Summary
Il presente protocollo descrive le capacità e le modalità di coltura essenziali dell'Open-Top Organ-Chip per il successo della creazione e della maturazione di colture organo-on-chip a tutto spessore di tessuti primari (pelle, alveolo, vie aeree e intestino), fornendo l'opportunità di indagare diversi aspetti funzionali dell'interfaccia di nicchia epiteliale/mesenchimale e vascolare umana in vitro.
Abstract
Quasi tutti gli organi umani sono rivestiti con tessuti epiteliali, comprendenti uno o più strati di cellule strettamente collegate organizzate in strutture tridimensionali (3D). Una delle funzioni principali degli epiteli è la formazione di barriere che proteggono i tessuti sottostanti da insulti fisici e chimici e agenti infettivi. Inoltre, gli epiteli mediano il trasporto di nutrienti, ormoni e altre molecole di segnalazione, spesso creando gradienti biochimici che guidano il posizionamento cellulare e la compartimentazione all'interno dell'organo. A causa del loro ruolo centrale nel determinare la struttura e la funzione degli organi, gli epiteli sono importanti bersagli terapeutici per molte malattie umane che non sono sempre catturate dai modelli animali. Oltre alle ovvie differenze tra specie, condurre studi di ricerca sulla funzione barriera e sulle proprietà di trasporto degli epiteli negli animali è ulteriormente aggravato dalla difficoltà di accedere a questi tessuti in un sistema vivente. Mentre le colture cellulari umane bidimensionali (2D) sono utili per rispondere a domande scientifiche di base, spesso producono scarse previsioni in vivo . Per superare questi limiti, nell'ultimo decennio, una pletora di piattaforme biomimetiche microingegnerizzate, note come organs-on-a-chip, sono emerse come una promettente alternativa ai tradizionali test in vitro e sugli animali. Qui, descriviamo un Open-Top Organ-Chip (o Open-Top Chip), una piattaforma progettata per modellare tessuti epiteliali specifici dell'organo, tra cui pelle, polmoni e intestino. Questo chip offre nuove opportunità per ricostituire l'architettura multicellulare e la funzione dei tessuti epiteliali, compresa la capacità di ricreare una componente stromale 3D incorporando fibroblasti tessuto-specifici e cellule endoteliali all'interno di un sistema meccanicamente attivo. Questo Open-Top Chip fornisce uno strumento senza precedenti per studiare le interazioni epiteliali/mesenchimali e vascolari a più scale di risoluzione, dalle singole cellule ai costrutti tissutali multistrato, consentendo così la dissezione molecolare della diafonia intercellulare degli organi epitelializzati in salute e malattia.
Introduction
Storicamente, gli scienziati hanno fatto affidamento sulla sperimentazione animale preclinica per la scoperta di farmaci, ma un numero crescente di questi metodi è stato messo in discussione a causa della scarsa correlazione con il risultato umano1. L'attuazione dei principi delle "3R" per sostituire, ridurre e perfezionare la sperimentazione animale esorta gli scienziati a trovare nuovi metodi alternativi in vitro per supportare la valutazione preclinica del rischio tossicologico e chimicologico2. Tuttavia, molti modelli in vitro sviluppati fino ad oggi mancano dell'architettura biologica, della complessità cellulare e dell'ambiente meccanico necessari per ricapitolare la natura dinamica degli organi viventi umani 3,4.
I sistemi preclinici convenzionali in vitro impiegano tipicamente monocolture 2D di cellule umane coltivate su una superficie plastica rigida. Questi metodi forniscono uno strumento per condurre semplici studi meccanicistici e consentono un rapido screening dei farmaci candidati. A causa del loro costo relativamente basso e dell'elevata robustezza, i modelli 2D sono spesso abbinati a sistemi automatici ad alta produttività e utilizzati per la rapida identificazione di potenziali candidati farmaci durante la fase iniziale del processo di sviluppo del farmaco 5,6. Tuttavia, tali modelli 2D non forniscono un approccio traslazionale per la modellazione delle risposte a livello tissutale, a livello di organo o sistemiche ai candidati terapeutici, che è necessario per previsioni accurate della sicurezza e dell'efficacia dei farmaci durante la fase preclinica del loro sviluppo. Le colture cellulari piatte non ricapitolano il microambiente tissutale nativo, compresa la complessa interazione multicellulare, le proprietà biomeccaniche e l'architettura tridimensionale (3D) dei tessuti umani7. Le cellule che crescono su una superficie piana spesso non acquisiscono un fenotipo maturo e, quindi, non possono rispondere agli stimoli farmacologici come farebbero nel tessuto nativo. Ad esempio, le cellule epiteliali alveolari umane primarie coltivate in vitro mostrano un fenotipo squamoso e perdono marcatori fenotipici chiave, comprese le proteine tensioattive C e B (SP-C e SP-B)8. Oltre all'insufficiente differenziazione, le cellule primarie diventano spesso insensibili ai fattori di stress biologici in vitro, poiché alcuni percorsi biochimici associati all'infiammazione dei tessuti diventano non funzionali9. Tale perdita della funzione cellulare sembra essere principalmente associata all'uso di substrati rigidi e alla mancanza di fattori solubili rilasciati naturalmente dalle cellule stromali tessuto-specifiche come i fibroblasti polmonari e le cellule muscolari lisce10,11.
Comprendere che la mancanza di complessità chemio-fisica e biologica limita il comportamento fisiologico delle cellule in vitro ha favorito lo sviluppo di modelli multicellulari più sofisticati, che hanno dimostrato di catturare meglio la complessità dei tessuti umani al di fuori del corpo12,13. Dalla creazione dei primi modelli di co-coltura nei primi anni 197014, l'introduzione di idrogel sintetici e naturali ha migliorato significativamente la capacità di imitare i microambienti tissutali nativi ed è diventato uno strumento inestimabile per guidare la differenziazione cellulare, guidare l'auto-organizzazione delle cellule in strutture simili ai tessuti e il ripristino delle funzioni tissutali native15,16. Ad esempio, se coltivate nell'appropriata impalcatura 3D, le cellule umane possono auto-organizzarsi in strutture funzionali come sferoidi o organoidi, esprimendo marcatori di cellule staminali, e sono in grado di auto-rinnovarsi17. Al contrario, le cellule umane (comprese le cellule staminali), se coltivate su substrati 2D tradizionali, invecchiano rapidamente e subiscono la senescenza dopo pochi passaggi18. Inoltre, gli idrogel possono essere "personalizzati" per adattarsi a specifiche proprietà del tessuto come porosità, dimensione dei pori, spessore delle fibre, viscoelasticità, topografia e rigidità o ulteriormente ingegnerizzati con componenti cellulari derivati dai tessuti e / o molecole bioattive che consentono l'emulazione delle condizioni fisiologiche o patologiche19,20. Nonostante il loro enorme potenziale per i test farmacologici, i modelli 3D basati sull'idrogel utilizzati nella ricerca farmaceutica non riassumono completamente la complessa citoarchitettura dei tessuti in vivo e mancano di importanti stimoli emodinamici e meccanici normalmente presenti nel corpo umano, tra cui pressione idrostatica, allungamento ciclico e taglio dei fluidi21.
I sistemi microfisiologici (MPS) come gli Organs-on-chip (OOC) sono recentemente emersi come strumenti in grado di catturare risposte fisiologiche complesse in vitro22,23. Questi modelli utilizzano spesso l'uso di piattaforme microfluidiche, che consentono la modellazione del microambiente dinamico degli organi viventi.
Abbiamo combinato i principi della bioingegneria tissutale 3D e della meccanobiologia per creare un modello Open-Top Chip di tessuto epiteliale umano complesso. Questo ci ha permesso di ricapitolare da vicino il microambiente multicellulare e dinamico dei tessuti epiteliali. Ciò include segnali biochimici e biomeccanici specifici del tessuto naturalmente presenti negli organi viventi, ma spesso trascurati dai tradizionali modelli in vitro 24. L'Open-Top Chip incorpora due compartimenti: un compartimento vascolare (Figura 1A) e un compartimento stromale (Figura 1B) separati da una membrana porosa, consentendo la diffusione dei nutrienti tra le due camere (Figura 1C). Il compartimento vascolare è esposto a flusso continuo di fluido per ricapitolare lo stress fisiologico di taglio, mentre il design estensibile della camera stromale consente di modellare la tensione meccanica associata ai movimenti respiratori o alla peristalsi intestinale. Il compartimento stromale ospita l'impalcatura idrogel 3D sintonizzabile progettata per supportare la crescita fisiologica dei fibroblasti tessuto-specifici. Possiede un coperchio rimovibile che facilita l'istituzione di un'interfaccia aria-liquido, una condizione che consente una maggiore emulazione della fisiologia umana dei tessuti della mucosa e l'accesso diretto al tessuto per la somministrazione di farmaci direttamente sullo strato epiteliale. La Figura 1 supplementare cattura alcuni dei componenti chiave del progetto Open-Top Chip, comprese le dimensioni e i compartimenti biologici (Figura supplementare 1A-D), nonché le principali fasi tecniche descritte in questo protocollo (Figura supplementare 1E).
La perfusione del chip Open-Top si ottiene con una pompa peristaltica programmabile (Figura 1D). La configurazione della pompa peristaltica consente di eseguire contemporaneamente 12 chip Open-Top. La maggior parte degli incubatori può ospitare due configurazioni che consentono la coltura di un massimo di 24 chip per incubatore. Lo stretching meccanico è ottenuto utilizzando un regolatore di pressione del vuoto programmabile su misura (Figura 1E). È costituito da un regolatore di vuoto elettropneumatico controllato elettronicamente da un convertitore digitale-analogico. In altre parole, il regolatore di vuoto elettropneumatico genera un profilo di vuoto sinusoidale con un'ampiezza e una frequenza determinate dall'utente. La deformazione ciclica compresa tra 0% e 15% viene generata applicando una pressione negativa al canale del vuoto del chip Open-Top ad un'ampiezza compresa tra 0 e -90 kPa e una frequenza di 0,2 Hz. Si tratta di un sistema su misura equivalente all'unità di deformazione Flexcell disponibile in commercio precedentemente adottata e descritta in altri documenti25. Per imitare la deformazione meccanica del tessuto associata, ad esempio, al movimento respiratorio del polmone o alla peristalsi dell'intestino, l'attuatore pneumatico applica onde sinusoidali di vuoto/deformazione la cui grandezza e ampiezza possono essere regolate per corrispondere al livello fisiologico di deformazione e frequenza che le cellule umane sperimentano nel loro tessuto nativo.
Qui, descriviamo un metodo efficiente e riproducibile per ingegnerizzare e coltivare equivalenti di epitelio organotipico su una piattaforma prototipo Open-Top Chip. Consente la generazione di modelli di organi complessi come pelle, alveolo, vie aeree e colon, integrando un flusso di fluido vascolare e uno stretching meccanico. Descriveremo gli aspetti tecnici chiave che devono essere considerati durante l'implementazione dei principi dell'ingegneria tissutale per la generazione di modelli epiteliali complessi. Discuteremo i vantaggi e le possibili limitazioni del design attuale.
Una panoramica delle principali fasi utilizzate per ottenere la maturazione dei tessuti e degli organi, compresi i parametri di flusso e allungamento, è riportata in: Figura 2 per la pelle, Figura 3 per l'alveolo, Figura 4 per le vie aeree e Figura 5 per l'intestino. Ulteriori informazioni sulla composizione dei mezzi e sui reagenti utilizzati per la coltura dei diversi modelli di organi sono incluse nelle tabelle supplementari (Tabella supplementare 1 per la pelle; Tabella supplementare 2 per l'alveolo; Tabella supplementare 3 per le vie aeree e Tabella supplementare 4 per l'intestino).
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Protocol
I colonoidi umani sono stati ottenuti da resezioni intestinali in conformità con le linee guida del Comitato istituzionale per la biosicurezza dell'ospedale pediatrico di Cincinnati (IBC 2017-2011).
1. Attivazione della superficie
- Preparazione del buffer di attivazione
- Posizionare il reticolante e i reagenti tampone solvente sotto l'armadio di biosicurezza (BSC) e lasciarli equilibrare a temperatura ambiente (RT) per 10 minuti prima dell'uso.
- Ricostituire 5 mg di reticolante in 5 mL del tampone solvente utilizzando un contenitore sterile impermeabile alla luce o un tubo conico trasparente da 15 mL avvolto in un foglio di alluminio per proteggere la soluzione reticolante dall'esposizione diretta alla luce.
- Vortice la soluzione per 1 minuto per rimuovere tutti i grumi, quindi pipettare 50 μL della soluzione reticolante direttamente nel canale inferiore del chip e 150 μL nella camera aperta.
- Rimuovere qualsiasi eccesso di soluzione reticolante dalla superficie del chip utilizzando un aspiratore. Quindi pipettare ulteriori 50 μL della soluzione reticolante direttamente nel canale inferiore del chip e 150 μL nella camera aperta per rimuovere eventuali bolle d'aria rimanenti.
- Attivazione con macchina reticolante UV
- Rimuovere delicatamente il coperchio dal chip sotto il BSC e conservarlo in un contenitore sterile.
- Trasferire i trucioli contenenti la soluzione reticolante in una capsula di Petri, chiudere la capsula di Petri per evitare la contaminazione e posizionare la capsula con i trucioli sotto la macchina reticolante UV.
NOTA: rimuovere il coperchio della piastra di Petri per massimizzare l'esposizione ai raggi UV. - Impostare la reticolatrice UV con una lunghezza d'onda di picco di 365 nm ad un'intensità di 100 μJ/cm2 e accendere la luce UV per 20 minuti.
NOTA: Dopo 20 minuti di trattamento UV, la soluzione reticolante apparirà più scura (marrone). - Riportare i trucioli sotto il BSC e aspirare la soluzione reticolante ossidata. Quindi, sciacquare tutti i trucioli tre volte con il tampone solvente e lasciare asciugare i trucioli sotto il BSC per 5-10 minuti per completare la funzionalizzazione chimica della superficie del polidimetilsilossano (PDMS).
2. Preparazione dello stroma equivalente
- Preparazione del tampone di ricostruzione 10x (100 ml)
- Sciogliere 2,2 g di bicarbonato di sodio in 75 mL di 0,067 M NaOH in acqua bidistillata.
- Aggiungere 4,76 g di HEPES e portare il volume a 100 ml utilizzando acqua distillata doppiamente.
- Filtrare sterile la soluzione sotto la BSC utilizzando un filtro monouso sterile a bottiglia con membrana da 0,22 μm.
NOTA: La soluzione è stabile per circa 6 mesi se conservata a 4 °C.
- Stima del volume della soluzione pre-gel
- Moltiplicare il numero di chip necessari per l'esperimento per 150 μL (volume interno della camera centrale aperta) per stimare la quantità di soluzione pre-gel necessaria per l'esperimento:
Volume necessario = (Numero di chip x 150) μL - Preparare la soluzione di collagene pre-gel su ghiaccio mescolando: 1 volume di 10x EMEM contenente le cellule di scelta, 1 volume di tampone di ricostruzione 10x (vedere punto 2.1), 8 volumi di soluzione di collagene I (10 mg/ml) e 1 μL di soluzione 1 N NaOH per ogni mg di collagene I.
NOTA: Si consiglia di preparare un volume extra +15% per tenere conto degli errori sperimentali; L'esempio descritto nella sezione 2.2 fornisce una procedura dettagliata passo-passo per preparare una soluzione pre-gel sufficiente per 12 chip e un volume extra del 15%.
- Moltiplicare il numero di chip necessari per l'esperimento per 150 μL (volume interno della camera centrale aperta) per stimare la quantità di soluzione pre-gel necessaria per l'esperimento:
- Preparazione della soluzione pre-gel per lo stroma equivalente (per 12 chip)
- Portare le seguenti soluzioni sotto il BSC su ghiaccio: 10x EMEM; 10x Buffer di ricostruzione (vedere il punto 2.1); Soluzione di collagene I (10 mg/ml); e soluzione sterile 1 N NaOH.
- Colture di cellule mesenchimali tessuto-specifiche come indicato dai fornitori fino all'80% -90% confluente, quindi dissociare le cellule usando tripsina o altri metodi come raccomandato dal fornitore di cellule. Raccogliere le celle in un pellet mediante centrifugazione a 250 x g per 5 minuti a 24 °C.
- Risospendere il pellet cellulare in 225 μL di EMEM 10x ghiacciato e aggiungere 225 μL di tampone di ricostruzione 10x ghiacciato (vedere punto 2.1). Mescolare la soluzione pipettando delicatamente su e giù, quindi aggiungere 1.800 μL di soluzione di collagene I ghiacciata.
- Pipettare su e giù 5-6 volte, evitando bolle per mescolare la soluzione pre-gel mentre si è sul ghiaccio.
- Incorporazione dello stroma equivalente su chip (per 12 chip)
- Neutralizzare la soluzione pre-gel con 18 μL di 1 N NaOH. Mescolare delicatamente pipettando su e giù 5-6 volte, quindi pipettare 150 μL di idrogel carico di cellule nella camera centrale del chip Open-Top evitando bolle.
NOTA: se è necessaria la micropatterning, passare al passaggio successivo (sezione 3). - Raggruppare i trucioli in piastre di Petri separate, compreso un tappo a tubo da centrifuga riempito con 2 ml diddH 2O sterile in ciascuna capsula di Petri, e incubare le piastre di Petri nell'incubatore a 37 °C, 5% CO2.
NOTA: Dopo 90 minuti, l'idrogel carico di cellule sarà completamente polimerizzato.
- Neutralizzare la soluzione pre-gel con 18 μL di 1 N NaOH. Mescolare delicatamente pipettando su e giù 5-6 volte, quindi pipettare 150 μL di idrogel carico di cellule nella camera centrale del chip Open-Top evitando bolle.
3. Micropatterning superficiale (opzionale)
- Eseguire la micromodellazione superficiale dell'idrogel stromale dopo il pipettaggio dell'idrogel di collagene neutralizzato (ancora allo stato liquido) utilizzando timbri stampati in 3D.
NOTA: I francobolli stampati in 3D possono essere ottenuti in vari disegni personalizzabili, come precedentemente descritto altrove24. - Pipettare 20 μL della soluzione di collagene neutralizzato I pre-gel sulla superficie modellata di un timbro sterile stampato in 3D e inserire il timbro all'interno (in alto) della camera aperta mentre l'idrogel stromale è ancora in forma liquida.
- Rimuovere qualsiasi residuo di idrogel che potrebbe fuoriuscire dalla parte superiore della camera aperta utilizzando un aspiratore (o una pipetta). Raggruppare tutti i trucioli in piastre di Petri separate e includere un tappo a tubo conico da 15 mL da 15 mL riempito con 2 mL diddH 2O sterile in ciascuna capsula di Petri.
- Incubare tutte le piastre di Petri a 37 °C, 5% CO2 per 90 minuti, quindi riportare i trucioli sotto la BSC e rimuovere delicatamente i timbri usando una pinzetta di precisione per ridurre il rischio di danneggiare l'idrogel.
4. Rivestimento della superficie epiteliale e vascolare con proteine ECM tessuto-specifiche
- Rivestimento della camera microfluidica vascolare con proteine della matrice extracellulare
- Moltiplicare il numero di chip necessari per l'esperimento per 20 μL (volume del canale vascolare) per stimare il volume della soluzione di rivestimento ECM vascolare richiesta per l'esperimento:
Volume necessario = (Numero di chip x 20) μL
NOTA: si consiglia di preparare un volume aggiuntivo del 15% per tenere conto degli errori sperimentali. - Preparare la soluzione di rivestimento ECM vascolare per tutti i chip (ad esempio, 300 μL per 12 chip) utilizzando PBS o HBSS ghiacciati.
NOTA: Fare riferimento alla tabella specifica organo-protocollo nella sezione materiali supplementari (Tabella supplementare 1 per la pelle; Tabella supplementare 2 per l'alveolo; Tabella supplementare 2 per le vie aeree e Tabella supplementare 4 per l'intestino) per identificare i reagenti specifici e la composizione ECM raccomandata. - Pipettare 20 μL di soluzione di rivestimento ECM vascolare nel canale vascolare di ciascun chip.
- Moltiplicare il numero di chip necessari per l'esperimento per 20 μL (volume del canale vascolare) per stimare il volume della soluzione di rivestimento ECM vascolare richiesta per l'esperimento:
- Rivestimento della superficie apicale dell'equivalente stromale con proteine della matrice extracellulare
- Moltiplicare il numero di chip necessari per l'esperimento per 50 μL (volume del canale vascolare) per stimare il volume della soluzione di rivestimento ECM epiteliale necessaria per l'esperimento:
Volume necessario = (Numero di chip x 50) μL
NOTA: si consiglia di preparare un volume extra del 15% per tenere conto degli errori sperimentali. - Preparare una soluzione di rivestimento ECM sufficiente per tutti i chip (ad esempio, 750 μL per 12 chip) in PBS o HBSS ghiacciato e trasferire 50 μL di soluzione di rivestimento ECM epiteliale direttamente sulla superficie dell'idrogel.
NOTA: Fare riferimento alla tabella specifica organo-protocollo nella sezione materiali supplementari (Tabella supplementare 1 per la pelle; Tabella supplementare 2 per l'alveolo; Tabella supplementare 2 per le vie aeree e Tabella supplementare 4 per l'intestino) per identificare i reagenti specifici e la composizione ECM raccomandata. - Raggruppare i trucioli in piastre di Petri separate, compresa una centrifuga da 15 mL di tappo conico riempito con 2 mL di ddH2O sterile in ciascuna capsula di Petri, e incubare le piastre di Petri nell'incubatore a 37 °C, 5% CO 2 per2 ore prima di procedere con la semina delle cellule epiteliali.
- Moltiplicare il numero di chip necessari per l'esperimento per 50 μL (volume del canale vascolare) per stimare il volume della soluzione di rivestimento ECM epiteliale necessaria per l'esperimento:
5. Seminare cellule epiteliali sull'equivalente stromale
- Coltura cellulare epiteliale
- Colture di cellule epiteliali tessuto-specifiche come indicato dai fornitori fino all'80% -90% confluente.
- Dissociare le cellule utilizzando procedure enzimatiche proteolitiche come raccomandato dal fornitore di cellule.
NOTA: Per ottenere i migliori risultati, raccogliere cellule epiteliali a basso passaggio (P1-P2) durante la fase di crescita attiva quando raggiungono tra il 70% e il 90% di confluenza. - Una volta dissociate, centrifugare le cellule e raccoglierle come pellet.
- Risospendere le cellule epiteliali alla densità appropriata di cellula/frammento come indicato nella tabella specifica del protocollo d'organo.
NOTA: In questo studio, la soluzione cellulare è stata utilizzata a una densità di 3 x 10 6 cellule / ml per la pelle, 1 x 10 6 cellule / ml per l'alveolo, 6 x 10 6 cellule / ml per le vie aeree e 8 x 10 6 frammenti / ml per l'intestino.
- Semina delle cellule epiteliali
- Trasferire i chip dall'incubatore al BSC. Aspirare la soluzione di rivestimento dal canale vascolare e sciacquare il canale microfluidico vascolare tre volte con 50 μL di terreno di coltura cellulare endoteliale fresco.
- Aspirare la soluzione di rivestimento dalla superficie dell'idrogel e sciacquare la superficie stromale tre volte con 100 μL di terreno di coltura cellulare epiteliale fresco per rimuovere qualsiasi soluzione di rivestimento in eccesso.
- Aspirare il terreno ascendente e seminare la superficie dell'idrogel con 50 μL della sospensione cellulare epiteliale utilizzando la densità cellulare appropriata, come indicato nelle tabelle supplementari, quindi trasferire nuovamente i trucioli nell'incubatore per 2 ore (o durante la notte per i colonoidi).
- Risciacquare delicatamente la superficie dell'idrogel con il terreno di coltura cellulare due volte per rimuovere i detriti cellulari. Infine, rinfrescare il mezzo mediante autoclave in contenitori autoclavabili sigillati e collegare i trucioli alla pompa peristaltica.
6. Collegamento dei chip al flusso
- Preparazione delle parti fluidiche
- Tagliare 2 pollici di tubo di trasferimento in elastomero termoplastico (TPE) a base di polipropilene biocompatibile (Table of Materials) per preparare il tubo microfluidico corto necessario per collegare i chip ai serbatoi dei fluidi.
- Tagliare 7,5 pollici di tubi di trasferimento TPE biocompatibili per produrre il lungo tubo microfluidico.
- Preparare abbastanza connettori metallici da 18 G e 19 G (tabella dei materiali).
NOTA: Si raccomanda di preparare e sterilizzare i tubi e i connettori descritti nei punti 6.1.1 e 6.1.2 almeno 1 giorno prima di collegare i chip aperti alle pompe peristaltiche. - Forare il coperchio di ciascun serbatoio medio con un ago ipodermico da 4 pollici (tabella dei materiali).
- Degasaggio medio
- Lasciare che il terreno di coltura cellulare si equilibri a temperatura ambiente (RT).
- Trasferire il volume del mezzo necessario in un tubo filtrante conico.
- Applicare una pressione di vuoto negativa di -20 PSI per degassare il fluido (filtrazione guidata dal vuoto).
NOTA: Se non è disponibile un vuoto, il terreno di coltura cellulare può essere lasciato equilibrare nell'incubatore durante la notte per ottenere risultati simili.
- Preparare il chip Open-Top per il flusso del fluido
- Portare i trucioli e le parti fluidiche sterili sotto il BSC e allineare il coperchio (parte superiore) del chip Open-Top per sigillare il prototipo di chip Open-Top prima di iniziare il flusso del fluido.
- Pipettare 200 μL del terreno di coltura cellulare degassato (vedere tabelle organo-specifiche) nella porta di ingresso di entrambi i canali superiore e inferiore del chip prestando attenzione per evitare bolle.
- Pipettare 300 μL del terreno di coltura nel tubo microfluidico corto per innescare la superficie interna dei tubi e collegare il tubo corto agli ingressi dei canali superiore e inferiore del chip.
- Collegare e innescare le superfici microfluidiche
- Posizionare i serbatoi medi nel rack dell'azienda, collegare l'ago ipodermico all'ingresso inferiore dei trucioli e, infine, ospitare tutti i trucioli nei supporti dell'alloggiamento all'interno dell'incubatore.
- Collegare i chip alla pompa peristaltica, quindi ispezionare tutti i connettori per assicurarsi che tutti i chip siano collegati correttamente e che non vi siano perdite visibili di terreni di coltura cellulare.
- Utilizzare il pulsante di spurgo sulla pompa e tenerlo premuto per circa 15 secondi o fino a quando le goccioline del terreno di coltura cellulare appaiono alla fine del tubo di deflusso.
- Utilizzare il sistema di controllo sulla pompa per impostare la portata organo-chip appropriata (Figura 2, Figura 3, Figura 4 e Figura 5).
7. Manutenzione dei chip
- Manutenzione del chip dell'organo
- Preparare un terreno di coltura cellulare fresco per l'epitelio e/o l'endotelio ed eseguire le fasi di degasaggio (come precedentemente descritto al punto 6.2).
- Mettere in pausa la pompa peristaltica, scollegare con attenzione i chip dalla pompa ed estrarre i supporti dell'alloggiamento del chip. Trasferire i trucioli dall'incubatore al BSC e rimuovere il volume di fluido rimasto nei serbatoi.
- Sostituire i terreni di coltura cellulare nei serbatoi di ingresso superiore e inferiore con 5 ml di terreno di coltura cellulare fresco e riposizionare i supporti dell'alloggiamento del chip nell'incubatore. Collegare i chip alla pompa peristaltica e riavviare il flusso.
NOTA: Si consiglia di utilizzare la funzione Purge per aggiornare rapidamente il mezzo al compartimento vascolare e ridurre il rischio di bolle d'aria. - Ripetere i passaggi 7.1.1-7.1.3 a giorni alterni, come da Figura 2, Figura 3, Figura 4 e Figura 5.
- Creazione di un'interfaccia aria-liquido (ALI)
- Mettere in pausa la pompa peristaltica, scollegare con attenzione i chip dalla pompa ed estrarre i supporti dell'alloggiamento del chip. Trasferire i trucioli dall'incubatore all'armadio di biosicurezza e rimuovere il volume di mezzo rimasto nel serbatoio superiore.
- Aspirare delicatamente tutto il fluido dal canale microfluidico superiore e bloccare il tubo microfluidico corto collegato agli ingressi superiori utilizzando clip leganti per ridurre l'evaporazione del fluido e il mantenimento di ALI.
- Posizionare il chip Open-Top sui supporti dell'alloggiamento nell'incubatore e ricollegare i chip alla pompa peristaltica.
NOTA: Si consiglia di utilizzare la funzione Purge per aggiornare rapidamente il mezzo al compartimento vascolare e ridurre il rischio di bolle d'aria. - Riprendere il flusso avviando la pompa peristaltica.
- Stretching (opzionale)
- Mettere in pausa la pompa peristaltica e collegare le porte del vuoto dei chip al modulo del vuoto utilizzando due lunghi tubi microfluidici per chip.
- Utilizzare il modulo vuoto per regolare l'impostazione di allungamento in base alla condizione raccomandata per ciascun organo, come specificato all'interno delle tabelle di protocollo degli organi: Tabella supplementare 1 per la pelle; Tabella supplementare 2 per l'alveolo; Tabella supplementare 2 per le vie aeree; e Tabella supplementare 4 per l'intestino.
- Ispezionare visivamente le connessioni dei tubi per assicurarsi che tutti i chip siano collegati correttamente e che non vi siano goccioline visibili di gocciolamento medio.
- Riprendere il flusso avviando la pompa peristaltica.
8. Semina di cellule endoteliali nel compartimento vascolare
- Preparare cellule e chip per la semina delle cellule vascolari
- Coltivare le cellule endoteliali tessuto-specifiche come indicato dai fornitori fino all'80% -90% confluente. Dissociare le cellule utilizzando una procedura enzimatica proteolitica (come raccomandato dal fornitore) e, infine, risospendere le cellule endoteliali in una soluzione di 3 x 106 cellule / ml.
NOTA: Per ottenere i migliori risultati, raccogliere le cellule endoteliali a basso passaggio (P2-P4) durante la fase di crescita attiva quando raggiungono tra il 70% e il 90% di confluenza. - Metti in pausa la pompa peristaltica. Trasferire i chip dall'incubatore al BSC, scollegare i chip dai serbatoi dei supporti e da qualsiasi tubo collegato, quindi raggruppare i chip in piastre di Petri separate.
- Rinfrescare il terreno di coltura cellulare del compartimento epiteliale con terreno di coltura cellulare epiteliale fresco. Risciacquare il canale vascolare con terreno di coltura cellulare endoteliale fresco due volte, quindi aspirare il mezzo dal compartimento vascolare.
- Coltivare le cellule endoteliali tessuto-specifiche come indicato dai fornitori fino all'80% -90% confluente. Dissociare le cellule utilizzando una procedura enzimatica proteolitica (come raccomandato dal fornitore) e, infine, risospendere le cellule endoteliali in una soluzione di 3 x 106 cellule / ml.
- Semina delle cellule endoteliali
- Seminare il canale inferiore (vascolare) con 25 μL di sospensione di cellule endoteliali (3 x 106 cellule / ml), capovolgere i chip per consentire alle cellule endoteliali di attaccarsi alla superficie superiore della camera microfluidica.
NOTA: Aggiungere 50 μL di sospensione cellulare per chip (600 μL per 12 chip). - Raggruppare le patatine in piastre di Petri. Rimetterli nell'incubatore a 37 °C, 5% di CO2, e lasciare che le cellule endoteliali si attacchino per 1 ora.
- Dopo 1 ora, trasferire i chip dall'incubatore al BSC. Risciacquare il canale vascolare con terreno di coltura cellulare endoteliale due volte per rimuovere i detriti cellulari.
- Ripetere i passaggi 8.2.1-8.2.2 per seminare nuovamente il canale vascolare con cellule endoteliali e posare i trucioli in piano per facilitare l'adesione delle cellule endoteliali alla superficie inferiore del canale vascolare.
- Seminare il canale inferiore (vascolare) con 25 μL di sospensione di cellule endoteliali (3 x 106 cellule / ml), capovolgere i chip per consentire alle cellule endoteliali di attaccarsi alla superficie superiore della camera microfluidica.
- Ricollegare il chip al flusso
- Riempire il serbatoio del mezzo vascolare con il terreno di coltura cellulare vascolare degassato sotto la BSC.
- Riposizionare i trucioli all'interno dei contenitori dell'alloggiamento del chip e ricollegare i trucioli ai serbatoi medi su un'estremità alla pompa peristaltica all'altra estremità.
NOTA: Si consiglia di utilizzare la funzione Purge per aggiornare rapidamente il mezzo al compartimento vascolare e ridurre il rischio di bolle d'aria. - Ispezionare visivamente le connessioni microfluidiche per assicurarsi che tutti i chip siano collegati correttamente e che non vi siano goccioline visibili di gocciolamento medio. Quindi, riprendere il flusso del fluido avviando la pompa peristaltica.
9. Saggi comuni degli endpoint
- Disconnettere i chip per i test degli endpoint
- Mettere in pausa la pompa peristaltica, scollegare con attenzione i chip dalla pompa ed estrarre i supporti dell'alloggiamento del chip. Trasferire il/i porta-alloggiamento del chip dall'incubatore al BSC e liberare i chip.
- Lavare delicatamente la camera centrale dell'Open-Top Chip con il terreno di coltura cellulare epiteliale e il canale vascolare con il terreno di coltura dell'endotelio due volte per rimuovere eventuali detriti cellulari.
- Rimuovere il coperchio dell'Open-Top Chip per accedere al compartimento apicale del chip utilizzando una pinzetta.
- Immunocolorazione per microscopia a fluorescenza
- Procedere con la fissazione, la permeabilizzazione e il blocco convenzionali del campione.
NOTA: In questo studio, i campioni sono stati fissati in 200 μL di paraformaldeide (PFA) al 4% per 1 ora, seguito da risciacquo con PBS, permeabilizzazione in Triton X-100 allo 0,1% per 40 minuti e blocco in albumina sierica bovina all'1% per 1 ora. - Incubare i trucioli con anticorpi primari (Table of Materials) a 4 °C durante la notte. e quindi lavare due volte i compartimenti epiteliali ed endoteliali dei chip con 200 μL di PBS. Quindi, procedere con gli anticorpi secondari appropriati per 2 ore.
NOTA: Diluire gli anticorpi primari e gli anticorpi secondari in PBS + 1% BSA ad una diluizione di 1:100 (anticorpo primario) e 1:200 (anticorpo secondario).
- Procedere con la fissazione, la permeabilizzazione e il blocco convenzionali del campione.
- Immunoistochimica
- Estrarre gli equivalenti stromali dalla camera principale del chip Open-Top usando una pinzetta, raccoglierli in un tubo da 1,5 ml riempito con formalina tamponata neutra al 10% e incubare per almeno 24 ore.
- Trasferire l'equivalente stromale fisso al processore tissutale e seguire i passaggi seguenti per ottenere una disidratazione ottimale del campione.
- Immergere l'idrogel in etanolo al 70% per 90 minuti.
- Rimuovere l'etanolo al 70% e immergere l'idrogel in etanolo all'80% per 90 minuti.
- Rimuovere l'etanolo all'80% e immergere l'idrogel in etanolo al 95% per 90 minuti.
- Rimuovere l'etanolo al 95% e immergere l'idrogel in etanolo al 100% per 90 minuti due volte.
- Rimuovere l'etanolo al 100% e immergere l'idrogel in una soluzione di xilene per 120 minuti due volte.
- Rimuovere la soluzione di xilene e infiltrare gli equivalenti stromali trattati nella cera di paraffina per 120 minuti (~ 2 h) due volte.
- Incorporare gli equivalenti stromali infiltrati in blocchi di paraffina sezionati.
- A questo punto, gli equivalenti stromali possono essere sezionati come blocchi di paraffina usando un microtomo e trattati secondo le tecniche istologiche convenzionali26.
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Representative Results
Micropatterning superficiale
Il micropatterning della matrice extracellulare (ECM) può essere utilizzato per replicare la configurazione spaziale dell'interfaccia della cripta intestinale. La configurazione Open-Top Chip può essere modificata per integrare timbri microstrutturati specificamente progettati per imitare la topografia naturale dell'interfaccia epitelio-stroma del colon (Figura 6A,B) e delle cripte intestinali su scala micrometrica (Figura 6C-E). Si prega di notare che abbiamo utilizzato una superficie piatta (non modellata) per i modelli di pelle, vie aeree e alveolo. Il timbro è stato utilizzato in questo caso per ottenere una superficie uniforme di idrogel per seminare le cellule epiteliali. Abbiamo optato per un design che potesse imitare l'architettura naturale della mucosa intestinale umana, costituita dall'alternanza di cupole positive e negative che imitano le cripte intestinali.
Modelli di organi
Abbiamo coltivato e differenziato quattro diversi epiteli (pelle, alveolo, vie aeree e intestino) utilizzando il prototipo Open-Top Chip per dimostrare la versatilità di questa piattaforma biomimetica. Le sezioni istologiche dei chip d'organo confermano la presenza di cellule epiteliali fenotipicamente distinte e rappresentative di: epitelio stratificato nel caso della pelle (Figura 7), epitelio colonnare pseudo-stratificato nel caso delle vie aeree (Figura 8 e Video Supplementare 1), epitelio squamoso semplice nel caso dell'alveolo (Figura 9), e semplice epitelio colonnare nel caso dell'intestino (Figura 10). Le cellule cutanee, delle vie aeree e alveolari sono state tutte ottenute da fornitori disponibili in commercio (come specificato nella tabella dei materiali).
Figura 1: Schema del chip Open-Top e della configurazione microfluidica utilizzata in questo studio. (A-C) Vista dall'alto, proiezione strato per strato e rendering 3D che mostra il prototipo di design Open-Top Chip che comprende il coperchio superiore rimovibile con canale microfluidico incassato (blu), i due canali di vuoto semi-lunari accanto alla camera di coltura (grigio) e i canali microfluidici endoteliali spiralizzati inferiori (magenta). (D) Portachip su misura (chiamato anche "sistema agricolo") che include il supporto dell'alloggiamento del chip (freccia rossa), la pompa peristaltica e i serbatoi (freccia gialla) disposti in una configurazione che si adatta a un comune incubatore di colture cellulari. € Attuatore pneumatico, lo strumento che controlla la pressione negativa applicata al canale del vuoto dei chip, che viene utilizzato per generare la forza meccanica ciclica sperimentata dalle cellule durante la respirazione o il movimento della peristalsi (stretch). Questa cifra è stata adattata con il permesso di Varone et al.24. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Panoramica tecnica del protocollo skin-chip open-top. (A) Schema che mostra la sequenza di azioni per la preparazione di chip cutanei open-top e (B) fornisce la fase biologica chiave della coltura di chip cutanei open-top. Nella fase iniziale della preparazione del chip, le cellule mesenchimali (fibroblasti) vengono incorporate nel gel e caricate nell'Open-Top Chip per formare lo strato stromale, che viene rivestito per 2-4 ore e seminato con cellule epiteliali. Una volta che le cellule epiteliali hanno formato un monostrato compatto, vengono esposte all'aria (ALI). Il sistema biologico è mantenuto sotto regime ALI fino ad essere sacrificato per l'analisi il giorno 14. Lo stretching meccanico può essere applicato mentre il sistema è in flusso e ad ALI. Lo stretching viene mantenuto fino a quando i tessuti non vengono sacrificati per l'analisi. Ulteriori informazioni sulla composizione dei supporti, sui reagenti specifici e sui tipi di cellule sono disponibili nella Tabella supplementare 1. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Panoramica tecnica del protocollo open-top alveolus-chip. (A) Schema che mostra la sequenza di azioni per la preparazione di chip di alveolo open-top e (B) fornisce la fase biologica chiave della coltura di chip di alveolo open-top. Nella fase iniziale della preparazione del chip, le cellule mesenchimali (fibroblasti) vengono incorporate nel gel e caricate nell'Open-Top Chip per formare lo strato stromale, che viene rivestito per 2-4 ore e seminato con cellule epiteliali delle vie aeree in un mezzo integrato con KIAD (vedi Tabella supplementare 2). Il mezzo integrato con EGF viene mantenuto per ~ 4 giorni per supportare la crescita delle cellule epiteliali. L'epitelio viene quindi esposto all'aria (ALI) per ~ 10 giorni per ottenere la completa maturazione del tessuto. Le cellule endoteliali microvascolari polmonari vengono seminate il giorno 14 e il sistema biologico viene mantenuto sotto ALI e regime di flusso fino a quando non viene sacrificato per l'analisi il giorno 21. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Panoramica tecnica del protocollo open-top-airway-chip . (A) Schema che mostra la sequenza di azioni per la preparazione dei chip delle vie aeree open-top e (B) fornisce la fase biologica chiave della coltura di chip delle vie aeree open-top. Nella fase iniziale della preparazione del chip, le cellule mesenchimali (fibroblasti e/o cellule muscolari lisce) vengono incorporate nel gel e caricate nell'Open-Top Chip per formare lo strato stromale, che viene rivestito per 2-4 ore e seminato con cellule epiteliali in mezzo integrate con EGF (vedi Tabella supplementare 3). Il mezzo integrato con EGF viene mantenuto per ~ 4 giorni per supportare la crescita delle cellule epiteliali. L'epitelio viene quindi esposto all'aria (ALI) per ~ 10 giorni per ottenere la completa maturazione del tessuto. Le cellule endoteliali microvascolari polmonari vengono seminate il giorno 14 e il sistema biologico viene mantenuto sotto ALI e regime di flusso fino a quando non viene sacrificato per l'analisi il giorno 21. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Panoramica tecnica del protocollo intestino-chip open-top . (A) Schema che mostra la sequenza di azioni per la preparazione del chip intestinale a cielo aperto e (B) fornisce la fase biologica chiave della coltura di chip intestinali aperti. Nella fase iniziale della preparazione del chip, le cellule mesenchimali (fibroblasti del colon) vengono incorporate nel gel e caricate nell'Open-Top Chip per formare lo strato stromale, che viene rivestito per 2-4 ore e seminato con frammenti di colonoidi epiteliali ottenuti da resezioni cliniche. Il terreno di coltura cellulare, compresi gli integratori (ROCK e CHIR, vedi Tabella supplementare 4) è necessario durante la fase di semina per mantenere la vitalità delle cellule colonoidi e la morfologia fisiologica. Diversi mezzi vengono quindi utilizzati per guidare l'espansione (giorno 1-6) e la maturazione (giorno 6-9) dell'epitelio del colon. Le cellule endoteliali microvascolari del colon vengono seminate il giorno 6 utilizzando un terreno di coltura cellulare endoteliale (EGM2 MV) e quindi coltivate sotto flusso con un mezzo di espansione epiteliale per un massimo di altri 10 giorni. L'epitelio viene esposto all'ALI dal giorno 10 per promuovere ulteriormente la maturazione delle cellule epiteliali. Lo stretching meccanico può essere applicato al sistema dal giorno 13 e mantenuto fino al giorno 16, quando il modello di organo viene sacrificato per l'analisi degli endpoint. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6: Stampaggio di micropattern. (A) La vista laterale e superiore del francobollo che mostra la trama in microscala (500 μm di altezza e 250 μm di larghezza pillar-array) viene utilizzata per ricreare l'interfaccia del tessuto della cripta del colon e la vista superiore e laterale del gruppo francobollo-chip, mostrando l'adattamento dei due elementi quando utilizzati per fondere la superficie del gel. (B) Vista laterale angolata che mostra l'interfaccia tra timbro e chip. (C-E) Immagini della superficie del gel micromodellato con e senza cellule. Barre scala: 200 μm. Questa cifra è stata adattata con il permesso di Varone et al.24. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 7: Dati rappresentativi ottenuti con il chip cutaneo open-top. (A) Schema che mostra la sequenza d'azione per la preparazione di chip cutanei open-top e fornisce le fasi biologiche chiave della coltura di chip cutanei open-top. (B) Colorazione con citocheratina PCNA 14, citocheratina10, involucrina e fluorescenza Fillagrin e H&E che mostrano epidermide stratificata multistrato matura differenziata on-Chip. Barre della scala: 100 μm. (C) Immagine in alto della sezione trasversale Skin-Chip (Scale bars: 5 mm) e H&E (Scale bars: 100 μm) che mostra la presenza dei fibroblasti all'interno dello strato dermico. (D) PECAM-1, VE-Cadherin e Von Willebrand Colorazione a fluorescenza che mostra la differenziazione delle cellule endoteliali microvascolari umane co-coltivate nel chip cutaneo open-top. Barre della scala: 20 μm. (E) Rendering concettuale 3D Cartoon del chip skin-top open-top. Questa cifra è stata adattata con il permesso di Varone et al.24. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 8: Dati rappresentativi ottenuti con il chip delle vie aeree open-top. (A) Schema che mostra la sequenza d'azione per la preparazione dei chip delle vie aeree in superficie aperta e fornisce la fase biologica chiave della coltura Open-Top Airway-Chip. (B) MUC5AC (Calice a secchio), α e β-tubulina (cellule ciliate), proteina 16 delle cellule Clara (cellule club), p63 (cellule basali/progenitrici) e colorazione a fluorescenza ZO-1 che mostra epitelio maturo delle vie aeree. Barre della scala: 20 μm. (C) Video/immagine a contrasto di fase che mostra la presenza di ciglia battenti. Barre della scala: colorazione H&E da 50 μm. (D) (barre della scala: 20 μm) e immagine TEM (barre della scala: 5 μm) che mostrano epitelio pseudo-stratificato maturo differenziato su chip. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 9: Dati rappresentativi ottenuti con il chip di alveolo open-top. (A) Schema che mostra la sequenza d'azione per la preparazione del chip di alveolo open-top e fornisce la fase biologica chiave della coltura di chip di alveolo open-top. (B) Colorazione con fluorescenza di tipo I (HTI-56, AT1-α), di tipo II (HTII-280, LAMP3, ABCA3, tensioattivo (C) ed E-caderina che mostra la presenza di pneumociti maturi su chip. Barre della scala: 20 μm. (C) Immagine SEM e TEM che mostra la presenza di microvilli e vescicole lisosomiali che evidenziano fenotipo alveolare maturo. Barre della scala: 5 μm. (D) Sezione trasversale H&E (Barre della scala: 5 μm) che conferma la presenza di cellule piatte e squamose coerenti con il fenotipo di Tipo I e cellule cuboidali, simili a ciottoli coerenti con il fenotipo di Tipo II, e (E) che mostrano la presenza dei fibroblasti all'interno dello strato dermico (Barre della scala: 10 μm). (F) Rendering concettuale di cartoni animati 3D del chip di alveolo open-top. Questa cifra è stata adattata con il permesso di Varone et al.24. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 10: Dati rappresentativi ottenuti con il chip intestinale aperto. (A) Schema che mostra la sequenza d'azione per la preparazione di chip intestinali aperti e fornisce la fase biologica chiave della coltura di chip intestinali aperti. (B) Vista laterale angolata che mostra l'assemblaggio Stamp e Chip durante la fase di fusione del gel, il concetto di cartone animato del gel micromodellato e le immagini a contrasto di fase di una struttura simile a una cripta micromodellata sulla superficie del gel e seminata con colonoidi a due diverse altezze. Barre della scala: 200 μm. (C) Colorazione a fluorescenza della mucina 2 e della caderina E-caderina che mostra la presenza di enterociti e cellule caliciformi mature su chip. Barre della scala: 200 μm. (D) Sezione trasversale H&E di una struttura simile a una cripta che mostra la presenza dei fibroblasti all'interno dello strato dermico e conferma la presenza di un semplice epitelio colonnare. Barre di scala: 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Video supplementare 1: Video a contrasto di fase che mostra ciglia che battono. Barre di scala: 100 μm. Clicca qui per scaricare questo file.
Figura supplementare 1: Assemblaggio di chip open-top. (A) Schema che mostra la resa tridimensionale dell'assemblaggio Open-Top Chip e la resa cartoon del chip skin-top open-top con i diversi compartimenti biologici evidenziati e inclusi epiteliali (blu), dermici (gialli) e vascolari (rosso). (B) La piattaforma microfluidica assemblata ha un formato di 35 mm x 17 mm, un'area di coltura tissutale di 0,32 cm2, un canale microfluidico a spirale inferiore e un coperchio della camera con un canale microfluidico. (C) La piattaforma comprende una camera con una parete angolata di 5 gradi, che ha un diametro di 6 mm a livello della membrana e 5,7 mm nella parte superiore della parete della camera PDMS e un'altezza di 4 mm e larghezza. La membrana porosa ha uno spessore di 50 μm e i pori hanno un diametro di 7 μm. (D) Il canale microfluidico inferiore a forma di spirale ha dimensioni della sezione trasversale di 400 μm (altezza) x 600 μm (larghezza). (E) Una panoramica della cronologia dell'esperimento e dei passaggi necessari per preparare l'Open-Top Organ-Chip. Clicca qui per scaricare questo file.
Tabella supplementare 1: Pelle. La tabella fornisce un riepilogo dei passaggi giornalieri chiave e dei parametri di allungamento e flusso utilizzati durante le tre fasi della coltura Open-Top Skin-Chip (crescita, proliferazione e differenziazione). La tabella fornisce anche l'elenco dei materiali, le formulazioni dei mezzi e le istruzioni su come preparare i supporti necessari per questo protocollo. La composizione dei tre supporti è ottimizzata per le diverse fasi del protocollo. In particolare, Medium I è ottimizzato per la fase di semina e coltura precoce dei cheratinociti. Medium II è ottimizzato per la proliferazione e la differenziazione precoce (formazione di un epitelio stratificato). Il mezzo ALI è ottimizzato per mantenere i cheratinociti in un'interfaccia aria-liquido fino a quando non viene prodotta un'epidermide completamente differenziata. Clicca qui per scaricare questo file.
Tabella supplementare 2: Alveolo. La tabella fornisce un riepilogo delle fasi giornaliere chiave e dei parametri di allungamento e flusso utilizzati durante le tre fasi della coltura di chip alveolo open-top (crescita, proliferazione e differenziazione). La tabella fornisce anche l'elenco dei materiali, le formulazioni dei mezzi e le istruzioni su come preparare i supporti necessari per questo protocollo. La composizione dei due supporti è ottimizzata per le diverse fasi del protocollo. Si noti che l'aggiunta di integratori (KIAD) al terreno di coltura cellulare è fondamentale per ottenere una differenziazione ottimale degli pneumociti. Clicca qui per scaricare questo file.
Tabella supplementare 3: Vie aeree. La tabella fornisce un riepilogo dei passaggi giornalieri chiave e dei parametri di allungamento e flusso utilizzati durante le tre fasi della coltura open-top airway-chip (crescita, proliferazione e differenziazione). La tabella fornisce anche l'elenco dei materiali, la formulazione del mezzo e le istruzioni su come preparare il mezzo necessario per questo protocollo. La composizione del mezzo è ottimizzata per mantenere le cellule delle vie aeree all'interfaccia aria-liquido, che a sua volta induce la differenziazione terminale e stimola la produzione di muco. Clicca qui per scaricare questo file.
Tabella supplementare 4: Intestino. La tabella fornisce un riepilogo delle fasi giornaliere chiave e dei parametri di allungamento e flusso utilizzati durante le tre fasi della coltura di chip intestinali aperti (crescita, proliferazione e differenziazione). La tabella fornisce anche l'elenco dei materiali, le formulazioni dei mezzi e le istruzioni su come preparare i supporti necessari per questo protocollo. Le composizioni di entrambi i media sono ottimizzate per le diverse fasi del protocollo. In particolare, il mezzo di dilatazione integrato con gli inibitori CHIR e ROCK è ottimizzato per la semina e la fase iniziale della coltura perché promuove la sopravvivenza e la crescita del frammento organoide del colon come monostrato. Il mezzo di espansione è ottimizzato per la proliferazione e la differenziazione precoce del monostrato epiteliale. Il mezzo di differenziazione è ottimizzato per la differenziazione terminale del monostrato epiteliale prima dell'esposizione all'interfaccia aria-liquido. Clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
L'Open-Top Chip rappresenta una piattaforma abilitante per studiare la complessa interazione cellulare che si verifica tra endotelio, stroma ed epitelio in un microambiente controllato, in tempo reale. Questa tecnologia offre vantaggi critici rispetto alle colture organotipiche e organoidi convenzionali, come l'integrazione di segnali fisici e biochimici rilevanti per ricostituire il microambiente del tessuto umano, tra cui taglio fluidico (flusso), allungamento ciclico e ricostruzione della topografia della superficie epiteliale ottenuta tramite micropatterning. Le cellule umane che crescono all'interno di questa piattaforma agiscono in sinergia per ricapitolare le funzioni specifiche del tessuto che possono essere analizzate tramite tecniche convenzionali, tra cui istochimica immunitaria e saggi biochimici utilizzando i fluidi di deflusso (o effluenti) dai compartimenti superiore e / o inferiore. Il design attuale consente un facile accesso allo strato epiteliale, dove le cellule crescono a diretto contatto con fibroblasti tessuto-specifici e altre cellule stromali, imitando l'architettura multicellulare dei tessuti epiteliali. In particolare, il prototipo Open-Top Chip offre una soluzione praticabile alle sfide comuni associate all'uso di altre piattaforme organ-on-chip. Mentre consente l'incorporazione di diversi tipi di cellule all'interno di un compartimento stromale che porta alla creazione di tessuti 3D molto complessi, consente anche una facile estrazione dei costrutti tissutali stabiliti dal dispositivo chip per l'analisi a valle, compresa la colorazione H&E convenzionale.
Il design attuale presenta alcune limitazioni. Ad esempio, la membrana elastica interposta tra il microcanale vascolare e il compartimento stromale (idrogel) del prototipo Open-Top Chip è considerevolmente più spessa (≈ 50 μm contro ≈ 1 μm) rispetto allo spazio interstiziale che separa i tessuti endoteliali dallo stroma negli organi umani nativi. Sebbene la membrana elastica non rappresenti una barriera fisica alla diffusione di grandi molecole, come ormoni e altri fattori paracrini che mediano la diafonia intercellulare tra i tessuti, può limitare le interazioni dirette cellula-cellula e la migrazione delle cellule dal compartimento vascolare a quello stromale. Infine, il prototipo Open-Top Chip è realizzato in PDMS, che è noto per assorbire un vasto numero di composti idrofobici. Questa limitazione è condivisa da molte piattaforme basate su PDMS che possono costituire un serio ostacolo nelle applicazioni destinate a testare la farmacodinamica e la farmacocinetica di piccoli composti terapeutici27.
Una delle principali sfide dell'integrazione di idrogel 3D in un dispositivo microfluidico come l'Open-Top Chip, è che il PDMS non fornisce un substrato ottimale per il legame di proteine o cellule umane. La funzionalizzazione chimica della superficie PDMS è quindi un passaggio critico in questo protocollo necessario per garantire il corretto rivestimento ECM e l'adesione dell'idrogel alla camera del gel del modello Open-Top Chip. Per ottenere risultati ottimali, l'agente reticolante nella soluzione ER1 deve essere sempre protetto dall'esposizione diretta alla luce. Un indicatore importante dello stato reattivo del reticolante è il suo colore. Il reticolante nell'ER1, infatti, subisce una transizione di colore dall'arancio brillante al marrone scuro quando si ossida. La transizione di colore può essere utilizzata come indicatore dopo la fase di attivazione UV per verificare se la soluzione ha reagito efficacemente con la superficie PDMS. Durante la preparazione della soluzione reticolante, la transizione di colore deve essere monitorata per garantire che un'esposizione accidentale alla luce diretta non foto-sbiancare il composto chimico nella soluzione. Per proteggere la soluzione reticolante ed evitare qualsiasi fotosbiancamento indesiderato, suggeriamo di avvolgere un foglio di alluminio, circa 15 cm x 15 cm, attorno a un tubo conico da 15 ml o utilizzando un tubo ambrato disponibile sul mercato. L'utilizzo dell'ER1 consente un metodo semplice ed efficace per ottenere una rapida funzionalizzazione delle superfici PDMS; tuttavia, ci sono altre molecole che possono essere utilizzate al posto di ER1. Ad esempio, i reticolanti chimici 3-amminopropil-trimetossisilano (APTMES) non sono fotosensibili come l'ER1 e possono essere utilizzati per ottenere risultati simili con alcuni passaggi aggiuntivi come abbiamo precedentemente descritto altrove28,29. Indipendentemente dalla molecola scelta, uno dei principali vincoli nel lavorare con un reticolante chimico è la presenza di residui residui, che possono indurre citotossicità. Dopo la reazione di attivazione, è importante risciacquare le superfici microfluidiche con abbondanti volumi di soluzione di lavaggio.
Poiché le bolle d'aria tendono a formarsi e crescere all'interno delle interfacce idrofobiche dei chip, dei tubi e dei connettori, è importante valutare se il percorso microfluidico è libero da bolle d'aria prima di iniziare il flusso del fluido. Le bolle possono infatti interrompere il flusso e persino uccidere le cellule quando i chip sono collegati al flusso. L'adescamento dei componenti microfluidici prima di iniziare il flusso del fluido ridurrà il rischio di generare bolle d'aria e contribuirà a ottenere risultati ottimali e riproducibili. Se il ciclo di adescamento descritto in questo protocollo non fosse sufficiente, il risciacquo dei tubi microfluidici con etanolo (5 min) e quindi con HBSS (20 min) ridurrà ulteriormente il rischio di generare bolle d'aria all'interno dei connettori fluidici.
Nonostante i suoi limiti, PDMS possiede una rara combinazione di proprietà chimiche che ha permesso la fabbricazione di dispositivi microfluidici altamente biocompatibili, trasparenti ed elastici. Tutte queste proprietà hanno reso PDMS il materiale più ampiamente applicato per la costruzione dei modelli Organ-on-Chip negli ultimi dieci anni. I recenti progressi nei campi della scienza dei materiali e dell'ingegneria chimica30,31 suggeriscono che la componente PDMS di questa piattaforma potrebbe essere sostituita nel prossimo futuro con nuovi polimeri sintetici o biomateriali. Se raggiunto con successo, potrebbe consentire la ricapitolazione delle proprietà specifiche del tessuto, tra cui la porosità, la composizione ECM dello spazio interstiziale fornendo un mimetismo più vicino ai tessuti nativi umani e modelli più avanzati per studi farmacologici. Prevediamo che la futura evoluzione del design Open-Top Chip consentirà la modellazione di tessuti e organi umani con un livello di dettaglio senza precedenti.
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Disclosures
Gli autori dichiarano i seguenti interessi finanziari/relazioni personali, che possono essere considerati come potenziali interessi concorrenti: Varone Antonio è un ex dipendente di Emulate Inc. e può detenere partecipazioni in Emulate.
Acknowledgments
Nessuno
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x EMEM | Lonza | 12-684F | Medium; Stroma |
| 18 Gauge needle | MicroGroup | 316H18RW | Tube stainless steel 316 welded, 18RW Full Hard |
| 19 Gauge needle | MicroGroup | 316H19RW | Tube stainless steel 316 welded, 19RW Full Hard |
| 2-Stop PharMed BPT | Cole-Palmer | EW-95723-12 | Tube, 0.25 mm, 12/pack |
| 70% ethanol and wipes | - | - | For surface sterilization |
| 8-Bromoadenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt (8-Br-cAMP) | Sigma | B7880 | Medium supplement |
| A-83-01 | Tocris | 2939 | |
| Adenine | Sigma | A9795 | |
| Advanced DMEM/F12 | Thermo | 12634010 | |
| Airway Epithelial Cells | Lifeline Cell Technology | FC-0016 | |
| Aluminum foil | - | - | - |
| Alveolar cells | Cell Biologics | H6621 | |
| Anti-ABCA3 | ABCAM | ab24751 | Mouse monoclonal antibody [3C9] |
| Anti-Aquaporin5 Alexa Fluor 647 | ABCAM | ab215225 | Rabbit monoclonal antibody [EPR3747] |
| Anti-Aquaporin5 | ABCAM | ab92320 | Rabbit monoclonal antibody [EPR3747] |
| Anti-beta IV Tubulin | ABCAM | ab11315 | Mouse monoclonal antibody [ONS.1A6] |
| Anti-CD31 (PECAM-1) | ABCAM | ab9498 | Mouse monoclonal [JC/70A] antibody |
| Anti-CK5 | ABCAM | ab75869 | Rabbit recombinant monoclonal [AY1E6] |
| Anti-Cytokeratin 10 | ThermoFisher | MA5-13705 | Mouse monoclonal antibody (DE-K10) |
| Anti-Cytokeratin 14 | ABCAM | ab7800 | Mouse monoclonal antibody |
| Anti-E-Cadherin | ABCAM | ab1416 | Mouse monoclonal antibody |
| Anti-Filaggrin | ThermoFisher | PA5-79267 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-HTI-56 | Terrace Biotech | TB-29AHT1-56 | Mouse monoclonal antibody (IgG1) |
| Anti-HTII-280 | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | Mouse monoclonal antibody (IgM) |
| Anti-Involucrin | ThermoFisher | MA5-11803 | Mouse monoclonal antibody (SY5) |
| Anti-Isoforms TA p63-α, -β, -γ | Biolengend | 618902 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Ki67 | ABCAM | ab8191 | Mouse monoclonal antibody [B126.1] |
| Anti-LAMP3 | ABCAM | ab111090 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Mature SP-B | Seven Hill | WRAB-48604 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-MUC5AC | ThermoFisher | PA5-34612 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Mucin-2 | SantaCruz Biotechnology | sc-7314 | Mouse monoclonal antibody (IgG1) |
| Anti-p63 | Dako | GA662 | Mouse monoclonal antibody p63 Protein (Dako Omnis) Clone DAK-p63 |
| Anti-PCNA | ThermoFisher | PA5-32541 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Podoplanin (AT-1α) | ABCAM | ab128994 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Pro + Mature Surfactant Protein B | ABCAM | ab40876 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Surfactant C | Seven Hill | WRAB-9337 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Uteroglobin/SCGB1A1 | Hycult Biotech | HM2178 | Mouse monoclonal antibody [AY1E6] |
| Anti-VE-cadherin | ABCAM | ab33168 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-ZO-1 | ThermoFisher | 33-9100 | Mouse monoclonal antibody [1A12] |
| Ascorbic acid | Sigma | A4544 | |
| Aspirating pipettes | Corning / Falcon | 357558 | 2 mL, polystyrene, individually wrapped |
| Aspirating tips | - | - | Sterile (autoclaved) |
| B27 | Thermo | 17504044 | |
| Blocker BSA (10X) in PBS solution | ThermoFisher | 37525 | Blocker agent |
| Calcium Chloride | Sigma | C7902 | |
| CHIR 99021 | Tocris | 4423 | |
| Collagen I | Advanced Biomatrix | 5133 | 10 mg/mL (Stroma) |
| Collagen I | Advanced BioMatrix | 5005 | 3 mg/mL (Vascular ECM) |
| Collagen IV | Sigma | C5533 | |
| Collagen-IV | Sigma | C5533-5MG | Collagen from human placenta, 5 mg powder, reconstitute to 1 mg/mL |
| Colonic Fibroblasts | Cell Biologics | H6231 | |
| Colonic microvascular endothelial cells | Cell Biologics | H6203 | |
| Conical tubes | - | - | 15 mL and 50 mL polypropylene, sterile |
| Crosslinker (ER-1) | Emulate | 10461 | 5 mg powder |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | ThermoFisher | D3571 | DNA probe |
| Dermal fibroblasts | ATCC | PCS-201-010 | |
| Dermal microvascular endothelial cells | ATCC | CRL-3243 | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
| DMEM | ThermoFisher | 11054020 | |
| DMEM/F-12 | GIBCO | 11320082 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX | GIBCO | 10565-018 | Basal medium for ALI medium |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) | ABCAM | ab150105 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568) | ABCAM | ab175472 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) | ABCAM | ab150107 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | ABCAM | ab150073 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568) | ABCAM | ab175470 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 647) | ABCAM | ab150075 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Dulbecco’s PBS (DPBS-/-) (without Ca2+, Mg2+) | Corning | 21-031-CV | 1x |
| Epidermal Growth Factor (EGF) human, recombinant in E. coli | PromoCell | C-60170 | Medium supplement |
| F-12 Ham’s | Invitrogen | 21700-108 | For vascular ECM |
| FibriCol | Advanced BioMatrix | 5133-20ML | Collagen-I solution (10 mg/mL) |
| Fibronectin | Corning | 356008 | |
| Fibronectin, Human, Natural, | Corning | 47743-654 | human plasma fibronectin |
| Fine-tip precision tweezers | Aven | 18056USA | Technik Style 5B-SA Precision Stainless Steel Tweezers |
| Glutamax | Invitrogen | 21700-108 | |
| Glutamax | Invitrogen | 35050061 | |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 594) | ABCAM | ab150080 | Goat Anti-Mouse secondary antibody |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) | ABCAM | ab150115 | Goat Anti-Mouse secondary antibody |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (FITC) | ABCAM | ab6785 | Goat Anti-Mouse secondary antibody |
| Goat Anti-Mouse IgG1 Alexa Fluor 568 | ThermoFisher | A-21124 | Goat Anti-Mouse IgG1 secondary antibody |
| Goat Anti-Mouse IgM Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A-21042 | Goat Anti-Mouse IgM secondary antibody |
| Handheld vacuum aspirator | Corning | 4930 | - |
| Heat Inactivated HyClone FetalClone II Serum (FCS) | GE Healthcare Life Sciences | SH30066.03 | |
| Hemocytometer | - | - | - |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma | H3149 | |
| HEPES | Thermo | 15630080 | |
| Human [Leu15] - Gastrin | Sigma | G9145 | |
| Human colonoids | Obtained from clinical resections | Obtained from clinical resections | |
| Human EGF Recombinant Protein | Thermo | PHG0311L | |
| human epithelial growth factor | Thermo | PHG0311 | |
| HyClone FetalClone II Serum (U.S.) | GE Healthcare | SH30066.02HI | Sterile FBS heat-inactivated |
| Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt | Sigma | H4881 | |
| Hydrocortisone | PromoCell | C-64420 | Medium supplement |
| Ice bucket | - | - | - |
| Ismatec IPC-N | Cole-Palmer | EW-78000-41 | Low-Speed Digital Peristaltic Pump; q24-Channel (1 per 12 Chips) |
| ITES | BioWhittaker | 17-839Z | |
| Keratinocyte Growth Factor (KGF), also known as Basic Fibroblast Growth Factor 7 (FGF-7), human, recombinant in HEK | PromoCell | C-63821 | |
| Keratinocytes | ATCC | PCS-200-010 | |
| Laminin | Biolamina | CT521-0501 | |
| Laminin, 521 CTG (CT521) | Biolamina | CT521-0501 | human recombinant laminin 521 |
| Lung Fibroblast | Cell Biologics | H6013 | |
| Lung Fibroblast | Lifeline Cell Technology | FC-0049 | |
| Lung microvascular endothelial cells | Lonza | CC-2527 | |
| Lung smooth muscle cells | Lifeline Cell Technology | FC-0046 | |
| Manual counter | - | - | - |
| Masterflex (TPE) Transfer Tubing | Cole-Palmer | FV-96880-02 | PharMed BPT, 1/32" ID x 5/32" OD |
| Medium 199, no phenol red | Thermo | 11043023 | |
| Microcentrifuge tube | - | - | 1.5 mL, sterile |
| Microscope (with camera) | - | - | For bright-field imaging |
| N2 | Sigma | 17502001 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma | A5099 | |
| Noggin (HEK293T conditioned medium) | Sigma | N17001 | |
| Normal Goat Serum | ThermoFisher | 50062Z | Blocking solution |
| O-phosphosrylethanolamine | Sigma | P0503 | |
| Paraformaldehyde (4% wt/vol) | EMS | 15710 | Fixing agent |
| Penicillin Streptomycin | GIBCO | 15140122 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P4333 | 10,000 U/mL; 10 mg/mL |
| Pipette tips | - | - | P20, P200, and P1000 sterile, low adhesion |
| Pipette | Gilson | F167380 | P20, P200, and P1000 |
| PluriQ Serum Replacement (or alternatively KO Serum replacement) | AMSBIO (or Thermo) | N/A (or C1910828010) | |
| Poly-L-Lysine coated microscope glass slides | Sigma | P0425 | Glass slides |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| ProLong Gold | ThermoFisher | P36931 | Antifade Mountant with DAPI |
| Retinoic Acid | Sigma | R2625 | |
| ROCK inhibitor (Y27632) | Tocris | TB1254-GMP/10 | |
| R-spondin (HEK293T conditioned medium) | Sigma | SCC111 | |
| SAGM SingleQuots supplements | Lonza | CC-4124 | |
| SAGMTM Small Airway Epithelial Cell Growth medium BulletKitTM | Lonza | CC-4124 | Medium supplements |
| SB2001190 | Tocris | 1264/10 | |
| Serological pipettes | - | - | 2 mL, 5 mL, 10 mL, and 25 mL low endotoxin, sterile |
| Small Airway Epithelial Cell Growth medium (SAGM) | Lonza | CC-4124 | |
| Solvent Buffer (ER-2) | Emulate | 10462 | 25 mL bottle |
| Steriflip-HV | Millipore | SE1M003M00 | Sterile filtering conical tube |
| Sterilin 100 mm Square Petri Dishes | Thermo | 103 | Sterile, 1 per 6 chips |
| T25 flasks | - | - | - |
| T75 flasks | - | - | - |
| Tri-iodothyronine | Sigma | T5516 | |
| Triton X-100 (0.3% (vol/vol) | Sigma | T8787 | Permeabilization agent |
| Trypan blue | Sigma | 93595 | 0.4% solution |
| TrypEE solution | Sigma | 12604013 | Cell detaching solution |
| TWEEN-20 | Sigma | P2287 | Permeabilization agent |
| UV Light Oven (peak frequency 365nm, intensity of 100 µJ/cm2) | VWR | 21474-598 | UVP, Long Range UV, 365 nm 60Hz Model CL-1000L |
| Vacuum set-up | - | - | Minimum pressure: -70 kPa |
| Vascular Endothelial Growth Factor 165 (VEGF-165) human, recombinant in E. coli | PromoCell | C-64420 | |
| VEGF-165 | PromoCell | C-64420 | Medium supplement |
| Von Willebrand Factor conjugated FITC | ABCAM | ab8822 | Sheep polyclonal antibody |
| Water bath (or beads) | - | - | Set to 37 °C |
| Wnt3A (L-Wnt3A conditioned medium) | ATCC | CRL-2647 |
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