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Bioengineering

एक ओपन-टॉप ऑर्गन-चिप पर साइटोआर्किटेक्चर और मानव उपकला ऊतकों के कार्य का पुनर्गठन

Published: February 17, 2023 doi: 10.3791/64633
Automatic Translation
1, 2, 3, 2,3
1Merk Sharp & Dohme LLC, 2Department of Biomedical Engineering, University of Cincinnati, 3Center for Stem Cell and Organoid Medicine, Cincinnati Children's Hospital Medical Center

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल प्राथमिक ऊतकों (त्वचा, एल्वियोलस, वायुमार्ग और आंत) की पूर्ण मोटाई वाले अंग-ऑन-चिप संस्कृतियों की सफल स्थापना और परिपक्वता के लिए ओपन-टॉप ऑर्गन-चिप की क्षमताओं और आवश्यक संस्कृति के तौर-तरीकों का वर्णन करता है, जो विट्रो में मानव उपकला / मेसेनकाइमल और संवहनी आला इंटरफ़ेस के विभिन्न कार्यात्मक पहलुओं की जांच करने का अवसर प्रदान करता है।

Abstract

लगभग सभी मानव अंग उपकला ऊतकों के साथ पंक्तिबद्ध होते हैं, जिसमें तीन आयामी (3 डी) संरचनाओं में व्यवस्थित कसकर जुड़ी कोशिकाओं की एक या कई परतें होती हैं। एपिथेलिया के मुख्य कार्यों में से एक बाधाओं का गठन है जो शारीरिक और रासायनिक अपमान और संक्रामक एजेंटों के खिलाफ रेखांकित ऊतकों की रक्षा करता है। इसके अलावा, एपिथेलिया पोषक तत्वों, हार्मोन और अन्य सिग्नलिंग अणुओं के परिवहन में मध्यस्थता करता है, अक्सर जैव रासायनिक ग्रेडिएंट बनाता है जो अंग के भीतर सेल पोजिशनिंग और कंपार्टमेंटलाइजेशन का मार्गदर्शन करता है। अंग-संरचना और कार्य को निर्धारित करने में उनकी केंद्रीय भूमिका के कारण, एपिथेलिया कई मानव रोगों के लिए महत्वपूर्ण चिकित्सीय लक्ष्य हैं जो हमेशा पशु मॉडल द्वारा कब्जा नहीं किए जाते हैं। स्पष्ट प्रजातियों-से-प्रजातियों के अंतर के अलावा, जानवरों में एपिथेलिया के बाधा कार्य और परिवहन गुणों पर शोध अध्ययन करना एक जीवित प्रणाली में इन ऊतकों तक पहुंचने की कठिनाई से और जटिल हो जाता है। जबकि दो-आयामी (2 डी) मानव कोशिका संस्कृतियां बुनियादी वैज्ञानिक सवालों के जवाब देने के लिए उपयोगी हैं, वे अक्सर विवो भविष्यवाणियों में खराब परिणाम देते हैं। इन सीमाओं को दूर करने के लिए, पिछले दशक में, माइक्रो-इंजीनियर बायोमिमेटिक प्लेटफार्मों की अधिकता, जिन्हें ऑर्गन-ऑन-ए-चिप के रूप में जाना जाता है, पारंपरिक इन विट्रो और पशु परीक्षण के लिए एक आशाजनक विकल्प के रूप में उभरे हैं। यहां, हम एक ओपन-टॉप ऑर्गन-चिप (या ओपन-टॉप चिप) का वर्णन करते हैं, एक मंच जो त्वचा, फेफड़े और आंतों सहित अंग-विशिष्ट उपकला ऊतकों के मॉडलिंग के लिए डिज़ाइन किया गया है। यह चिप बहुकोशिकीय वास्तुकला और उपकला ऊतकों के कार्य को पुनर्गठित करने के लिए नए अवसर प्रदान करती है, जिसमें यांत्रिक रूप से सक्रिय प्रणाली के भीतर ऊतक-विशिष्ट फाइब्रोब्लास्ट और एंडोथेलियल कोशिकाओं को शामिल करके 3 डी स्ट्रोमल घटक को फिर से बनाने की क्षमता शामिल है। यह ओपन-टॉप चिप एकल कोशिकाओं से बहु-परत ऊतक निर्माण तक संकल्प के कई पैमानों पर उपकला / मेसेनकाइमल और संवहनी इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए एक अभूतपूर्व उपकरण प्रदान करता है, इस प्रकार स्वास्थ्य और बीमारी में उपकला अंगों के अंतरकोशिकीय क्रॉसस्टॉक के आणविक विच्छेदन की अनुमति देता है।

Introduction

ऐतिहासिक रूप से, वैज्ञानिकों ने दवा की खोज के लिए प्रीक्लिनिकल पशु परीक्षण पर भरोसा किया है, लेकिन मानव परिणाम1 के साथ खराब सहसंबंध के कारण इन तरीकों की बढ़ती संख्या पर सवाल उठाया गया है। पशु प्रयोग को बदलने, कम करने और परिष्कृत करने के लिए "3आर" सिद्धांतों का कार्यान्वयन वैज्ञानिकों को प्रीक्लिनिकल दवा और रासायनिक विष विज्ञान जोखिम मूल्यांकन का समर्थन करने के लिए नए इन विट्रो वैकल्पिक तरीकों को खोजनेका आग्रह करता है। हालांकि, आज तक विकसित कई इन विट्रो मॉडल ों में जैविक वास्तुकला, सेलुलर जटिलता और यांत्रिक वातावरण की कमी है जो मानव जीवित अंगों की गतिशील प्रकृति को पुन: उत्पन्न करने के लिए आवश्यक है।

पारंपरिक इन विट्रो प्रीक्लिनिकल सिस्टम आमतौर पर कठोर प्लास्टिक की सतह पर उगाए गए मानव कोशिकाओं के 2 डी मोनोकल्चर को नियोजित करते हैं। ये विधियां सरल यांत्रिक अध्ययन करने के लिए एक उपकरण प्रदान करती हैं और दवा उम्मीदवारों की तेजी से जांच को सक्षम करती हैं। उनकी अपेक्षाकृत कम लागत और उच्च मजबूती के कारण, 2 डी मॉडल को अक्सर स्वचालित उच्च-थ्रूपुट सिस्टम के साथ जोड़ा जाता है और दवाविकास प्रक्रिया 5,6 के शुरुआती चरण के दौरान संभावित दवा उम्मीदवारों की तेजी से पहचान के लिए उपयोग किया जाता है। हालांकि, इस तरह के 2 डी मॉडल चिकित्सीय उम्मीदवारों के लिए ऊतक-स्तर, अंग-स्तर, या प्रणालीगत प्रतिक्रियाओं के मॉडलिंग के लिए एक ट्रांसलेशनल दृष्टिकोण प्रदान नहीं करते हैं, जो उनके विकास के प्रीक्लिनिकल चरण के दौरान दवा सुरक्षा और प्रभावकारिता की सटीक भविष्यवाणियों के लिए आवश्यक है। फ्लैट सेल संस्कृतियां देशी ऊतक माइक्रोएन्वायरमेंट को पुन: उत्पन्न नहीं करती हैं, जिसमें जटिल बहुकोशिकीय इंटरप्ले, बायोमैकेनिकल गुण और मानव ऊतकों की त्रि-आयामी (3 डी) वास्तुकलाशामिल है। एक सपाट सतह पर बढ़ने वाली कोशिकाएं अक्सर एक परिपक्व फेनोटाइप प्राप्त नहीं करती हैं और इसलिए, औषधीय उत्तेजनाओं का जवाब नहीं दे सकती हैं क्योंकि वे देशी ऊतक में होंगे। उदाहरण के लिए, विट्रो में उगाई गई प्राथमिक मानव वायुकोशीय उपकला कोशिकाएं एक स्क्वैमस फेनोटाइप प्रदर्शित करती हैं और प्रमुख फेनोटाइपिक मार्करों को खो देती हैं, जिसमें सर्फेक्टेंट प्रोटीन सी और बी (एसपी-सी और एसपी-बी) 8 शामिल हैं। अपर्याप्त भेदभाव के अलावा, प्राथमिक कोशिकाएं अक्सर विट्रो में जैविक तनावों के प्रति असंवेदनशील हो जाती हैं, क्योंकि ऊतक सूजन से जुड़े कुछ जैव रासायनिक मार्ग गैर-कार्यात्मकहो जाते हैं। सेल फ़ंक्शन का ऐसा नुकसान मुख्य रूप से कठोर सब्सट्रेट्स के उपयोग के साथ-साथ ऊतक-विशिष्ट स्ट्रोमल कोशिकाओं जैसे फेफड़ों के फाइब्रोब्लास्ट और चिकनीमांसपेशी कोशिकाओं द्वारा स्वाभाविक रूप से जारी घुलनशील कारकों की कमी से जुड़ा हुआ है।

यह समझना कि कीमो-शारीरिक और जैविक जटिलता की कमी विट्रो में कोशिकाओं के शारीरिक व्यवहार को सीमित करती है, ने अधिक परिष्कृत बहुकोशिकीय मॉडल के विकास को बढ़ावा दिया है,जो शरीर के बाहर मानव ऊतकों की जटिलता को बेहतर ढंग से पकड़ने के लिए साबित हुए हैं। 1970के दशक की शुरुआत में पहले सह-संस्कृति मॉडल के निर्माण के बाद से, सिंथेटिक और प्राकृतिक हाइड्रोगेल की शुरूआत ने देशी ऊतक माइक्रोएन्वायरमेंट की नकल करने की क्षमता में काफी सुधार किया है और सेलुलर भेदभाव को चलाने के लिए एक अमूल्य उपकरण बन गया है, ऊतकों जैसी संरचनाओं में कोशिकाओं के आत्म-संगठन का मार्गदर्शन करता है, और देशी ऊतक कार्यों की बहाली15,16. उदाहरण के लिए, जब उपयुक्त 3 डी मचान में उगाया जाता है, तो मानव कोशिकाएं कार्यात्मक संरचनाओं जैसे स्फेरॉइड या ऑर्गेनोइड में स्वयं को व्यवस्थित कर सकती हैं, स्टेम सेल मार्करों को व्यक्त कर सकती हैं, और आत्म-नवीकरण में सक्षमहैं। इसके विपरीत, मानव कोशिकाएं (स्टेम कोशिकाओं सहित), जब पारंपरिक 2 डी सब्सट्रेट्स पर उगाई जाती हैं, तो तेजी से उम्र बढ़ती हैं और कुछ मार्गों के बाद शिथिलता से गुजरतीहैं। इसके अलावा, हाइड्रोगेल को विशिष्ट ऊतक गुणों जैसे सरंध्रता, छिद्र आकार, फाइबर मोटाई, विस्कोस्टिकिटी, स्थलाकृति और कठोरता से मेल खाने के लिए "अनुरूप" किया जा सकता है या आगे ऊतक-व्युत्पन्न सेलुलर घटकों और / या बायोएक्टिव अणुओं के साथ इंजीनियर किया जा सकता है जो शारीरिक या रोगसंबंधी स्थितियों के अनुकरण को सक्षम करता है।. दवा परीक्षण के लिए उनकी विशाल क्षमता के बावजूद, फार्मास्युटिकल अनुसंधान में उपयोग किए जाने वाले 3 डी हाइड्रोगेल-आधारित मॉडल विवो ऊतकों के जटिल साइटोआर्किटेक्चर को पूरी तरह से पुन: उत्पन्न नहीं करते हैं और मानव शरीर में सामान्य रूप से मौजूद महत्वपूर्ण हेमोडायनामिक और यांत्रिक उत्तेजनाओं की कमी होती है, जिसमें हाइड्रोस्टेटिक दबाव, चक्रीय खिंचाव और द्रव कतरनी21 शामिल हैं।

माइक्रोफिजियोलॉजिकल सिस्टम (एमपीएस) जैसे ऑर्गन्स-ऑन-चिप्स (ओओसी) हाल ही में ऐसे उपकरण के रूप में उभरे हैं जो विट्रो22,23 में जटिल शारीरिक प्रतिक्रियाओं को पकड़ने में सक्षम हैं। ये मॉडल अक्सर माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफार्मों के उपयोग को नियोजित करते हैं, जो जीवित अंगों के गतिशील माइक्रोएन्वायरमेंट के मॉडलिंग को सक्षम करते हैं।

हमने जटिल मानव उपकला ऊतक का ओपन-टॉप चिप मॉडल बनाने के लिए 3 डी ऊतक बायोइंजीनियरिंग और मेकेनोबायोलॉजी के सिद्धांतों को जोड़ा है। इसने हमें उपकला ऊतकों के बहुकोशिकीय और गतिशील माइक्रोएन्वायरमेंट को बारीकी से पुन: उत्पन्न करने की अनुमति दी। इसमें ऊतक-विशिष्ट जैव रासायनिक और बायोमैकेनिकल संकेत शामिल हैं जो स्वाभाविक रूप से जीवित अंगों में मौजूद होते हैं लेकिन अक्सर पारंपरिक इन विट्रो मॉडल24 द्वारा उपेक्षित होते हैं। ओपन-टॉप चिप में दो डिब्बे शामिल हैं: एक संवहनी डिब्बे (चित्रा 1 ए) और एक स्ट्रोमल कम्पार्टमेंट (चित्रा 1 बी) एक छिद्रपूर्ण झिल्ली द्वारा अलग किया जाता है, जिससे दो कक्षों (चित्रा 1 सी) के बीच पोषक तत्वों के प्रसार की अनुमति मिलती है। संवहनी डिब्बे को शारीरिक कतरनी तनाव को दूर करने के लिए निरंतर द्रव प्रवाह के संपर्क में लाया जाता है, जबकि स्ट्रोमल कक्ष का खिंचाव योग्य डिजाइन श्वास गति या आंतों के पेरिस्टलोसिस से जुड़े यांत्रिक तनाव के मॉडलिंग की अनुमति देता है। स्ट्रोमल कम्पार्टमेंट में टिशू-विशिष्ट फाइब्रोब्लास्ट ्स के शारीरिक विकास का समर्थन करने के लिए डिज़ाइन किया गया 3 डी हाइड्रोगेल पाड़ है। इसमें एक हटाने योग्य ढक्कन होता है जो एक वायु-तरल इंटरफ़ेस की स्थापना की सुविधा प्रदान करता है, एक ऐसी स्थिति जो म्यूकोसल ऊतकों के मानव शरीर विज्ञान के अधिक अनुकरण के साथ-साथ उपकला परत पर सीधे दवाओं को प्रशासित करने के लिए ऊतक तक सीधी पहुंच की अनुमति देती है। पूरक चित्र 1 ओपन-टॉप चिप डिजाइन के कुछ प्रमुख घटकों को कैप्चर करता है जिसमें आयाम और जैविक डिब्बे (पूरक चित्रा 1 ए-डी) के साथ-साथ इस प्रोटोकॉल (पूरक चित्रा 1 ई) में वर्णित मुख्य तकनीकी कदम शामिल हैं।

ओपन-टॉप चिप का छिड़काव एक प्रोग्राम करने योग्य पेरिस्टालिक पंप (चित्रा 1 डी) के साथ प्राप्त किया जाता है। पेरिस्टालिक पंप सेटअप 12 ओपन-टॉप चिप्स को एक साथ लगाने की अनुमति देता है। अधिकांश इनक्यूबेटर में दो सेटअप हो सकते हैं जो प्रति इनक्यूबेटर 24 चिप्स तक की संस्कृति को सक्षम करते हैं। मैकेनिकल स्ट्रेचिंग एक कस्टम-निर्मित प्रोग्राम बेल वैक्यूम दबाव नियामक (चित्रा 1 ई) का उपयोग करके प्राप्त की जाती है। इसमें एक इलेक्ट्रो-वायवीय वैक्यूम नियामक होता है जो एक डिजिटल-टू-एनालॉग कनवर्टर द्वारा इलेक्ट्रॉनिक रूप से नियंत्रित होता है। दूसरे शब्दों में, इलेक्ट्रो-वायवीय वैक्यूम नियामक एक आयाम और आवृत्ति के साथ एक साइनसॉइडल वैक्यूम प्रोफाइल उत्पन्न करता है जो उपयोगकर्ता द्वारा निर्धारित किया जाता है। 0% से 15% तक चक्रीय तनाव ओपन-टॉप चिप के वैक्यूम चैनल पर 0 से -90 kPa के आयाम और 0.2 हर्ट्ज की आवृत्ति पर नकारात्मक दबाव लागू करके उत्पन्न होता है। यह व्यावसायिक रूप से उपलब्ध फ्लेक्ससेल स्ट्रेन यूनिट के बराबर एक कस्टम-निर्मित प्रणाली है जिसे पहले अपनाया गया था औरअन्य पत्रों में वर्णित किया गया था। यांत्रिक ऊतक विरूपण से जुड़े यांत्रिक ऊतक विरूपण की नकल करने के लिए, उदाहरण के लिए, फेफड़े की श्वास गति या आंत के पेरिस्टलोसिस के साथ, वायवीय एक्ट्यूएटर साइनसॉइडल वैक्यूम / तनाव तरंगों को लागू करता है जिनके परिमाण और आयाम को तनाव और आवृत्ति के शारीरिक स्तर से मेल खाने के लिए समायोजित किया जा सकता है जो मानव कोशिकाएं अपने मूल ऊतक में अनुभव करती हैं।

यहां, हम एक प्रोटोटाइप ओपन-टॉप चिप प्लेटफॉर्म पर ऑर्गेनोटाइपिक एपिथेलियम समकक्षों की इंजीनियरिंग और संवर्धन के लिए एक कुशल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि का वर्णन करते हैं। यह संवहनी द्रव प्रवाह और यांत्रिक स्ट्रेचिंग को एकीकृत करते हुए त्वचा, एल्वियोलस, वायुमार्ग और बृहदान्त्र जैसे जटिल अंग मॉडल की पीढ़ी की अनुमति देता है। हम उन प्रमुख तकनीकी पहलुओं को रेखांकित करेंगे जिन्हें जटिल उपकला मॉडल उत्पन्न करने के लिए ऊतक इंजीनियरिंग के सिद्धांतों को लागू करते समय विचार किया जाना चाहिए। हम वर्तमान डिजाइन के फायदे और संभावित सीमाओं पर चर्चा करेंगे।

प्रवाह और खिंचाव मापदंडों सहित ऊतक और अंग परिपक्वता प्राप्त करने के लिए उपयोग किए जाने वाले मुख्य चरणों का अवलोकन इस प्रकार बताया गया है: त्वचा के लिए चित्रा 2, एल्वियोलस के लिए चित्रा 3, वायुमार्ग के लिए चित्रा 4, और आंत के लिए चित्रा 5। विभिन्न अंग मॉडलों के संवर्धन के लिए उपयोग की जाने वाली मीडिया संरचना और अभिकर्मकों से संबंधित अतिरिक्त जानकारी पूरक तालिकाओं में शामिल है (त्वचा के लिए पूरक तालिका 1; एल्वियोलस के लिए पूरक तालिका 2; वायुमार्ग के लिए पूरक तालिका 3, और आंत के लिए पूरक तालिका 4)।

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Protocol

सिनसिनाटी चिल्ड्रन हॉस्पिटल (आईबीसी 2017-2011) की संस्थागत जैव सुरक्षा समिति के दिशानिर्देशों के अनुसार मानव कोलोनोइड्स आंतों के शोधन से प्राप्त किए गए थे।

1. सतह सक्रियण

  1. सक्रियण बफर की तैयारी
    1. क्रॉसलिंकर और विलायक बफर अभिकर्मकों को जैव सुरक्षा कैबिनेट (बीएससी) के तहत रखें और उन्हें उपयोग से पहले 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर बराबर करने दें।
    2. क्रॉसलिंकर समाधान को सीधे प्रकाश जोखिम से बचाने के लिए बाँझ प्रकाश-अभेद्य कंटेनर या एल्यूमीनियम पन्नी में लिपटी एक पारदर्शी 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब का उपयोग करके विलायक बफर के 5 मिलीलीटर में 5 मिलीग्राम क्रॉसलिंकर का पुनर्गठन करें।
    3. सभी झुरमुट को हटाने के लिए 1 मिनट के लिए घोल को भंवर करें, और फिर क्रॉसलिंकर समाधान के 50 μL को सीधे चिप के निचले चैनल में और 150 μL को ओपन-टॉप चैंबर में डालें।
    4. एस्पिरेटर का उपयोग करके चिप की सतह से क्रॉसलिंकिंग समाधान की किसी भी अतिरिक्त को हटा दें। फिर किसी भी शेष वायु बुलबुले को हटाने के लिए क्रॉसलिंकिंग समाधान के अतिरिक्त 50 μL को सीधे चिप के निचले चैनल में और 150 μL को ओपन-टॉप चैंबर में डालें।
  2. यूवी क्रॉसलिंकिंग मशीन के साथ सक्रियण
    1. धीरे से बीएससी के तहत चिप से ढक्कन हटा दें और इसे बाँझ कंटेनर में स्टोर करें।
    2. क्रॉसलिंकर समाधान वाले चिप्स को पेट्री डिश में स्थानांतरित करें, संदूषण से बचने के लिए पेट्री डिश को बंद करें, और यूवी क्रॉसलिंकिंग मशीन के तहत चिप्स के साथ डिश रखें।
      नोट: यूवी एक्सपोजर को अधिकतम करने के लिए पेट्री डिश ढक्कन को हटा दें।
    3. 100 μJ /cm2 की तीव्रता पर 365 nm की चरम तरंग दैर्ध्य के साथ यूवी क्रॉसलिंकिंग मशीन सेट करें, और 20 मिनट के लिए यूवी प्रकाश चालू करें।
      नोट: यूवी उपचार के 20 मिनट के बाद, क्रॉसलिंकर समाधान गहरा (भूरा) दिखेगा।
    4. चिप्स को बीएससी के तहत वापस लाएं और ऑक्सीकृत क्रॉसलिंकर समाधान को एस्पिरेट करें। फिर, विलायक बफर के साथ सभी चिप्स को तीन बार कुल्ला करें और पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) सतह के रासायनिक कार्यात्मककरण को पूरा करने के लिए चिप्स को बीएससी के तहत 5-10 मिनट तक सूखने दें।

2. स्ट्रोमा समकक्ष तैयार करना।

  1. 10x पुनर्निर्माण बफर (100 एमएल) की तैयारी
    1. डबल-डिस्टिल्ड पानी में 0.067 एम एनएओएच के 75 एमएल में 2.2 ग्राम सोडियम बाइकार्बोनेट घोलें।
    2. एचईपीईएस के 4.76 ग्राम जोड़ें और डबल आसुत जल का उपयोग करके मात्रा को 100 एमएल तक लाएं।
    3. 0.22 μm झिल्ली के साथ एक डिस्पोजेबल बाँझ बोतल-टॉप फ़िल्टर का उपयोग करके बीएससी के तहत बाँझ फ़िल्टर करें।
      नोट: 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत होने पर समाधान लगभग 6 महीने तक स्थिर रहता है।
  2. प्री-जेल समाधान की मात्रा का अनुमान
    1. प्रयोग के लिए आवश्यक प्री-जेल समाधान की मात्रा का अनुमान लगाने के लिए प्रयोग के लिए आवश्यक चिप्स की संख्या को 150 μL (केंद्रीय ओपन-टॉप कक्ष की आंतरिक मात्रा) से गुणा करें:
      आवश्यक मात्रा = (चिप्स की संख्या x 150) μL
    2. मिश्रण द्वारा बर्फ पर कोलेजन प्री-जेल समाधान तैयार करें: पसंद की कोशिकाओं वाले 10x EMEM की 1 मात्रा, 10x पुनर्निर्माण बफर की 1 मात्रा (चरण 2.1 देखें), कोलेजन I समाधान के 8 वॉल्यूम (10 मिलीग्राम / एमएल) और कोलेजन I के प्रत्येक मिलीग्राम के लिए 1 एन एनएओएच समाधान का 1 μL।
      नोट: प्रयोगात्मक त्रुटियों के लिए एक अतिरिक्त +15% मात्रा तैयार करने की सिफारिश की जाती है; खंड 2.2 में वर्णित उदाहरण 12 चिप्स और अतिरिक्त 15% मात्रा के लिए पर्याप्त प्री-जेल समाधान तैयार करने के लिए एक विस्तृत चरण-दर-चरण प्रक्रिया प्रदान करता है।
  3. स्ट्रोमा समकक्ष (12 चिप्स के लिए) के लिए प्री-जेल समाधान की तैयारी
    1. बर्फ पर बीएससी के तहत निम्नलिखित समाधान लाएं: 10x EMEM; 10x पुनर्निर्माण बफर (चरण 2.1 देखें); कोलेजन I समाधान (10 मिलीग्राम / एमएल); और बाँझ 1 एन एनएओएच समाधान।
    2. 80% -90% कंफ्लुएंट तक प्रदाताओं द्वारा निर्देशित ऊतक-विशिष्ट मेसेनकाइमल कोशिकाओं को कल्चर करें, और फिर सेल प्रदाता द्वारा अनुशंसित ट्रिप्सिन या अन्य तरीकों का उपयोग करके कोशिकाओं को अलग करें। 24 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 250 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा एक गोली में कोशिकाओं को इकट्ठा करें।
    3. सेल गोली को बर्फ-ठंडा 10x EMEM के 225 μL में पुन: निलंबित करें, और बर्फ-ठंडा 10x पुनर्निर्माण बफर के 225 μL जोड़ें (चरण 2.1 देखें)। धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पाइप करके घोल को मिलाएं, और फिर बर्फ-ठंडा कोलेजन आई समाधान के 1,800 μL जोड़ें।
    4. बर्फ पर रहते हुए प्री-जेल घोल को मिलाने के लिए बुलबुले से बचने के लिए 5-6 बार ऊपर और नीचे पिपेट करें।
  4. चिप पर स्ट्रोमा समकक्ष का समावेश (12 चिप्स के लिए)
    1. 1 एन एनएओएच के 18 μL के साथ प्री-जेल समाधान को बेअसर करें। 5-6 बार ऊपर और नीचे पाइप करके धीरे से मिलाएं, और फिर बुलबुले से बचने के लिए ओपन-टॉप चिप के केंद्रीय कक्ष में सेल से भरे हाइड्रोगेल के 150 μL को पिपेट करें।
      नोट: यदि माइक्रोपैटर्निंग की आवश्यकता है, तो कृपया अगले चरण (अनुभाग 3) पर जाएं।
    2. चिप्स को अलग-अलग पेट्री व्यंजनों में समूहीकृत करें, जिसमें प्रत्येक पेट्री डिश में 2 एमएल बाँझ डीडीएच 2 ओ से भरा एकसेंट्रीफ्यूज ट्यूब कैप शामिल है, और इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर पेट्री व्यंजन (ओं) को इनक्यूबेट करें।
      नोट: 90 मिनट के बाद, सेल से लदी हाइड्रोगेल पूरी तरह से बहुलक हो जाएगा।

3. सरफेस माइक्रोपैटर्निंग (वैकल्पिक)

  1. 3 डी-मुद्रित टिकटों का उपयोग करके बेअसर कोलेजन हाइड्रोगेल (अभी भी अपनी तरल अवस्था में) को पाइप करने के बाद स्ट्रोमल हाइड्रोगेल की सतह माइक्रोपैटर्निंग करें।
    नोट: 3 डी-मुद्रित डाक टिकट विभिन्न अनुकूलन योग्य डिजाइनों में प्राप्त किए जा सकते हैं, जैसा कि पहले कहीं और वर्णितहै।
  2. एक बाँझ 3 डी-मुद्रित स्टाम्प की पैटर्न वाली सतह पर बेअसर कोलेजन आई प्री-जेल समाधान के पिपेट 20 μL और ओपन-टॉप चैंबर के अंदर (शीर्ष पर) स्टैम्प डालें जबकि स्ट्रोमल हाइड्रोगेल अभी भी तरल रूप में है।
  3. हाइड्रोजेल के किसी भी अवशेष को हटा दें जो एस्पिरेटर (या पिपेट) का उपयोग करके ओपन-टॉप चैंबर के शीर्ष से फैल सकता है। सभी चिप्स को अलग-अलग पेट्री व्यंजनों में समूहीकृत करें और प्रत्येक पेट्री डिश में 2 एमएल बाँझ डीडीएच2ओ से भरा एक सेंट्रीफ्यूज 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब कैप शामिल करें।
  4. 90 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर सभी पेट्री व्यंजनों को इनक्यूबेट करें, और फिर चिप्स को बीएससी के तहत वापस लाएं और हाइड्रोगेल को नुकसान पहुंचाने के जोखिम को कम करने के लिए सटीक चिमटी का उपयोग करके धीरे-धीरे टिकटों को हटा दें।

4. ऊतक-विशिष्ट ईसीएम प्रोटीन के साथ उपकला और संवहनी सतह को कोटिंग

  1. बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन के साथ संवहनी माइक्रोफ्लुइडिक कक्ष को कोटिंग
    1. प्रयोग के लिए आवश्यक संवहनी ईसीएम कोटिंग समाधान की मात्रा का अनुमान लगाने के लिए प्रयोग के लिए आवश्यक चिप्स की संख्या को 20 μL (संवहनी चैनल की मात्रा) से गुणा करें:
      आवश्यक मात्रा = (चिप्स की संख्या x 20) μL
      नोट: प्रयोगात्मक त्रुटियों के लिए एक अतिरिक्त 15% मात्रा तैयार करने की सिफारिश की जाती है।
    2. बर्फ-ठंडे पीबीएस या एचबीएसएस का उपयोग करके सभी चिप्स (उदाहरण के लिए, 300 μL प्रति 12 चिप्स) के लिए संवहनी ईसीएम कोटिंग समाधान तैयार करें।
      नोट: पूरक सामग्री अनुभाग में विशिष्ट अंग-प्रोटोकॉल तालिका देखें (त्वचा के लिए पूरक तालिका 1 ; एल्वियोलस के लिए पूरक तालिका 2 ; वायुमार्ग के लिए पूरक तालिका 2 , और आंत के लिए पूरक तालिका 4 ) विशिष्ट अभिकर्मकों और अनुशंसित ईसीएम संरचना की पहचान करने के लिए।
    3. प्रत्येक चिप के संवहनी चैनल में संवहनी ईसीएम कोटिंग समाधान के पिपेट 20 μL।
  2. बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन के साथ स्ट्रोमल समकक्ष की एपिकल सतह को कोटिंग
    1. प्रयोग के लिए आवश्यक उपकला ईसीएम कोटिंग समाधान की मात्रा का अनुमान लगाने के लिए प्रयोग के लिए आवश्यक चिप्स की संख्या को 50 μL (संवहनी चैनल की मात्रा) से गुणा करें:
      आवश्यक आयतन = (चिप्स की संख्या x 50) μL
      नोट: प्रयोगात्मक त्रुटियों के लिए एक अतिरिक्त 15% मात्रा तैयार करने की सिफारिश की जाती है।
    2. बर्फ-ठंडे पीबीएस या एचबीएसएस में सभी चिप्स (उदाहरण के लिए, 750 μL प्रति 12 चिप्स) के लिए पर्याप्त ईसीएम कोटिंग समाधान तैयार करें और हाइड्रोगेल सतह के शीर्ष पर सीधे उपकला ईसीएम कोटिंग समाधान के 50 μL स्थानांतरित करें।
      नोट: पूरक सामग्री अनुभाग में विशिष्ट अंग-प्रोटोकॉल तालिका देखें (त्वचा के लिए पूरक तालिका 1 ; एल्वियोलस के लिए पूरक तालिका 2 ; वायुमार्ग के लिए पूरक तालिका 2 , और आंत के लिए पूरक तालिका 4 ) विशिष्ट अभिकर्मकों और अनुशंसित ईसीएम संरचना की पहचान करने के लिए।
    3. चिप्स को अलग-अलग पेट्री व्यंजनों में समूहीकृत करें, जिसमें प्रत्येक पेट्री डिश में 2 मिलीलीटर बाँझ डीडीएच 2 ओ से भरा एक सेंट्रीफ्यूज 15एमएल शंक्वाकार ट्यूब कैप शामिल है, और उपकला सेल सीडिंग के साथ आगे बढ़ने से पहले इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर 2 घंटे के लिए पेट्री व्यंजन (ओं) को इनक्यूबेट करें।

5. स्ट्रोमल समकक्ष पर उपकला कोशिकाओं को सीडिंग करना।

  1. उपकला कोशिका संस्कृति
    1. 80% -90% कंफ्लुएंट तक प्रदाताओं द्वारा निर्देशित ऊतक-विशिष्ट उपकला कोशिकाओं को कल्चर करें।
    2. सेल प्रदाता द्वारा अनुशंसित प्रोटियोलिटिक एंजाइम प्रक्रियाओं का उपयोग करके कोशिकाओं को अलग करें।
      नोट: सर्वोत्तम परिणामों के लिए, सक्रिय विकास चरण के दौरान कम मार्ग (पी 1-पी 2) पर उपकला कोशिकाओं की कटाई करें जब वे 70% -90% कंफ्लुएंसी के बीच पहुंच जाते हैं।
    3. एक बार अलग हो जाने के बाद, कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें और उन्हें गोली के रूप में इकट्ठा करें।
    4. विशिष्ट अंग प्रोटोकॉल तालिका में दर्शाए अनुसार उपकला कोशिकाओं को उपयुक्त कोशिका / टुकड़ा घनत्व में पुन: निलंबित करें।
      नोट: इस अध्ययन में, सेल समाधान का उपयोग त्वचा के लिए 3 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल, एल्वियोलस के लिए 1 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल, वायुमार्ग के लिए 6 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल और आंत के लिए 8 x 10 6 टुकड़े / एमएल के घनत्व पर किया गया था।
  2. एपिथेलियल सेल सीडिंग।
    1. चिप्स को इनक्यूबेटर से बीएससी में स्थानांतरित करें। संवहनी चैनल से कोटिंग समाधान को एस्पिरेट करें, और संवहनी माइक्रोफ्लुइडिक चैनल को ताजा एंडोथेलियल सेल कल्चर माध्यम के 50 μL के साथ तीन बार कुल्ला करें।
    2. हाइड्रोजेल सतह से कोटिंग समाधान को एस्पिरेट करें और किसी भी अतिरिक्त कोटिंग समाधान को हटाने के लिए 100 μL ताजा उपकला कोशिका संस्कृति माध्यम के साथ स्ट्रोमल सतह को तीन बार कुल्ला करें।
    3. बढ़ते माध्यम को एस्पिरेट करें और उचित सेल घनत्व का उपयोग करके उपकला सेल निलंबन के 50 μL के साथ हाइड्रोगेल सतह को बीज दें, जैसा कि पूरक तालिकाओं में दर्शाया गया है, और फिर चिप्स को 2 घंटे (या कोलोनोइड्स के लिए रात भर) के लिए इनक्यूबेटर में वापस स्थानांतरित करें।
    4. सेलुलर मलबे को हटाने के लिए सेल कल्चर माध्यम के साथ हाइड्रोगेल की सतह को धीरे से दो बार कुल्ला करें। अंत में, सीलबंद ऑटोक्लेवेबल कंटेनरों में ऑटोक्लेविंग करके माध्यम को ताज़ा करें, और चिप्स को पेरिस्टालिक पंप से कनेक्ट करें।

6. चिप्स को प्रवाह से जोड़ना

  1. तरल भागों की तैयारी
    1. चिप्स को मीडिया जलाशयों से जोड़ने के लिए आवश्यक लघु माइक्रोफ्लुइडिक टयूबिंग तैयार करने के लिए बायोकंपैटिबल पॉलीप्रोपाइलीन-आधारित थर्मोप्लास्टिक इलास्टोमेर (टीपीई) ट्रांसफर ट्यूबिंग (सामग्री की तालिका) के 2 इंच काटें।
    2. लंबे माइक्रोफ्लुइडिक ट्यूबिंग का उत्पादन करने के लिए 7.5 इंच बायोकंपैटिबल टीपीई ट्रांसफर ट्यूबिंग काटें।
    3. पर्याप्त 18 ग्राम और 19 ग्राम धातु कनेक्टर (सामग्री की तालिका) तैयार करें।
      नोट: ओपन-टॉप चिप्स को पेरिस्टाल्टिक पंप से जोड़ने से कम से कम 1 दिन पहले चरण 6.1.1 और 6.1.2 में वर्णित ट्यूबिंग और कनेक्टर को तैयार और स्टरलाइज़ करने की सिफारिश की जाती है।
    4. प्रत्येक मध्यम जलाशयों के ढक्कन को 4 इंच की हाइपोडर्मिक सुई (सामग्री की तालिका) के साथ छेदें।
  2. मध्यम डिगैसिंग
    1. सेल कल्चर माध्यम को कमरे के तापमान (आरटी) के बराबर करने की अनुमति दें।
    2. एक शंक्वाकार फ़िल्टरिंग ट्यूब में आवश्यक माध्यम की मात्रा को स्थानांतरित करें।
    3. माध्यम (वैक्यूम-संचालित निस्पंदन) को हटाने के लिए -20 पीएसआई का नकारात्मक वैक्यूम दबाव लागू करें।
      नोट: यदि वैक्यूम उपलब्ध नहीं है, तो सेल कल्चर माध्यम को समान परिणाम प्राप्त करने के लिए रात भर इनक्यूबेटर में संतुलन के लिए छोड़ा जा सकता है।
  3. द्रव प्रवाह के लिए ओपन-टॉप चिप तैयार करें
    1. चिप्स और बाँझ तरल भागों को बीएससी के तहत लाएं और द्रव प्रवाह शुरू करने से पहले ओपन-टॉप चिप प्रोटोटाइप को सील करने के लिए ओपन-टॉप चिप के ढक्कन (शीर्ष भाग) को संरेखित करें।
    2. बुलबुले से बचने के लिए ध्यान देते हुए चिप के शीर्ष और निचले दोनों चैनलों के इनलेट पोर्ट में डिगैस्ड सेल कल्चर माध्यम (अंग-विशिष्ट तालिकादेखें) के पिपेट 200 μL।
    3. कल्चर माध्यम के पिपेट 300 μL को ट्यूबों की आंतरिक सतह को प्राइम करने के लिए लघु माइक्रोफ्लुइडिक टयूबिंग में और चिप के शीर्ष और निचले चैनलों के इनलेट्स से शॉर्ट टयूबिंग को जोड़ता है।
  4. माइक्रोफ्लुइडिक सतहों को कनेक्ट और प्राइम करें
    1. मध्यम जलाशयों को फार्म रैक में रखें, हाइपोडर्मिक सुई को चिप्स के निचले इनलेट से कनेक्ट करें, और अंत में, इनक्यूबेटर के अंदर आवास वाहक (ओं) में सभी चिप्स को समायोजित करें।
    2. चिप्स को पेरिस्टाल्टिक पंप से कनेक्ट करें, और फिर यह सुनिश्चित करने के लिए सभी कनेक्टर्स का निरीक्षण करें कि सभी चिप्स ठीक से जुड़े हुए हैं और सेल कल्चर मीडिया का कोई दृश्य रिसाव नहीं है।
    3. पंप पर पर्ज बटन का उपयोग करें और इसे लगभग 15 सेकंड तक रखें या जब तक कि बहिर्वाह ट्यूबिंग के अंत में सेल कल्चर माध्यम की बूंदें दिखाई न दें।
    4. उपयुक्त अंग-चिप प्रवाह दर (चित्रा 2, चित्रा 3, चित्रा 4, और चित्रा 5) सेट करने के लिए पंप पर नियंत्रण प्रणाली का उपयोग करें।

7. चिप्स का रखरखाव

  1. अंग-चिप रखरखाव
    1. एपिथेलियम और / या एंडोथेलियम के लिए ताजा सेल कल्चर माध्यम तैयार करें और डिगैसिंग चरणों का प्रदर्शन करें (जैसा कि पहले चरण 6.2 में वर्णित है)।
    2. पेरिस्टालिक पंप को रोकें, पंप से चिप्स को सावधानीपूर्वक डिस्कनेक्ट करें, और चिप हाउसिंग कैरियर (ओं) को निकालें। चिप्स को इनक्यूबेटर से बीएससी में स्थानांतरित करें और जलाशयों में छोड़े गए मीडिया की मात्रा को हटा दें।
    3. सेल कल्चर मीडिया को 5 एमएल ताजा सेल कल्चर मीडिया के साथ शीर्ष और निचले इनलेट जलाशयों में बदलें और चिप हाउसिंग कैरियर (ओं) को इनक्यूबेटर में वापस रखें। चिप्स को पेरिस्टालिक पंप से कनेक्ट करें और प्रवाह को पुनरारंभ करें।
      नोट: माध्यम को संवहनी डिब्बे में तेजी से ताज़ा करने और हवा के बुलबुले के जोखिम को कम करने के लिए पर्ज फ़ंक्शन का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।
    4. चित्र 2, चित्र 3, चित्र 4 और चित्र 5 के अनुसार, हर दूसरे दिन चरण 7.1.1-7.1.3 दोहराएं।
  2. वायु-तरल इंटरफ़ेस (ALI) की स्थापना
    1. पेरिस्टालिक पंप को रोकें, पंप से चिप्स को सावधानीपूर्वक डिस्कनेक्ट करें, और चिप हाउसिंग कैरियर (ओं) को निकालें। चिप्स को इनक्यूबेटर से जैव सुरक्षा कैबिनेट में स्थानांतरित करें, और शीर्ष जलाशय में छोड़े गए माध्यम की मात्रा को हटा दें।
    2. धीरे से शीर्ष माइक्रोफ्लुइडिक चैनल से सभी माध्यमों को अलग करें और मीडिया वाष्पीकरण और एएलआई के रखरखाव को कम करने के लिए बाइंडर क्लिप का उपयोग करके शीर्ष इनलेट्स से जुड़े छोटे माइक्रोफ्लुइडिक ट्यूबिंग को दबाएं।
    3. आवास वाहक (ओं) पर ओपन-टॉप चिप को इनक्यूबेटर में वापस रखें और चिप्स को पेरिस्टालिक पंप से फिर से कनेक्ट करें।
      नोट: माध्यम को संवहनी डिब्बे में तेजी से ताज़ा करने और हवा के बुलबुले के जोखिम को कम करने के लिए पर्ज फ़ंक्शन का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।
    4. पेरिस्टालिक पंप शुरू करके प्रवाह को फिर से शुरू करें।
  3. स्ट्रेचिंग (वैकल्पिक)
    1. पेरिस्टाल्टिक पंप को रोकें और चिप के वैक्यूम पोर्ट को प्रति चिप दो लंबे माइक्रोफ्लुइडिक ट्यूबों का उपयोग करके वैक्यूम मॉड्यूल से कनेक्ट करें।
    2. अंग प्रोटोकॉल तालिकाओं के अंदर निर्दिष्ट प्रत्येक अंग के लिए अनुशंसित स्थिति में खिंचाव सेटिंग को समायोजित करने के लिए वैक्यूम मॉड्यूल का उपयोग करें: त्वचा के लिए पूरक तालिका 1 ; एल्वियोलस के लिए पूरक तालिका 2 ; वायुमार्ग के लिए पूरक तालिका 2 ; और आंत के लिए पूरक तालिका 4 ।
    3. यह सुनिश्चित करने के लिए ट्यूब कनेक्शन का नेत्रहीन निरीक्षण करें कि सभी चिप्स ठीक से जुड़े हुए हैं और मध्यम टपकने वाली कोई बूंदें दिखाई नहीं दे रही हैं।
    4. पेरिस्टालिक पंप शुरू करके प्रवाह को फिर से शुरू करें।

8. संवहनी डिब्बे में एंडोथेलियल कोशिकाओं को सीडिंग करना।

  1. संवहनी सेल सीडिंग के लिए कोशिकाओं और चिप्स तैयार करें
    1. ऊतक-विशिष्ट एंडोथेलियल कोशिकाओं को प्रदाताओं द्वारा निर्देशित 80% -90% कंफ्लुएंट तक कल्चर करें। प्रोटियोलिटिक एंजाइम प्रक्रिया (प्रदाता द्वारा अनुशंसित) का उपयोग करके कोशिकाओं को अलग करें और अंत में, एंडोथेलियल कोशिकाओं को 3 x 106 कोशिकाओं / एमएल के समाधान में फिर से निलंबित करें।
      नोट: सर्वोत्तम परिणामों के लिए, सक्रिय विकास चरण के दौरान कम मार्ग (पी 2-पी 4) पर एंडोथेलियल कोशिकाओं की कटाई करें जब वे 70% -90% कंफ्लुएंसी के बीच पहुंच जाते हैं।
    2. पेरिस्टालिक पंप को रोकें। चिप्स को इनक्यूबेटर से बीएससी में स्थानांतरित करें, चिप्स को मीडिया जलाशयों और किसी भी जुड़े टयूबिंग से डिस्कनेक्ट करें, और फिर चिप्स को अलग-अलग पेट्री व्यंजनों में समूहित करें।
    3. ताजा उपकला कोशिका संस्कृति माध्यम के साथ उपकला डिब्बे के सेल कल्चर माध्यम को ताज़ा करें। संवहनी चैनल को ताजा एंडोथेलियम सेल कल्चर माध्यम से दो बार धोएं, और फिर संवहनी डिब्बे से माध्यम को अलग करें।
  2. एंडोथेलियल सेल सीडिंग।
    1. एंडोथेलियल सेल सस्पेंशन (3 x 106 कोशिकाओं / एमएल) के 25 μL के साथ नीचे (संवहनी) चैनल को बीज दें, एंडोथेलियल कोशिकाओं को माइक्रोफ्लुइडिक कक्ष की ऊपरी सतह से जुड़ने की अनुमति देने के लिए चिप्स को उल्टा पलटें।
      नोट: प्रति चिप सेल निलंबन के 50 μL जोड़ें (600 μL प्रति 12 चिप्स)।
    2. चिप्स को पेट्री व्यंजनों में समूहीकृत करें। उन्हें 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर इनक्यूबेटर में वापस रखें, और एंडोथेलियल कोशिकाओं को 1 घंटे के लिए संलग्न होने दें।
    3. 1 घंटे के बाद, चिप्स को इनक्यूबेटर से बीएससी में स्थानांतरित करें। सेलुलर मलबे को हटाने के लिए एंडोथेलियल सेल कल्चर माध्यम के साथ संवहनी चैनल को दो बार कुल्ला करें।
    4. एंडोथेलियल कोशिकाओं के साथ संवहनी चैनल को एक बार फिर से बीज देने के लिए चरण 8.2.1-8.2.2 दोहराएं और संवहनी चैनल की निचली सतह पर एंडोथेलियल कोशिकाओं के आसंजन की सुविधा के लिए चिप्स को सपाट रखें।
  3. चिप को प्रवाह के लिए पुन: कनेक्ट करें
    1. बीएससी के तहत डिगैस्ड वैस्कुलर सेल कल्चर माध्यम के साथ संवहनी माध्यम जलाशय भरें।
    2. चिप्स को चिप हाउसिंग कैरियर (ओं) के अंदर वापस रखें और चिप्स को एक छोर पर मध्यम जलाशयों से दूसरे छोर पर पेरिस्टाल्टिक पंप से फिर से कनेक्ट करें।
      नोट: माध्यम को संवहनी डिब्बे में तेजी से ताज़ा करने और हवा के बुलबुले के जोखिम को कम करने के लिए पर्ज फ़ंक्शन का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।
    3. यह सुनिश्चित करने के लिए माइक्रोफ्लुइडिक कनेक्शन का नेत्रहीन निरीक्षण करें कि सभी चिप्स ठीक से जुड़े हुए हैं और मध्यम टपकने वाली कोई दिखाई देने वाली बूंदें नहीं हैं। फिर, पेरिस्टालिक पंप शुरू करके द्रव प्रवाह को फिर से शुरू करें।

9. सामान्य समापन बिंदु परख।

  1. एंडपॉइंट परख के लिए चिप्स डिस्कनेक्ट करें।
    1. पेरिस्टालिक पंप को रोकें, पंप से चिप्स को सावधानीपूर्वक डिस्कनेक्ट करें, और चिप हाउसिंग कैरियर (ओं) को निकालें। चिप हाउसिंग कैरियर (ओं) को इनक्यूबेटर से बीएससी में स्थानांतरित करें और चिप्स को मुक्त करें।
    2. किसी भी सेलुलर मलबे को हटाने के लिए ओपन-टॉप चिप के केंद्रीय कक्ष को उपकला सेल कल्चर माध्यम और संवहनी चैनल को एंडोथेलियम कल्चर माध्यम के साथ दो बार धीरे से धोएं।
    3. चिमटी का उपयोग करके चिप के एपिकल डिब्बे तक पहुंचने के लिए ओपन-टॉप चिप के ढक्कन को हटा दें।
  2. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए इम्यूनोस्टेनिंग।
    1. पारंपरिक नमूना निर्धारण, परमेबिलाइजेशन और ब्लॉकिंग के साथ आगे बढ़ें।
      नोट: इस अध्ययन में, नमूनों को 1 घंटे के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के 200 μL में तय किया गया था, इसके बाद पीबीएस के साथ धोना, 40 मिनट के लिए 0.1% ट्राइटन एक्स -100 में परमेबिलाइजेशन और 1 घंटे के लिए 1% गोजातीय सीरम एल्बुमिन में अवरुद्ध किया गया था।
    2. चिप्स को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर प्राथमिक एंटीबॉडी (सामग्री की तालिका) के साथ इनक्यूबेट करें। और फिर चिप्स के उपकला और एंडोथेलियल दोनों डिब्बों को पीबीएस के 200 μL के साथ दो बार धोएं। फिर, 2 घंटे के लिए उपयुक्त द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ आगे बढ़ें।
      नोट: पीबीएस + 1% बीएसए में प्राथमिक एंटीबॉडी और द्वितीयक एंटीबॉडी को 1: 100 (प्राथमिक एंटीबॉडी) और 1: 200 (द्वितीयक एंटीबॉडी) के कमजोर पड़ने पर पतला करें।
  3. इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री।
    1. चिमटी का उपयोग करके ओपन-टॉप चिप के मुख्य कक्ष से स्ट्रोमल समकक्षों को निकालें, उन्हें 10% तटस्थ बफर्ड फॉर्मलिन से भरे 1.5 एमएल ट्यूब में इकट्ठा करें और कम से कम 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    2. ऊतक प्रोसेसर के बराबर निश्चित स्ट्रोमल को स्थानांतरित करें और इष्टतम नमूना निर्जलीकरण प्राप्त करने के लिए नीचे दिए गए चरणों का पालन करें।
      1. हाइड्रोजेल को 90 मिनट के लिए 70% इथेनॉल में डुबोएं।
      2. 70% इथेनॉल निकालें और हाइड्रोगेल को 90 मिनट के लिए 80% इथेनॉल में डुबोएं।
      3. 80% इथेनॉल निकालें और हाइड्रोगेल को 90 मिनट के लिए 95% इथेनॉल में डुबोएं।
      4. 95% इथेनॉल निकालें और हाइड्रोगेल को 100% इथेनॉल में 90 मिनट के लिए दो बार डुबोएं।
      5. 100% इथेनॉल निकालें और हाइड्रोजेल को 120 मिनट के लिए जाइलीन के घोल में दो बार डुबोएं।
      6. जाइलीन घोल को निकालें और 120 मिनट (~ 2 घंटे) के लिए पैराफिन मोम में संसाधित स्ट्रोमल समकक्षों को दो बार घुसपैठ करें।
    3. घुसपैठ किए गए स्ट्रोमल समकक्षों को पैराफिन ब्लॉकों को विभाजित करने में एम्बेड करें।
    4. इस बिंदु पर, स्ट्रोमल समकक्षों को माइक्रोटोम का उपयोग करके पैराफिन ब्लॉक के रूप में वर्गीकृत किया जा सकता है और पारंपरिक हिस्टोलॉजिकल तकनीकोंके अनुसार संसाधित किया जा सकता है।

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Representative Results

सतह माइक्रोपैटर्निंग।
बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) के माइक्रोपैटर्निंग का उपयोग आंतों के क्रिप्ट इंटरफ़ेस के स्थानिक विन्यास को दोहराने के लिए किया जा सकता है। ओपन-टॉप चिप कॉन्फ़िगरेशन को माइक्रोपैटर्न्ड स्टैम्प को एकीकृत करने के लिए संशोधित किया जा सकता है जो विशेष रूप से कोलोनिक एपिथेलियम-स्ट्रोमा इंटरफ़ेस (चित्रा 6 ए, बी) और माइक्रोमीटर स्केल (चित्रा 6 सी-ई) पर आंतों के क्रिप्ट की प्राकृतिक स्थलाकृति की नकल करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। कृपया ध्यान दें कि हमने त्वचा, वायुमार्ग और एल्वियोलस मॉडल के लिए एक सपाट (पैटर्न नहीं) सतह का उपयोग किया। इस मामले में डाक टिकट का उपयोग बीज उपकला कोशिकाओं के लिए एक समान हाइड्रोगेल सतह प्राप्त करने के लिए किया गया था। हमने एक ऐसे डिजाइन का विकल्प चुना जो मानव आंतों के श्लेष्म की प्राकृतिक वास्तुकला की नकल कर सकता है, जिसमें आंतों के क्रिप्ट्स की नकल करने वाले सकारात्मक और नकारात्मक गुंबदों की भिन्नता शामिल है।

अंग-मॉडल
हमने इस बायोमिमेटिक प्लेटफॉर्म की बहुमुखी प्रतिभा को साबित करने के लिए ओपन-टॉप चिप प्रोटोटाइप का उपयोग करके चार अलग-अलग एपिथेलिया (त्वचा, एल्वियोलस, वायुमार्ग और आंत) को सुसंस्कृत और विभेदित किया। अंग चिप्स के हिस्टोलॉजिकल खंड उपकला कोशिकाओं की उपस्थिति की पुष्टि करते हैं जो फेनोटाइपिक रूप से अलग और प्रतिनिधि हैं: त्वचा के मामले में एक स्तरीकृत उपकला (चित्रा 7), वायुमार्ग के मामले में छद्म-स्तरीकृत स्तंभ उपकला (चित्रा 8 और पूरक वीडियो 1), एल्वियोलस के मामले में सरल स्क्वैमस एपिथेलियम (चित्रा 9), और आंत के मामले में सरल स्तंभ उपकला (चित्रा 10)। त्वचा, वायुमार्ग, और वायुकोशीय कोशिकाएं सभी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध विक्रेताओं से प्राप्त की गई थीं (जैसा कि सामग्री की तालिका में निर्दिष्ट है)।

Figure 1
चित्रा 1: ओपन-टॉप चिप का योजनाबद्ध और इस अध्ययन में उपयोग किया जाने वाला माइक्रोफ्लुइडिक सेटअप। (ए-सी) टॉप-व्यू, परत-दर-परत प्रक्षेपण और 3 डी प्रतिपादन प्रोटोटाइप ओपन-टॉप चिप डिजाइन को दर्शाता है जिसमें संलग्न माइक्रो-फ्लुइडिक चैनल (नीला) के साथ हटाने योग्य ऊपरी ढक्कन, कल्चर चैंबर (ग्रे) के साथ दो अर्ध-चंद्र वैक्यूम चैनल और नीचे सर्पिलीकृत एंडोथेलियल माइक्रो-फ्लुइडिक चैनल (मैजेंटा) शामिल हैं। (डी) कस्टम-निर्मित चिप धारक (जिसे "फार्म सिस्टम" भी कहा जाता है) जिसमें चिप हाउसिंग कैरियर (लाल तीर), पेरिस्टाल्टिक पंप, और जलाशय (पीला तीर) शामिल हैं जो एक कॉन्फ़िगरेशन में व्यवस्थित हैं जो एक सामान्य सेल-कल्चर इनक्यूबेटर में फिट बैठता है। € वायवीय एक्ट्यूएटर, वह उपकरण जो चिप्स के वैक्यूम चैनल पर लागू नकारात्मक दबाव को नियंत्रित करता है, जिसका उपयोग श्वास या पेरिस्टलोसिस गति (खिंचाव) के दौरान चक्रीय यांत्रिक बल कोशिकाओं के अनुभव को उत्पन्न करने के लिए किया जाता है। इस आंकड़े को वरोन एट अल .24 से अनुमति के साथ अनुकूलित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: ओपन-टॉप स्किन-चिप प्रोटोकॉल का तकनीकी अवलोकन। (ए) ओपन-टॉप स्किन-चिप तैयारी के लिए कार्यों के अनुक्रम को दिखाने वाला योजनाबद्ध और (बी) ओपन-टॉप स्किन-चिप संस्कृति का प्रमुख जैविक चरण प्रदान करना। चिप तैयार करने के प्रारंभिक चरण में, मेसेनकाइमल कोशिकाओं (फाइब्रोब्लास्ट्स) को जेल में एम्बेडेड किया जाता है और स्ट्रोमल परत बनाने के लिए ओपन-टॉप चिप में लोड किया जाता है, जिसे 2-4 घंटे के लिए लेपित किया जाता है और उपकला कोशिकाओं के साथ बीज दिया जाता है। एक बार उपकला कोशिकाओं ने एक कॉम्पैक्ट मोनोलेयर का निर्माण कर लिया है, तो वे हवा (एएलआई) के संपर्क में आते हैं। जैविक प्रणाली को एएलआई शासन के तहत रखा जाता है जब तक कि 14 वें दिन विश्लेषण के लिए बलिदान नहीं किया जाता है। यांत्रिक स्ट्रेचिंग को तब लागू किया जा सकता है जब सिस्टम प्रवाह में हो और एएलआई पर हो। स्ट्रेचिंग तब तक रखी जाती है जब तक कि ऊतकों को विश्लेषण के लिए बलिदान नहीं किया जाता है। मीडिया संरचना, विशिष्ट अभिकर्मकों और सेल प्रकारों पर अतिरिक्त जानकारी पूरक तालिका 1 में पाई जा सकती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: ओपन-टॉप एल्वियोलस-चिप प्रोटोकॉल का तकनीकी अवलोकन। (ए) ओपन-टॉप एल्वियोलस-चिप तैयारी के लिए क्रियाओं के अनुक्रम को दर्शाने वाला योजनाबद्ध और (बी) ओपन-टॉप एल्वियोलस-चिप संस्कृति का प्रमुख जैविक चरण प्रदान करना। चिप तैयार करने के प्रारंभिक चरण में, मेसेनकाइमल कोशिकाओं (फाइब्रोब्लास्ट्स) को जेल में एम्बेडेड किया जाता है और स्ट्रोमल परत बनाने के लिए ओपन-टॉप चिप में लोड किया जाता है, जिसे 2-4 घंटे के लिए लेपित किया जाता है और केआईएडी के साथ पूरक माध्यम में वायुमार्ग उपकला कोशिकाओं के साथ बीज दिया जाता है (पूरक तालिका 2 देखें)। उपकला कोशिका वृद्धि का समर्थन करने के लिए ईजीएफ-पूरक माध्यम ~ 4 दिनों के लिए बनाए रखा जाता है। एपिथेलियम को तब पूर्ण ऊतक परिपक्वता प्राप्त करने के लिए ~ 10 दिनों के लिए हवा (एएलआई) के संपर्क में लाया जाता है। फुफ्फुसीय माइक्रोवस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं को 14 वें दिन बीज दिया जाता है, और जैविक प्रणाली को 21 वें दिन विश्लेषण के लिए बलिदान होने तक एएलआई और प्रवाह शासन के तहत रखा जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: ओपन-टॉप वायुमार्ग-चिप प्रोटोकॉल का तकनीकी अवलोकन। (ए) ओपन-टॉप वायुमार्ग-चिप तैयारी के लिए कार्यों के अनुक्रम को दिखाने वाला योजनाबद्ध और (बी) ओपन-टॉप वायुमार्ग-चिप संस्कृति के प्रमुख जैविक चरण प्रदान करना। चिप तैयार करने के प्रारंभिक चरण में, मेसेनकाइमल कोशिकाओं (फाइब्रोब्लास्ट और / या चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं) को जेल में एम्बेडेड किया जाता है और स्ट्रोमल परत बनाने के लिए ओपन-टॉप चिप में लोड किया जाता है, जिसे 2-4 घंटे के लिए लेपित किया जाता है और ईजीएफ के साथ पूरक माध्यम में उपकला कोशिकाओं के साथ बीज दिया जाता है (पूरक तालिका 3 देखें)। उपकला कोशिका वृद्धि का समर्थन करने के लिए ईजीएफ-पूरक माध्यम ~ 4 दिनों के लिए बनाए रखा जाता है। एपिथेलियम को तब पूर्ण ऊतक परिपक्वता प्राप्त करने के लिए ~ 10 दिनों के लिए हवा (एएलआई) के संपर्क में लाया जाता है। फुफ्फुसीय माइक्रोवस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं को 14 वें दिन बीज दिया जाता है, और जैविक प्रणाली को 21 वें दिन विश्लेषण के लिए बलिदान होने तक एएलआई और प्रवाह शासन के तहत रखा जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: ओपन-टॉप आंत-चिप प्रोटोकॉल का तकनीकी अवलोकन। (ए) ओपन-टॉप आंत-चिप तैयारी के लिए क्रियाओं के अनुक्रम को दिखाने वाला योजनाबद्ध और (बी) ओपन-टॉप आंत-चिप संस्कृति का प्रमुख जैविक चरण प्रदान करना। चिप तैयार करने के प्रारंभिक चरण में, मेसेनकाइमल कोशिकाओं (कोलोनिक फाइब्रोब्लास्ट्स) को जेल में एम्बेडेड किया जाता है और स्ट्रोमल परत बनाने के लिए ओपन-टॉप चिप में लोड किया जाता है, जिसे 2-4 घंटे के लिए लेपित किया जाता है और नैदानिक शोधन से प्राप्त उपकला कोलोनोइड्स के टुकड़ों के साथ बीज दिया जाता है। कोलोनॉइड सेल व्यवहार्यता और शारीरिक आकृति विज्ञान को बनाए रखने के लिए सीडिंग चरण के दौरान पूरक (रॉक और सीएचआईआर, पूरक तालिका 4 देखें) सहित सेल कल्चर माध्यम की आवश्यकता होती है। विभिन्न मीडिया का उपयोग तब कोलोनिक एपिथेलियम के विस्तार (दिन 1 से 6) और परिपक्वता (दिन 6 से 9) को चलाने के लिए किया जाता है। कोलोनिक माइक्रोवस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं को एंडोथेलियल सेल कल्चर माध्यम (ईजीएम 2 एमवी) का उपयोग करके दिन 6 पर बीज दिया जाता है, और फिर 10 और दिनों तक उपकला विस्तार माध्यम के साथ प्रवाह के तहत सुसंस्कृत किया जाता है। एपिथेलियम को एपिथेलियल सेल परिपक्वता को बढ़ावा देने के लिए 10 वें दिन से एएलआई के संपर्क में लाया जाता है। मैकेनिकल स्ट्रेचिंग को 13 वें दिन से सिस्टम पर लागू किया जा सकता है और 16 वें दिन तक बनाए रखा जा सकता है, जब एंडपॉइंट विश्लेषण के लिए अंग-मॉडल का बलिदान किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6: माइक्रोपैटर्न स्टैम्पिंग। (ए) माइक्रो-स्केल बनावट (ऊंचाई में 500 μm और 250 μm चौड़ाई स्तंभ-सरणी) दिखाने वाले स्टैम्प के पार्श्व और शीर्ष दृश्य का उपयोग कोलोनिक क्रिप्ट ऊतक इंटरफ़ेस और स्टाम्प-चिप असेंबली के शीर्ष और पार्श्व दृश्य को फिर से बनाने के लिए किया जाता है, जो जेल की सतह को डालने के लिए उपयोग किए जाने पर दो तत्वों की फिटिंग दिखाता है। (बी) स्टाम्प और चिप इंटरफेसिंग को दर्शाने वाला कोण पार्श्व दृश्य। (C-E) कोशिकाओं के साथ और बिना माइक्रोपैटर्न जेल सतह की छवियां। स्केल बार: 200 μm. इस आंकड़े को वरोन एट अल .24 से अनुमति के साथ अनुकूलित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: ओपन-टॉप स्किन-चिप के साथ प्राप्त प्रतिनिधि डेटा। (ए) ओपन-टॉप स्किन-चिप तैयारी के लिए कार्रवाई के अनुक्रम को दिखाने और ओपन-टॉप स्किन-चिप संस्कृति के प्रमुख जैविक चरणों को प्रदान करने वाला योजनाबद्ध। (ख) पीसीएनए साइटोकेराटिन 14, साइटोकेराटिन 10, इनवोल्यूक्रिन और फिलग्रिन फ्लोरेसेंस स्टेनिंग और एच एंड ई परिपक्व बहुस्तरीय स्तरीकृत एपिडर्मिस को दर्शाते हैं। स्केल बार: 100 μm. (C) त्वचीय परत के अंदर फाइब्रोब्लास्ट की उपस्थिति दिखाते हुए स्किन-चिप (स्केल बार: 5 मिमी) और एच एंड ई क्रॉस-सेक्शन (स्केल बार: 100 μm) की शीर्ष दृश्य तस्वीर। (डी) पीईसीएएम -1, वीई-कैडरिन और वॉन विलेब्रांड फ्लोरेसेंस धुंधला पन ओपन-टॉप स्किन-चिप में सह-सुसंस्कृत मानव माइक्रोवैस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं के भेदभाव को दर्शाता है। स्केल बार: 20 μm. (E) ओपन-टॉप स्किन-चिप का 3 डी कार्टून अवधारणा प्रतिपादन। इस आंकड़े को वरोन एट अल .24 से अनुमति के साथ अनुकूलित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्रा 8: ओपन-टॉप वायुमार्ग-चिप के साथ प्राप्त प्रतिनिधि डेटा। (ए) ओपन-टॉप वायुमार्ग-चिप तैयारी के लिए कार्रवाई के अनुक्रम को दिखाने और ओपन-टॉप एयरवेज-चिप संस्कृति के प्रमुख जैविक चरण प्रदान करने के लिए योजनाबद्ध। (बी) एमयूसी 5एसी (गोब्लेट), α और β-ट्यूबुलिन (सिलियेटेड कोशिकाएं), क्लारा सेल प्रोटीन 16 (क्लब सेल), पी 63 (बेसल / पूर्वज कोशिकाएं) और जेडओ -1 फ्लोरेसेंस धुंधला पन परिपक्व वायुमार्ग उपकला दिखाते हैं। स्केल बार: 20 μm. (C) फेज कंट्रास्ट वीडियो/छवि जो सिलिया की उपस्थिति को दर्शाती है। स्केल बार: 50 μm. (D) H &E धुंधला (स्केल बार: 20 μm) और TEM छवि (स्केल बार: 5 μm) परिपक्व छद्म-स्तरीकृत एपिथेलियम को दर्शाते हुए चिप पर विभेदित करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 9
चित्रा 9: ओपन-टॉप एल्वियोलस-चिप के साथ प्राप्त प्रतिनिधि डेटा। (ए) ओपन-टॉप एल्वियोलस-चिप तैयारी के लिए कार्रवाई के अनुक्रम को दिखाने और ओपन-टॉप एल्वियोलस-चिप संस्कृति के प्रमुख जैविक चरण प्रदान करने के लिए योजनाबद्ध। (बी) टाइप I (एचटीआई -56, एटी 1-α), टाइप II (एचटीआईआई -280, एलएएमपी 3, एबीसीए 3, सर्फेक्टेंट (सी) और ई-कैडरिन फ्लोरेसेंस धुंधला होना चिप पर परिपक्व न्यूमोसाइट्स की उपस्थिति को दर्शाता है। (सी) एसईएम और टीईएम छवि माइक्रोविली और लाइसोसोमल पुटिकाओं की उपस्थिति को दर्शाती है परिपक्व वायुकोशीय फेनोटाइप के सबूत। (डी) एच एंड ई क्रॉस-सेक्शन (स्केल बार: 5 μm) टाइप I फेनोटाइप के अनुरूप सपाट, स्क्वैमस कोशिकाओं की उपस्थिति की पुष्टि करता है और क्यूबॉइडल, कोबलस्टोन जैसी कोशिकाएं टाइप II फेनोटाइप के साथ सुसंगत हैं, और (ई) त्वचीय परत के अंदर फाइब्रोब्लास्ट की उपस्थिति दिखाती हैं (स्केल बार: 10 μm)। (एफ) ओपन-टॉप एल्वियोलस-चिप का 3 डी कार्टून अवधारणा प्रतिपादन। इस आंकड़े को वरोन एट अल .24 से अनुमति के साथ अनुकूलित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 10
चित्रा 10: ओपन-टॉप आंत-चिप के साथ प्राप्त प्रतिनिधि डेटा। (ए) ओपन-टॉप इंटेस्टाइन-चिप तैयारी के लिए कार्रवाई के अनुक्रम को दिखाने और ओपन-टॉप इंटेस्टाइन-चिप संस्कृति के प्रमुख जैविक चरण प्रदान करने के लिए योजनाबद्ध। (बी) जेल कास्टिंग चरण के दौरान स्टाम्प और चिप असेंबली को दिखाने वाला कोण पार्श्व दृश्य, माइक्रोपैटर्न्ड जेल की कार्टून अवधारणा और जेल की सतह पर माइक्रोपैटर्न वाली क्रिप्ट जैसी संरचना की चरण कंट्रास्ट छवियां और दो अलग-अलग ऊंचाइयों पर कोलोनोइड्स के साथ बीजित किया गया है। स्केल बार: 200 μm. (C) म्यूसिन 2 और ई-कैडरिन फ्लोरेसेंस धुंधला होना चिप पर एंटरोसाइट्स और परिपक्व गोब्लेट कोशिकाओं की उपस्थिति को दर्शाता है। स्केल बार: 200 μm. (D) एक क्रिप्ट जैसी संरचना का H & E क्रॉस-सेक्शन त्वचीय परत के अंदर फाइब्रोब्लास्ट की उपस्थिति को दर्शाता है और एक साधारण स्तंभ उपकला की उपस्थिति की पुष्टि करता है। स्केल सलाखों: 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक वीडियो 1: फेज कंट्रास्ट वीडियो जिसमें सिलिया को पीटते हुए दिखाया गया है। स्केल सलाखों: 100 μm. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्र 1: ओपन-टॉप चिप असेंबली। (ए) ओपन-टॉप चिप असेंबली के त्रि-आयामी प्रतिपादन और ओपन-टॉप स्किन-चिप के कार्टून प्रतिपादन को दिखाने वाला योजनाबद्ध जिसमें विभिन्न जैविक डिब्बों पर प्रकाश डाला गया है और जिसमें उपकला (नीला), त्वचीय (पीला), और संवहनी (लाल) शामिल हैं। (बी) इकट्ठे माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म में 35 मिमी x 17 मिमी प्रारूप, 0.32 सेमी2 का एक ऊतक संवर्धन क्षेत्र, एक निचला-सर्पिल माइक्रोफ्लुइडिक चैनल और एक माइक्रोफ्लुइडिक चैनल के साथ एक चैंबर ढक्कन होता है। (सी) मंच में 5-डिग्री कोण वाली दीवार के साथ एक कक्ष शामिल है, जिसमें झिल्ली के स्तर पर 6 मिमी का व्यास और पीडीएमएस कक्ष की दीवार के शीर्ष पर 5.7 मिमी और 4 मिमी और चौड़ाई की ऊंचाई है। छिद्रपूर्ण झिल्ली 50 μm मोटी है और छिद्र व्यास में 7 μm हैं। (डी) नीचे सर्पिल के आकार के माइक्रोफ्लुइडिक चैनल में 400 μm (ऊंचाई) x 600 μm (चौड़ाई) के क्रॉस-सेक्शन आयाम हैं। (ई) ओपन-टॉप ऑर्गन-चिप तैयार करने के लिए प्रयोग समयरेखा और आवश्यक कदमों का अवलोकन। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका 1: त्वचा। तालिका ओपन-टॉप स्किन-चिप संस्कृति (विकास, प्रसार और भेदभाव) के तीन चरणों के दौरान उपयोग किए जाने वाले प्रमुख दैनिक चरणों और स्ट्रेचिंग और प्रवाह मापदंडों का सारांश प्रदान करती है। तालिका इस प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक मीडिया तैयार करने के तरीके पर सामग्री, मध्यम योगों और निर्देशों की सूची भी प्रदान करती है। प्रोटोकॉल के विभिन्न चरणों के लिए तीन मीडिया की संरचना को अनुकूलित किया गया है। विशेष रूप से, माध्यम I को सीडिंग और प्रारंभिक केराटिनोसाइट कल्चर चरण के लिए अनुकूलित किया गया है। मध्यम II प्रसार और प्रारंभिक भेदभाव (एक स्तरीकृत उपकला का गठन) के लिए अनुकूलित है। एएलआई माध्यम को एक वायु-तरल इंटरफ़ेस पर केराटिनोसाइट्स को बनाए रखने के लिए अनुकूलित किया जाता है जब तक कि पूरी तरह से विभेदित एपिडर्मिस का उत्पादन नहीं होता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका 2: एल्वियोलस। तालिका ओपन-टॉप एल्वियोलस-चिप संस्कृति (विकास, प्रसार और भेदभाव) के तीन चरणों के दौरान उपयोग किए जाने वाले प्रमुख दैनिक चरणों और स्ट्रेचिंग और प्रवाह मापदंडों का सारांश प्रदान करती है। तालिका इस प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक मीडिया तैयार करने के तरीके पर सामग्री, मध्यम योगों और निर्देशों की सूची भी प्रदान करती है। प्रोटोकॉल के विभिन्न चरणों के लिए दो मीडिया की संरचना को अनुकूलित किया गया है। कृपया ध्यान दें कि न्यूमोसाइट्स के इष्टतम भेदभाव को प्राप्त करने के लिए सेल कल्चर माध्यम में पूरक (केआईएडी) को जोड़ना महत्वपूर्ण है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका 3: वायुमार्ग। तालिका ओपन-टॉप वायुमार्ग-चिप संस्कृति (विकास, प्रसार और भेदभाव) के तीन चरणों के दौरान उपयोग किए जाने वाले प्रमुख दैनिक चरणों और स्ट्रेचिंग और प्रवाह मापदंडों का सारांश प्रदान करती है। तालिका इस प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक माध्यम तैयार करने के तरीके पर सामग्री, माध्यम सूत्रीकरण और निर्देशों की सूची भी प्रदान करती है। माध्यम की संरचना वायु-तरल इंटरफ़ेस पर वायुमार्ग कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए अनुकूलित है, जो बदले में, टर्मिनल भेदभाव को प्रेरित करती है और बलगम के उत्पादन को उत्तेजित करती है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका 4: आंत। तालिका ओपन-टॉप आंत-चिप संस्कृति (विकास, प्रसार और भेदभाव) के तीन चरणों के दौरान उपयोग किए जाने वाले प्रमुख दैनिक चरणों और स्ट्रेचिंग और प्रवाह मापदंडों का सारांश प्रदान करती है। तालिका इस प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक मीडिया तैयार करने के तरीके पर सामग्री, मध्यम योगों और निर्देशों की सूची भी प्रदान करती है। प्रोटोकॉल के विभिन्न चरणों के लिए दोनों मीडिया की रचनाओं को अनुकूलित किया गया है। विशेष रूप से, सीएचआईआर और रॉक इनहिबिटर के साथ पूरक विस्तार माध्यम को सीडिंग और संस्कृति के शुरुआती चरण के लिए अनुकूलित किया जाता है क्योंकि यह एक मोनोलेयर के रूप में कोलोनिक ऑर्गनॉइड टुकड़े के अस्तित्व और विकास को बढ़ावा देता है। विस्तार माध्यम एपिथेलियम मोनोलेयर के प्रसार और प्रारंभिक भेदभाव के लिए अनुकूलित है। विभेदन माध्यम को वायु-तरल इंटरफ़ेस के संपर्क में आने से पहले एपिथेलियम मोनोलेयर के टर्मिनल भेदभाव के लिए अनुकूलित किया जाता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

ओपन-टॉप चिप वास्तविक समय में एक नियंत्रित माइक्रोएन्वायरमेंट में एंडोथेलियम, स्ट्रोमा और एपिथेलियम के बीच होने वाली जटिल सेलुलर इंटरप्ले की जांच के लिए एक सक्षम मंच का प्रतिनिधित्व करता है। यह तकनीक पारंपरिक ऑर्गेनोटाइपिक और ऑर्गेनॉइड संस्कृतियों पर महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करती है, जैसे कि भौतिक और जैव रासायनिक संकेतों का एकीकरण जो मानव ऊतक माइक्रोएन्वायरमेंट को पुनर्गठित करने के लिए प्रासंगिक हैं, जिसमें फ्लुइडिक कतरनी (प्रवाह), चक्रीय स्ट्रेचिंग और माइक्रोपैटर्निंग के माध्यम से प्राप्त उपकला सतह स्थलाकृति का पुनर्निर्माण शामिल है। इस मंच के भीतर बढ़ने वाली मानव कोशिकाएं ऊतक-विशिष्ट कार्यों को पुन: उत्पन्न करने के लिए तालमेल में कार्य करती हैं, जिनका विश्लेषण पारंपरिक तकनीकों के माध्यम से किया जा सकता है, जिसमें प्रतिरक्षा हिस्टोकैमिस्ट्री और जैव रासायनिक परख शामिल हैं, जो ऊपर और / या नीचे के डिब्बों से बहिर्वाह तरल पदार्थ (या बहिस्त्राव) का उपयोग करते हैं। वर्तमान डिजाइन उपकला परत तक आसान पहुंच की अनुमति देता है, जहां कोशिकाएं ऊतक-विशिष्ट फाइब्रोब्लास्ट और अन्य स्ट्रोमल कोशिकाओं के सीधे संपर्क में बढ़ती हैं, उपकला ऊतकों की बहुकोशिकीय वास्तुकला की नकल करती हैं। विशेष रूप से, ओपन-टॉप चिप प्रोटोटाइप अन्य ऑर्गन-ऑन-चिप प्लेटफार्मों के उपयोग से जुड़ी आम चुनौतियों का एक व्यवहार्य समाधान प्रदान करता है। जबकि यह एक स्ट्रोमल डिब्बे के भीतर कई अलग-अलग सेल प्रकारों को शामिल करने में सक्षम बनाता है जिससे बहुत जटिल 3 डी ऊतकों का निर्माण होता है, यह पारंपरिक एच एंड ई धुंधला सहित डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए चिप डिवाइस से स्थापित ऊतक संरचनाओं के आसान निष्कर्षण की भी अनुमति देता है।

वर्तमान डिजाइन कुछ सीमाएं प्रस्तुत करता है। उदाहरण के लिए, प्रोटोटाइप ओपन-टॉप चिप के संवहनी माइक्रोचैनल और स्ट्रोमल कम्पार्टमेंट (हाइड्रोगेल) के बीच स्थित लोचदार झिल्ली देशी मानव अंगों में स्ट्रोमा से एंडोथेलियल ऊतकों को अलग करने वाले अंतरालीय स्थान की तुलना में काफी मोटी (≈ 50 μm बनाम ≈ 1 μm) है। यद्यपि लोचदार झिल्ली बड़े अणुओं के प्रसार के लिए एक भौतिक बाधा का प्रतिनिधित्व नहीं करती है, जैसे हार्मोन और अन्य पैराक्रिन कारक जो ऊतकों के बीच अंतरकोशिकीय क्रॉसटॉक को मध्यस्थ करते हैं, यह प्रत्यक्ष, सेल-सेल इंटरैक्शन और संवहनी से स्ट्रोमल डिब्बे में कोशिकाओं के प्रवास को सीमित कर सकता है। अंत में, प्रोटोटाइप ओपन-टॉप चिप पीडीएमएस से बना है, जो हाइड्रोफोबिक यौगिकों की एक विशाल संख्या को अवशोषित करने के लिए जाना जाता है। यह सीमा कई पीडीएमएस-आधारित प्लेटफार्मों द्वारा साझा की जाती है जो छोटेचिकित्सीय यौगिकों के फार्माकोडायनामिक्स और फार्माकोकाइनेटिक्स के परीक्षण के लिए अनुप्रयोगों में एक गंभीर बाधा हो सकती है।

ओपन-टॉप चिप जैसे माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस में 3 डी हाइड्रोगेल को एकीकृत करने की मुख्य चुनौतियों में से एक यह है कि पीडीएमएस मानव प्रोटीन या कोशिकाओं के बंधन के लिए एक इष्टतम सब्सट्रेट प्रदान नहीं करता है। पीडीएमएस सतह का रासायनिक कार्यात्मककरण इसलिए इस प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम है जो ओपन-टॉप चिप मॉडल के जेल कक्ष में उचित ईसीएम कोटिंग और हाइड्रोगेल आसंजन सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है। इष्टतम परिणाम प्राप्त करने के लिए, ईआर 1 समाधान में क्रॉसलिंकिंग एजेंट को हमेशा प्रकाश के प्रत्यक्ष संपर्क से संरक्षित किया जाना चाहिए। क्रॉसलिंकर की प्रतिक्रियाशील स्थिति का एक महत्वपूर्ण संकेतक इसका रंग है। ईआर 1 में क्रॉसलिंकर, वास्तव में, ऑक्सीकरण होने पर शानदार नारंगी से गहरे भूरे रंग के रंग संक्रमण से गुजरता है। रंग संक्रमण का उपयोग यूवी सक्रियण चरण के बाद एक संकेतक के रूप में किया जा सकता है ताकि यह जांचा जा सके कि समाधान ने पीडीएमएस सतह के साथ प्रभावी ढंग से प्रतिक्रिया की है या नहीं। क्रॉसलिंकर समाधान की तैयारी के दौरान, रंग संक्रमण की निगरानी यह सुनिश्चित करने के लिए की जानी चाहिए कि प्रत्यक्ष प्रकाश के आकस्मिक संपर्क में समाधान में रासायनिक यौगिक को फोटो-ब्लीच नहीं किया जाता है। क्रॉसलिंकर समाधान की रक्षा करने और किसी भी अवांछित फोटोब्लीचिंग से बचने के लिए, हम एल्यूमीनियम पन्नी को लपेटने का सुझाव देते हैं, लगभग 15 सेमी x 15 सेमी, लगभग 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब या बाजार पर उपलब्ध एम्बर ट्यूब का उपयोग करके। ईआर 1 का उपयोग पीडीएमएस सतहों के तेजी से कार्यात्मककरण को प्राप्त करने के लिए एक सरल और प्रभावी विधि की अनुमति देता है; हालांकि, अन्य अणु हैं जिनका उपयोग ईआर 1 के स्थान पर किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, रासायनिक क्रॉसलिंकर 3-एमिनोप्रोपिल-ट्राइमेथॉक्सीसिलेन (एपीटीएमईएस) ईआर 1 के रूप में फोटोसेंसिटिव नहीं है और इसका उपयोग कुछ अतिरिक्त चरणों के साथ समान परिणाम प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है जैसा कि हमने पहले कहीं और वर्णित किया है28,29. पसंद के अणु से स्वतंत्र रूप से, रासायनिक क्रॉसलिंकर के साथ काम करने में मुख्य बाधाओं में से एक बचे हुए अवशेषों की उपस्थिति है, जो साइटोटॉक्सिसिटी को प्रेरित कर सकता है। सक्रियण प्रतिक्रिया के बाद, धोने के घोल की प्रचुर मात्रा के साथ माइक्रोफ्लुइडिक सतहों को कुल्ला करना महत्वपूर्ण है।

क्योंकि हवा के बुलबुले चिप्स, टयूबिंग और कनेक्टर्स के हाइड्रोफोबिक इंटरफेस के भीतर बनते और बढ़ते हैं, इसलिए यह आकलन करना महत्वपूर्ण है कि द्रव प्रवाह शुरू करने से पहले माइक्रोफ्लुइडिक पथ हवा के बुलबुले से मुक्त है या नहीं। बुलबुले वास्तव में प्रवाह को बाधित कर सकते हैं और यहां तक कि कोशिकाओं को मार सकते हैं जब चिप्स प्रवाह से जुड़े होते हैं। द्रव प्रवाह शुरू करने से पहले माइक्रोफ्लुइडिक घटकों की प्राइमिंग हवा के बुलबुले पैदा करने के जोखिम को कम करेगी और इष्टतम और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने में मदद करेगी। यदि इस प्रोटोकॉल में वर्णित प्राइमिंग चक्र पर्याप्त नहीं था, तो इथेनॉल (5 मिनट) के साथ माइक्रोफ्लुइडिक ट्यूबों को धोना, और फिर एचबीएसएस (20 मिनट) के साथ फ्लूइडिक कनेक्टर्स के अंदर हवा के बुलबुले पैदा करने के जोखिम को और कम कर देगा।

इसकी सीमाओं के बावजूद, पीडीएमएस में रासायनिक गुणों का एक दुर्लभ संयोजन है जिसने अत्यधिक जैव-संगत, पारदर्शी और लोचदार माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों के निर्माण को सक्षम किया है। इन सभी गुणों ने पीडीएमएस को पिछले दशक में ऑर्गन-ऑन-चिप मॉडल के निर्माण के लिए सबसे व्यापक रूप से लागू सामग्री बना दिया है। सामग्री विज्ञान और रासायनिक इंजीनियरिंग के क्षेत्र में हाल की प्रगति30,31 से पता चलता है कि इस मंच के पीडीएमएस घटक को निकट भविष्य में नए सिंथेटिक पॉलिमर या बायोमैटेरियल्स के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है। यदि सफलतापूर्वक हासिल किया जाता है, तो यह ऊतक-विशिष्ट गुणों के पुनर्मूल्यांकन को सक्षम कर सकता है, जिसमें छिद्र, अंतरालीय स्थान की ईसीएम संरचना मानव मूल ऊतकों के लिए निकट मिमिक्री प्रदान करती है, और फार्माकोलॉजी अध्ययन के लिए अधिक उन्नत मॉडल शामिल हैं। हम उम्मीद करते हैं कि ओपन-टॉप चिप डिजाइन का भविष्य का विकास मानव ऊतकों और अंगों के मॉडलिंग को विस्तार के अभूतपूर्व स्तर के साथ सक्षम करेगा।

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Disclosures

लेखक निम्नलिखित वित्तीय हितों / व्यक्तिगत संबंधों की घोषणा करते हैं, जिन्हें संभावित प्रतिस्पर्धी हितों के रूप में माना जा सकता है: वरोन एंटोनियो अनुकरण इंक के पूर्व कर्मचारी हैं और अनुकरण में इक्विटी हित रख सकते हैं।

Acknowledgments

कोई नहीं

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x EMEM  Lonza 12-684F Medium; Stroma
18 Gauge needle MicroGroup 316H18RW Tube stainless steel 316 welded, 18RW Full Hard 
19 Gauge needle MicroGroup 316H19RW Tube stainless steel 316 welded, 19RW Full Hard
2-Stop PharMed BPT  Cole-Palmer  EW-95723-12 Tube, 0.25 mm, 12/pack
70% ethanol and wipes   -   -  For surface sterilization 
8-Bromoadenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt (8-Br-cAMP) Sigma B7880 Medium supplement 
A-83-01  Tocris  2939
Adenine Sigma A9795
Advanced DMEM/F12  Thermo 12634010
Airway Epithelial Cells Lifeline Cell Technology FC-0016
Aluminum foil   -   -   -
Alveolar cells Cell Biologics H6621
Anti-ABCA3   ABCAM  ab24751  Mouse monoclonal antibody [3C9] 
Anti-Aquaporin5 Alexa Fluor 647  ABCAM  ab215225   Rabbit monoclonal antibody [EPR3747]  
Anti-Aquaporin5  ABCAM  ab92320  Rabbit monoclonal antibody [EPR3747] 
Anti-beta IV Tubulin   ABCAM  ab11315  Mouse monoclonal antibody [ONS.1A6] 
Anti-CD31 (PECAM-1)  ABCAM  ab9498  Mouse monoclonal [JC/70A] antibody  
Anti-CK5   ABCAM  ab75869  Rabbit recombinant monoclonal [AY1E6] 
Anti-Cytokeratin 10   ThermoFisher  MA5-13705  Mouse monoclonal antibody (DE-K10) 
Anti-Cytokeratin 14   ABCAM  ab7800  Mouse monoclonal antibody 
Anti-E-Cadherin   ABCAM  ab1416   Mouse monoclonal antibody 
Anti-Filaggrin   ThermoFisher  PA5-79267  Rabbit polyclonal antibody  
Anti-HTI-56  Terrace Biotech  TB-29AHT1-56   Mouse monoclonal antibody (IgG1) 
Anti-HTII-280  Terrace Biotech  TB-27AHT2-280  Mouse monoclonal antibody (IgM) 
Anti-Involucrin   ThermoFisher  MA5-11803  Mouse monoclonal antibody (SY5) 
Anti-Isoforms TA p63-α, -β, -γ   Biolengend  618902  Rabbit polyclonal antibody  
Anti-Ki67   ABCAM  ab8191  Mouse monoclonal antibody [B126.1] 
Anti-LAMP3   ABCAM  ab111090  Rabbit polyclonal antibody 
Anti-Mature SP-B  Seven Hill  WRAB-48604  Rabbit polyclonal antibody 
Anti-MUC5AC   ThermoFisher  PA5-34612  Rabbit polyclonal antibody  
Anti-Mucin-2  SantaCruz Biotechnology sc-7314 Mouse monoclonal antibody (IgG1) 
Anti-p63   Dako  GA662  Mouse monoclonal antibody p63 Protein (Dako Omnis) Clone DAK-p63 
Anti-PCNA   ThermoFisher  PA5-32541  Rabbit polyclonal antibody  
Anti-Podoplanin (AT-1α)   ABCAM  ab128994  Rabbit polyclonal antibody 
Anti-Pro + Mature Surfactant Protein B  ABCAM  ab40876  Rabbit polyclonal antibody 
Anti-Surfactant C    Seven Hill   WRAB-9337   Rabbit polyclonal antibody 
Anti-Uteroglobin/SCGB1A1  Hycult Biotech  HM2178  Mouse monoclonal antibody [AY1E6] 
Anti-VE-cadherin   ABCAM  ab33168  Rabbit polyclonal antibody  
Anti-ZO-1   ThermoFisher  33-9100  Mouse monoclonal antibody [1A12] 
Ascorbic acid Sigma A4544
Aspirating pipettes  Corning / Falcon  357558  2 mL, polystyrene, individually wrapped 
Aspirating tips   -   -  Sterile (autoclaved) 
B27 Thermo 17504044
Blocker BSA (10X) in PBS solution   ThermoFisher  37525  Blocker agent 
Calcium Chloride Sigma C7902
CHIR 99021 Tocris 4423
Collagen I Advanced Biomatrix 5133 10 mg/mL (Stroma)
Collagen I  Advanced BioMatrix 5005 3 mg/mL (Vascular ECM)
Collagen IV Sigma  C5533
Collagen-IV Sigma  C5533-5MG  Collagen from human placenta, 5 mg powder, reconstitute to 1 mg/mL 
Colonic Fibroblasts  Cell Biologics  H6231
Colonic microvascular endothelial cells  Cell Biologics H6203 
Conical tubes    -   -  15 mL and 50 mL polypropylene, sterile 
Crosslinker (ER-1)  Emulate  10461 5 mg powder 
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)   ThermoFisher  D3571  DNA probe 
Dermal fibroblasts ATCC PCS-201-010
Dermal microvascular endothelial cells ATCC CRL-3243
Dexamethasone Sigma D4902
DMEM ThermoFisher 11054020
DMEM/F-12  GIBCO  11320082
DMEM/F-12, GlutaMAX   GIBCO  10565-018  Basal medium for ALI medium 
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488)   ABCAM  ab150105  Donkey Anti-Mouse secondary antibody  
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568)   ABCAM  ab175472  Donkey Anti-Mouse secondary antibody 
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647)   ABCAM  ab150107  Donkey Anti-Mouse secondary antibody 
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488)   ABCAM   ab150073  Donkey Anti-Mouse secondary antibody 
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568)   ABCAM  ab175470  Donkey Anti-Mouse secondary antibody 
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 647)   ABCAM  ab150075  Donkey Anti-Mouse secondary antibody 
Dulbecco’s PBS (DPBS-/-) (without Ca2+, Mg2+)  Corning  21-031-CV  1x 
Epidermal Growth Factor (EGF) human, recombinant in E. coli PromoCell C-60170 Medium supplement 
F-12 Ham’s Invitrogen  21700-108 For vascular ECM
FibriCol  Advanced BioMatrix  5133-20ML  Collagen-I solution (10 mg/mL)
Fibronectin Corning 356008
Fibronectin, Human, Natural,   Corning  47743-654  human plasma fibronectin 
Fine-tip precision tweezers  Aven 18056USA  Technik Style 5B-SA Precision Stainless Steel Tweezers
Glutamax Invitrogen  21700-108
Glutamax  Invitrogen  35050061
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 594)   ABCAM  ab150080  Goat Anti-Mouse secondary antibody  
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647)   ABCAM  ab150115  Goat Anti-Mouse secondary antibody  
Goat Anti-Mouse IgG H&L (FITC)   ABCAM  ab6785  Goat Anti-Mouse secondary antibody  
Goat Anti-Mouse IgG1 Alexa Fluor 568   ThermoFisher  A-21124  Goat Anti-Mouse IgG1 secondary antibody 
Goat Anti-Mouse IgM Alexa Fluor 488   ThermoFisher  A-21042  Goat Anti-Mouse IgM secondary antibody 
Handheld vacuum aspirator  Corning  4930   - 
Heat Inactivated HyClone FetalClone II Serum (FCS)  GE Healthcare Life Sciences SH30066.03
Hemocytometer   -   -  - 
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa Sigma H3149
HEPES Thermo 15630080
Human [Leu15] - Gastrin  Sigma G9145
Human colonoids Obtained from clinical resections Obtained from clinical resections
Human EGF Recombinant Protein  Thermo PHG0311L
human epithelial growth factor  Thermo  PHG0311
HyClone FetalClone II Serum (U.S.)   GE Healthcare  SH30066.02HI   Sterile FBS heat-inactivated 
Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt Sigma H4881
Hydrocortisone  PromoCell   C-64420  Medium supplement  
Ice bucket   -   -   - 
Ismatec IPC-N  Cole-Palmer EW-78000-41 Low-Speed Digital Peristaltic Pump; q24-Channel (1 per 12 Chips)
ITES BioWhittaker 17-839Z
Keratinocyte Growth Factor (KGF), also known as Basic Fibroblast Growth Factor 7 (FGF-7), human, recombinant in HEK PromoCell C-63821
Keratinocytes ATCC PCS-200-010
Laminin  Biolamina CT521-0501 
Laminin, 521 CTG (CT521)  Biolamina   CT521-0501  human recombinant laminin 521    
Lung Fibroblast Cell Biologics H6013
Lung Fibroblast Lifeline Cell Technology FC-0049
Lung microvascular endothelial cells Lonza CC-2527
Lung smooth muscle cells Lifeline Cell Technology FC-0046
Manual counter   -   -   -
Masterflex (TPE) Transfer Tubing  Cole-Palmer FV-96880-02 PharMed BPT, 1/32" ID x 5/32" OD
Medium 199, no phenol red Thermo  11043023
Microcentrifuge tube   -    -   1.5 mL, sterile 
Microscope (with camera)   -   -  For bright-field imaging 
N2 Sigma 17502001
N-acetyl cysteine Sigma A5099
Noggin (HEK293T conditioned medium) Sigma N17001
Normal Goat Serum   ThermoFisher  50062Z  Blocking solution  
O-phosphosrylethanolamine  Sigma P0503
Paraformaldehyde (4% wt/vol)   EMS  15710  Fixing agent 
Penicillin Streptomycin GIBCO 15140122
Penicillin-streptomycin  Sigma  P4333  10,000 U/mL; 10 mg/mL 
Pipette tips    -   -  P20, P200, and P1000 sterile, low adhesion
Pipette  Gilson   F167380  P20, P200, and P1000 
PluriQ Serum Replacement (or alternatively KO Serum replacement) AMSBIO (or Thermo) N/A (or C1910828010)
Poly-L-Lysine coated microscope glass slides   Sigma  P0425  Glass slides 
Primocin InvivoGen ant-pm-1
Progesterone Sigma P8783
ProLong Gold   ThermoFisher  P36931  Antifade Mountant with DAPI 
Retinoic Acid  Sigma R2625
ROCK inhibitor (Y27632) Tocris TB1254-GMP/10
R-spondin (HEK293T conditioned medium) Sigma SCC111
SAGM SingleQuots supplements  Lonza CC-4124
SAGMTM Small Airway Epithelial Cell Growth medium BulletKitTM  Lonza  CC-4124  Medium supplements 
SB2001190  Tocris  1264/10
Serological pipettes   -   -  2 mL, 5 mL, 10 mL, and 25 mL low endotoxin, sterile 
Small Airway Epithelial Cell Growth medium (SAGM) Lonza  CC-4124 
Solvent Buffer (ER-2)  Emulate  10462 25 mL bottle 
Steriflip-HV  Millipore SE1M003M00 Sterile filtering conical tube
Sterilin 100 mm Square Petri Dishes Thermo 103 Sterile, 1 per 6 chips 
T25 flasks   -   -   -
T75 flasks   -   -   - 
Tri-iodothyronine Sigma T5516
Triton X-100 (0.3% (vol/vol)   Sigma  T8787  Permeabilization agent 
Trypan blue  Sigma  93595  0.4% solution 
TrypEE solution  Sigma  12604013  Cell detaching solution 
TWEEN-20  Sigma  P2287  Permeabilization agent 
UV Light Oven (peak frequency 365nm, intensity of 100 µJ/cm2) VWR 21474-598 UVP, Long Range UV, 365 nm 60Hz Model CL-1000L
Vacuum set-up   -   -  Minimum pressure: -70 kPa 
Vascular Endothelial Growth Factor 165 (VEGF-165) human, recombinant in E. coli PromoCell C-64420
VEGF-165   PromoCell   C-64420  Medium supplement 
Von Willebrand Factor conjugated FITC   ABCAM  ab8822  Sheep polyclonal antibody 
Water bath (or beads)   -   -  Set to 37 °C 
Wnt3A (L-Wnt3A conditioned medium) ATCC CRL-2647

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References

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Antonio, V., Panchal, A., Kasendra, M., Riccardo, B. Reconstituting Cytoarchitecture and Function of Human Epithelial Tissues on an Open-Top Organ-Chip. J. Vis. Exp. (192), e64633, doi:10.3791/64633 (2023).

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