Summary
本プロトコルは、初代組織(皮膚、肺胞、気道、および腸)の全層臓器チップ培養の確立と成熟を成功させるためのOpen-Top Organ-Chipの機能と本質的な培養モダリティを説明し、ヒトの上皮/間葉系および血管ニッチ界面のさまざまな機能的側面をin vitroで調査する機会を提供します。
Abstract
ほぼすべての人間の臓器は上皮組織で裏打ちされており、3次元(3D)構造に編成された緊密に接続された細胞の1つまたは複数の層で構成されています。上皮の主な機能の1つは、下線組織を物理的および化学的傷害および感染性病原体から保護する障壁の形成である。さらに、上皮は栄養素、ホルモン、およびその他のシグナル伝達分子の輸送を媒介し、多くの場合、臓器内の細胞の位置決めと区画化を導く生化学的勾配を作成します。上皮は、臓器の構造と機能を決定する上で中心的な役割を果たすため、動物モデルでは必ずしも捕捉されない多くのヒト疾患の重要な治療標的です。明らかな種間の違いに加えて、動物の上皮のバリア機能と輸送特性に関する調査研究を行うことは、生体系でこれらの組織にアクセスすることの難しさによってさらに悪化します。二次元(2D)ヒト細胞培養は、基本的な科学的質問に答えるのに役立ちますが、 in vivo での予測が不十分であることがよくあります。これらの制限を克服するために、過去10年間で、臓器チップとして知られる多数のマイクロエンジニアリングされた生体模倣プラットフォームが、従来の in vitro および動物実験の有望な代替手段として浮上しました。ここでは、皮膚、肺、腸などの臓器特異的な上皮組織をモデル化するために設計されたプラットフォームであるオープントップ臓器チップ(またはオープントップチップ)について説明します。このチップは、機械的に活性なシステム内に組織特異的な線維芽細胞と内皮細胞を組み込むことによって3D間質成分を再現する機能を含む、上皮組織の多細胞構造と機能を再構成するための新しい機会を提供します。このOpen-Top Chipは、単一細胞から多層組織構築物まで、複数の解像度スケールで上皮/間葉系および血管の相互作用を研究するための前例のないツールを提供し、健康と疾患における上皮化臓器の細胞間クロストークの分子解剖を可能にします。
Introduction
歴史的に、科学者は創薬のために前臨床動物実験に依存してきましたが、人間の転帰との相関性が低いため、これらの方法の多くが疑問視されてきました1。動物実験を置き換え、削減し、改良するための「3R」原則の実施は、科学者に前臨床薬物および化学毒物学のリスク評価をサポートするための新しいin vitro代替方法を見つけることを促します2。しかし、これまでに開発された多くのin vitroモデルは、人間の生体器官の動的な性質を再現するために必要な生物学的構造、細胞の複雑さ、および機械的環境を欠いています3,4。
従来のin vitro前臨床システムでは、通常、硬質プラスチック表面上で増殖したヒト細胞の2D単培養が使用されます。これらの方法は、簡単な機構研究を行うためのツールを提供し、医薬品候補の迅速なスクリーニングを可能にします。2Dモデルは比較的低コストで堅牢性が高いため、自動ハイスループットシステムと組み合わされることが多く、医薬品開発プロセスの初期段階で潜在的な医薬品候補を迅速に特定するために使用されます5,6。しかし、このような2Dモデルは、治療薬候補に対する組織レベル、臓器レベル、または全身反応をモデル化するためのトランスレーショナルアプローチを提供しておらず、開発の前臨床段階での医薬品の安全性と有効性を正確に予測する必要があります。フラットセル培養では、複雑な多細胞相互作用、生体力学的特性、ヒト組織の3次元(3D)構造など、天然の組織の微小環境を再現することはできません7。平坦な表面上で増殖する細胞は、成熟した表現型を獲得しないことが多く、したがって、天然組織の場合のように薬理学的刺激に応答することができません。例えば、in vitroで増殖した初代ヒト肺胞上皮細胞は、扁平上皮表現型を示し、サーファクタントタンパク質CおよびB(SP-CおよびSP-B)8を含む重要な表現型マーカーを失います。不十分な分化に加えて、初代細胞は、組織の炎症に関連する特定の生化学的経路が機能しなくなるため、in vitroで生物学的ストレッサーに対して鈍感になることがよくあります9。このような細胞機能の喪失は、主に硬い基質の使用と、肺線維芽細胞や平滑筋細胞などの組織特異的間質細胞によって自然に放出される可溶性因子の欠如に関連しているようです10,11。
化学的物理的および生物学的複雑さの欠如がin vitroでの細胞の生理学的挙動を制限することを理解することで、より洗練された多細胞モデルの開発が促進され、体外のヒト組織の複雑さをよりよく捉えることが証明されています12,13。1970年代初頭に最初の共培養モデルが作成されて以来14、合成および天然のヒドロゲルの導入により、天然の組織微小環境を模倣する能力が大幅に向上し、細胞分化を促進し、細胞の自己組織化を組織様構造に導き、天然の組織機能を回復するための貴重なツールになりました15,16.例えば、適切な3D足場で増殖させると、ヒト細胞はスフェロイドやオルガノイドなどの機能的な構造に自己配列し、幹細胞マーカーを発現し、自己複製することができます17。対照的に、ヒト細胞(幹細胞を含む)は、従来の2D基質上で増殖すると、急速に老化し、数回継代した後に老化を受ける18。さらに、ヒドロゲルは、多孔性、孔径、繊維の太さ、粘弾性、トポグラフィー、剛性などの特定の組織特性に合わせて「調整」することも、組織由来の細胞成分および/または生理活性分子でさらに操作して、生理学的または病理学的状態のエミュレーションを可能にすることもできます19,20.医薬品研究で使用される3Dヒドロゲルベースのモデルは、薬物試験の大きな可能性を秘めているにもかかわらず、in vivo組織の複雑な細胞構造を完全に再現しておらず、静水圧、周期的伸張、流体せん断など、人体に通常存在する重要な血行動態および機械的刺激を欠いています21。
臓器チップ(OOC)などの微小生理学的システム(MPS)は、インビトロで複雑な生理学的応答をキャプチャできるツールとして最近登場しました22,23。これらのモデルは、多くの場合、生体の動的な微小環境のモデリングを可能にするマイクロ流体プラットフォームの使用を採用しています。
3D組織バイオエンジニアリングとメカノバイオロジーの原理を組み合わせて、複雑なヒト上皮組織のオープントップチップモデルを作成しました。これにより、上皮組織の多細胞で動的な微小環境を詳細に再現することができました。これには、生体器官に自然に存在するが、従来のin vitroモデルでは無視されることが多い組織特異的な生化学的および生体力学的手がかりが含まれます24。Open-Top Chipには、多孔質膜で区切られた血管コンパートメント(図1A)と間質コンパートメント(図1B)の2つのコンパートメントが組み込まれており、2つのチャンバー間で栄養素を拡散させることができます(図1C)。血管コンパートメントは、生理学的せん断応力を再現するために連続的な流体の流れにさらされ、間質チャンバーの伸縮性のある設計により、呼吸運動または腸の蠕動運動に関連する機械的ひずみのモデリングが可能になります。間質コンパートメントには、組織特異的線維芽細胞の生理学的成長をサポートするように設計された調整可能な3Dヒドロゲル足場が収容されています。これは、空気 - 液体界面の確立を容易にする取り外し可能な蓋を有し、粘膜組織のヒト生理機能のより大きなエミュレーションを可能にする条件、ならびに上皮層に直接薬物を投与するための組織への直接アクセスを可能にする。補足図1は、寸法や生物学的コンパートメント(補足図1A-D)を含むオープントップチップ設計の主要コンポーネントのいくつかと、このプロトコルで説明されている主な技術的ステップ(補足図1E)を示しています。
オープントップチップの灌流は、プログラム可能な蠕動ポンプで実現されます(図1D)。ペリスタルティックポンプのセットアップにより、12個のオープントップチップを同時に灌流できます。ほとんどのインキュベーターは、インキュベーターあたり最大24チップの培養を可能にする2つのセットアップを収容できます。機械的延伸は、カスタムメイドのプログラム可能な真空圧力調整器を使用して実現されます(図1E)。これは、デジタル-アナログコンバータによって電子的に制御される電空真空レギュレータで構成されています。言い換えれば、電空真空レギュレータは、ユーザーが決定する振幅と周波数を持つ正弦波真空プロファイルを生成します。0%から15%の範囲の周期ひずみは、0〜-90kPaの範囲の振幅と0.2Hzの周波数でオープントップチップの真空チャネルに負圧を加えることによって生成されます。これは、以前に採用され、他の論文25に記載されている市販のFlexcellひずみユニットと同等のカスタムメイドのシステムです。例えば、肺の呼吸運動や腸の蠕動運動に関連する機械的組織変形を模倣するために、空気圧アクチュエータは正弦波真空/ひずみ波を適用し、その大きさと振幅は、ヒト細胞が本来の組織で経験する歪みと周波数の生理学的レベルに一致するように調整できます。
ここでは、プロトタイプのOpen-Top Chipプラットフォーム上で有機型上皮等価物をエンジニアリングおよび培養するための効率的で再現性のある方法について説明します。これにより、血管液の流れと機械的伸張を統合しながら、皮膚、肺胞、気道、結腸などの複雑な臓器モデルを生成できます。複雑な上皮モデルを生成するための組織工学の原理を実装する際に考慮しなければならない重要な技術的側面を概説します。現在の設計の利点と考えられる制限について説明します。
流れとストレッチのパラメーターを含む、組織と臓器の成熟を達成するために使用される主なステップの概要は、皮膚の場合の図2、肺胞の場合の図3、気道の場合の図4、および腸の場合の 図5で報告されています。 異なる臓器モデルの培養に使用される培地組成および試薬に関する追加情報は、補足表に含まれています(皮膚については補足表1;肺胞の補足表2;気道については附則表3、腸については附則表4)。
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Protocol
ヒトコロノイドは、シンシナティ小児病院の施設バイオセーフティ委員会(IBC 2017-2011)のガイドラインに従って腸切除から取得されました。
1.表面活性化
- 活性化バッファーの調製
- 架橋剤と溶媒緩衝試薬をバイオセーフティキャビネット(BSC)の下に置き、室温(RT)で10分間平衡化してから使用してください。
- 架橋剤溶液を直接光曝露から保護するために、滅菌非透光性容器またはアルミニウム箔で包まれた透明な15 mLコニカルチューブを使用して、5 mLの溶媒バッファー中で5 mgの架橋剤を再構成します。
- 溶液を1分間ボルテックスしてすべての凝集塊を除去した後、50 μLの架橋剤溶液をチップのボトムチャネルに直接ピペットで入れ、150 μLをオープントップチャンバーにピペットで入れます。
- アスピレーターを使用して、チップの表面から余分な架橋溶液を取り除きます。次に、追加の50 μLの架橋溶液をチップの底部チャネルに直接ピペットで送り、150 μLをオープントップチャンバーにピペットで入れて、残っている気泡を取り除きます。
- UV架橋機による活性化
- BSCの下のチップから蓋をそっと取り外し、滅菌容器に保管します。
- 架橋剤溶液を含むチップをペトリ皿に移し、汚染を避けるためにペトリ皿を閉じて、チップの入った皿をUV架橋機の下に置きます。
注意: ペトリ皿の蓋を取り外して、UV露出を最大化します。 - ピーク波長365nmのUV架橋機を100μJ/cm2の強度にセットし、UV光を20分間オンにします。
注:20分間のUV処理後、架橋剤溶液はより暗く(茶色)に見えます。 - チップをBSCの下に戻し、酸化された架橋剤溶液を吸引します。次に、すべてのチップを溶媒バッファーで3回すすぎ、チップをBSC下で5〜10分間乾燥させて、ポリジメチルシロキサン(PDMS)表面の化学官能基化を完了します。
2.間質等価物の準備
- 10x再構成バッファー(100 mL)の調製
- 2.2 gの重炭酸ナトリウムを75 mLの0.067 M NaOHに二重蒸留水に溶解します。
- 4.76 gのHEPESを追加し、二重蒸留水を使用して容量を100 mLにします。
- 0.22 μmメンブレンを備えた使い捨て滅菌ボトルトップフィルターを使用して、BSC下の溶液を滅菌ろ過します。
注:この溶液は、4°Cで保存した場合、約6か月間安定です。
- プレゲル溶液量の推定
- 実験に必要なチップ数に150 μL(中央のオープントップチャンバーの内容積)を掛けて、実験に必要なプレゲル溶液の量を推定します。
必要量=(チップ数×150)μL - 選択した細胞を含む1容量の10x EMEM、1容量の10x再構成バッファー(ステップ2.1を参照)、8容量のコラーゲンI溶液(10 mg / mL)、およびコラーゲンI1 mgあたり1 μLの1 N NaOH溶液を混合して、氷上でコラーゲンプレゲル溶液を調製します。
注:実験エラーを考慮して、追加の+ 15%ボリュームを準備することをお勧めします。セクション2.2で説明した例は、12個のチップと追加の15%容量に十分なプレゲル溶液を調製するための詳細なステップバイステップの手順を提供します。
- 実験に必要なチップ数に150 μL(中央のオープントップチャンバーの内容積)を掛けて、実験に必要なプレゲル溶液の量を推定します。
- 間質当量のプレゲル溶液の調製(12チップ用)
- 氷上のBSCの下に次のソリューションをもたらします:10x EMEM;10x再構成バッファ(ステップ2.1を参照)。コラーゲンI溶液(10 mg / mL);滅菌1 N NaOH溶液。
- プロバイダーの指示に従って組織特異的間葉系細胞を80%〜90%コンフルエントになるまで培養し、次に細胞プロバイダーが推奨するトリプシンまたはその他の方法を使用して細胞を解離します。250 x g で24°Cで5分間遠心分離することにより、細胞をペレットに回収します。
- 細胞ペレットを225 μLの氷冷10x EMEMに再懸濁し、225 μLの氷冷10x再構成バッファーを追加します(ステップ2.1を参照)。上下に静かにピペッティングして溶液を混合し、氷冷コラーゲンI溶液1,800 μLを加えます。
- 氷上でプレゲル溶液を混合するために気泡を避けて、5〜6回ピペットで上下させます。
- 間質等価チップの組み込み(12チップ用)
- プレゲル溶液を18 μLの1 N NaOHで中和します。5〜6回上下にピペッティングして穏やかに混合し、気泡を避けて150μLの細胞含有ヒドロゲルをオープントップチップの中央チャンバーにピペットで入れます。
注意: マイクロパターニングが必要な場合は、次の手順(セクション3)に進んでください。 - 各ペトリ皿に2 mLの滅菌ddH2Oを充填した遠沈管キャップを含む、チップを別々のペトリ皿にグループ化し、インキュベーター内で37°C、5%CO2でペトリ皿をインキュベートします。
注:90分後、細胞を含んだヒドロゲルは完全に重合します。
- プレゲル溶液を18 μLの1 N NaOHで中和します。5〜6回上下にピペッティングして穏やかに混合し、気泡を避けて150μLの細胞含有ヒドロゲルをオープントップチップの中央チャンバーにピペットで入れます。
3. 表面マイクロパターニング(オプション)
- 3Dプリントされたスタンプを使用して、中和コラーゲンヒドロゲル(まだ液体状態)をピペッティングした後、間質ヒドロゲルの表面マイクロパターニングを実行します。
注:3Dプリントされたスタンプは、前述の他の場所24のように、さまざまなカスタマイズ可能なデザインで入手できます。 - 中和コラーゲンIプレゲル溶液20 μLを滅菌3Dプリントスタンプのパターン表面にピペットで固定し、間質ヒドロゲルが液体のままでオープントップチャンバーの内側(上部)にスタンプを挿入します。
- アスピレーター(またはピペット)を使用して、オープントップチャンバーの上部からこぼれる可能性のあるヒドロゲルの残留物を取り除きます。すべてのチップを別々のペトリ皿にグループ化し、各ペトリ皿に2 mLの滅菌ddH2Oを充填した遠心分離機15 mLコニカルチューブキャップを含めます。
- すべてのペトリ皿を37°C、5%CO2 で90分間インキュベートしてから、チップをBSCの下に戻し、精密ピンセットを使用してスタンプをそっと取り除き、ヒドロゲルを損傷するリスクを減らします。
4.上皮および血管表面を組織特異的ECMタンパク質でコーティングする
- 血管マイクロ流体チャンバーを細胞外マトリックスタンパク質でコーティングする
- 実験に必要なチップ数に20 μL(血管チャネルの体積)を掛けて、実験に必要な血管ECMコーティング溶液の体積を推定します。
必要量=(チップ数×20)μL
注意: 実験エラーを考慮して、追加の15%ボリュームを準備することをお勧めします。 - 氷冷PBSまたはHBSSを使用して、すべてのチップ用の血管ECMコーティング溶液を調製します(たとえば、12チップあたり300 μL)。
注意: 補足資料セクションの特定の臓器プロトコル表を参照してください(皮膚については補足表1 ;肺胞の 補足表2 ;気道については補足 表2 、および腸については 補足表4 )を特定して、特定の試薬および推奨されるECM組成物を同定した。 - 20 μLの血管ECMコーティング溶液を各チップの血管チャネルにピペットで入れます。
- 実験に必要なチップ数に20 μL(血管チャネルの体積)を掛けて、実験に必要な血管ECMコーティング溶液の体積を推定します。
- 間質等価物の頂端表面を細胞外マトリックスタンパク質でコーティングする
- 実験に必要なチップ数に50 μL(血管チャネルの体積)を掛けて、実験に必要な上皮ECMコーティング溶液の体積を推定します。
必要量=(チップ数×50)μL
注:実験エラーを考慮して、追加の15%ボリュームを準備することをお勧めします。 - 氷冷PBSまたはHBSSですべてのチップに十分なECMコーティング溶液(たとえば、12チップあたり750 μL)を調製し、50 μLの上皮ECMコーティング溶液をヒドロゲル表面の上に直接移します。
注意: 補足資料セクションの特定の臓器プロトコル表を参照してください(皮膚については補足表1 ;肺胞の 補足表2 ;気道については補足 表2 、および腸については 補足表4 )を特定して、特定の試薬および推奨されるECM組成物を同定した。 - 各ペトリ皿に2 mLの滅菌ddH2Oを充填した遠心分離機15 mLコニカルチューブキャップを含む別々のペトリ皿にチップをグループ化し、上皮細胞の播種を進める前に、37°C、5%CO2 のインキュベーター内でペトリ皿を2時間インキュベートします。
- 実験に必要なチップ数に50 μL(血管チャネルの体積)を掛けて、実験に必要な上皮ECMコーティング溶液の体積を推定します。
5.間質等価物に上皮細胞を播種する
- 上皮細胞培養
- 組織特異的上皮細胞を80%〜90%コンフルエントになるまで提供者の指示に従って培養する。
- 細胞提供者が推奨するタンパク質分解酵素手順を使用して細胞を解離します。
注:最良の結果を得るには、上皮細胞が70%〜90%のコンフルエントに達する活発な成長期に、低継代(P1-P2)で上皮細胞を採取します。 - 解離したら、細胞を遠心分離し、ペレットとして収集します。
- 特定の臓器プロトコル表に示されているように、上皮細胞を適切な細胞/フラグメント密度に再懸濁します。.
注:この研究では、細胞溶液は、皮膚に3 x 10 6細胞/ mL、肺胞に1 x 10 6細胞/ mL、気道に6 x 10 6細胞/ mL、腸に8 x 10 6フラグメント/ mLの密度で使用されました。
- 上皮細胞播種
- チップをインキュベーターからBSCに移します。血管チャネルからコーティング溶液を吸引し、血管マイクロ流体チャネルを50μLの新鮮な内皮細胞培養培地で3回リンスする。
- ヒドロゲル表面からコーティング溶液を吸引し、間質表面を100 μLの新鮮な上皮細胞培養培地で3回すすぎ、余分なコーティング溶液を除去します。
- 上昇培地を吸引し、補足表に示されているように、適切な細胞密度を使用して50 μLの上皮細胞懸濁液をヒドロゲル表面に播種し、チップをインキュベーターに2時間(またはコロノイドの場合は一晩)戻します。
- ヒドロゲル表面を細胞培養培地で2回穏やかにすすぎ、細胞の破片を取り除きます。最後に、密閉されたオートクレーブ可能な容器でオートクレーブして培地をリフレッシュし、チップをペリスタルティックポンプに接続します。
6.チップをフローに接続する
- 流体部品の準備
- 2インチの生体適合性ポリプロピレンベースの熱可塑性エラストマー(TPE)トランスファーチューブ(材料表)を切断して、チップをメディアリザーバーに接続するために必要な短いマイクロ流体チューブを準備します。
- 7.5インチの生体適合性TPEトランスファーチューブを切断して、長いマイクロ流体チューブを製造します。
- 十分な18Gおよび19Gの金属コネクタを準備します(材料表)。
注意: オープントップチップをペリスタルティックポンプに接続する少なくとも1日前に、手順6.1.1および6.1.2で説明されているチューブとコネクタを準備して滅菌することをお勧めします。 - 各培地リザーバーの蓋を4インチの皮下注射針で突き刺します(材料表)。
- 中程度の脱気
- 細胞培養培地を室温(RT)まで平衡化させます。
- 必要な量の培地を円錐形のろ過管に移します。
- -20 PSIの負真空圧力を適用して、媒体を脱気します(真空駆動ろ過)。
注:真空が利用できない場合は、細胞培養培地をインキュベーター内で一晩平衡化させて、同様の結果を得ることができます。
- 流体の流れのためにオープントップチップを準備する
- チップと滅菌流体部品をBSCの下に持ってきて、流体の流れを開始する前に、オープントップチップの蓋(上部)を合わせてオープントップチップのプロトタイプを密閉します。
- 脱気した細胞培養培地200 μL(臓器固有の表を参照)を、気泡を避けるように注意しながら、チップの上部チャネルと下部チャネルの両方の入口ポートにピペットで入れます。
- 300 μLの培養液を短いマイクロ流体チューブにピペットで入れてチューブの内面をプライミングし、短いチューブをチップの上部チャネルと下部チャネルの入口に接続します。
- マイクロ流体表面の接続とプライミング
- 培地リザーバーをファームラックに配置し、皮下注射針をチップの下部入口に接続し、最後に、インキュベーター内のハウジングキャリアにすべてのチップを収容します。
- チップをペリスタルティックポンプに接続し、すべてのコネクタを検査して、すべてのチップが正しく接続され、細胞培養培地の目に見える漏れがないことを確認します。
- ポンプの パージ ボタンを使用して、約15秒間、または細胞培養培地の液滴が流出チューブの端に現れるまで保持します。
- ポンプの制御システムを使用して、適切な臓器チップ流量を設定します(図2、図3、図4、および図5)。
7.チップのメンテナンス
- 臓器チップのメンテナンス
- 上皮および/または内皮用の新鮮な細胞培養培地を準備し、脱気ステップを実行します(ステップ6.2で前述)。
- ペリスタルティックポンプを一時停止し、チップをポンプから慎重に外し、チップハウジングキャリアを引き出します。チップをインキュベーターからBSCに移し、リザーバーに残っている大量の培地を取り除きます。
- 細胞培養培地を上部と下部の入口リザーバーに5 mLの新しい細胞培養培地と交換し、チップハウジングキャリアをインキュベーターに戻します。チップを蠕動ポンプに接続し、流れを再開します。
注意: パージ 機能を使用して、媒体を血管コンパートメントにすばやくリフレッシュし、気泡のリスクを減らすことをお勧めします。 - 図2、図3、図4、および図5に従って、手順7.1.1〜7.1.3を1日おきに繰り返します。
- 気液界面(ALI)の確立
- ペリスタルティックポンプを一時停止し、チップをポンプから慎重に外し、チップハウジングキャリアを引き出します。チップをインキュベーターからバイオセーフティキャビネットに移し、上部のリザーバーに残っている培地の量を取り除きます。
- 上部のマイクロ流体チャネルからすべての媒体を穏やかに吸引し、バインダークリップを使用して上部の入口に接続された短いマイクロ流体チューブをクランプして、媒体の蒸発とALIの維持を減らします。
- オープントップチップをハウジングキャリアに戻し、インキュベーターに戻し、チップをペリスタルティックポンプに再接続します。
注意: パージ 機能を使用して、媒体を血管コンパートメントにすばやくリフレッシュし、気泡のリスクを減らすことをお勧めします。 - 蠕動ポンプを始動して流れを再開します。
- ストレッチ(オプション)
- ペリスタルティックポンプを一時停止し、チップごとに2本の長いマイクロ流体チューブを使用して、チップの真空ポートを真空モジュールに接続します。
- 真空モジュールを使用して、臓器プロトコルテーブル内で指定されている各臓器に推奨される条件にストレッチ設定を調整します:皮膚の 補足表1 。肺胞の 補足表2 ;気道の 補足表2 ;腸についての 補足表4 。
- チューブの接続を目視検査して、すべてのチップが正しく接続されており、中程度の滴りの目に見える液滴がないことを確認します。
- 蠕動ポンプを始動して流れを再開します。
8.血管コンパートメントに内皮細胞を播種する
- 血管細胞播種用の細胞とチップを準備する
- 組織特異的内皮細胞を、提供者の指示に従って、80%〜90%コンフルエントになるまで培養する。タンパク質分解酵素手順(プロバイダーが推奨)を使用して細胞を解離し、最後に内皮細胞を3 x 106 細胞/ mLの溶液に再懸濁します。
注:最良の結果を得るには、内皮細胞が2%〜4%のコンフルエントに達する活発な成長期に、低継代(P70-P90)で内皮細胞を収穫します。 - 蠕動ポンプを一時停止します。チップをインキュベーターからBSCに移し、チップをメディアリザーバーと接続されているチューブから外してから、チップを別々のペトリ皿にグループ化します。
- 上皮区画の細胞培養培地を新鮮な上皮細胞培養培地でリフレッシュする。新鮮な内皮細胞培養培地で血管チャネルを2回すすぎ、次いで血管コンパートメントから培地を吸引する。
- 組織特異的内皮細胞を、提供者の指示に従って、80%〜90%コンフルエントになるまで培養する。タンパク質分解酵素手順(プロバイダーが推奨)を使用して細胞を解離し、最後に内皮細胞を3 x 106 細胞/ mLの溶液に再懸濁します。
- 内皮細胞播種
- 底部(血管)チャネルに25 μLの内皮細胞懸濁液(3 x 106 細胞/mL)を播種し、チップを逆さまにして内皮細胞をマイクロ流体チャンバーの上面に付着させます。
注:チップあたり50 μLの細胞懸濁液を追加します(12チップあたり600 μL)。 - チップをペトリ皿にグループ化します。それらを37°C、5%CO2 のインキュベーターに戻し、内皮細胞を1時間付着させます。
- 1時間後、チップをインキュベーターからBSCに移します。血管チャネルを内皮細胞培養培地で2回すすぎ、細胞残骸を除去する。
- 手順8.2.1〜8.2.2を繰り返して、血管チャネルに内皮細胞をもう一度播種し、チップを平らに置いて、血管チャネルの底面への内皮細胞の接着を促進します。
- 底部(血管)チャネルに25 μLの内皮細胞懸濁液(3 x 106 細胞/mL)を播種し、チップを逆さまにして内皮細胞をマイクロ流体チャンバーの上面に付着させます。
- チップをフローに再接続します
- BSCの下で脱気された血管細胞培養培地で血管培地リザーバーを満たします。
- チップをチップハウジングキャリア内に戻し、チップを一方の端の媒体リザーバーに再接続し、もう一方の端のペリスタルティックポンプに再接続します。
注意: パージ 機能を使用して、媒体を血管コンパートメントにすばやくリフレッシュし、気泡のリスクを減らすことをお勧めします。 - マイクロ流体接続を目視検査して、すべてのチップが正しく接続されており、媒体の滴りの目に見える液滴がないことを確認します。次に、蠕動ポンプを始動して流体の流れを再開します。
9. 一般的なエンドポイントアッセイ
- エンドポイントアッセイ用のチップの切断
- ペリスタルティックポンプを一時停止し、チップをポンプから慎重に外し、チップハウジングキャリアを引き出します。チップハウジングキャリアをインキュベーターからBSCに移し、チップを解放します。
- Open-Top Chipの中央チャンバーを上皮細胞培養培地で、血管チャネルを内皮培養培地で2回穏やかに洗浄し、細胞の破片を取り除きます。
- オープントップチップの蓋を取り外し、ピンセットを使用してチップの頂端コンパートメントにアクセスします。
- 蛍光顕微鏡のための免疫染色
- 従来のサンプルの固定、透過処理、ブロッキングを進めます。
注:この研究では、サンプルを200 μLの4%パラホルムアルデヒド(PFA)で1時間固定した後、PBSですすぎ、0.1%Triton X-100で40分間透過処理し、1%ウシ血清アルブミンで1時間ブロッキングしました。 - チップを一次抗体(材料表)とともに4°Cで一晩インキュベートします。次に、チップの上皮コンパートメントと内皮コンパートメントの両方を200μLのPBSで2回洗浄します。その後、適切な二次抗体を2時間進めます。
注:一次抗体と二次抗体をPBS + 1%BSAで1:100(一次抗体)および1:200(二次抗体)の希釈で希釈します。
- 従来のサンプルの固定、透過処理、ブロッキングを進めます。
- 免疫組織化学
- ピンセットを使用してOpen-Top Chipのメインチャンバーからストロマ等価物を抽出し、10%中性緩衝ホルマリンで満たされた1.5 mLチューブに集め、少なくとも24時間インキュベートします。
- 固定ストローマ相当物をティッシュプロセッサーに移し、以下の手順に従って最適なサンプル脱水を実現します。
- ヒドロゲルを70%エタノールに90分間浸します。
- 70%エタノールを除去し、ヒドロゲルを80%エタノールに90分間沈めます。
- 80%エタノールを除去し、ヒドロゲルを95%エタノールに90分間沈めます。
- 95%エタノールを除去し、ヒドロゲルを100%エタノールに90分間2回沈めます。
- 100%エタノールを除去し、ヒドロゲルをキシレン溶液に120分間2回沈めます。
- キシレン溶液を除去し、処理した間質当量をパラフィンワックスに120分(~2時間)2回浸透させます。
- 浸潤した間質等価物をセクショニングパラフィンブロックに埋め込みます。
- この時点で、間質等価物をミクロトームを用いてパラフィンブロックとして切片化し、従来の組織学的手法に従って処理することができる26。
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Representative Results
表面マイクロパターニング
細胞外マトリックス(ECM)のマイクロパターニングは、腸陰窩界面の空間的構成を複製するために使用することができる。Open-Top Chipの構成を変更して、結腸上皮-間質界面の自然なトポグラフィー(図6A、B)とマイクロメートルスケールの腸陰窩(図6C-E)を模倣するように特別に設計されたマイクロパターンスタンプを統合することができます。皮膚、気道、肺胞のモデルには平らな(パターン化されていない)表面を使用したことに注意してください。このスタンプをこの際に用いて、種子上皮細胞に対して均一なヒドロゲル表面を得た。私たちは、腸の陰窩を模倣した正と負のドームの交互からなる、人間の腸粘膜の自然な構造を模倣できるデザインを選択しました。
臓器モデル
Open-Top Chipのプロトタイプを使用して、4つの異なる上皮(皮膚、肺胞、気道、腸)を培養および分化させ、この生体模倣プラットフォームの汎用性を証明しました。臓器チップの組織学的切片は、表現型的に区別され、以下を代表する上皮細胞の存在を確認します:皮膚の場合は層状上皮(図7)、気道の場合は疑似層状柱状上皮(図8 および 補足ビデオ1)、肺胞の場合は単純な扁平上皮(図9)、 腸の場合は単純な円柱上皮(図10)。皮膚、気道、および肺胞細胞はすべて、市販のベンダーから入手しました( 材料表に指定されているとおり)。
図1:オープントップチップとこの研究で使用されたマイクロ流体セットアップの概略図。 (A-C)マイクロ流体チャネル(青)、培養室の横にある2つの半月真空チャネル(灰色)、および下部のらせん状内皮微小流体チャネル(マゼンタ)を含むプロトタイプのOpen-Top Chip設計を示すトップビュー、レイヤーごとの投影、および3Dレンダリング。(D)チップ収容担体(赤矢印)、蠕動ポンプ、リザーバー(黄色矢印)を含む特注のチップホルダー(別名「ファームシステム」)を、共通の細胞培養インキュベーターに収まる構成で配置したもの。€空気圧アクチュエータは、チップの真空チャネルに加えられる負圧を制御する機器であり、呼吸または蠕動運動(ストレッチ)中に細胞が経験する周期的な機械的力を生成するために使用されます。この図は、Varoneらの許可を得て翻案されています24。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:オープントップスキンチッププロトコルの技術概要 。 (A)オープントップスキンチップ調製のための一連の作用を示す概略図、および(B)オープントップスキンチップ培養の重要な生物学的ステップを提供する。チップ調製の初期段階では、間葉系細胞(線維芽細胞)をゲルに埋め込み、Open-Topチップに装填して間質層を形成し、これを2〜4時間コーティングし、上皮細胞を播種します。上皮細胞がコンパクトな単層を形成すると、それらは空気(ALI)にさらされる。生物学的システムは、14日目に分析のために犠牲にされるまでALI体制下に保たれます。機械的ストレッチは、システムが流れている間、およびALIで適用できます。伸張は、分析のために組織が犠牲になるまで保持されます。培地組成、特定の試薬、および細胞タイプに関する追加情報は、 補足表1に記載されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:オープントップ肺胞チッププロトコルの技術的概要 。 (A)オープントップ肺胞チップ調製のための一連の作用を示す概略図、および(B)オープントップ肺胞チップ培養の重要な生物学的ステップを提供する。チップ調製の初期段階では、間葉系細胞(線維芽細胞)をゲルに埋め込み、Open-Topチップに装填して間質層を形成し、これを2〜4時間コーティングし、KIADを添加した培地に気道上皮細胞を播種します( 補足表2を参照)。EGF添加培地は、上皮細胞の増殖をサポートするために~4日間維持されます。その後、上皮を空気(ALI)に~10日間さらし、組織を完全に成熟させます。肺微小血管内皮細胞は14日目に播種され、生物学的系は21日目に分析のために犠牲にされるまでALIおよびフローレジーム下に保たれます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:オープントップ気道チッププロトコルの技術的概要 。 (A)オープントップ気道チップ調製のための一連の作用を示す概略図、および(B)オープントップ気道チップ培養の重要な生物学的ステップを提供する。チップ調製の初期段階では、間葉系細胞(線維芽細胞および/または平滑筋細胞)をゲルに埋め込み、Open-Top Chipにロードして間質層を形成し、これを2〜4時間コーティングし、EGFを添加した培地に上皮細胞を播種します( 補足表3を参照)。EGF添加培地は、上皮細胞の増殖をサポートするために~4日間維持されます。その後、上皮を空気(ALI)に~10日間さらし、組織を完全に成熟させます。肺微小血管内皮細胞は14日目に播種され、生物学的系は21日目に分析のために犠牲にされるまでALIおよびフローレジーム下に保たれます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:オープントップ腸チッププロトコルの技術的概要 。 (A)オープントップ腸チップ調製のための一連の作用を示す概略図、および(B)オープントップ腸チップ培養の重要な生物学的ステップを提供する。チップ調製の初期段階では、間葉系細胞(結腸線維芽細胞)をゲルに埋め込み、オープントップチップに装填して間質層を形成し、これを2〜4時間コーティングし、臨床切除から得られた上皮性コロノイドの断片を播種する。サプリメント(ROCKおよびCHIR、 補足表4参照)を含む細胞培養培地は、コロノイド細胞の生存率および生理学的形態を維持するために播種工程中に必要とされる。次に、結腸上皮の拡大(1日目から6日目)と成熟(6日目から9日目)を促進するために、さまざまな培地が使用されます。結腸微小血管内皮細胞は、内皮細胞培養培地(EGM2 MV)を使用して6日目に播種され、その後、上皮拡張培地でさらに最大10日間フロー下で培養されます。上皮は10日目からALIに曝露され、上皮細胞の成熟をさらに促進します。機械的伸張は、13日目からシステムに適用し、エンドポイント分析のために臓器モデルが犠牲になる16日目まで維持することができます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:マイクロパターンスタンピング。 (A)マイクロスケールのテクスチャ(高さ500μm、幅250μmのピラーアレイ)を示すスタンプの側面図と上面図を使用して、結腸陰窩組織界面を再現し、スタンプチップアセンブリの上面図と側面図を示し、ゲル表面のキャストに使用した場合の2つの要素のフィッティングを示します。(B)スタンプとチップのインターフェースを示す斜めの側面図。(C-E)細胞の有無にかかわらず、マイクロパターン化されたゲル表面の画像。スケールバー:200μm。この図は、Varoneらの許可を得て翻案されています24。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図7:オープントップスキンチップで得られた代表的なデータ 。 (A)オープントップスキンチップ調製の一連の作用を示し、オープントップスキンチップ培養の主要な生物学的ステップを提供する概略図。(B)PCNAサイトケラチン14、サイトケラチン10、インボルクリンおよびフィラグリン蛍光染色およびH&Eは、オンチップで分化した成熟多層層状表皮を示す。スケールバー:100 μm。 (C)真皮層内部の線維芽細胞の存在を示すスキンチップ(スケールバー:5 mm)とH&E断面(スケールバー:100 μm)の上面図。(D)PECAM-1、VE-カドヘリンおよびフォンビルブランド蛍光染色により、オープントップスキンチップで共培養したヒト微小血管内皮細胞の分化を示す。スケールバー:20μm。 (E)オープントップスキンチップの3D漫画コンセプトレンダリング。この図は、Varoneらの許可を得て翻案されています24。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図8:オープントップ気道チップで得られた代表的なデータ 。 (A)オープントップ気道チップ調製のための一連の作用を示し、オープントップ気道チップ培養の重要な生物学的ステップを提供する概略図。(B)MUC5AC(ゴブレット)、αおよびβ-チューブリン(繊毛細胞)、クララ細胞タンパク質16(クラブ細胞)、p63(基底/前駆細胞)および成熟気道上皮を示すZO-1蛍光染色。スケールバー:20μm。 (C)拍動繊毛の存在を示す位相差ビデオ/画像。スケールバー:50 μm。 (D)H&E染色(スケールバー:20 μm)およびTEM画像(スケールバー:5 μm)は、オンチップで分化した成熟した疑似層状上皮を示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図9:オープントップ肺胞チップで得られた代表的なデータ 。 (A)オープントップ肺胞チップ調製のための一連の作用を示し、オープントップ肺胞チップ培養の重要な生物学的ステップを提供する概略図。(B)タイプI(HTI-56、AT1-α)、タイプII(HTII-280、LAMP3、ABCA3、界面活性剤(C)およびE-カドヘリン蛍光染色は、オンチップの成熟肺細胞の存在を示します。スケールバー:20μm。 (C)成熟肺胞表現型の証拠の微絨毛およびリソソーム小胞の存在を示すSEMおよびTEM画像。スケールバー:5 μm。 (D)H&E断面(スケールバー:5μm)は、タイプI表現型と一致する平坦な扁平上皮細胞およびタイプII表現型と一致する直方体の石畳のような細胞の存在を確認し、(E)真皮層内の線維芽細胞の存在を示す(スケールバー:10μm)。(F)オープントップ肺胞チップの3D漫画コンセプトレンダリング。この図は、Varoneらの許可を得て翻案されています24。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図10:オープントップ腸チップで得られた代表的なデータ。 (A)オープントップ腸チップ調製のための一連の作用を示し、オープントップ腸チップ培養の重要な生物学的ステップを提供する概略図。(B)ゲルキャスティング段階中のスタンプとチップのアセンブリを示す斜めの側面図、マイクロパターン化されたゲルの漫画の概念、およびゲル表面にマイクロパターン化され、2つの異なる高さでコロノイドが播種されたクリプト様構造の位相差画像。スケールバー:200 μm。 (C)ムチン2およびE-カドヘリン蛍光染色により、オンチップの腸細胞および成熟杯細胞の存在を示す。スケールバー:200 μm。 (D)真皮層の内側の線維芽細胞の存在を示し、単純な柱状上皮の存在を確認する陰窩様構造のH&E断面。スケールバー:100 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足ビデオ1:繊毛を叩く位相差ビデオ。 スケールバー:100 μm。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図1:オープントップチップアセンブリ。(A)オープントップチップアセンブリの3次元レンダリングと、上皮(青)、真皮(黄色)、血管(赤)を含むさまざまな生物学的コンパートメントが強調表示されたオープントップスキンチップの漫画レンダリングを示す概略図。(B)組み立てられたマイクロ流体プラットフォームは、35mm×17mmフォーマット、0.32cm2の組織培養領域、底部スパイラルマイクロ流体チャネル、およびマイクロ流体チャネルを有するチャンバー蓋を有する。(C)プラットフォームは、膜の高さで直径6mm、PDMSチャンバー壁の上部で5.7mm、高さ4mm、幅4mmの5度の角度の壁を有するチャンバで構成されています。多孔質膜の厚さは50μmで、細孔の直径は7μmです。(D)底部螺旋状のマイクロ流体チャネルは、断面寸法が400μm(高さ)×600μm(幅)である。(E)実験タイムラインの概要とオープントップオルガンチップの準備に必要な手順。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足表1:皮膚。 この表は、オープントップスキンチップ培養の3つのフェーズ(成長、増殖、および分化)で使用される主要な毎日のステップとストレッチおよびフローパラメータの要約を示しています。この表には、材料のリスト、培地の配合、およびこのプロトコルに必要な培地の調製方法に関する指示も記載されています。3つのメディアの構成は、プロトコルの異なるフェーズに合わせて最適化されています。具体的には、培地Iは、播種および初期ケラチノサイト培養期に最適化される。培地IIは、増殖および早期分化(層状上皮の形成)に最適化されている。ALI培地は、完全に分化した表皮が産生されるまで、ケラチノサイトを気液界面に維持するように最適化されています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足表2:肺胞。 この表は、オープントップ肺胞チップ培養の3つの段階(成長、増殖、および分化)で使用される主要な毎日のステップと伸張およびフローパラメータの要約を提供します。この表には、材料のリスト、培地の配合、およびこのプロトコルに必要な培地の調製方法に関する指示も記載されています。2つのメディアの構成は、プロトコルの異なるフェーズに合わせて最適化されています。細胞培養培地へのサプリメント(KIAD)の添加は、肺細胞の最適な分化を達成するために重要であることに注意してください。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足表3:気道。 この表は、オープントップ気道チップ培養の3つの段階(成長、増殖、および分化)で使用される主要な毎日のステップと伸張およびフローパラメータの要約を提供します。この表には、材料のリスト、培地の配合、およびこのプロトコルに必要な培地の調製方法に関する指示も記載されています。培地の組成は、気液界面で気道細胞を維持するために最適化されており、それが次に最終分化を誘導し、粘液の産生を刺激します。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足表4:腸。 この表は、毎日の主要なステップと、オープントップ腸チップ培養の3つのフェーズ(成長、増殖、および分化)で使用されるストレッチおよびフローパラメーターの要約を示しています。この表には、材料のリスト、培地の配合、およびこのプロトコルに必要な培地の調製方法に関する指示も記載されています。両方の媒体の組成は、プロトコルの異なるフェーズに合わせて最適化されています。具体的には、CHIRおよびROCK阻害剤を添加した膨張培地は、単層としての結腸オルガノイド断片の生存および成長を促進するため、播種および培養初期に最適化される。膨張培地は、上皮単分子膜の増殖および早期分化のために最適化されている。分化媒体は、気液界面に曝露される前の上皮単層の最終分化に最適化されています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
Open-Top Chipは、制御された微小環境において内皮、間質、上皮の間で発生する複雑な細胞相互作用をリアルタイムで調査するためのプラットフォームです。この技術は、流体せん断(流れ)、周期的伸張、マイクロパターニングによって達成される上皮表面トポグラフィの再構築など、ヒト組織の微小環境の再構成に関連する物理的および生化学的手がかりの統合など、従来の有機型およびオルガノイド培養 に比べて 重要な利点を提供します。このプラットフォーム内で増殖するヒト細胞は相乗効果を発揮して、免疫組織化学や上部および/または下部コンパートメントからの流出液(または排水)を使用した生化学的アッセイなど、従来の手法 で 分析できる組織特異的機能を再現します。現在の設計では、細胞が組織特異的線維芽細胞や他の間質細胞と直接接触して増殖する上皮層に容易にアクセスでき、上皮組織の多細胞構造を模倣しています。特に、Open-Top Chipプロトタイプは、他のオルガンオンチッププラットフォームの使用に関連する一般的な課題に対する実行可能なソリューションを提供します。間質コンパートメント内にいくつかの異なる細胞タイプを組み込むことができ、非常に複雑な3D組織の作成につながる一方で、従来のH&E染色を含む下流の分析のために、チップデバイスから確立された組織構築物を簡単に抽出することもできます。
現在の設計にはいくつかの制限があります。例えば、プロトタイプのOpen-Top Chipの血管マイクロチャネルと間質コンパートメント(ヒドロゲル)の間に介在する弾性膜は、ヒトの天然臓器において内皮組織を間質から分離する間質腔よりもかなり厚い(≈ 50 μm対≈ 1 μm)。弾性膜は、組織間の細胞間クロストークを媒介するホルモンやその他のパラクリン因子などの大きな分子の拡散に対する物理的な障壁を表すものではありませんが、直接的な細胞間相互作用および血管から間質コンパートメントへの細胞の移動を制限する可能性があります。最後に、プロトタイプのオープントップチップは、膨大な数の疎水性化合物を吸収することが知られているPDMSで作られています。この制限は、小型治療用化合物の薬力学および薬物動態を試験することを意図した用途において重大な障害となり得る多くのPDMSベースのプラットフォームによって共有されている27。
3DヒドロゲルをOpen-Top Chipなどのマイクロ流体デバイスに組み込む際の主な課題の1つは、PDMSがヒトタンパク質または細胞の結合に最適な基質を提供しないことです。したがって、PDMS表面の化学的機能化は、このプロトコルの重要なステップの1つであり、Open-Top Chipモデルのゲルチャンバーへの適切なECMコーティングとヒドロゲルの接着を確保するために必要です。最適な結果を得るには、ER1溶液中の架橋剤を常に光に直接さらさないように保護する必要があります。架橋剤の反応性を示す重要な指標はその色である。実際、ER1の架橋剤は、酸化すると鮮やかなオレンジ色から濃い茶色に色が変わります。色の変化は、UV活性化ステップ後の指標として使用して、溶液がPDMS表面と効果的に反応したかどうかを確認できます。架橋剤溶液の調製中は、色の変化を監視して、直接光に誤ってさらされても溶液中の化合物が光退色しないようにする必要があります。架橋剤溶液を保護し、不要な光退色を避けるために、約15 cm x 15 cmのアルミホイルを15 mLの円錐管に巻き付けるか、市販の琥珀色の管を使用することをお勧めします。ER1を使用することで、PDMS表面の迅速な機能化を達成するためのシンプルで効果的な方法が可能になります。ただし、ER1の代わりに使用できる他の分子があります。例えば、化学架橋剤3−アミノプロピル−トリメトキシシラン(APTMES)は、ER1ほど感光性ではなく、他の場所で以前に説明したように、いくつかの追加ステップで同様の結果を達成するために使用することができる28,29。選択した分子とは無関係に、化学架橋剤を使用する際の主な制約の1つは、細胞毒性を誘発する可能性のある残留物の存在です。活性化反応に続いて、マイクロ流体表面を大量の洗浄液ですすぐことが重要です。
気泡はチップ、チューブ、コネクタの疎水性界面内で形成および成長する傾向があるため、流体の流れを開始する前に、マイクロ流体経路に気泡がないかどうかを評価することが重要です。気泡は確かに流れを乱し、チップが流れに接続されているときに細胞を殺すことさえあります。流体の流れを開始する前にマイクロ流体コンポーネントをプライミングすることで、気泡が発生するリスクが軽減され、最適で再現性のある結果が得られます。このプロトコルに記載されているプライミングサイクルが十分でなかった場合は、マイクロ流体チューブをエタノール(5分)でリンスし、次にHBSS(20分)でリンスすると、流体コネクタ内に気泡が発生するリスクがさらに軽減されます。
PDMSは、その限界にもかかわらず、生体適合性が高く、透明で弾性の高いマイクロ流体デバイスの製造を可能にした化学的特性のまれな組み合わせを持っています。これらすべての特性により、PDMSは過去10年間でオルガンオンチップモデルの構築に最も広く適用された材料となっています。材料科学と化学工学の分野における最近の進歩30,31は、このプラットフォームのPDMSコンポーネントが近い将来、新しい合成ポリマーまたは生体材料に置き換えられる可能性があることを示唆しています。成功すれば、多孔性、ヒト天然組織に近い模倣を提供する間質腔のECM組成、薬理学研究のためのより高度なモデルなど、組織固有の特性の再現が可能になる可能性があります。Open-Top Chip設計の将来の進化により、これまでにない詳細レベルで人間の組織や臓器のモデリングが可能になると期待しています。
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Disclosures
著者は、潜在的な競合する利益と見なされる可能性のある以下の金銭的利益/個人的な関係を宣言します。 ヴァローネアントニオはEmulate Inc.の元従業員であり、Emulateの株式を保有している可能性があります。
Acknowledgments
何一つ
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x EMEM | Lonza | 12-684F | Medium; Stroma |
| 18 Gauge needle | MicroGroup | 316H18RW | Tube stainless steel 316 welded, 18RW Full Hard |
| 19 Gauge needle | MicroGroup | 316H19RW | Tube stainless steel 316 welded, 19RW Full Hard |
| 2-Stop PharMed BPT | Cole-Palmer | EW-95723-12 | Tube, 0.25 mm, 12/pack |
| 70% ethanol and wipes | - | - | For surface sterilization |
| 8-Bromoadenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt (8-Br-cAMP) | Sigma | B7880 | Medium supplement |
| A-83-01 | Tocris | 2939 | |
| Adenine | Sigma | A9795 | |
| Advanced DMEM/F12 | Thermo | 12634010 | |
| Airway Epithelial Cells | Lifeline Cell Technology | FC-0016 | |
| Aluminum foil | - | - | - |
| Alveolar cells | Cell Biologics | H6621 | |
| Anti-ABCA3 | ABCAM | ab24751 | Mouse monoclonal antibody [3C9] |
| Anti-Aquaporin5 Alexa Fluor 647 | ABCAM | ab215225 | Rabbit monoclonal antibody [EPR3747] |
| Anti-Aquaporin5 | ABCAM | ab92320 | Rabbit monoclonal antibody [EPR3747] |
| Anti-beta IV Tubulin | ABCAM | ab11315 | Mouse monoclonal antibody [ONS.1A6] |
| Anti-CD31 (PECAM-1) | ABCAM | ab9498 | Mouse monoclonal [JC/70A] antibody |
| Anti-CK5 | ABCAM | ab75869 | Rabbit recombinant monoclonal [AY1E6] |
| Anti-Cytokeratin 10 | ThermoFisher | MA5-13705 | Mouse monoclonal antibody (DE-K10) |
| Anti-Cytokeratin 14 | ABCAM | ab7800 | Mouse monoclonal antibody |
| Anti-E-Cadherin | ABCAM | ab1416 | Mouse monoclonal antibody |
| Anti-Filaggrin | ThermoFisher | PA5-79267 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-HTI-56 | Terrace Biotech | TB-29AHT1-56 | Mouse monoclonal antibody (IgG1) |
| Anti-HTII-280 | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | Mouse monoclonal antibody (IgM) |
| Anti-Involucrin | ThermoFisher | MA5-11803 | Mouse monoclonal antibody (SY5) |
| Anti-Isoforms TA p63-α, -β, -γ | Biolengend | 618902 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Ki67 | ABCAM | ab8191 | Mouse monoclonal antibody [B126.1] |
| Anti-LAMP3 | ABCAM | ab111090 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Mature SP-B | Seven Hill | WRAB-48604 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-MUC5AC | ThermoFisher | PA5-34612 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Mucin-2 | SantaCruz Biotechnology | sc-7314 | Mouse monoclonal antibody (IgG1) |
| Anti-p63 | Dako | GA662 | Mouse monoclonal antibody p63 Protein (Dako Omnis) Clone DAK-p63 |
| Anti-PCNA | ThermoFisher | PA5-32541 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Podoplanin (AT-1α) | ABCAM | ab128994 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Pro + Mature Surfactant Protein B | ABCAM | ab40876 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Surfactant C | Seven Hill | WRAB-9337 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Uteroglobin/SCGB1A1 | Hycult Biotech | HM2178 | Mouse monoclonal antibody [AY1E6] |
| Anti-VE-cadherin | ABCAM | ab33168 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-ZO-1 | ThermoFisher | 33-9100 | Mouse monoclonal antibody [1A12] |
| Ascorbic acid | Sigma | A4544 | |
| Aspirating pipettes | Corning / Falcon | 357558 | 2 mL, polystyrene, individually wrapped |
| Aspirating tips | - | - | Sterile (autoclaved) |
| B27 | Thermo | 17504044 | |
| Blocker BSA (10X) in PBS solution | ThermoFisher | 37525 | Blocker agent |
| Calcium Chloride | Sigma | C7902 | |
| CHIR 99021 | Tocris | 4423 | |
| Collagen I | Advanced Biomatrix | 5133 | 10 mg/mL (Stroma) |
| Collagen I | Advanced BioMatrix | 5005 | 3 mg/mL (Vascular ECM) |
| Collagen IV | Sigma | C5533 | |
| Collagen-IV | Sigma | C5533-5MG | Collagen from human placenta, 5 mg powder, reconstitute to 1 mg/mL |
| Colonic Fibroblasts | Cell Biologics | H6231 | |
| Colonic microvascular endothelial cells | Cell Biologics | H6203 | |
| Conical tubes | - | - | 15 mL and 50 mL polypropylene, sterile |
| Crosslinker (ER-1) | Emulate | 10461 | 5 mg powder |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | ThermoFisher | D3571 | DNA probe |
| Dermal fibroblasts | ATCC | PCS-201-010 | |
| Dermal microvascular endothelial cells | ATCC | CRL-3243 | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
| DMEM | ThermoFisher | 11054020 | |
| DMEM/F-12 | GIBCO | 11320082 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX | GIBCO | 10565-018 | Basal medium for ALI medium |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) | ABCAM | ab150105 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568) | ABCAM | ab175472 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) | ABCAM | ab150107 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | ABCAM | ab150073 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568) | ABCAM | ab175470 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 647) | ABCAM | ab150075 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Dulbecco’s PBS (DPBS-/-) (without Ca2+, Mg2+) | Corning | 21-031-CV | 1x |
| Epidermal Growth Factor (EGF) human, recombinant in E. coli | PromoCell | C-60170 | Medium supplement |
| F-12 Ham’s | Invitrogen | 21700-108 | For vascular ECM |
| FibriCol | Advanced BioMatrix | 5133-20ML | Collagen-I solution (10 mg/mL) |
| Fibronectin | Corning | 356008 | |
| Fibronectin, Human, Natural, | Corning | 47743-654 | human plasma fibronectin |
| Fine-tip precision tweezers | Aven | 18056USA | Technik Style 5B-SA Precision Stainless Steel Tweezers |
| Glutamax | Invitrogen | 21700-108 | |
| Glutamax | Invitrogen | 35050061 | |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 594) | ABCAM | ab150080 | Goat Anti-Mouse secondary antibody |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) | ABCAM | ab150115 | Goat Anti-Mouse secondary antibody |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (FITC) | ABCAM | ab6785 | Goat Anti-Mouse secondary antibody |
| Goat Anti-Mouse IgG1 Alexa Fluor 568 | ThermoFisher | A-21124 | Goat Anti-Mouse IgG1 secondary antibody |
| Goat Anti-Mouse IgM Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A-21042 | Goat Anti-Mouse IgM secondary antibody |
| Handheld vacuum aspirator | Corning | 4930 | - |
| Heat Inactivated HyClone FetalClone II Serum (FCS) | GE Healthcare Life Sciences | SH30066.03 | |
| Hemocytometer | - | - | - |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma | H3149 | |
| HEPES | Thermo | 15630080 | |
| Human [Leu15] - Gastrin | Sigma | G9145 | |
| Human colonoids | Obtained from clinical resections | Obtained from clinical resections | |
| Human EGF Recombinant Protein | Thermo | PHG0311L | |
| human epithelial growth factor | Thermo | PHG0311 | |
| HyClone FetalClone II Serum (U.S.) | GE Healthcare | SH30066.02HI | Sterile FBS heat-inactivated |
| Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt | Sigma | H4881 | |
| Hydrocortisone | PromoCell | C-64420 | Medium supplement |
| Ice bucket | - | - | - |
| Ismatec IPC-N | Cole-Palmer | EW-78000-41 | Low-Speed Digital Peristaltic Pump; q24-Channel (1 per 12 Chips) |
| ITES | BioWhittaker | 17-839Z | |
| Keratinocyte Growth Factor (KGF), also known as Basic Fibroblast Growth Factor 7 (FGF-7), human, recombinant in HEK | PromoCell | C-63821 | |
| Keratinocytes | ATCC | PCS-200-010 | |
| Laminin | Biolamina | CT521-0501 | |
| Laminin, 521 CTG (CT521) | Biolamina | CT521-0501 | human recombinant laminin 521 |
| Lung Fibroblast | Cell Biologics | H6013 | |
| Lung Fibroblast | Lifeline Cell Technology | FC-0049 | |
| Lung microvascular endothelial cells | Lonza | CC-2527 | |
| Lung smooth muscle cells | Lifeline Cell Technology | FC-0046 | |
| Manual counter | - | - | - |
| Masterflex (TPE) Transfer Tubing | Cole-Palmer | FV-96880-02 | PharMed BPT, 1/32" ID x 5/32" OD |
| Medium 199, no phenol red | Thermo | 11043023 | |
| Microcentrifuge tube | - | - | 1.5 mL, sterile |
| Microscope (with camera) | - | - | For bright-field imaging |
| N2 | Sigma | 17502001 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma | A5099 | |
| Noggin (HEK293T conditioned medium) | Sigma | N17001 | |
| Normal Goat Serum | ThermoFisher | 50062Z | Blocking solution |
| O-phosphosrylethanolamine | Sigma | P0503 | |
| Paraformaldehyde (4% wt/vol) | EMS | 15710 | Fixing agent |
| Penicillin Streptomycin | GIBCO | 15140122 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P4333 | 10,000 U/mL; 10 mg/mL |
| Pipette tips | - | - | P20, P200, and P1000 sterile, low adhesion |
| Pipette | Gilson | F167380 | P20, P200, and P1000 |
| PluriQ Serum Replacement (or alternatively KO Serum replacement) | AMSBIO (or Thermo) | N/A (or C1910828010) | |
| Poly-L-Lysine coated microscope glass slides | Sigma | P0425 | Glass slides |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| ProLong Gold | ThermoFisher | P36931 | Antifade Mountant with DAPI |
| Retinoic Acid | Sigma | R2625 | |
| ROCK inhibitor (Y27632) | Tocris | TB1254-GMP/10 | |
| R-spondin (HEK293T conditioned medium) | Sigma | SCC111 | |
| SAGM SingleQuots supplements | Lonza | CC-4124 | |
| SAGMTM Small Airway Epithelial Cell Growth medium BulletKitTM | Lonza | CC-4124 | Medium supplements |
| SB2001190 | Tocris | 1264/10 | |
| Serological pipettes | - | - | 2 mL, 5 mL, 10 mL, and 25 mL low endotoxin, sterile |
| Small Airway Epithelial Cell Growth medium (SAGM) | Lonza | CC-4124 | |
| Solvent Buffer (ER-2) | Emulate | 10462 | 25 mL bottle |
| Steriflip-HV | Millipore | SE1M003M00 | Sterile filtering conical tube |
| Sterilin 100 mm Square Petri Dishes | Thermo | 103 | Sterile, 1 per 6 chips |
| T25 flasks | - | - | - |
| T75 flasks | - | - | - |
| Tri-iodothyronine | Sigma | T5516 | |
| Triton X-100 (0.3% (vol/vol) | Sigma | T8787 | Permeabilization agent |
| Trypan blue | Sigma | 93595 | 0.4% solution |
| TrypEE solution | Sigma | 12604013 | Cell detaching solution |
| TWEEN-20 | Sigma | P2287 | Permeabilization agent |
| UV Light Oven (peak frequency 365nm, intensity of 100 µJ/cm2) | VWR | 21474-598 | UVP, Long Range UV, 365 nm 60Hz Model CL-1000L |
| Vacuum set-up | - | - | Minimum pressure: -70 kPa |
| Vascular Endothelial Growth Factor 165 (VEGF-165) human, recombinant in E. coli | PromoCell | C-64420 | |
| VEGF-165 | PromoCell | C-64420 | Medium supplement |
| Von Willebrand Factor conjugated FITC | ABCAM | ab8822 | Sheep polyclonal antibody |
| Water bath (or beads) | - | - | Set to 37 °C |
| Wnt3A (L-Wnt3A conditioned medium) | ATCC | CRL-2647 |
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