den nøytraliserte kollagenhydrogelen (fortsatt i flytende tilstand) ved bruk av 3D-printede frimerker.
    MERK: De 3D-trykte frimerkene kan fås i forskjellige tilpassbare design, som tidligere beskrevet andre steder24.
  2. Pipette 20 μL av det nøytraliserte kollagenet I pre-gel-løsningen på den mønstrede overflaten av et sterilt 3D-trykt stempel og sett stempelet inn i (på toppen) av det åpne kammeret mens stromal hydrogelen fortsatt er i flytende form.
  3. Fjern eventuelle rester av hydrogelen som kan spyle fra toppen av det åpne kammeret ved hjelp av en aspirator (eller en pipette). Grupper alle chips i separate petriskåler og inkluder en sentrifuge 15 ml konisk rørhette fylt med 2 ml steril ddH2O i hver petriskål.
  4. Inkuber alle petriskåler ved 37 °C, 5 % CO2 i 90 minutter, og bring deretter sponene tilbake under BSC og fjern stemplene forsiktig med presisjonspinsett for å redusere risikoen for å skade hydrogelen.

4. Belegge epitel- og vaskulær overflate med vevsspesifikke ECM-proteiner

  1. Belegg det vaskulære mikrofluidiske kammeret med ekstracellulære matriksproteiner
    1. Multipliser antall chips som trengs for forsøket med 20 μL (volum av vaskulær kanal) for å estimere volumet av vaskulær ECM-beleggløsning som kreves for forsøket:
      Nødvendig volum = (Antall chips x 20) μL
      MERK: Det anbefales å forberede et ekstra volum på 15 % for å ta hensyn til eksperimentelle feil.
    2. Forbered den vaskulære ECM-beleggløsningen for alle chips (for eksempel 300 μL per 12 chips) ved bruk av iskald PBS eller HBSS.
      MERK: Se den spesifikke organprotokolltabellen i delen om tilleggsmaterialer (tilleggstabell 1 for huden; Supplerende tabell 2 for alveolus; Tilleggstabell 2 for luftveiene og tilleggstabell 4 for tarmen) for å identifisere spesifikke reagenser og anbefalt ECM-sammensetning.
    3. Pipette 20 μL vaskulær ECM-beleggoppløsning i vaskulær kanal for hver brikke.
  2. Belegg av den apikale overflaten av stromalekvivalenten med ekstracellulære matriksproteiner
    1. Multipliser antall chips som trengs for forsøket med 50 μL (volum av vaskulær kanal) for å estimere volumet av epitelial ECM-beleggløsning som kreves for forsøket:
      Nødvendig volum = (antall chips x 50) μL
      MERK: Det anbefales å forberede et ekstra volum på 15 % for å ta hensyn til eksperimentelle feil.
    2. Forbered nok ECM-beleggløsning for alle spon (for eksempel 750 μL per 12 chips) i iskald PBS eller HBSS og overfør 50 μL ECM-beleggløsning direkte på hydrogeloverflaten.
      MERK: Se den spesifikke organprotokolltabellen i delen om tilleggsmaterialer (tilleggstabell 1 for huden; Supplerende tabell 2 for alveolus; Tilleggstabell 2 for luftveiene og tilleggstabell 4 for tarmen) for å identifisere spesifikke reagenser og anbefalt ECM-sammensetning.
    3. Grupper sjetongene i separate petriskåler, inkludert en sentrifuge 15 ml konisk rørhette fylt med 2 ml steril ddH 2 O i hver petriskål, ogrug petriskålen(e) i inkubatoren ved 37 °C, 5 % CO 2 i2 timer før du fortsetter med epitelcellesåing.

5. Såing epitelceller på stromalekvivalenten

  1. Epitelcellekultur
    1. Dyrkningsvevsspesifikke epitelceller som instruert av leverandørene til 80% -90% sammenflytende.
    2. Dissosiere cellene ved hjelp av proteolytiske enzymprosedyrer som anbefalt av celleleverandøren.
      MERK: For best resultat, høst epitelceller ved lav passasje (P1-P2) i den aktive vekstfasen når de når mellom 70% -90% konfluens.
    3. Når de er dissosiert, sentrifugerer cellene og samler dem som en pellet.
    4. Resuspender epitelcellene til riktig celle-/fragmenttetthet som angitt i den spesifikke organprotokolltabellen.
      MERK: I denne studien ble celleoppløsning brukt med en tetthet på 3 x 10 6 celler / ml for huden, 1 x 10 6 celler / ml for alveolus, 6 x 10 6 celler / ml for luftveiene og 8 x 10 6 fragmenter / ml for tarmen.
  2. Epitelcellesåing
    1. Overfør sjetongene fra inkubatoren til BSC. Aspirer beleggløsningen fra den vaskulære kanalen, og skyll den vaskulære mikrofluidiske kanalen tre ganger med 50 μL ferskt endotelcellekulturmedium.
    2. Aspirer beleggløsningen fra hydrogeloverflaten og skyll stromaloverflaten tre ganger med 100 mikroliter friskt epitelcellekulturmedium for å fjerne overflødig beleggløsning.
    3. Aspirer det stigende mediet og frø hydrogeloverflaten med 50 μL av epitelcellesuspensjonen ved bruk av passende celletetthet, som angitt i tilleggstabellene, og overfør deretter sjetongene tilbake til inkubatoren i 2 timer (eller over natten for kolonoider).
    4. Skyll hydrogeloverflaten forsiktig med cellekulturmediet to ganger for å fjerne cellulært rusk. Til slutt oppdaterer du mediet ved å autoklavere i forseglede autoklaverbare beholdere, og kobler sponene til den peristaltiske pumpen.

6. Koble chips til å flyte

  1. Forbereder de fluidiske delene
    1. Skjær 2 tommer biokompatibel polypropylenbasert termoplastisk elastomer (TPE) overføringsrør (materialfortegnelse) for å forberede det korte mikrofluidiske røret som kreves for å koble brikkene til mediebeholderne.
    2. Klipp 7,5 tommer biokompatibelt TPE-overføringsrør for å produsere det lange mikrofluidiske røret.
    3. Forbered nok 18 G og 19 G metallkontakter (materialfortegnelse).
      MERK: Det anbefales å klargjøre og sterilisere slangene og koblingene beskrevet i trinn 6.1.1 og 6.1.2 minst 1 dag før du kobler Open-Top-chipsene til de peristaltiske pumpene.
    4. Pierce lokket på hvert medium reservoarer med en 4-tommers hypodermisk nål (Table of Materials).
  2. Middels avgassing
    1. La cellekulturmediet likevekte til romtemperatur (RT).
    2. Overfør volumet av medium som trengs til et konisk filtreringsrør.
    3. Påfør et negativt vakuumtrykk på -20 PSI på degas mediet (vakuumdrevet filtrering).
      MERK: Hvis et vakuum ikke er tilgjengelig, kan cellekulturmediet overlates til å balansere i inkubatoren over natten for å oppnå lignende resultater.
  3. Forbered Open-Top-brikken for væskestrøm
    1. Ta sponene og de sterile fluidiske delene under BSC og juster lokket (øverste del) på Open-Top-brikken for å forsegle Open-Top Chip-prototypen før du starter væskestrømmen.
    2. Pipett 200 μL av det avgassede cellekulturmediet (se organspesifikke tabeller) inn i innløpsporten på både topp- og bunnkanalen på brikken mens du tar hensyn for å unngå bobler.
    3. Pipette 300 μL av kulturmediet inn i det korte mikrofluidiske røret for å prime den indre overflaten av rørene og koble de korte slangene til innløpene til topp- og bunnkanalene på brikken.
  4. Koble til og prime de mikrofluidiske overflatene
    1. Plasser de mellomstore reservoarene i gårdsstativet, koble den hypodermiske nålen til bunninnløpet av sjetongene, og til slutt imøtekomme alle sjetongene i husbæreren (e) inne i inkubatoren.
    2. Koble brikkene til den peristaltiske pumpen, og kontroller deretter alle kontaktene for å sikre at alle brikkene er riktig tilkoblet og at det ikke er synlig lekkasje av cellekulturmedier.
    3. Bruk renseknappen på pumpen og hold den i ca. 15 sekunder eller til dråpene i cellekulturmediet kommer til syne på enden av utløpsslangen.
    4. Bruk kontrollsystemet på pumpen til å stille inn riktig strømningshastighet for organbrikker (figur 2, figur 3, figur 4 og figur 5).

7. Vedlikehold av sjetonger

  1. Organ-chip vedlikehold
    1. Klargjør ferske cellekulturer for epitelet og/eller endotelet og utfør avgassingstrinnene (som tidligere beskrevet i trinn 6.2).
    2. Sett den peristaltiske pumpen på pause, koble sponet forsiktig fra pumpen og trekk ut bæreren(e) av sponhuset. Overfør sjetongene fra inkubatoren til BSC og fjern volumet av media igjen i reservoarene.
    3. Erstatt cellekulturmediet til de øverste og nederste innløpsbeholderne med 5 ml ferske cellekulturmedier og plasser chiphusets bærer(e) tilbake i inkubatoren. Koble flisene til den peristaltiske pumpen og start strømmen på nytt.
      MERK: Det anbefales å bruke Purge-funksjonen for raskt å oppdatere mediet til vaskulært rom og redusere risikoen for luftbobler.
    4. Gjenta trinn 7.1.1-7.1.3 annenhver dag, i henhold til figur 2, figur 3, figur 4 og figur 5.
  2. Etablering av luft-væskegrensesnitt (ALI)
    1. Sett den peristaltiske pumpen på pause, koble sponet forsiktig fra pumpen og trekk ut bæreren(e) av sponhuset. Overfør sjetongene fra inkubatoren til biosikkerhetsskapet, og fjern volumet av medium igjen i toppreservoaret.
    2. Aspirer forsiktig alt mediet fra den øverste mikrofluidiske kanalen og klem den korte mikrofluidiske slangen som er koblet til de øverste innløpene ved hjelp av bindeklips for å redusere mediefordampning og vedlikehold av ALI.
    3. Plasser Open-Top Chip på husbæreren (e) tilbake i inkubatoren og koble sjetongene til den peristaltiske pumpen.
      MERK: Det anbefales å bruke Purge-funksjonen for raskt å oppdatere mediet til vaskulært rom og redusere risikoen for luftbobler.
    4. Fortsett strømmen ved å starte den peristaltiske pumpen.
  3. Stretching (valgfritt)
    1. Sett den peristaltiske pumpen på pause og koble vakuumportene på brikkene til vakuummodulen ved hjelp av to lange mikrofluidrør per brikke.
    2. Bruk vakuummodulen til å justere strekkinnstillingen til den tilstanden som anbefales for hvert organ, som spesifisert i organprotokolltabellene: Tilleggstabell 1 for huden; Supplerende tabell 2 for alveolus; Tilleggstabell 2 for luftveiene; og tilleggstabell 4 for tarmen.
    3. Inspiser rørforbindelsene visuelt for å sikre at alle brikkene er riktig tilkoblet og at det ikke er synlige dråper med middels drypp.
    4. Fortsett strømmen ved å starte den peristaltiske pumpen.

8. Såing endotelceller i det vaskulære rommet

  1. Forbered celler og chips for vaskulær cellesåing
    1. Dyrk de vevsspesifikke endotelcellene som anvist av leverandørene til 80% -90% sammenflytende. Dissosiere cellene ved hjelp av en proteolytisk enzymprosedyre (som anbefalt av leverandøren) og til slutt resuspendere endotelcellene i en løsning av 3 x 106 celler / ml.
      MERK: For best resultat, høst endotelcellene ved lav passasje (P2-P4) i den aktive vekstfasen når de når mellom 70% -90% konfluens.
    2. Sett den peristaltiske pumpen på pause. Overfør sjetongene fra inkubatoren til BSC, koble sjetongene fra mediereservoarene og eventuelle tilkoblede rør, og grupper deretter sjetongene i separate petriskåler.
    3. Oppdater cellekulturmediet i epitelrommet med friskt epitelcellekulturmedium. Skyll den vaskulære kanalen med friskt endotelcellekulturmedium to ganger, og aspirer deretter mediet fra det vaskulære rommet.
  2. Endotelcellesåing
    1. Frø den nederste (vaskulære) kanalen med 25 μL endotelcellesuspensjon (3 x 106 celler / ml), snu sjetongene opp ned for å tillate endotelceller å feste seg til den øvre overflaten av det mikrofluidiske kammeret.
      MERK: Tilsett 50 μL av cellesuspensjonen per brikke (600 μL per 12 chips).
    2. Grupper sjetongene i petriskåler. Legg dem tilbake i inkubatoren ved 37 °C, 5% CO2, og la endotelcellene feste seg i 1 time.
    3. Etter 1 time, overfør sjetongene fra inkubatoren til BSC. Skyll den vaskulære kanalen med endotelcellekulturmedium to ganger for å fjerne cellulært rusk.
    4. Gjenta trinn 8.2.1-8.2.2 for å frø den vaskulære kanalen igjen med endotelceller og legg sjetongene flate for å lette adhesjonen av endotelcellene til bunnen av den vaskulære kanalen.
  3. Koble brikken til strømmen igjen
    1. Fyll opp det vaskulære mediumreservoaret med det avgassede vaskulære cellekulturmediet under BSC.
    2. Plasser sjetongene tilbake i brikkehusbæreren(e) og koble sjetongene til de mellomstore reservoarene i den ene enden til den peristaltiske pumpen i den andre enden.
      MERK: Det anbefales å bruke Purge-funksjonen for raskt å oppdatere mediet til vaskulært rom og redusere risikoen for luftbobler.
    3. Inspiser visuelt de mikrofluidiske tilkoblingene for å sikre at alle sjetongene er riktig tilkoblet og at det ikke er synlige dråper med middels drypp. Deretter gjenopptar væskestrømmen ved å starte den peristaltiske pumpen.

9. Vanlige endepunktanalyser

  1. Koble fra brikker for endepunktanalyser
    1. Sett den peristaltiske pumpen på pause, koble sponet forsiktig fra pumpen og trekk ut bæreren(e) av sponhuset. Overfør chiphusbæreren(e) fra inkubatoren til BSC og sett sjetongene fri.
    2. Vask forsiktig det sentrale kammeret i Open-Top-brikken med epitelcellekulturmediet og vaskulærkanalen med endotelkulturmediet to ganger for å fjerne cellulært rusk.
    3. Fjern lokket på Open-Top-brikken for å få tilgang til det apikale rommet på brikken ved hjelp av pinsett.
  2. Immunfarging for fluorescensmikroskopi
    1. Fortsett med konvensjonell prøvefiksering, permeabilisering og blokkering.
      MERK: I denne studien ble prøvene fiksert i 200 μL 4% paraformaldehyd (PFA) i 1 time etterfulgt av skylling med PBS, permeabilisering i 0,1% Triton X-100 i 40 minutter og blokkering i 1% bovint serumalbumin i 1 time.
    2. Inkuber sjetongene med primære antistoffer (Table of Materials) ved 4 °C over natten. og vask deretter både epitel- og endotelrom av sjetongene med 200 μL PBS to ganger. Fortsett deretter med passende sekundære antistoffer i 2 timer.
      MERK: Fortynn de primære antistoffene og sekundære antistoffene i PBS + 1% BSA ved en fortynning på 1:100 (primært antistoff) og 1:200 (sekundært antistoff).
  3. Immunhistokjemi
    1. Trekk ut stromale ekvivalenter fra hovedkammeret i Open-Top Chip ved hjelp av pinsett, samle dem inn i et 1,5 ml rør fylt med 10% nøytral bufret formalin og inkuber i minst 24 timer.
    2. Overfør den faste stromalekvivalenten til vevsprosessoren og følg trinnene nedenfor for å oppnå optimal dehydrering av prøven.
      1. Senk hydrogelen i 70% etanol i 90 minutter.
      2. Fjern 70% etanol og senk hydrogelen i 80% etanol i 90 minutter.
      3. Fjern 80% etanol og senk hydrogelen i 95% etanol i 90 minutter.
      4. Fjern 95% etanol og senk hydrogelen i 100% etanol i 90 minutter to ganger.
      5. Fjern 100% etanol og senk hydrogelen i en løsning av xylen i 120 minutter to ganger.
      6. Fjern xylenoppløsningen og infiltrer de behandlede stromale ekvivalentene i parafinvoks i 120 minutter (~2 timer) to ganger.
    3. Legg de infiltrerte stromale ekvivalentene inn i seksjonerende parafinblokker.
    4. På dette tidspunktet kan stromale ekvivalenter seksjoneres som parafinblokker ved hjelp av en mikrotome og behandles i henhold til konvensjonelle histologiske teknikker26.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mikromønster på overflaten
Mikromønster av den ekstracellulære matrisen (ECM) kan brukes til å replikere den romlige konfigurasjonen av tarmkryptgrensesnittet. Open-Top Chip-konfigurasjonen kan modifiseres for å integrere mikromønstrede frimerker som er spesielt utviklet for å etterligne den naturlige topografien til kolonepitel-stroma-grensesnittet (figur 6A, B) og tarmkryptene i mikrometerskala (figur 6C-E). Vær oppmerksom på at vi brukte en flat (ikke mønstret) overflate for hud-, luftveis- og alveolusmodellene. Stempelet ble brukt i dette tilfellet for å oppnå en jevn hydrogeloverflate til frøepitelceller. Vi valgte et design som kunne etterligne den naturlige arkitekturen til den menneskelige tarmslimhinnen, bestående av veksling av positive og negative kupler som etterligner tarmkryptene.

Orgel-modeller
Vi dyrket og differensierte fire forskjellige epiteler (hud, alveolus, luftveier og tarm) ved hjelp av Open-Top Chip-prototypen for å bevise denne biomimetiske plattformens allsidighet. Histologiske snitt av organbrikkene bekrefter tilstedeværelsen av epitelceller som er fenotypisk distinkte og representative for: et stratifisert epitel når det gjelder huden (figur 7), pseudostratifisert søyleepitel når det gjelder luftveiene (figur 8 og tilleggsvideo 1), enkelt plateepitel når det gjelder alveolus (figur 9), og enkelt søyleepitel når det gjelder tarmen (figur 10). Hud-, luftveis- og alveolære celler ble alle hentet fra kommersielt tilgjengelige leverandører (som spesifisert i materialfortegnelsen).

Figure 1
Figur 1: Skjematisk fremstilling av Open-Top Chip og det mikrofluidiske oppsettet som er brukt i denne studien. (A-C) Toppvisning, lag-for-lag-projeksjon og 3D-gjengivelse som viser prototypen Open-Top Chip-design som består av det avtakbare øvre lokket med innkapslet mikrofluidisk kanal (blå), de to halvmånevakuumkanalene langs kulturkammeret (grå) og de nederste spiraliserte endoteliale mikrofluidiske kanalene (magenta). (D) Skreddersydd chipholder (også kalt "Farm system") inkludert chiphusbæreren (rød pil), den peristaltiske pumpen og reservoarene (gul pil) arrangert i en konfigurasjon som passer inn i en felles cellekulturinkubator. € Pneumatisk aktuator, instrumentet som styrer det negative trykket som påføres vakuumkanalen til brikkene, som brukes til å generere de sykliske mekaniske kraftcellene som oppstår under pust eller peristaltikkbevegelse (strekk). Denne figuren er tilpasset med tillatelse fra Varone et al.24. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Teknisk oversikt over open-top skin-chip-protokollen . (A) Skjematisk som viser rekkefølgen av handlinger for det åpne hudflispreparatet og (B) gir det viktigste biologiske trinnet i den åpne hudfliskulturen. I den første fasen av chippreparatet blir mesenkymale celler (fibroblaster) innebygd i gelen og lastet i Open-Top Chip for å danne stromallaget, som er belagt i 2-4 timer og frøet med epitelceller. Når epitelcellene har dannet et kompakt monolag, blir de utsatt for luft (ALI). Det biologiske systemet holdes under ALI-regimet til det ofres for analyse på dag 14. Mekanisk strekking kan påføres mens systemet er under flyt og ved ALI. Strekket holdes til vevet ofres for analyse. Ytterligere informasjon om mediesammensetning, spesifikke reagenser og celletyper finnes i tilleggstabell 1. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Teknisk oversikt over den åpne alveolus-chip-protokollen. (A) Skjematisk som viser sekvensen av handlinger for det åpne alveolus-chippreparatet og (B) gir det viktigste biologiske trinnet i den åpne alveolus-chipkulturen. I den innledende fasen av sponpreparatet blir mesenkymale celler (fibroblaster) innebygd i gelen og lastet i Open-Top-brikken for å danne stromallaget, som er belagt i 2-4 timer og frøet med luftveisepitelceller i et medium supplert med KIAD (se tilleggstabell 2). EGF-supplert medium opprettholdes i ~ 4 dager for å støtte epitelcellevekst. Epitelet blir deretter utsatt for luft (ALI) i ~ 10 dager for å oppnå fullstendig vevsmodning. Pulmonale mikrovaskulære endotelceller sås på dag 14, og det biologiske systemet holdes under ALI og strømningsregime til det ofres for analyse på dag 21. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Teknisk oversikt over open-top airway-chip-protokollen . (A) Skjematisk som viser handlingssekvensen for klargjøring av åpen luftveisbrikke og (B) som gir det viktigste biologiske trinnet i den åpne luftveisbrikkekulturen. I den innledende fasen av sponpreparatet blir mesenkymale celler (fibroblaster og/eller glatte muskelceller) innebygd i gelen og lastet i Open-Top Chip for å danne stromallaget, som er belagt i 2-4 timer og frøet med epitelceller i medium supplert med EGF (se tilleggstabell 3). EGF-supplert medium opprettholdes i ~ 4 dager for å støtte epitelcellevekst. Epitelet blir deretter utsatt for luft (ALI) i ~ 10 dager for å oppnå fullstendig vevsmodning. Pulmonale mikrovaskulære endotelceller sås på dag 14, og det biologiske systemet holdes under ALI og strømningsregime til det ofres for analyse på dag 21. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Teknisk oversikt over tarmbrikkeprotokollen med åpen topp . (A) Skjematisk som viser rekkefølgen av handlinger for det åpne tarm-chip-preparatet og (B) som gir det viktigste biologiske trinnet i den åpne tarm-chipkulturen. I den første fasen av sponpreparatet blir mesenkymale celler (kolonfibroblaster) innebygd i gelen og lastet i Open-Top Chip for å danne stromallaget, som er belagt i 2-4 timer og frøet med fragmenter av epitelkolonoider oppnådd fra kliniske reseksjoner. Cellekulturmedium, inkludert tilskudd (ROCK og CHIR, se tilleggstabell 4) er nødvendig under såingstrinnet for å opprettholde kolonoidcellenes levedyktighet og fysiologiske morfologi. Ulike medier brukes deretter til å drive ekspansjonen (dag 1 til 6) og modning (dag 6 til 9) av kolonepitelet. Koloniske mikrovaskulære endotelceller blir sådd på dag 6 ved hjelp av et endotelcellekulturmedium (EGM2 MV), og deretter dyrket under strømning med et epitelekspansjonsmedium i opptil 10 dager. Epitelet eksponeres for ALI fra dag 10 for ytterligere å fremme epitelcellemodning. Mekanisk tøyning kan påføres systemet fra dag 13 og opprettholdes til dag 16, når orgelmodellen ofres for endepunktsanalyse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Stempling av mikromønster. (A) Lateral og øverste visning av stempelet som viser mikroskala tekstur (500 μm i høyden og 250 μm bredde søyle-array) brukes til å gjenskape colonic crypt tissue interface og topp og lateral visning av stempel-chip-enheten, som viser montering av de to elementene når de brukes til å støpe geloverflaten. (B) Vinklet sidevisning som viser stempelet og sponet som vender. (VG Nett) Bilder av den mikromønstrede geloverflaten med og uten celler. Skala barer: 200 μm. Denne figuren er tilpasset med tillatelse fra Varone et al.24. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Representative data oppnådd med den åpne hudbrikken . (A) Skjematisk som viser virkningssekvensen for klargjøringen av den åpne huden og gir de viktigste biologiske trinnene i den åpne hudfliskulturen. (B) PCNA Cytokeratin 14, Cytokeratin10, Involucrin og Fillagrin fluorescensfarging og H &E som viser moden flerlags stratifisert epidermis differensiert på Chip. Skalastenger: 100 μm. (C) Toppbilde av Skin-Chip (skalastenger: 5 mm) og H&E-tverrsnitt (skalastenger: 100 μm) som viser tilstedeværelsen av fibroblastene inne i hudlaget. (D) PECAM-1, VE-Cadherin og Von Willebrand fluorescensfarging som viser differensiering av humane mikrovaskulære endotelceller dyrket samtidig i den åpne hudbrikken. Skala barer: 20 μm. (E) 3D Cartoon konsept rendering av open-top skin-chip. Denne figuren er tilpasset med tillatelse fra Varone et al.24. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 8
Figur 8: Representative data oppnådd med den åpne luftveisbrikken . (A) Skjematisk som viser virkningssekvensen for klargjøring av åpen luftveisbrikke og gir det viktigste biologiske trinnet i Open-Top Airway-Chip-kulturen. (B) MUC5AC (beger), α og β-tubulin (cilierte celler), Clara Cell protein 16 (klubbceller), p63 (basal / stamceller) og ZO-1 fluorescensfarging som viser modent luftveisepitel. Skala barer: 20 μm. (C) Fasekontrast video / bilde som viser tilstedeværelsen av å slå cilia. Skalastenger: 50 μm. (D) H&E-farging (skalastenger: 20 μm) og TEM-bilde (skalastenger: 5 μm) som viser modent pseudostratifisert epitel differensiert på brikken. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 9
Figur 9: Representative data oppnådd med den åpne alveolus-brikken. (A) Skjematisk som viser virkningssekvensen for det åpne alveolus-chippreparatet og gir det viktigste biologiske trinnet i den åpne alveolus-chipkulturen. (B) Type I (HTI-56, AT1-α), Type II (HTII-280, LAMP3, ABCA3, Overflateaktivt middel (C) og E-Cadherin fluorescensfarging som viser tilstedeværelsen av modne pneumocytter på Chip. Skalastenger: 20 μm. (C) SEM- og TEM-bilde som viser tilstedeværelse av mikrovilli og lysosomale vesikler som viser moden alveolær fenotype. Skalastenger: 5 μm. (D) H&E-tverrsnitt (skalastenger: 5 μm) som bekrefter tilstedeværelsen av flate, plateepitelceller som er konsistente med type I-fenotype og kuboidale, brosteinslignende celler som er sammenhengende med type II-fenotype, og (E) som viser tilstedeværelsen av fibroblastene inne i dermale laget (skalastenger: 10 μm). (F) 3D tegneseriekonseptgjengivelse av den åpne alveolus-brikken. Denne figuren er tilpasset med tillatelse fra Varone et al.24. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 10
Figur 10: Representative data oppnådd med den åpne tarmbrikken. (A) Skjematisk som viser virkningssekvensen for Open-Top Intestine-Chip-preparatet og gir det viktigste biologiske trinnet i Open-Top Intestine-Chip-kulturen. (B) Vinklet sidebilde som viser Stamp and Chip-monteringen under gelstøpefasen, tegneseriekonseptet til den mikromønstrede gelen og fasekontrastbilder av en kryptlignende struktur mikromønstret på geloverflaten og frøet med kolonoider i to forskjellige høyder. Skalastenger: 200 μm. (C) Mucin 2 og E-Cadherin fluorescensfarging som viser tilstedeværelsen av enterocytter og modne begerceller på Chip. Skalastenger: 200 μm. (D) H&E-tverrsnitt av en kryptlignende struktur som viser tilstedeværelsen av fibroblastene inne i dermallaget og bekrefter tilstedeværelsen av et enkelt søyleepitel. Skala barer: 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsvideo 1: Fasekontrastvideo som viser slagende flimmerhår. Skala barer: 100 μm. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur 1: Åpen sponmontering. (A) Skjematisk som viser den tredimensjonale gjengivelsen av Open-Top Chip-enheten og tegneseriegjengivelsen av den åpne hudbrikken med de forskjellige biologiske rommene uthevet og inkludert epitel (blå), dermal (gul) og vaskulær (rød). (B) Den sammensatte mikrofluidiske plattformen har et 35 mm x 17 mm format, et vevskulturområde på 0,32 cm2, en bunnspiralisert mikrofluidisk kanal og et kammerlokk med en mikrofluidisk kanal. (C) Plattformen består av et kammer med en 5-graders vinklet vegg, som har en diameter på 6 mm på membrannivå og 5,7 mm på toppen av PDMS-kammerveggen og en høyde på 4 mm og bredde. Den porøse membranen er 50 μm tykk og porene er 7 μm i diameter. (D) Den nederste spiralformede mikrofluidiske kanalen har tverrsnittsdimensjoner på 400 μm (høyde) x 600 μm (bredde). (E) En oversikt over eksperimentets tidslinje og trinnene som kreves for å forberede Open Top Organ-Chip. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggstabell 1: Hud. Tabellen gir et sammendrag av de viktigste daglige trinnene og strekk- og strømningsparametrene som brukes i de tre fasene av Open-Top Skin-Chip-kulturen (vekst, spredning og differensiering). Tabellen inneholder også listen over materialer, medieformuleringer og instruksjoner om hvordan du klargjør mediene som er nødvendige for denne protokollen. Sammensetningen av de tre mediene er optimalisert for de forskjellige fasene i protokollen. Spesielt er Medium I optimalisert for såing og tidlig keratinocytkulturfase. Medium II er optimalisert for spredning og tidlig differensiering (dannelse av et stratifisert epitel). ALI-mediet er optimalisert for å opprettholde keratinocytter ved et luft-væske-grensesnitt til en fullstendig differensiert epidermis er produsert. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggstabell 2: Alveolus. Tabellen gir et sammendrag av de viktigste daglige trinnene og strekk- og strømningsparametrene som brukes i de tre fasene av den åpne alveolus-chipkulturen (vekst, spredning og differensiering). Tabellen inneholder også listen over materialer, medieformuleringer og instruksjoner om hvordan du klargjør mediene som er nødvendige for denne protokollen. Sammensetningen av de to mediene er optimalisert for de forskjellige fasene i protokollen. Vær oppmerksom på at tilsetning av kosttilskudd (KIAD) til cellekulturmediet er avgjørende for å oppnå optimal differensiering av pneumocytter. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggstabell 3: Luftveier. Tabellen gir et sammendrag av de viktigste daglige trinnene og strekk- og strømningsparametrene som brukes i de tre fasene av den åpne luftveisbrikkekulturen (vekst, spredning og differensiering). Tabellen inneholder også listen over materialer, mediumformuleringen og instruksjoner om hvordan du forbereder mediet som er nødvendig for denne protokollen. Sammensetningen av mediet er optimalisert for å opprettholde luftveisceller ved luftvæskegrensesnittet, noe som igjen induserer terminal differensiering og stimulerer produksjonen av slim. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggstabell 4: Tarm. Tabellen gir et sammendrag av de viktigste daglige trinnene og strekk- og strømningsparametrene som brukes i de tre fasene av den åpne tarmbrikkekulturen (vekst, spredning og differensiering). Tabellen inneholder også listen over materialer, medieformuleringer og instruksjoner om hvordan du klargjør mediene som er nødvendige for denne protokollen. Komposisjonene til begge mediene er optimalisert for de forskjellige fasene av protokollen. Spesielt er ekspansjonsmediet supplert med CIR- og ROCK-hemmere optimalisert for såing og tidlig fase av kultur fordi det fremmer overlevelse og vekst av kolonorganoidfragmentet som et monolag. Ekspansjonsmediet er optimalisert for spredning og tidlig differensiering av epitelmonolag. Differensieringsmediet er optimalisert for terminal differensiering av epitelmonolaget før eksponering for luft-væskegrensesnittet. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Open-Top Chip representerer en muliggjørende plattform for å undersøke det komplekse cellulære samspillet som skjer mellom endotel, strom og epitel i et kontrollert mikromiljø, i sanntid. Denne teknologien gir kritiske fordeler i forhold til konvensjonelle organotypiske og organoide kulturer, for eksempel integrering av fysiske og biokjemiske signaler som er relevante for å rekonstituere det menneskelige vevsmikromiljøet, inkludert fluidisk skjær (strømning), syklisk strekking og rekonstruksjon av epiteloverflatetopografien oppnådd via mikromønster. Menneskelige celler som vokser innenfor denne plattformen, virker i synergi for å rekapitulere vevsspesifikke funksjoner som kan analyseres via konvensjonelle teknikker, inkludert immunhistokjemi og biokjemiske analyser ved bruk av utstrømningsvæsker (eller avløp) fra topp- og / eller bunnrommene. Den nåværende utformingen gir enkel tilgang til epitellaget, hvor celler vokser i direkte kontakt med vevsspesifikke fibroblaster og andre stromale celler, som etterligner den multicellulære arkitekturen av epitelvev. Spesielt tilbyr Open-Top Chip-prototypen en levedyktig løsning på vanlige utfordringer knyttet til bruk av andre organ-on-chip-plattformer. Mens det muliggjør inkorporering av flere forskjellige celletyper i et stromalrom som fører til dannelse av svært komplekse 3D-vev, tillater det også enkel ekstraksjon av de etablerte vevskonstruksjonene fra chipenheten for nedstrømsanalyse, inkludert konvensjonell H &E-farging.

Den nåværende utformingen presenterer noen begrensninger. For eksempel er den elastiske membranen som er plassert mellom den vaskulære mikrokanalen og det stromale rommet (hydrogelen) til prototypen Open-Top Chip, betydelig tykkere (≈ 50 μm mot ≈ 1 μm) enn det interstitielle rommet som skiller endotelvev fra stroma i de innfødte menneskelige organene. Selv om den elastiske membranen ikke representerer en fysisk barriere for diffusjon av store molekyler, slik som hormoner og andre parakrine faktorer som formidler den intercellulære crosstalken mellom vev, kan den begrense direkte celle-celle-interaksjoner og migrasjon av celler fra vaskulær til stromalrom. Til slutt er prototypen Open-Top Chip laget av PDMS, som er kjent for å absorbere et stort antall hydrofobe forbindelser. Denne begrensningen deles av mange PDMS-baserte plattformer som kan være en alvorlig hindring i applikasjoner beregnet for testing av farmakodynamikk og farmakokinetikk av små terapeutiske forbindelser27.

En av hovedutfordringene ved å integrere 3D-hydrogeler i en mikrofluidisk enhet som Open-Top Chip, er at PDMS ikke gir et optimalt substrat for binding av humane proteiner eller celler. Kjemisk funksjonalisering av PDMS-overflaten er derfor et kritisk trinn i denne protokollen som er nødvendig for å sikre riktig ECM-belegg og hydrogeladhesjon til gelkammeret til Open-Top Chip-modellen. For å oppnå optimale resultater må tverrbindingsmiddelet i ER1-løsningen alltid beskyttes mot direkte eksponering for lys. En viktig indikator på tverrbinderens reaktive status er fargen. Tverrbinderen i ER1 gjennomgår faktisk en fargeovergang fra strålende oransje til mørk brun når den oksiderer. Fargeovergangen kan brukes som en indikator etter UV-aktiveringstrinnet for å kontrollere om løsningen effektivt har reagert med PDMS-overflaten. Under fremstillingen av tverrbindingsløsningen bør fargeovergangen overvåkes for å sikre at utilsiktet eksponering for direkte lys ikke fotobleker den kjemiske forbindelsen i løsningen. For å beskytte tverrbinderløsningen og unngå uønsket fotobleking, foreslår vi å pakke inn aluminiumsfolie, ca. 15 cm x 15 cm, rundt et 15 ml konisk rør eller bruke et gult rør tilgjengelig på markedet. Bruken av ER1 muliggjør en enkel og effektiv metode for å oppnå rask funksjonalisering av PDMS-overflatene; Imidlertid er det andre molekyler som kan brukes i stedet for ER1. For eksempel er de kjemiske tverrbinderne 3-aminopropyl-trimetoksysilan (APTMES) ikke så lysfølsomme som ER1, og det kan brukes til å oppnå lignende resultater med noen få ekstra trinn som vi tidligere har beskrevet andre steder28,29. Uavhengig av det valgte molekylet, er en av hovedbegrensningene ved arbeid med en kjemisk tverrbinder tilstedeværelsen av restrester, noe som kan indusere cytotoksisitet. Etter aktiveringsreaksjonen er det viktig å skylle de mikrofluidiske overflatene med rikelige mengder vaskeoppløsning.

Fordi luftbobler har en tendens til å danne og vokse innenfor de hydrofobe grensesnittene til sjetongene, slangene og kontaktene, er det viktig å vurdere om den mikrofluidiske banen er fri for luftbobler før du starter væskestrømmen. Bobler kan faktisk forstyrre strømmen og til og med drepe cellene når sjetonger er koblet til strømning. Klargjøring av de mikrofluidiske komponentene før væskestrømmen starter, vil redusere risikoen for å generere luftbobler og bidra til å oppnå optimale og reproduserbare resultater. Hvis primingsyklusen beskrevet i denne protokollen ikke var tilstrekkelig, vil skylling av mikrofluidrørene med etanol (5 min) og deretter med HBSS (20 min) ytterligere redusere risikoen for å generere luftbobler inne i fluidkontaktene.

Til tross for begrensningene har PDMS en sjelden kombinasjon av kjemiske egenskaper som har muliggjort fremstilling av svært biokompatible, gjennomsiktige og elastiske mikrofluidiske enheter. Alle disse egenskapene har gjort PDMS til det mest anvendte materialet for konstruksjonen av Organ-on-Chip-modellene det siste tiåret. Nylige fremskritt innen materialvitenskap og kjemiteknikk30,31 antyder at PDMS-komponenten i denne plattformen kan erstattes i nær fremtid med nye syntetiske polymerer eller biomaterialer. Hvis det lykkes, kan det muliggjøre rekapitulering av vevsspesifikke egenskaper, inkludert porøsitet, ECM-sammensetning av det interstitielle rommet som gir nærmere etterligning til humant innfødt vev og mer avanserte modeller for farmakologistudier. Vi forventer at den fremtidige utviklingen av Open-Top Chip-designet vil muliggjøre modellering av menneskelig vev og organer med et enestående detaljnivå.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer følgende økonomiske interesser / personlige forhold, som kan betraktes som potensielle konkurrerende interesser: Varone Antonio er tidligere ansatt i Emulate Inc. og kan ha egenkapitalinteresser i Emulate.

Acknowledgments

Ingen

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x EMEM  Lonza 12-684F Medium; Stroma
18 Gauge needle MicroGroup 316H18RW Tube stainless steel 316 welded, 18RW Full Hard 
19 Gauge needle MicroGroup 316H19RW Tube stainless steel 316 welded, 19RW Full Hard
2-Stop PharMed BPT  Cole-Palmer  EW-95723-12 Tube, 0.25 mm, 12/pack
70% ethanol and wipes   -   -  For surface sterilization 
8-Bromoadenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt (8-Br-cAMP) Sigma B7880 Medium supplement 
A-83-01  Tocris  2939
Adenine Sigma A9795
Advanced DMEM/F12  Thermo 12634010
Airway Epithelial Cells Lifeline Cell Technology FC-0016
Aluminum foil   -   -   -
Alveolar cells Cell Biologics H6621
Anti-ABCA3   ABCAM  ab24751  Mouse monoclonal antibody [3C9] 
Anti-Aquaporin5 Alexa Fluor 647  ABCAM  ab215225   Rabbit monoclonal antibody [EPR3747]  
Anti-Aquaporin5  ABCAM  ab92320  Rabbit monoclonal antibody [EPR3747] 
Anti-beta IV Tubulin   ABCAM  ab11315  Mouse monoclonal antibody [ONS.1A6] 
Anti-CD31 (PECAM-1)  ABCAM  ab9498  Mouse monoclonal [JC/70A] antibody  
Anti-CK5   ABCAM  ab75869  Rabbit recombinant monoclonal [AY1E6] 
Anti-Cytokeratin 10   ThermoFisher  MA5-13705  Mouse monoclonal antibody (DE-K10) 
Anti-Cytokeratin 14   ABCAM  ab7800  Mouse monoclonal antibody 
Anti-E-Cadherin   ABCAM  ab1416   Mouse monoclonal antibody 
Anti-Filaggrin   ThermoFisher  PA5-79267  Rabbit polyclonal antibody  
Anti-HTI-56  Terrace Biotech  TB-29AHT1-56   Mouse monoclonal antibody (IgG1) 
Anti-HTII-280  Terrace Biotech  TB-27AHT2-280  Mouse monoclonal antibody (IgM) 
Anti-Involucrin   ThermoFisher  MA5-11803  Mouse monoclonal antibody (SY5) 
Anti-Isoforms TA p63-α, -β, -γ   Biolengend  618902  Rabbit polyclonal antibody  
Anti-Ki67   ABCAM  ab8191  Mouse monoclonal antibody [B126.1] 
Anti-LAMP3   ABCAM  ab111090  Rabbit polyclonal antibody 
Anti-Mature SP-B  Seven Hill  WRAB-48604  Rabbit polyclonal antibody 
Anti-MUC5AC   ThermoFisher  PA5-34612  Rabbit polyclonal antibody  
Anti-Mucin-2  SantaCruz Biotechnology sc-7314 Mouse monoclonal antibody (IgG1) 
Anti-p63   Dako  GA662  Mouse monoclonal antibody p63 Protein (Dako Omnis) Clone DAK-p63 
Anti-PCNA   ThermoFisher  PA5-32541  Rabbit polyclonal antibody  
Anti-Podoplanin (AT-1α)   ABCAM  ab128994  Rabbit polyclonal antibody 
Anti-Pro + Mature Surfactant Protein B  ABCAM  ab40876  Rabbit polyclonal antibody 
Anti-Surfactant C    Seven Hill   WRAB-9337   Rabbit polyclonal antibody 
Anti-Uteroglobin/SCGB1A1  Hycult Biotech  HM2178  Mouse monoclonal antibody [AY1E6] 
Anti-VE-cadherin   ABCAM  ab33168  Rabbit polyclonal antibody  
Anti-ZO-1   ThermoFisher  33-9100  Mouse monoclonal antibody [1A12] 
Ascorbic acid Sigma A4544
Aspirating pipettes  Corning / Falcon  357558  2 mL, polystyrene, individually wrapped 
Aspirating tips   -   -  Sterile (autoclaved) 
B27 Thermo 17504044
Blocker BSA (10X) in PBS solution   ThermoFisher  37525  Blocker agent 
Calcium Chloride Sigma C7902
CHIR 99021 Tocris 4423
Collagen I Advanced Biomatrix 5133 10 mg/mL (Stroma)
Collagen I  Advanced BioMatrix 5005 3 mg/mL (Vascular ECM)
Collagen IV Sigma  C5533
Collagen-IV Sigma  C5533-5MG  Collagen from human placenta, 5 mg powder, reconstitute to 1 mg/mL 
Colonic Fibroblasts  Cell Biologics  H6231
Colonic microvascular endothelial cells  Cell Biologics H6203 
Conical tubes    -   -  15 mL and 50 mL polypropylene, sterile 
Crosslinker (ER-1)  Emulate  10461 5 mg powder 
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)   ThermoFisher  D3571  DNA probe 
Dermal fibroblasts ATCC PCS-201-010
Dermal microvascular endothelial cells ATCC CRL-3243
Dexamethasone Sigma D4902
DMEM ThermoFisher 11054020
DMEM/F-12  GIBCO  11320082
DMEM/F-12, GlutaMAX   GIBCO  10565-018  Basal medium for ALI medium 
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488)   ABCAM  ab150105  Donkey Anti-Mouse secondary antibody  
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568)   ABCAM  ab175472  Donkey Anti-Mouse secondary antibody 
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647)   ABCAM  ab150107  Donkey Anti-Mouse secondary antibody 
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488)   ABCAM   ab150073  Donkey Anti-Mouse secondary antibody 
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568)   ABCAM  ab175470  Donkey Anti-Mouse secondary antibody 
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 647)   ABCAM  ab150075  Donkey Anti-Mouse secondary antibody 
Dulbecco’s PBS (DPBS-/-) (without Ca2+, Mg2+)  Corning  21-031-CV  1x 
Epidermal Growth Factor (EGF) human, recombinant in E. coli PromoCell C-60170 Medium supplement 
F-12 Ham’s Invitrogen  21700-108 For vascular ECM
FibriCol  Advanced BioMatrix  5133-20ML  Collagen-I solution (10 mg/mL)
Fibronectin Corning 356008
Fibronectin, Human, Natural,   Corning  47743-654  human plasma fibronectin 
Fine-tip precision tweezers  Aven 18056USA  Technik Style 5B-SA Precision Stainless Steel Tweezers
Glutamax Invitrogen  21700-108
Glutamax  Invitrogen  35050061
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 594)   ABCAM  ab150080  Goat Anti-Mouse secondary antibody  
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647)   ABCAM  ab150115  Goat Anti-Mouse secondary antibody  
Goat Anti-Mouse IgG H&L (FITC)   ABCAM  ab6785  Goat Anti-Mouse secondary antibody  
Goat Anti-Mouse IgG1 Alexa Fluor 568   ThermoFisher  A-21124  Goat Anti-Mouse IgG1 secondary antibody 
Goat Anti-Mouse IgM Alexa Fluor 488   ThermoFisher  A-21042  Goat Anti-Mouse IgM secondary antibody 
Handheld vacuum aspirator  Corning  4930   - 
Heat Inactivated HyClone FetalClone II Serum (FCS)  GE Healthcare Life Sciences SH30066.03
Hemocytometer   -   -  - 
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa Sigma H3149
HEPES Thermo 15630080
Human [Leu15] - Gastrin  Sigma G9145
Human colonoids Obtained from clinical resections Obtained from clinical resections
Human EGF Recombinant Protein  Thermo PHG0311L
human epithelial growth factor  Thermo  PHG0311
HyClone FetalClone II Serum (U.S.)   GE Healthcare  SH30066.02HI   Sterile FBS heat-inactivated 
Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt Sigma H4881
Hydrocortisone  PromoCell   C-64420  Medium supplement  
Ice bucket   -   -   - 
Ismatec IPC-N  Cole-Palmer EW-78000-41 Low-Speed Digital Peristaltic Pump; q24-Channel (1 per 12 Chips)
ITES BioWhittaker 17-839Z
Keratinocyte Growth Factor (KGF), also known as Basic Fibroblast Growth Factor 7 (FGF-7), human, recombinant in HEK PromoCell C-63821
Keratinocytes ATCC PCS-200-010
Laminin  Biolamina CT521-0501 
Laminin, 521 CTG (CT521)  Biolamina   CT521-0501  human recombinant laminin 521    
Lung Fibroblast Cell Biologics H6013
Lung Fibroblast Lifeline Cell Technology FC-0049
Lung microvascular endothelial cells Lonza CC-2527
Lung smooth muscle cells Lifeline Cell Technology FC-0046
Manual counter   -   -   -
Masterflex (TPE) Transfer Tubing  Cole-Palmer FV-96880-02 PharMed BPT, 1/32" ID x 5/32" OD
Medium 199, no phenol red Thermo  11043023
Microcentrifuge tube   -    -   1.5 mL, sterile 
Microscope (with camera)   -   -  For bright-field imaging 
N2 Sigma 17502001
N-acetyl cysteine Sigma A5099
Noggin (HEK293T conditioned medium) Sigma N17001
Normal Goat Serum   ThermoFisher  50062Z  Blocking solution  
O-phosphosrylethanolamine  Sigma P0503
Paraformaldehyde (4% wt/vol)   EMS  15710  Fixing agent 
Penicillin Streptomycin GIBCO 15140122
Penicillin-streptomycin  Sigma  P4333  10,000 U/mL; 10 mg/mL 
Pipette tips    -   -  P20, P200, and P1000 sterile, low adhesion
Pipette  Gilson   F167380  P20, P200, and P1000 
PluriQ Serum Replacement (or alternatively KO Serum replacement) AMSBIO (or Thermo) N/A (or C1910828010)
Poly-L-Lysine coated microscope glass slides   Sigma  P0425  Glass slides 
Primocin InvivoGen ant-pm-1
Progesterone Sigma P8783
ProLong Gold   ThermoFisher  P36931  Antifade Mountant with DAPI 
Retinoic Acid  Sigma R2625
ROCK inhibitor (Y27632) Tocris TB1254-GMP/10
R-spondin (HEK293T conditioned medium) Sigma SCC111
SAGM SingleQuots supplements  Lonza CC-4124
SAGMTM Small Airway Epithelial Cell Growth medium BulletKitTM  Lonza  CC-4124  Medium supplements 
SB2001190  Tocris  1264/10
Serological pipettes   -   -  2 mL, 5 mL, 10 mL, and 25 mL low endotoxin, sterile 
Small Airway Epithelial Cell Growth medium (SAGM) Lonza  CC-4124 
Solvent Buffer (ER-2)  Emulate  10462 25 mL bottle 
Steriflip-HV  Millipore SE1M003M00 Sterile filtering conical tube
Sterilin 100 mm Square Petri Dishes Thermo 103 Sterile, 1 per 6 chips 
T25 flasks   -   -   -
T75 flasks   -   -   - 
Tri-iodothyronine Sigma T5516
Triton X-100 (0.3% (vol/vol)   Sigma  T8787  Permeabilization agent 
Trypan blue  Sigma  93595  0.4% solution 
TrypEE solution  Sigma  12604013  Cell detaching solution 
TWEEN-20  Sigma  P2287  Permeabilization agent 
UV Light Oven (peak frequency 365nm, intensity of 100 µJ/cm2) VWR 21474-598 UVP, Long Range UV, 365 nm 60Hz Model CL-1000L
Vacuum set-up   -   -  Minimum pressure: -70 kPa 
Vascular Endothelial Growth Factor 165 (VEGF-165) human, recombinant in E. coli PromoCell C-64420
VEGF-165   PromoCell   C-64420  Medium supplement 
Von Willebrand Factor conjugated FITC   ABCAM  ab8822  Sheep polyclonal antibody 
Water bath (or beads)   -   -  Set to 37 °C 
Wnt3A (L-Wnt3A conditioned medium) ATCC CRL-2647

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Van Norman, G. A. Limitations of animal studies for predicting toxicity in clinical trials: Is it time to rethink our current approach. JACC: Basic to Translational Science. 4 (7), 845-854 (2019).
  2. Wange, R. L., Brown, P. C., Davis-Bruno, K. L. Implementation of the principles of the 3Rs of animal testing at CDER: Past, present and future. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 123, 104953 (2021).
  3. Mosig, A. S. Organ-on-chip models: New opportunities for biomedical research. Future Science OA. 3 (2), (2017).
  4. Alépée, N., et al. State-of-the-art of 3D cultures (organs-on-a-chip) in safety testing and pathophysiology. Altex. 31 (4), 441-477 (2014).
  5. MacArron, R., et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (3), 188-195 (2011).
  6. Hughes, J. P., Rees, S. S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. Principles of early drug discovery. British Journal of Pharmacology. 162 (6), 1239-1249 (2011).
  7. Kitaeva, K. V., Rutland, C. S., Rizvanov, A. A., Solovyeva, V. V. Cell culture based in vitro test systems for anticancer drug screening. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 322 (2020).
  8. Mao, P., et al. Human alveolar epithelial type II cells in primary culture. Physiological Reports. 3 (2), 12288 (2015).
  9. Zaitseva, M., Vollenhoven, B. J., Rogers, P. A. W. In vitro culture significantly alters gene expression profiles and reduces differences between myometrial and fibroid smooth muscle cells. Molecular Human Reproduction. 12 (3), 187-207 (2006).
  10. Singh, A., Brito, I., Lammerding, J. Beyond tissue stiffness and bioadhesivity: Advanced biomaterials to model tumor microenvironments and drug resistance. Trends in Cancer. 4 (4), 281-291 (2018).
  11. Nawroth, J. C., et al. Stem cell-based Lung-on-Chips: The best of both worlds. Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 12-32 (2019).
  12. Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2d to 3d cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).
  13. Kapałczyńska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
  14. Sutherland, R. M., Inch, W. R., McCredie, J. A., Kruuv, J. A multi-component radiation survival curve using an in vitro tumour model. International Journal of Radiation Biology. 18 (5), 491-495 (1970).
  15. Chandra, P., Lee, S. J. Synthetic extracellular microenvironment for modulating stem cell behaviors. Biomarker Insights. 10, 105-116 (2015).
  16. Nicolas, J., et al. 3D extracellular matrix mimics: Fundamental concepts and role of materials chemistry to influence stem cell fate. Biomacromolecules. 21 (6), 1968-1994 (2020).
  17. Brassard, J. A., Lutolf, M. P. Engineering stem cell self-organization to build better organoids. Cell Stem Cell. 24 (6), 860-876 (2019).
  18. Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. Designing materials to direct stem-cell fate. Nature. 462 (7272), 433-441 (2009).
  19. Mantha, S., et al. Smart hydrogels in tissue engineering and regenerative medicine. Materials. 12 (20), 3323 (2019).
  20. Langhans, S. A. Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 6 (2018).
  21. Li, H., et al. Biomechanical cues as master regulators of hematopoietic stem cell fate. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (16), 5881-5902 (2021).
  22. Donoghue, L., Nguyen, K. T., Graham, C., Sethu, P. Tissue chips and microphysiological systems for disease modeling and drug testing. Micromachines. 12 (2), 139 (2021).
  23. Ma, C., Peng, Y., Li, H., Chen, W. Organ-on-a-chip: A new paradigm for drug development. Trends in Pharmacological Sciences. 42 (2), 119-133 (2021).
  24. Varone, A., et al. A novel organ-chip system emulates three-dimensional architecture of the human epithelia and the mechanical forces acting on it. Biomaterials. 275, 120957 (2021).
  25. Hassell, B. A., et al. Human organ chip models recapitulate orthotopic lung cancer growth, therapeutic responses, and tumor dormancy in vitro. Cell Reports. 21 (2), 508-516 (2017).
  26. Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. Making formalin-fixed, paraffin embedded blocks. Biobanking. 1897, 253-268 (2019).
  27. Grant, J., et al. Simulating drug concentrations in PDMS microfluidic organ chips. Lab on a Chip. 21 (18), 3509-3519 (2021).
  28. Barrile, R., et al. Organ-on-chip recapitulates thrombosis Induced by an anti-CD154 monoclonal antibody: Translational potential of advanced microengineered systems. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 104 (6), 1240-1248 (2018).
  29. Jain, A., et al. Primary human lung alveolus-on-a-chip model of intravascular thrombosis for assessment of therapeutics. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 103 (2), 332-340 (2018).
  30. Campbell, S. B., Wu, Q., Yazbeck, J., Liu, C., Okhovatian, S., Radisic, M. Beyond polydimethylsiloxane: Alternative materials for fabrication of organ-on-a-chip devices and microphysiological systems. ACS Biomaterials Science and Engineering. 7 (7), 2880-2899 (2021).
  31. Pun, S., Haney, L. C., Barrile, R. Modelling human physiology on-chip: Historical perspectives and future directions. Micromachines. 12 (10), 1250 (2021).

Tags

Denne måneden i JoVE utgave 192
Rekonstituering av cytoarkitektur og funksjon av humant epitelvev på en åpen organbrikke
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Antonio, V., Panchal, A., Kasendra,… More

Antonio, V., Panchal, A., Kasendra, M., Riccardo, B. Reconstituting Cytoarchitecture and Function of Human Epithelial Tissues on an Open-Top Organ-Chip. J. Vis. Exp. (192), e64633, doi:10.3791/64633 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter