Bu protokol, Primer dokuların (deri, alveolus, hava yolu ve bağırsak) tam kalınlıkta çip üstü organ kültürlerinin başarılı bir şekilde kurulması ve olgunlaşması için Open-Top Organ-Chip'in yeteneklerini ve temel kültür modalitelerini açıklamakta ve insan epitelyal/mezenkimal ve vasküler niş arayüzünün farklı fonksiyonel yönlerini in vitro olarak araştırma fırsatı sunmaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
İnsan Epitel Dokularının Üstü Açık Bir Organ Çipi Üzerindeki Sitomimarisinin ve İşlevinin Yeniden Yapılandırılması
Bu makalede
Özet
Özet
Neredeyse tüm insan organları, üç boyutlu (3B) yapılar halinde organize edilmiş, sıkıca bağlanmış hücrelerin bir veya daha fazla katmanından oluşan epitel dokularıyla kaplıdır. Epitelin temel işlevlerinden biri, altı çizili dokuları fiziksel ve kimyasal hakaretlere ve enfeksiyöz ajanlara karşı koruyan bariyerlerin oluşmasıdır. Ek olarak, epitel, besinlerin, hormonların ve diğer sinyal moleküllerinin taşınmasına aracılık eder ve genellikle organ içindeki hücre konumlandırmasını ve bölümlenmesini yönlendiren biyokimyasal gradyanlar oluşturur. Organ yapısını ve fonksiyonunu belirlemedeki merkezi rolleri nedeniyle, epitel, her zaman hayvan modelleri tarafından yakalanmayan birçok insan hastalığı için önemli terapötik hedeflerdir. Türler arası bariz farklılıkların yanı sıra, hayvanlarda epitelin bariyer fonksiyonu ve taşıma özellikleri üzerine araştırma çalışmaları yapmak, canlı bir sistemde bu dokulara erişmenin zorluğu ile daha da artmaktadır. İki boyutlu (2B) insan hücre kültürleri temel bilimsel soruları cevaplamak için yararlı olsa da, genellikle zayıf in vivo tahminler verirler. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, son on yılda, çip üzerinde organlar olarak bilinen çok sayıda mikro mühendislik biyomimetik platform, geleneksel in vitro ve hayvan testlerine umut verici bir alternatif olarak ortaya çıkmıştır. Burada, deri, akciğerler ve bağırsaklar dahil olmak üzere organa özgü epitel dokularını modellemek için tasarlanmış bir platform olan Open-Top Organ Chip'i (veya Open-Top Chip) açıklıyoruz. Bu çip, dokuya özgü fibroblastları ve endotel hücrelerini mekanik olarak aktif bir sisteme dahil ederek bir 3D stromal bileşeni yeniden oluşturma yeteneği de dahil olmak üzere, epitel dokularının çok hücreli mimarisini ve işlevini yeniden oluşturmak için yeni fırsatlar sunmaktadır. Bu Open-Top Chip, epitelyal/mezenkimal ve vasküler etkileşimleri tek hücrelerden çok katmanlı doku yapılarına kadar çoklu çözünürlük ölçeklerinde incelemek için benzeri görülmemiş bir araç sağlar, böylece epitelize organların hücreler arası çapraz konuşmasının sağlık ve hastalıkta moleküler diseksiyonuna izin verir.
Giriş
Tarihsel olarak, bilim adamları ilaç keşfi için klinik öncesi hayvan testlerine güvenmişlerdir, ancak insan sonuçlarıyla zayıf korelasyon nedeniyle bu yöntemlerin giderek artan bir kısmı sorgulanmıştır1. Hayvan deneylerini Değiştirmek, Azaltmak ve İyileştirmek için "3R" ilkelerinin uygulanması, bilim insanlarını klinik öncesi ilaç ve kimyasal toksikoloji risk değerlendirmesini desteklemek için yeni in vitro alternatif yöntemler bulmaya çağırmaktadır2. Bununla birlikte, bugüne kadar geliştirilen birçok in vitro model, insan canlı organlarının dinamik doğasını özetlemek için gerekli biyolojik mimariden, h....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
İnsan kolonoidleri, Cincinnati Çocuk Hastanesi Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi'nin (IBC 2017-2011) yönergelerine uygun olarak bağırsak rezeksiyonlarından elde edildi.
1. Yüzey aktivasyonu
- Aktivasyon tamponunun hazırlanması
- Çapraz bağlayıcı ve çözücü tampon reaktiflerini biyogüvenlik kabininin (BSC) altına yerleştirin ve kullanmadan önce 10 dakika boyunca oda sıcaklığında (RT) dengelenmelerini sağlayın.
- Crosslinker çözeltisini doğrudan ışığa maruz kalmaktan korumak için steril ışık geçirimsiz bir kap veya alüminyum folyoya sarılmış şeffaf bir 15 mL konik tüp kullanarak çözücü tamponunun 5 mL'sinde ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Yüzey mikro desenleme
Hücre dışı matrisin (ECM) mikro modellemesi, bağırsak kript arayüzünün uzamsal konfigürasyonunu çoğaltmak için kullanılabilir. Open-Top Chip konfigürasyonu, kolonik epitel-stroma arayüzünün doğal topografyasını (Şekil 6A, B) ve bağırsak kriptolarını mikrometre ölçeğinde (Şekil 6C-E) taklit etmek için özel olarak tasarlanmış mikro desenli pulları entegre edecek şekilde de.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Open-Top Chip, kontrollü bir mikro ortamda endotel, stroma ve epitel arasında meydana gelen karmaşık hücresel etkileşimi gerçek zamanlı olarak araştırmak için uygun bir platformu temsil eder. Bu teknoloji, akışkan kayma (akış), siklik germe ve mikrodesenleme yoluyla elde edilen epitel yüzey topografyasının yeniden yapılandırılması dahil olmak üzere insan dokusu mikroçevresini yeniden oluşturmakla ilgili fiziksel ve biyokimyasal ipuçlarının entegrasyonu gibi geleneksel organotipik ve organoid kültürlere göre krit.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar, potansiyel rakip çıkarlar olarak kabul edilebilecek aşağıdaki finansal çıkarları / kişisel ilişkileri beyan ederler: Varone Antonio, Emulate Inc.'in eski bir çalışanıdır ve Emulate'de hisse senedi payına sahip olabilir.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 10x EMEM | Lonza | 12-684F | Orta; Stroma |
| 18 Ayar iğnesi | MicroGroup | 316H18RW | Boru paslanmaz çelik 316 kaynaklı, 18RW Tam Sert |
| 19 Ölçer iğne | MicroGroup | 316H19RW | Tüp paslanmaz çelik 316 kaynaklı, 19RW Tam Sert |
| 2 Duraklı PharMed BPT | Cole-Palmer | EW-95723-12 | Tüp, 0,25 mm, 12/paket |
| %70 etanol ve mendil | - | - | Yüzey sterilizasyonu için |
| 8-Bromoadenosin 3&asal;,5′-siklik monofosfat sodyum tuzu (8-Br-cAMP) | Sigma | B7880 | Orta takviye |
| A-83-01 | Tokris | 2939 | |
| Adenin | Sigma | A9795 | |
| İleri DMEM/F12 | Termo | 12634010 | |
| Havayolu Epitel Hücreleri | Yaşam Hattı Hücre Teknolojisi | FC-0016 | |
| Alüminyum folyo | - | - | - |
| Alveolar hücreler | Hücre Biyolojikleri | H6621 | |
| Anti-ABCA3 | ABCAM | AB24751 | Fare monoklonal antikoru [3C9] |
| Anti-Aquaporin5 Alexa Fluor 647 | ABCAM | ab215225 | Tavşan monoklonal antikoru [EPR3747] |
| Anti-Aquaporin5 | ABCAM | ab92320 | Tavşan monoklonal antikoru [EPR3747] |
| Anti-beta IV Tübülin | ABCAM | AB11315 | Fare monoklonal antikoru [ONS.1A6] |
| Anti-CD31 (PECAM-1) | ABCAM | ab9498 | Fare monoklonal [JC / 70A] antikoru |
| Anti-CK5 | ABCAM | ab75869 | Tavşan rekombinant monoklonal [AY1E6] |
| Anti-Sitokeratin 10 | ThermoFisher | MA5-13705 | Fare monoklonal antikoru (DE-K10) |
| Anti-Sitokeratin 14 | ABCAM | ab7800 | Fare monoklonal antikoru |
| Anti-E-Cadherin | ABCAM | AB1416 | Fare monoklonal antikoru |
| Anti-Filaggrin | ThermoFisher | PA5-79267 | Tavşan poliklonal antikoru |
| Anti-HTI-56 | Teras Biyoteknoloji | TB-29AHT1-56 | Fare monoklonal antikoru (IgG1) |
| Anti-HTII-280 | Teras Biyoteknoloji | TB-27AHT2-280 | Fare monoklonal antikoru (IgM) |
| Anti-involucrin | ThermoFisher | MA5-11803 | Fare monoklonal antikoru (SY5) |
| Anti-İzoformlar TA p63-&alfa;, -β, -&gama; | Biolengend | 618902 | Tavşan poliklonal antikoru |
| Anti-Ki67 | ABCAM | AB8191 | Fare monoklonal antikoru [B126.1] |
| Anti-LAMP3 | ABCAM | ab111090 | Tavşan poliklonal antikoru |
| Anti-Olgun SP-B | Yedi Tepe | WRAB-48604 | Tavşan poliklonal antikoru |
| Anti-MUC5AC | ThermoFisher | PA5-34612 | Tavşan poliklonal antikoru |
| Anti-Müsin-2 | SantaCruz Biyoteknoloji | sc-7314 | Fare monoklonal antikoru (IgG1) |
| Anti-p63 | Dako | GA662 | Fare monoklonal antikoru p63 Proteini (Dako Omnis) Klon DAK-p63 |
| Anti-PCNA | ThermoFisher | PA5-32541 | Tavşan poliklonal antikoru |
| Anti-Podoplanin (AT-1&alfa;) | ABCAM | ab128994 | Tavşan poliklonal antikoru |
| Anti-Pro + Olgun Yüzey Aktif Madde Proteini B | ABCAM | ab40876 | Tavşan poliklonal antikoru |
| Anti-Yüzey Aktif Madde C | Yedi Tepe | WRAB-9337 | Tavşan poliklonal antikoru |
| Anti-Uteroglobin / SCGB1A1 | Hycult Biyoteknoloji | HM2178 | Fare monoklonal antikoru [AY1E6] |
| Anti-VE-cadherin | ABCAM | AB33168 | Tavşan poliklonal antikoru |
| Anti-ZO-1 | ThermoFisher | 33-9100 | Fare monoklonal antikoru [1A12] |
| Askorbik asit | Sigma | A4544 | |
| Aspirasyon pipetleri | Corning / Şahin | 357558 | 2 mL, polistiren, ayrı ayrı sarılmış |
| Aspirasyon ipuçları | - | - | Steril (otoklavlanmış) |
| PBS solüsyonunda B27 | Termo | 17504044 | |
| Engelleyici BSA (10X) | ThermoFisher | 37525 | Engelleyici ajan |
| Kalsiyum Klorür | Sigma | C7902 | |
| CHIR 99021 | Tocris | 4423 | |
| Kollajen I | İleri Biomatrix | 5133 | 10 mg/mL (Stroma) |
| Kollajen I | Gelişmiş BioMatrix | 5005 | 3 mg / mL (Vasküler ECM) |
| Kollajen IV | Sigma | C5533 | |
| Kollajen-IV | Sigma | C5533-5MG & nbsp; | İnsan plasentasından elde edilen kollajen, 5 mg toz, 1 mg / mL 'ye sulandırılır; |
| Kolon Fibroblastları | Hücre Biyolojikleri | H6231 | |
| Kolonik mikrovasküler endotel hücreleri | Hücre Biyolojikleri | H6203 | |
| Konik borular | - | - | 15 mL ve 50 mL polipropilen, steril ve nbsp; |
| Çapraz bağlayıcı (ER-1) | Öykünmek | 10461 | 5 mg toz |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-fenilindol, Dilaktat) | ThermoFisher | D3571 | DNA probu |
| Dermal fibroblastlar | ATCC | PCS-201-010 | |
| Dermal mikrovasküler endotel hücreleri | ATCC | CRL-3243 | |
| Deksametazon | Sigma | D4902 | |
| DMEM | ThermoFisher | 11054020 | |
| DMEM / F-12 | GIBCO | ||
| DMEM / F-12, GlutaMAX ve nbsp; | GIBCO | 10565-018 | ALI ortamı için bazal ortam |
| Eşek Anti-Fare IgG H & L (Alexa Fluor 488) | ABCAM | ab150105 | Eşek Anti-Fare ikincil antikoru |
| Eşek Anti-Fare IgG H & L (Alexa Fluor 568) | ABCAM | AB175472 | Eşek Anti-Fare ikincil antikoru |
| Eşek Anti-Fare IgG H & L (Alexa Fluor 647) | ABCAM | ab150107 | Eşek Anti-Fare ikincil antikoru |
| Eşek Anti-Tavşan IgG H & L (Alexa Fluor 488) | ABCAM | ab150073 | Eşek Anti-Fare ikincil antikoru |
| Eşek Anti-Tavşan IgG H & L (Alexa Fluor 568) | ABCAM | AB175470 | Eşek Anti-Fare ikincil antikoru |
| Eşek Anti-Tavşan IgG H & L (Alexa Fluor 647) | ABCAM | ab150075 | Eşek Anti-Fare ikincil antikoru |
| Dulbecco' s PBS (DPBS-/-) (Ca2+, Mg2+ olmadan) | Corning | 21-031-CV | 1x |
| Epidermal Büyüme Faktörü (EGF) insan, E. coli'de rekombinant | PromoCell | C-60170 | Orta takviyesi |
| F-12 Jambonu' s | Invitrogen | 21700-108 | Vasküler ECM |
| FibriCol | Gelişmiş BioMatrix | 5133-20ML | Kollajen-I çözeltisi (10 mg / mL) |
| Fibronektin | Corning | 356008 | |
| Fibronektin, İnsan, Doğal, | Corning | 47743-654 | insan plazma fibronektin |
| İnce uçlu hassas cımbız | Aven | 18056ABD | Technik Style 5B-SA Hassas Paslanmaz Çelik Cımbız |
| Glutamax | Canlandırıcı | 21700-108 | |
| Glutamax | Canlandırıcı | ||
| Keçi Anti-Fare IgG H & L (Alexa Fluor 594) | ABCAM | ab150080 | Keçi Anti-Fare ikincil antikoru |
| Keçi Anti-Fare IgG H & L (Alexa Fluor 647) | ABCAM | AB150115 | Keçi Anti-Fare ikincil antikoru |
| Keçi Anti-Fare IgG H & L (FITC) | ABCAM | ab6785 ve nbsp; | Keçi Anti-Fare ikincil antikoru |
| Keçi Anti-Fare IgG1 Alexa Fluor 568 | ThermoFisher | A-21124 | Keçi Anti-Fare IgG1 ikincil antikoru |
| Keçi Anti-Fare IgM Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A-21042 | Keçi Anti-Fare IgM ikincil antikoru |
| El tipi vakum aspiratörü | Corning | 4930 | - |
| Isı ile İnaktive Edilmiş HyClone FetalClone II Serum (FCS) | GE Healthcare Yaşam Bilimleri | SH30066.03 | |
| Hemositometre | - | - | - |
| Domuz bağırsak mukozasından heparin sodyum tuzu | Sigma | H3149 | |
| HEPES | Thermo | 15630080 | |
| İnsan [Leu15] - Gastrin | Sigma | G9145 | |
| Klinik rezeksiyonlardan | insan kolonoidleri | Klinik rezeksiyonlardan elde edilen | |
| İnsan EGF Rekombinant Proteini | Termo | PHG0311L | |
| insan epitelyal büyüme faktörü | Termo | ||
| HyClone FetalClone II Serum (ABD) | GE Sağlık | SH30066.02HI | Steril FBS ısı inaktive edilmiş |
| Hidrokortizon 21-hemisüksinat sodyum tuzu | Sigma | H4881 | |
| Hidrokortizon | PromoCell | C-64420 | Orta takviye |
| Buz kovası | - | - | - |
| Ismatec IPC-N | Cole-Palmer | EW-78000-41 | Düşük Hızlı Dijital Peristaltik Pompa; q24-Kanal (12 Cips başına 1) |
| ITES | BioWhittaker | 17-839Z | |
| Keratinosit Büyüme Faktörü (KGF), Temel Fibroblast Büyüme Faktörü 7 (FGF-7) olarak da bilinir, insan, HEK | PromoCell | C-63821 | |
| Keratinositlerde | ATCC | PCS-200-010 | |
| Laminin | Biolamina | CT521-0501 ve nbsp; | |
| Laminin, 521 CTG (CT521) | Biyolamina | CT521-0501 ve nbsp; | İnsan Rekombinant Laminin 521 & |
| Akciğer Fibroblast | Hücre Biyolojikleri | H6013 | |
| Akciğer Fibroblast | Yaşam Hattı Hücre Teknolojisi | FC-0049 | |
| Akciğer mikrovasküler endotel hücreleri | Lonza | CC-2527 | |
| Akciğer düz kas hücreleri | Yaşam Hattı Hücre Teknolojisi | FC-0046 | |
| Manuel sayaç | - | - | - |
| Masterflex (TPE) Transfer Boruları | Cole-Palmer | FV-96880-02 | PharMed BPT, 1/32" ID x 5/32" OD |
| Orta 199, fenol kırmızısı | Thermo | ||
| Mikrosantrifüj tüpü | - | - | 1.5 mL, steril |
| Mikroskop (kameralı) | - | - | Parlak alan görüntülemesi için |
| N2 | Sigma | 17502001 | |
| N-asetil sistein | Sigma | A5099 | |
| Noggin (HEK293T şartlandırılmış ortam) | Sigma | N17001 | |
| Normal Keçi Serumu | ThermoFisher | 50062Z | Engelleme çözümü |
| O-fosgripanolamin | Sigma | P0503 | |
| Paraformaldehit (%4 ağırlıkça/hacim) | EMS | 15710 | Sabitleme maddesi |
| Penisilin Streptomisin | GIBCO | 15140122 | |
| Penisilin-streptomisin | Sigma | P4333 | 10.000 U/mL; 10 mg/mL |
| Pipet uçları | - | - | P20, P200 ve P1000 steril, düşük yapışma |
| özelliğine sahip Pipet | Gilson | F167380 | P20, P200 ve P1000 |
| PluriQ Serum Replasmanı (veya alternatif olarak KO Serum replasmanı) | AMSBIO (veya Thermo) | N / A (veya C1910828010) | |
| Poli-L-Lizin kaplı mikroskop cam slaytları ve nbsp; | Sigma | P0425 | Cam kaydıraklar |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| Progesteron | Sigma | P8783 | |
| ProLong Altın | ThermoFisher | P36931 | DAPI ile Antifade Mountant |
| Retinoik Asit | Sigma | R2625 | |
| ROCK inhibitörü (Y27632) | Tocris | TB1254-GMP/10 | |
| R-spondin (HEK293T şartlandırılmış ortam) | Sigma | SCC111 | |
| SAGM SingleQuots takviyeleri | Lonza | CC-4124 | |
| SAGMTM Küçük Hava Yolu Epitel Hücre Büyüme ortamı BulletKitTM | Lonza | CC-4124 ve nbsp; | Orta takviyeler |
| SB2001190 | Tokris | 1264/10 | |
| Serolojik pipetler | - | - | 2 mL, 5 mL, 10 mL ve 25 mL düşük endotoksin, steril |
| Küçük Hava Yolu Epitel Hücre Büyüme ortamı (SAGM) | Lonza | CC-4124 ve nbsp; | |
| Solvent Tamponu (ER-2) | Öykünmek | 10462 | 25 mL şişe |
| Steriflip-HV | Kırlangıç SE1M003M00 | Steril filtreleme konik tüp | |
| Sterilin 100 mm Kare Petri Kapları | Thermo | 103 | Steril, 6 cips başına 1 adet |
| T25 şişeleri | - | - | - |
| T75 şişeleri | - | - | - |
| Tri-iyodotironin | Sigma | T5516 | |
| Triton X-100 (% 0.3 (hacim / hacim) | Sigma | T8787 | Geçirgenleştirme ajanı |
| Tripan mavisi | Sigma | 93595 | % 0.4 çözelti |
| TrypEE çözümü | Sigma | 12604013 | Hücre ayırma solüsyonu |
| TWEEN-20 | Sigma | P2287 | Geçirgenleştirme ajanı |
| UV Işıklı Fırın (tepe frekansı 365nm, 100 ve mikro; J/cm2) | VWR | 21474-598 | UVP, Uzun Menzilli UV, 365 nm 60Hz Model CL-1000L |
| Vakum kurulumu | - | - | Minimum basınç: -70 kPa |
| Vasküler Endotelyal Büyüme Faktörü 165 (VEGF-165) insan, E. coli'de rekombinant | PromoCell | C-64420 | |
| VEGF-165 | PromoCell | C-64420 | Orta takviye |
| Von Willebrand Faktörü konjuge FITC | ABCAM | AB8822 | Koyun poliklonal antikoru |
| Su banyosu (veya boncuklar) | - | - | 37 & dereceye ayarlayın; C |
| Wnt3A (L-Wnt3A şartlandırılmış ortam) | ATCC | CRL-2647 |
Kaynaklar
- Van Norman, G. A. Limitations of animal studies for predicting toxicity in clinical trials: Is it time to rethink our current approach. JACC: Basic to Translational Science. 4 (7), 845-854 (2019).
- Wange, R. L., Brown, P. C., Davis-Bruno, K. L.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
