Summary
במחקר זה, מודל חולדה של השראת דלקת חניכיים מוצג באמצעות שילוב של ליגטורה חוזרת וזריקות חוזרות ונשנות של ליפופוליסכריד שמקורו בפורפירומונס חניכיים, במשך 14 יום סביב הטוחנות המקסילריות הראשונות. טכניקות הקשירה וההזרקה LPS היו יעילות בגרימת דלקת פרידונטיקה, וכתוצאה מכך אובדן עצם מכתשית ודלקת.
Abstract
פריודונטיטיס (PD) היא מחלה דלקתית-חיסונית כרונית שכיחה ביותר של החניכיים, הגורמת לאובדן רקמת חניכיים רכה, רצועה פריודונטלית, צמנטום ועצם מכתשית. במחקר זה מתוארת שיטה פשוטה של השראת פרקינסון בחולדות. אנו מספקים הוראות מפורטות למיקום מודל הליגטורה סביב הטוחנות המקסילריות הראשונות (M1) ושילוב של זריקות ליפופוליסכריד (LPS), הנגזר מחניכיים מסוג Porphyromonas בצד המזיו-פלטלי של M1. השראת דלקת חניכיים נשמרה במשך 14 יום, קידום הצטברות של חיידקים, ביופילם ודלקת. כדי לאמת את המודל של בעלי החיים, IL-1β, מתווך דלקתי מרכזי, נקבע על ידי בדיקה חיסונית בנוזל החניכיים (GCF), ואובדן עצם מכתשית חושב באמצעות טומוגרפיה ממוחשבת של קרן חרוט (CBCT). טכניקה זו הייתה יעילה בקידום נסיגת חניכיים, אובדן עצם מכתשית ועלייה ברמות IL-1β ב- GCF בסוף הליך הניסוי לאחר 14 יום. שיטה זו הייתה יעילה בגרימת מחלת פרקינסון, ובכך ניתן היה להשתמש בה במחקרים על מנגנוני התקדמות המחלה וטיפולים אפשריים בעתיד.
Introduction
דלקת חניכיים (PD) היא מחלת בריאות הציבור השישית בשכיחותה בעולם, המשפיעה על כ-11% מכלל האוכלוסייה, בהיותה צורה מתקדמת, בלתי הפיכה והרסנית של מחלת חניכיים 1,2. PD הוא תהליך דלקתי המשפיע על רקמות החניכיים והחניכיים, הגורם לנסיגת חניכיים, נדידה אפיקלית של אפיתל צומת עם התפתחות כיס, ואובדן עצם מכתשית3. יתר על כן, מחלת פרקינסון קשורה למספר מחלות מערכתיות, כולל מחלות לב וכלי דם, השמנת יתר, סוכרת ודלקת מפרקים שגרונית, שעבורן גורמים סביבתיים וספציפיים למארח ממלאים תפקיד משמעותי 4,5.
לפיכך, פרקינסון היא מחלה רב-גורמית הנגרמת בעיקר על ידי הצטברות של פלאק מיקרוביאלי - הנובע מדיסביוזה של קהילות מיקרוביאליות - ועל ידי תגובה חיסונית מוגזמת של המאכסן לפתוגנים חניכיים, מה שמוביל לפירוק רקמת חניכיים 4,6. מבין מספר חיידקי חניכיים, החיידק האנאירובי הגראם-שלילי Porphyromonas gingivalis הוא אחד הפתוגנים המרכזיים במחלת פרקינסון4. P. gingivalis מכיל ליפופוליסכריד מורכב (LPS) בדפנותיו, מולקולה הידועה כגורמת להסננת לויקוציטים פולימורפו-גרעיניים ולהרחבת כלי הדם ברקמות חניכיים דלקתיות7. התוצאה היא ייצור של מתווכי דלקת, כגון אינטרלוקין 1 (IL-1), IL-6 ו- IL-8, גורם נמק גידולי (TNF), או פרוסטגלנדינים, עם הפעלת אוסטאוקלסטים וספיגת עצם לאחר מכן, מה שמוביל להרס רקמות ולאובדן שיניים סופי3.
בין היתרונות השונים של מודלים בבעלי חיים ניתן למנות את היכולת לחקות מורכבויות תאיות כמו בבני אדם, או להיות מדויקים יותר מאשר מחקרי מבחנה , המתבצעים על משטחי פלסטיק עם סוגי תאים מוגבלים8. לצורך מידול ניסויי של PD in vivo, נעשה שימוש במינים שונים של בעלי חיים, כמו פרימטים לא אנושיים, כלבים, חזירים, חמוסים, ארנבות, עכברים וחולדות9. עם זאת, חולדות הן המודל הנחקר ביותר בבעלי חיים עבור הפתוגנזה של פרקינסון מכיוון שהן זולות וקלות לטיפול10. לרקמת החניכיים הדנטלית שלהם יש תכונות מבניות דומות לרקמת חניכיים אנושית, עם חריץ חניכיים רדוד ואפיתל צומת המחוברים לפני השטח של השן. יתר על כן, כמו בבני אדם, אפיתל צומת מאפשר מעבר של חיידקים זרים, ומפריש מתאים דלקתיים 9.
אחד המודלים הניסיוניים המדווחים ביותר של השראת פרקינסון בחולדות הוא מיקום הליגטורות סביב השיניים, שהוא מאתגר מבחינה טכנית אך אמין10. מיקום הליגטורה מאפשר הצטברות רובד שיניים וחיידקים, ויוצר דיסביוזיס בסולצ'י החניכיים, הגורם לדלקת והרס רקמת חניכיים11. אובדן התקשרות חניכיים וספיגה מחדש של עצם מכתשית יכול להתרחש תוך 7 ימים במודל חולדהזה 8.
מודל נוסף של בעלי חיים לפרקינסון מורכב מהזרקת LPS לרקמת החניכיים. כתוצאה מכך, osteoclastogenesis ואובדן עצם מגורים. המאפיינים ההיסטופתולוגיים של מודל זה דומים לפרקינסון שהוקם על ידי בני אדם, ומאופיין ברמות גבוהות יותר של ציטוקינים מעודדי דלקת, פירוק קולגן וספיגת עצם מכתשית 6,8.
לפיכך, מטרת מחקר זה הייתה לתאר מודל פשוט של חולדה של PD ניסיוני המבוסס על טכניקות של זריקות P. gingivalis-LPS (Pg-LPS), בשילוב עם מיקום רצועות סביב הטוחנות המקסילריות הראשונות (M1). זהו מודל בעל מאפיינים דומים לאלה שנצפו במחלת פרקינסון בבני אדם, אשר יכול לשמש לחקר מנגנוני התקדמות המחלה וטיפולים אפשריים עתידיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: פרוטוקול הניסוי של המחקר אושר על ידי הוועדה האתית לניסויים בבעלי חיים של מכון המחקר לבריאות האיים הבלאריים (CEEA-UIB; מספר סימוכין 163/03/21).
1. הרדמה של בעלי חיים והכנת הליכים
- יש לעקר את כל כלי הניתוח (פערי פה מאלומיניום, סייר שיניים, לאנס יהלום, מספריים כירורגיים, צבת מיקרוכירורגית, מחזיק מחט מיקרו, מגלף חלול, מעלית מיקרוכירורגית פריאוסטלית ומספריים מיקרוכירורגיים) (5 דקות ב-135°C) לפני הניתוח.
- הכינו את כל הפתרונות הדרושים להליך בתנאים סטריליים, כמתואר:
- הכינו תערובת של קטמין (60 מ"ג/מ"ל) וקסילזין (8 מ"ג/מ"ל) על ידי ערבוב של 1.6 מ"ל קטמין עם 1 מ"ל קסילזין מדולל בתמיסת חיץ פוספט (PBS)/מלוחים. אחסן את המלאי ב 4 °C.
- לדלל Atipamezole לריכוז סופי של 0.25 מ"ג / מ"ל PBS / מלוחים. אחסן את המלאי ב 4 °C.
- לדלל Buprenorphine לריכוז סופי של 0.03 מ"ג / מ"ל PBS / מלוחים. אחסן את המלאי ב 4 °C.
- מכינים 1 מ"ל של Pg-LPS (1 מ"ג/מ"ל) במי מלח סטריליים. אחסן את המלאי ב -20 °C.
- לצורך הניסוי, השתמשו בחולדות וויסטאר נקבות וזכרים, בנות 12 שבועות ובמשקל 210-350 גרם בזמן הניתוח. שמרו על בעלי החיים בקבוצות בסביבה המתאימה ובתנאים קבועים (20-24 מעלות צלזיוס, 12 שעות ביום מחזורי אור-חושך), עם מזון ומים סטנדרטיים, המוצעים אד ליביטום.
- כדי לגרום להרדמה, לשקול את החולדה ולתת את תערובת קטמין/קסילזין בריכוז של 80/10 מ"ג/ק"ג תוך צפקי (IP), באמצעות מחט היפודרמית סטרילית 25 גרם ומזרק 1 מ"ל.
- לאחר שהחולדה מורדמת, הניחו את החיה על גבה על פלטפורמה כירורגית מחוממת; במהלך ההליך, לכסות את הגוף של החיה כדי למנוע אובדן חום.
הערה: עומק ההרדמה מוערך על ידי אובדן רפלקס הדוושה במהלך ההליך ועל ידי ניטור סימנים חיוניים. במידת הצורך, השתמש בקונוס אף קטן כדי לשמור על הרדמה עם 2% איזופלורן ב-100% חמצן. יש למרוח משחת עיניים סטרילית על שתי העיניים לאחר השראת הרדמה כדי להגן על הקרניות ולמנוע התייבשות. - במהלך ההליכים, לנהל 100% חמצן באמצעות חרוט אף קטן, ולפקח על קצב הדופק וריווי חמצן על ידי אוקסימטריה הדופק.
הערה: אם ריווי החמצן וקצב הדופק יורדים מתחת ל-95% ו-190 פעימות לדקה, בהתאמה, יש להפסיק את ההליך ולמקם את בעל החיים במצב דקוביטוס לטרלי עד להגעה לערכים נורמליים. - יש לפתוח את פי החולדה באמצעות פה אלומיניום סביב החותכות (עליונות ותחתונות), למשוך את הלשון באמצעותה ולייצב את המקסילה והלסת התחתונה בתנוחת עבודה פתוחה ונוחה, המאפשרת גישה לטוחנות מנדיבולאריות.
הערה: אם בעל החיים צריך להיות ממוקם decubitus לרוחב, להסיר את הפה gag לפני שינוי המיקום שלה לטובת התאוששות. לאחר הרדמת בעל החיים, יש לאסוף את נוזל החניכיים (GCF) לפני הניתוח (דגימה בתנאי בסיס) (יום 0). - אסוף GCF כמתואר בשלבים הבאים:
- הניחו את בעל החיים על גבו על משטח כירורגי וייצבו את המקסילה והלסת התחתונה במצב פתוח עם סתימות פה מאלומיניום.
- יש לאסוף GCF באמצעות ארבע (שתיים לכל M1) נקודת נייר סופג nº 30 (קוטר 0.03 ס"מ x אורך 3 ס"מ), על ידי הכנסתו לנקיק החניכיים (רווח בין אפיתל חניכיים לאמייל סמוך) סביב המזו-פלטל של M1 עד להתנגדות קלה. שמור על נקודת הנייר באותו מיקום למשך 30 שניות בסך הכל לפני ההסרה המיידית.
- לאחר האיסוף, העבירו את נקודת הנייר מיד לבקבוקון פלסטיק, ואחסנו בטמפרטורה של -80°C עד לביצועי המבחן.
2. טכניקת ליגטורה שומרת והזרקת Pg -LPS תוך חניכיים
הערה: מודל הליגטורה נוצר (יום 0) על ידי הנחת ליגטורה משי קלועה סטרילית (5/0) סביב M1 דו-צדדית בתוך חריץ החניכיים באמצעות מכשירים מיקרוכירורגיים ואבטחתו עם קשרי המנתח על משטח החיך. המכשירים המיקרוכירורגיים ששימשו היו צבת מיקרוכירורגית, מחזיק מחט מיקרו, מגלף חלול, מעלית מיקרוכירורגית פריאוסטאלית ומספריים מיקרוכירורגיים. נעשה שימוש גם בזכוכית מגדלת כירורגית עם מקור אור LED (הגדלה פי 3.6).
- מקמו את הזנב הדיסטלי של התפר בצד החיך של השיניים והכניסו את המקטע הפרוקסימלי בין המגע של M1 לטוחנות מקסילריות שניות (M2).
- השתמש במעלית המיקרוכירורגית הפריאוסטאלית כדי להחדיר את התפר בתוך החריץ. לעטוף את הרצועה סביב פני השטח buccal של M1 בזהירות רבה, כמו הרקמות ברמה זו להציג אזור צר של חניכיים מחובר. בהיבט החיך, יש לוודא שהתפר מהודק בשני קצותיו כדי לוודא שהוא נדחף לתוך החריץ של החניכיים.
הערה: אם נצפתה התנגדות בעת החדרת התפר בין ה-M1 ל-M2, ניתן לפתוח מעט את המגע באמצעות סייר דנטלי ובור בצורת לאנס יהלום. - קשרו את קצות התפר בקשר מנתח וקצצו את הזנבות קצרים ככל האפשר. הכנס את הקשר לחריץ.
הערה: קצוות של כלי ניתוח עלולים לגרום לטראומה ודימום דרך הפה. הכינו מקטעים קטנים של גזה או צמר גפן כדי להסיר דם מחלל הפה ולהפעיל לחץ כדי לעצור כל דימום. ניהול זהיר של רקמות רכות בגישה מיקרוכירורגית ממזער סיבוכים כירורגיים ומוביל לפחות טראומה לרקמות. - לאחר מיקום הליגטורה, יש להזריק 40 μL של Pg-LPS במי מלח סטריליים עם מחט היפודרמית סטרילית 25 G ומזרק 1 מ"ל לרקמה התת-חניכית (בין שורש או צוואר השן לשולי החניכיים) בצד המזו-פלטלי של M1 באופן דו-צדדי (יום 0).
3. סיום ההליך
- לאחר מיקום הקשירה ויישום Pg-LPS, שחררו את החולדה מהמצב הניתוחי והניחו אותה בכלוב אישי נקי תחת מנורת חום.
- הזריקו לאנטגוניסט Atipamezole (0.5 מ"ג/ק"ג תת עורית (SC)) מחט היפודרמית סטרילית 25 גרם ומזרק 1 מ"ל.
- להקלה על כאבים, יש להזריק 0.03 מ"ג/ק"ג Buprenorphine, SC.
- עקוב אחר התאוששות החיה עד שהשפעות הפעולה מתהפכות לחלוטין. לשכן כל חולדה בנפרד בסביבה המתאימה בתנאים קבועים (20-24 מעלות צלזיוס, 12 שעות ביום מחזורי אור-חושך). הציעו מזון ומים נטולי יונים.
- במהלך היומיים הראשונים לאחר ההליך, לשקול את בעלי החיים ולהזריק Buprenorphine SC פעמיים ביום להקלה על הכאב.
הערה: Buprenorphine יכול להינתן לפני תחילת ההליך כדי לחסל את אפקט בסופו של דבר. - במהלך הניסוי, עקוב אחר בעלי החיים לפי משקל והערכת התנהגות כללית פעם או פעמיים בשבוע.
4. מעקב לאחר ההליך
הערה: השראת פרקינסון נשמרה במשך 14 יום כדי לקדם הצטברות של ביופילם חיידקים ודלקת כתוצאה מכך. יש לבדוק ולהתאים את הליגטורות, ומוזרק Pg-LPS שלוש פעמים בשבוע (יום 2, יום 4, יום 6, יום 8, יום 10 ויום 12).
- בדוק והתאם את הרצועה (יום 2, יום 4, יום 6, יום 8, יום 10 ויום 12) באופן הבא:
- מרדימים עם 2% איזופלורן ב-100% חמצן באמצעות תא השראת הרדמה.
- לאחר שהחולדה מורדמת, הניחו את בעל החיים על גבו והשתמשו במהלך ההליך בחרוט אף קטן עם 1% איזופלורן ב-100% חמצן לתחזוקת חומר ההרדמה של החיה.
- יש לפתוח את פי החולדה באמצעות פיו של האלומיניום סביב החותכות (עליונות ותחתונות), למשוך באמצעותו את הלשון ולייצב את המקסילה והלסת התחתונה בתנוחת עבודה פתוחה ונוחה, המאפשרת גישה לליגטורות.
- הדקו את הרצועות כנגד החניכיים בעזרת מעלית מיקרוכירורגית פריאוסטיאלית, וודאו שתפר הליגטורות מוכנס, מה שיוצר דלקת סביב החניכיים.
הערה: ייתכן כי 7-10 ימים לאחר הניתוח, ליגטורות אובדות. אם זה קורה, בצע את הפרוטוקול כפי שהוסבר עבור הזרקת Pg-LPS (שלב 2.4).
- לאחר התאמת הליגטורה, יש להזריק באופן דו-צדדי 40 מיקרוליטר של Pg-LPS עם מחט היפודרמית סטרילית של 25 גרם ומזרק של 1 מ"ל לרקמה התת-חניכית בצד המזו-פלטלי של M1 (יום 2, יום 4, יום 6, יום 8, יום 10 ויום 12).
- הסר את חרוט האף להרדמה והכנס את החולדה לכלוב שלה. עקוב אחר התאוששות בעל החיים עד שהשפעות ההרדמה מתהפכות לחלוטין.
5. הקרבת בעלי חיים וניתוח
הערה: קיימות אפשרויות שונות להערכת ההתקדמות של מחלת פרקינסון. כאן, הניתוח המתואר מורכב מהערכה של ציטוקינים מעודדי דלקת בנוזל החניכיים (GCF), והערכה של אובדן עצם הנאדית.
- ביום ה-14 של המחקר (יום 14), הקריבו את בעלי החיים עםCO2 בתא פחמן דו-חמצני. שיעור תזוזה של 30% עד 70% מנפח התא לדקה מומלץ למכרסמים.
הערה: חוסר תגובה של בעלי חיים לרפלקס הדוושה והיעדר סימנים חיוניים חייבים להיות מאומתים כדי לאשר המתת חסד. - אסוף GCF כמתואר בשלבים הבאים:
הערה: GCF נאסף לפני השראת פרקינסון (לפני ניתוח) (יום 0) ולאחר זירוז פרקינסון (לאחר הקרבה) (יום 14).- הניחו את בעל החיים על גבו על משטח כירורגי, וייצבו את המקסילה והלסת התחתונה במצב פתוח עם סתימות פה מאלומיניום.
- יש לאסוף את ה-GCF באמצעות נקודת נייר סופג מס' 30 (קוטר 0.03 ס"מ x אורך 3 ס"מ) על ידי הכנסתו לנקיק החניכיים סביב המזו-פלטל של ה-M1 עד להתנגדות קלה. שמור על נקודת הנייר באותו מיקום למשך 30 שניות בסך הכל לפני ההסרה המיידית.
- לאחר האיסוף, העבירו את נקודת הנייר מיד לבקבוקון פלסטיק ואחסנו בטמפרטורה של -80°C עד לביצועי המבחן.
- כדי להעריך חלבונים בתוך GCF, להכין את הפתרונות הבאים ובצע את השלבים של שיטת elution כמתואר:
הערה: IL-1β מוערך על GCF (יום 14) באמצעות immunoassay, על פי פרוטוקול היצרן.- הכינו את חיץ האלוציה טרי ושמרו אותו על קרח לאורך כל תהליך המיצוי כדי לעכב את פעילות הפרוטאז.
- הכינו את כל הפתרונות הדרושים למאגר האלוציה כמתואר:
- להכין 1 מ"ל של Aprotinin (1 מ"ג / מ"ל) במים טהורים במיוחד.
- הכינו 10 מ"ל של פנילמתיל-סולפונילפלואוריד (PMSF) (200 מ"ל) במתנול.
- הוסף 125 μL של PMSF ו- 250 μL של Aprotinin ל- 24.5 מ"ל של תמיסת PBS (pH = 7.4) כדי להכין את מאגר האלוציה.
- יש להמיס טבליה מסחרית אחת של מעכב פוספטאז עם 10 מ"ל של חיץ אלוציה טרי שהוכן למשך 10 דקות תחת תסיסה ב-4°C.
הערה: משך הזמן של אלוציית GCF מוגבל; יש להשתמש מיד עבור צנטריפוגות לאחר הוספת טבליה מעכב phosphatase בתוך 30 הדקות הראשונות. - לאחר הוספת מעכב phosphatase, להוסיף 11 μL של חיץ elution מלא ישירות על הצינור עם נקודות הנייר.
- צנטריפוגה את הצינור ב 452 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
- העבירו את התוכן המדולל לבקבוקון פלסטיק חדש. חזור על תהליך זה ארבע פעמים נוספות כדי להפיק נפח כולל של 50 μL.
- לאחר הצנטריפוגה האחרונה, הוסף נפח כולל של 60 μL ישירות על נקודת הנייר, וצנטריפוגה פעם אחרונה ב 452 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
- השתמש בנפח המדולל הנדרש להערכת חלבון.
- לאחר המתת חסד ואיסוף GCF, בעזרת מספריים כירורגיים, לחתוך את הלסת העליונה של החולדות. נסו לקלף את המסכה של החולדה ולהשאיר כמה שפחות רקמות רכות.
- מקמו את הלסת בשלב המיקרוסקופ לצורך הדמיה וצלמו בהגדלה הרצויה.
- הניחו את הלסת ישירות ב-4% פרפורמלדהיד (PFA) מדולל ב-PBS. רענן פעמיים בשבוע עם PFA חדש למשך 12 יום לקיבוע מלא.
התראה: יש לבצע צעדים הקשורים ל-PFA במכסה אדים בהתאם להמלצות גיליון נתוני הבטיחות. - לאחר קיבוע מלא של הלסת, הערך את אובדן העצם באמצעות סורק טומוגרפיה ממוחשבת של קרן חרוט (CBCT), באופן הבא:
- פתח את המחשב.
- פתח את תוכנית ניתוח CBCT.
- בחר פרוטוקול סריקה > מצב סריקת תותבות.
- בחר שדה ראייה (FOV) > (11x8) HIRes (90 kV של מתח ו- 3 mA של זרם).
- מניחים את המקסילה העליונה הקבועה של החולדות בגן.
- לחץ על הבא.
- לחץ על לחצן צילום רנטגן (לחץ על שלט הרנטגן כדי לבצע את הפליטה והשאר אותו לחוץ למשך כל הסריקה).
- במידת הצורך, מקם מחדש את המקסילה העליונה במרכז המישור הקדמי על ידי לחיצה על כפתור הבקרה, ולאחר מכן לחץ על לחצן צילום רנטגן (לחץ על שלט הרנטגן כדי לבצע את הפליטה והשאר אותו לחוץ למשך כל הסריקה).
- לחץ על הבא.
- לחץ על לחצן צילום רנטגן (לחץ על שלט הרנטגן כדי לבצע את הפליטה והשאר אותו לחוץ למשך כל הסריקה).
- במידת הצורך, מקם מחדש את התותבת במרכז מישור הקשת על ידי לחיצה על כפתור הבקרה, ולאחר מכן לחץ על לחצן צילום רנטגן (לחץ על שלט הרנטגן כדי לבצע את הפליטה והשאר אותה לחוצה למשך כל הסריקה).
- לחץ על הבא.
- לחץ על לחצן התחל (לחץ על שלט הרנטגן כדי לבצע את הפליטה ולהשאיר אותה לחוצה במשך כל תקופת הבחינה). המתן עד לקבלת הודעת עיבוד ולאחר מכן בצע את ההוראות המוצגות.
- מופיעה תצוגת חלון. החזירו את האפור ל- 65% ולחצו על ' החל'.
- לשמירת הסריקה, לחץ על קובץ ושמור אותה בפורמט DICOM. לאחר מכן, לחץ על All Images ובחלון בחירת הייצוא של DICOM, בחר את כל הפרמטרים המוצגים (תמונה ראשונית, ציר מקורי, ציר מעוצב מחדש, multiplanar) ובחר סוג מוגדר מראש.
- עיבוד התמונות המייצגות הדו-ממדיות והסגיטליות של הטוחנות המקסילריות באמצעות תוכנת אנליזה, באופן הבא:
- פתח את התוכנה.
- לחץ על File and Open, ולאחר מכן בחר בתיקייה עם תמונות בתבנית DICOM ולחץ על Open.
- המתן עד שיופיע החלון "המר ל -8 סיביות", בחר את הטווח בין 0 ל -6,000 ולחץ על אישור.
- לחץ על Raw images.
- הגדר את החלק העליון והתחתון של הבחירה כדי להגביל את אזור העניין. חפש את התמונה הראשונה והאחרונה שבהן מופיעה עצם מכתשית ובחר אותה עם החלק העליון של הבחירה והחלק התחתון של פקודות הבחירה .
הערה: ניתן לייצא תמונות דו-ממדיות מייצגות של עצם הנאדית של הטוחנות, כמו באיור 3A,B. - לתמונות מייצגות של קשת, לחצו על Toggle profile bar.
- ציירו קו קשת באמצע החיך ולחצו על ' פרוסת מודל'. קבעו פרמטרים לתיחום אזור העניין (מרווח בין פרוסות: 1; מספר פרוסות: 100) ולחצו על הלחצן 'אשר'. המתן עד לסיום מודל הפריסה. לבסוף, לחץ על שמור תמונות שנפרסו.
הערה: ניתן לייצא דמיונות סגיטליים מייצגים של עצם הנאדית של הטוחנות, כמו באיור 3C,D.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ציר זמן של שלבי הניסוי מוצג באיור 1. איור 2A מראה תמונה של המנדיבולה לאחר התערבות כירורגית, עם מיקום רצועות סביב החריץ של M1 בזמן 0 של הניסוי. איור 2B מראה כיצד, לאחר 14 יום של ההליך, הרצועה סביב M1 נכנסת לחריץ החניכיים, מה שגורם לדלקת בחניכיים ולהצטברות חדירה.
איור 1: ייצוג סכמטי של ציר הזמן של ההליך הניסיוני של השראת פריודונטיטיס (PD) בחולדות. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
תמונות דו-ממדיות מייצגות (איור 3; ריבוע אדום) מדגימות הבדלים באובדן עצם מכתשית במנדיבולה בין הבקרה הבסיסית, המראות נפח עצם גדול יותר (איור 3A), ולאחר התבססות מחלת פרקינסון, ומראות אובדן עצם גבוה יותר בנאדיות (איור 3B). יתר על כן, ניתוח של תמונות הקשת מדגיש את אובדן העצם הנאדית הגדול יותר באזור העצם הבין-רדיקולרית של M1 (איור 3D; חץ אדום) ו-M2 (איור 3D; חץ ירוק) לאחר התבססות PD, בהשוואה לקבוצת הביקורת הבסיסית (איור 3C). יתר על כן, ספיגת עצם מכתשית התאפיינה בעלייה במרווח שבין צומת האמייל הצמנטי (CEJ) לבין פסגת העצם הנאדית (ABC). המרחק בין CEJ ו-ABC בשתי קבוצות החולדות מוצג באיור 3C,D עם חיצים כחולים. PD מבוסס פיתח רווחים גדולים בין CEJ ו-ABC (איור 3D), בהשוואה לבקרות הבסיסיות (איור 3C).
ברגע ההקרבה, תמונות של החיך הציגו הבדלים בנסיגת חניכיים ב-M1 בקבוצות השונות (איורים 4A,B). קבוצת הפרקינסון (איור 4B) מראה נדידת חניכיים אפיקלית גדולה יותר עקב אובדן תמיכת עצם וחשיפת שורשים, בהשוואה לקבוצת הביקורת הבסיסית (איור 4A). כמו כן, קבוצת הפרקינסון (איור 4B) הציגה דלקת גדולה יותר של החניכיים סביב הטוחנות המקסילריות, בהשוואה לקבוצת הביקורת הבסיסית (איור 4A). איור 4C מציג את תוצאות הניתוח של ציטוקין מעודד דלקת IL-1β מ-GCF, ומראה שחרור גבוה משמעותית של IL-1β שהוצג בקבוצת הפרקינסון בהשוואה לקבוצת הביקורת. על פי הספרות, IL-1β משתתף בדלקת, ויסות חיסוני וספיגת עצם בדלקת חניכיים, והוא ממריץ חזק של הרס רקמת חניכיים12.
איור 2: תמונות של הרצועה שהוחדרה לחריץ של M1 בזמנים שונים. (A) חיך חולדה עם מיקום רצועות סביב M1, 0 ימים לאחר החדרת הליגטורה. (B) חיך חולדה עם מיקום רצועות סביב M1, 14 יום לאחר החדרת הליגטורה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: תמונות דו-ממדיות מייצגות של עצם מכתשית וטוחנות מקסילריות. תמונות דו-ממדיות מייצגות שהתקבלו על ידי CBCT של עצם מכתשית של טוחנות מקסילריות (ריבוע אדום) של (A) הבקרה הבסיסית, ו-(B) דלקת חניכיים מבוססת (PD) למשך 14 יום עם החדרת ליגטורה והזרקת Pg-LPS. תצוגות דו-ממדיות מייצגות של הטוחנות המקסילריות של (C) הבקרה הבסיסית ו-(D) PD. החיצים האדומים מציינים את אזור עצם הנאדית הבין-רדיקולרית של M1, החיצים הכחולים מציינים את המרחק בין CEJ ל-ABC, והחצים הירוקים מציינים את אזור עצם הנאדיות הבין-רדיקולרית של M2. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: תמונות מייצגות של החיך. תמונות מייצגות של החיך לאחר הקרבת קבוצת הביקורת הבסיסית (A) וקבוצת (B) פריודונטיטיס (PD), שטופלו במשך 14 יום עם החדרת ליגטורה והזרקת Pg-LPS. (C) קביעת ריכוזי IL-1β ב-GCF של קבוצת הביקורת הבסיסית וקבוצת PD (n = 9). הנתונים מייצגים את הממוצע ± SEM. התוצאות הושוו סטטיסטית על ידי Kruskal-Wallis: * p < קבוצת PD 0.05 לעומת קבוצת ביקורת בסיסית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שיטה זו מתארת השראת פרקינסון בחולדות בעקבות טכניקה משולבת של זריקות Pg-LPS ומיקום רצועות סביב M1, וחושפת כי ניתן לגרום לשינויים משמעותיים ברקמות החניכיים ובעצם הנאדית תוך 14 יום לאחר שיטה זו.
במהלך הליך זה, יש לתת תשומת לב לשלבים קריטיים שונים. במהלך הרדמת בעלי חיים והכנת פרוצדורות, הערכת ההרדמה הנכונה במהלך התהליך הכירורגי היא קריטית להצלחתו, כמו גם הקפדה על מיקום נכון של החיה, ייצוב פה החולדה הפתוח עם פה האלומיניום סביב החותכות, ומניעת פגיעה בבעלי החיים באמצעות ההקאה וכלי הניתוח. אם ריווי החמצן וקצב הדופק יורדים, יש לעצור את ההליך ולהציב את בעל החיים במצב דקוביטוס רוחבי עד הגעה לערכים נורמליים. במהלך תנוחת הליגטורה, חיוני כי התפר והקשר מוכנסים כראוי בחריץ, בהתחשב בפגיעה ברקמות רכות יש למזער כדי למנוע כאב ודלקת באזורים אחרים. אם ניקח בחשבון סוגיות אתיות הנוגעות לרווחתם של בעלי החיים, חיוני לעקוב אחר התאוששות החיה עד שהשפעות ההרדמה יבוטלו לחלוטין. תרופות כאב במהלך היומיים הראשונים לאחר ההליך הוא הכרחי. מעקב אחר משקלם והתנהגותם של בעלי החיים חשוב גם הוא, כדי להעריך עד כמה החולדה סובלת את ההליך ולוודא שהיא אינה מפגינה מצוקה קיצונית. במהלך הפרוטוקול שלאחר ההליך של הזרקת Pg-LPS והתאמת הליגטורה לרקמה התת-חניכית סביב M1, קודם כל, חשוב להדק ולמקם מחדש את הרצועה במצב אפיקלי כדי ליצור את הדלקת. שנית, חשוב להזריק באופן דו צדדי את Pg-LPS בזהירות, לא לגרום טראומה אוראלית. כמו כן, יש להקפיד בעת הרדמת החיה, ויש לעקוב אחריה עד להחלמה. במהלך איסוף GCF, הנייר המכויל צריך להישמר באותו מיקום למשך אותו זמן כולל, וחשוב להכניס אותו באותו נקיק חניכיים סביב M1 mesio-palatal. במהלך שלבי האלוציה של GCF, חשוב להשתמש במאגר האלוציה מיד לאחר הוספת טבלית מעכב פוספטאז מסחרית. שלב קריטי אחרון של הפרוטוקול הוא במהלך סריקות CBCT; יישור נכון של הדגימות ופרוטוקול הניתוח הוא קריטי להשגת תוצאות הניתנות לפרשנות.
השונות של החשיפה הספציפית של כל בעל חיים להזרקת Pg-LPS והרצועה השומרת סביב M1 יכולה להיכלל כסיבות לאי השגת הדלקת הנכונה וספיגת העצם כתוצאה מכך. בעוד שתוצאות טובות מושגות בהשראת פרקינסון באמצעות הליך זה, חשוב להפחית באופן הדוק את השונות בין בעלי חיים על ידי מעקב קפדני אחר הפרוטוקול. אחד השינויים המשמעותיים ביותר בשיטה הוא מיקום הליגטורה השמרנית סביב M1, ולא סביב M2, מודל הליגטורה המסורתי ביותר בספרות13,14,15. הליך הניתוח למיקום הרצועה בעכברים או חולדות מהווה קושי טכני, ומהווה אתגר פוטנציאלי עבור חוקרים רבים בשל גודלו הקטן של חלל הפה והשיניים11,16. השימוש בחולדות והצבת הרצועה סביב M1 הקלו על המניפולציה והגישה לאזור, מה שגם הפחית את הלחץ של החיה במהלך ההליך. במהלך הפרוטוקול לא נצפה סבל מבעלי חיים, אך אם חולדה כלשהי מראה סימני מצוקה, שקלו להוציא אותה מהניסוי כדי למנוע סבל. לבסוף, השלב המגביל ביותר של ההליך הוא למנוע את אובדן הליגטורה, אשר יכול לקרות 7-10 ימים לאחר הניתוח. כדי להגביר ולשמור על עוצמת המחלה עם הזמן, חשוב להתאים את הליגטורות כדי לשמור על מגע אינטימי עם רקמות חניכיים, ובכך להפחית את השונות בעוצמות על השראת דלקת חניכיים בין בעלי חיים15. באופן כללי, אם ההליך מבוצע כראוי, אין צורך בשינויים, ויתקבלו תוצאות עקביות.
חשוב לציין כי מודל זה מציג מספר מגבלות. ראשית, פותחה טכניקה לחקר מחלת פרקינסון הנגרמת על ידי פציעה טראומטית (מיקום רצועה), אשר נחשבת כמקלה על הצטברות מקומית של חיידקים ובכך מגבירה דלקת בתיווך חיידקים ואובדן עצם13,10, בשילוב של הזרקת Pg-LPS. אבל, למעשה, השיטה אינה מחקה את הגורמים האטיולוגיים הטבעיים האחראים למיקרוביוטה דיסביוזה בדלקת חניכיים אנושית ואינה מחקה מספר מנגנונים אפשריים אחרים שבאמצעותם עלולה להיווצר דלקת חניכיים. בנוסף, מבני שיניים מורין אינם זהים לבני אדם15. יתר על כן, בעוד שהשיטה המוצגת יעילה לחקר פרקינסון חריף, ייתכן שהיא אינה משקפת את מאפייני אובדן העצם וההסננה הדלקתית לטווח ארוך במחלת פרקינסוןכרונית 16. בפירוט עם המתודולוגיה המוצעת להערכת אובדן עצם מכתשית, השיטה הנפוצה ביותר של הערכה רב מימדית של העצם היא micro-CT, המאפשר הערכה של גורמים חיצוניים ומספק תמונות תלת מימדיות של העצם. בנוסף, ניתן לנתח פרמטרים של עצם טרבקולרית, נפח עצם וצפיפות מינרלים בעצם מבלי לשבור את העצמות14,17. אולם השימוש ב-CBCT להערכת אובדן עצם בנאדיות הוצע כאן (איור 3) כחלופה למיקרו-CT; למרות שמתקבלות תמונות ברזולוציה נמוכה יותר, הוא מספק גם ניתוח איכותי וכמותי שימושי של התקדמות דלקת חניכיים18,19,20. לכן, בדיקות CBCT מספקות שיטה מדויקת להדמיה, זמינה ונגישה יותר מאשר מיקרו-CT, אשר תקל על מחקרים של השראת דלקת חניכיים בחולדות.
בין המודלים השונים של בעלי חיים ששימשו לחיקוי PD in vivo16 כדי להעריך רקמות תומכות שיניים (חניכיים ועצמות) בתנאים מבוקרים היטב, מודל PD המושרה על ידי ליגטורה נמצא בשימוש נרחב בחולדות, כלבים ופרימטים לא אנושיים13. הספרות גם מצביעה על כך שלמרות השימוש בפרוטוקולים מסוימים, השימוש בעכברים – המייצג מודל נוח, זול ורב-תכליתי – גורם לאתגר טכני יותר בשל גודלו הקטן יחסית של חלל הפה של העכבר בהשוואה לחולדות13. בהשוואה למודלים אחרים, מודל חולדות PD המושרה על ידי ליגטורה מציע מספר יתרונות, כולל השראת מחלה מהירה, שיכולה להתחיל בזמן צפוי ולהגיע לשיאה באובדן עצם מכתשית תוך מספר ימים (עכברים וחולדות)13. ישנם יתרונות נוספים לשיטה זו, כגון הפוטנציאל לחקור רקמת חניכיים והתחדשות עצם מכתשית, כמו גם היכולת לאתר ולנתח רקמת חניכיים דלקתית על מנת להעריך את רמת הדלקת15. השיטה של שילוב מודל PD המושרה על ידי ליגטורה עם הזרקת LPS מוסיפה תגובה דלקתית הרסנית מקומית בחניכיים המגבירה את אובדן החיבור של רקמת החיבור ואת ספיגת העצם בנאדיות הנוצרת על ידי הליגטורה. אפקט תוסף זה מומלץ להגדיל עם ריכוז ותדירות של זריקות LPS10. השיטה המדווחת כאן מציגה פרוטוקול אופטימלי של שילוב ליגטורה עם הזרקת Pg-LPS, עם היתרונות והמשמעות של שתי השיטות.
אופטימיזציה ופיתוח של מודלים בטוחים וחסכוניים in vivo של PD הם קריטיים כדי להקל על הבנת הפתוגנזה של מחלות חניכיים ובדיקת גישות טיפוליות חדשות. מודל PD של הטכניקה המשולבת של זריקות Pg-LPS ומיקום רצועות סביב M1 המוצג כאן מוערך כמודל מחקר אטרקטיבי, לחקור אינטראקציות בין מיקרוב מארח, דלקת חניכיים וספיגת עצם מכתשית. מודל זה מזהה את הקבוצות הקריטיות ביותר של הפרוטוקול, מתאר אותן בפירוט טכני מבוסס תמונה, ומתקנן ומייעל את השימוש בטכניקות משולבות אלה. שימוש בטכניקות נוספות להערכת התקדמות דלקת חניכיים עשוי להיות אפשרי, כולל ניתוחים היסטולוגיים הן של עצם הנאדית והן של החניכיים המחוברות סביבה, קביעת ציטוקינים אחרים המעורבים בדלקת ואפיון מיקרוביוטה אוראלית. למרות שהמודל אינו יכול לשקף את כל ההיבטים של המנגנונים או הגורמים לפרקינסון בבני אדם, מחקר זה מגלה כי שינויים ניווניים ודלקתיים משמעותיים ברקמות החניכיים ובעצם הנאדית יכולים להיגרם לאחר 14 יום לאחר ההתערבות, ולספק את הבסיס למחקרי מניעה או טיפול פרה-קליניים עתידיים במחלות חניכיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי Fundació Universitat-Empresa de les Illes Balears (הוכחת היתכנות קריאה 2020), על ידי Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competividad, במימון משותף של הקרן החברתית האירופית ESF והקרן האירופית לפיתוח אזורי ERDF (חוזה ל- M.M.B; FI18/00104) ועל ידי Direcció General d'Investigació, Conselleria d'Investigació, Govern Balear (חוזה עם M.M.F.C; פ/040/2020). המחברים מודים לד"ר אנה תומס ומריה טורטוסה על עזרתן בניתוח הניסויי ובפלטפורמה של IdISBa. לבסוף, תודה לבית הספר לרפואת שיניים ADEMA על הגישה לסורק CBCT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adsorbent paper point nº30 | Proclinc | 8187 | |
| Aprotinin | Sigma-Aldrich | A1153 | |
| Atipamezole | Dechra | 573751.5 | Revanzol 5 mg/mL |
| Braided silk ligature (5/0) | Laboratorio Arago Sl | 613112 | |
| Buprenorphine | Richter pharma | 578816.6 | Bupaq 0.3 mg/mL |
| Cone-beam computed tomography (CBCT) Scanner | MyRay | hyperion X9 | Model Hyperion X9 |
| CTAn software | SkyScan | Version 1.13.4.0 | |
| Dental explorer | Proclinc | 99743 | |
| Diamond lance-shaped bur | Dentaltix | IT21517 | |
| Food maintenance diet | Sodispain research | ROD14 | |
| Heated surgical platform | PetSavers | ||
| Hollenback carver | Hu-FRIEDY | HF45234 | |
| Hypodermic needle | BD | 300600 | 25G X 5/8” - 0,5 X 16 MM |
| Isoflurane | Karizoo | Isoflutek 1000mg/g | |
| Ketamine | Dechra | 581140.6 | Anesketin 100 mg/mL |
| Lipopolysaccharide derived from P.Gingivalis | InvivoGen | TLRL-PGLPS | |
| Methanol | Fisher Scientific | M/4000/PB08 | |
| Micro needle holter | Fehling Surgical Instruments | KOT-6 | |
| Microsurgical pliers | KLS Martin | 12-384-06-07 | |
| microsurgical scissors | S&T microsurgical instruments | SDC-15 RV | |
| Monitor iMEC 8 Vet | Mindray | ||
| Multiplex bead immunoassay | Procartaplex, Thermo fisher Scientific | PPX-05 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 8187151000 | |
| Periosteal microsurgical elevator | Dentaltix | CU19112468 | |
| Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) | Roche | 10837091001 | |
| Phosphate Buffer Solution (PBS) | Capricorn Scientific | PBS-1A | |
| PhosSTOP | Roche | 4906845001 | Commercial phosphatase inhibitor tablet |
| Plastic vial | SPL Lifesciencies | 60015 | 1.5mL |
| Saline | Cinfa | 204024.3 | |
| Stereo Microscope | Zeiss | Model SteREO Discovery.V12 | |
| Surgical loupes led light | Zeiss | ||
| Surgical scissors | Zepf Surgical | 08-1701-17 | |
| Syringe | BD plastipak | 303172 | 1mL |
| Veterinary dental micromotor | Eickemeyer | 174028 | |
| Xylazine | Calier | 20102-003 | Xilagesic 20 mg/mL |
References
- Carvalho, J. D. S., et al. Impact of citrus flavonoid supplementation on inflammation in lipopolysaccharide-induced periodontal disease in mice. Food and Function. 12 (11), 5007-5017 (2021).
- Nazir, M. A. Prevalence of periodontal disease, its association with systemic diseases and prevention. International Journal of Health Sciences. 1 (2), 72-80 (2017).
- Dumitrescu, A. L., El-Aleem, S. A., Morales-Aza, B., Donaldson, L. F. A model of periodontitis in the rat: Effect of lipopolysaccharide on bone resorption, osteoclast activity, and local peptidergic innervation. Journal of Clinical Periodontology. 31 (8), 596-603 (2004).
- Wang, H. Y., et al. Preventive effects of the novel antimicrobial peptide Nal-P-113 in a rat Periodontitis model by limiting the growth of Porphyromonas gingivalis and modulating IL-1β and TNF-α production. BMC Complementary and Alternative Medicine. 17 (1), 1-10 (2017).
- Guan, J., Zhang, D., Wang, C. Identifying periodontitis risk factors through a retrospective analysis of 80 cases. Pakistan Journal of Medical Sciences. 38 (1), 293-296 (2021).
- Khajuria, D. K., Patil, O. N., Karasik, D., Razdan, R. Development and evaluation of novel biodegradable chitosan based metformin intrapocket dental film for the management of periodontitis and alveolar bone loss in a rat model. Archives of Oral Biology. 85, 120-129 (2018).
- Nishida, E., et al. Bone resorption and local interleukin-1alpha and interleukin-1beta synthesis induced by Actinobacillus actinomycetemcomitans and Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide. Journal of Periodontal Research. 36 (1), 1-8 (2001).
- Graves, D. T., Kang, J., Andriankaja, O., Wada, K., Rossa, C. Animal models to study host-bacteria interactions involved in periodontitis. Bone. 23 (1), 1-7 (2008).
- Struillou, X., Boutigny, H., Soueidan, A., Layrolle, P. Experimental animal models in periodontology: a review. The Open Dentistry Journal. 4 (1), 37-47 (2010).
- Mustafa, H., et al. Induction of periodontal disease via retentive ligature, lipopolysaccharide injection, and their combination in a rat model. Polish Journal of Veterinary Sciences. 24 (3), 365-373 (2021).
- Chadwick, J. W., Glogauer, M. Robust ligature-induced model of murine periodontitis for the evaluation of oral neutrophils. Journal of Visualized Experiments. 2020 (155), 6-13 (2019).
- Cheng, R., Wu, Z., Li, M., Shao, M., Hu, T. Interleukin-1β is a potential therapeutic target for periodontitis: a narrative review. International Journal of Oral Science. 12 (1), 1-9 (2020).
- Abe, T., Hajishengallis, G. Optimization of the ligature-induced periodontitis model in mice. Journal of Immunological Methods. 394 (1-2), 49-54 (2013).
- Jeong-Hyon, K., Bon-Hyuk, G., Sang-Soo, N., Yeon-Cheol, P. A review of rat models of periodontitis treated with natural extracts. Journal of Traditional Chinese Medical Sciences. 7 (2), 95-103 (2020).
- Marchesan, J., et al. An experimental murine model to study periodontitis. Nature Protocols. 13 (10), 2247-2267 (2018).
- Lin, P., et al. Application of ligature-induced periodontitis in mice to explore the molecular mechanism of periodontal disease. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 8900 (2021).
- Irie, M. S., et al. Use of micro-computed tomography for bone evaluation in dentistry. Brazilian Dental Journal. 29 (3), 227-238 (2018).
- Haas, L. F., Zimmermann, G. S., De Luca Canto, G., Flores-Mir, C., Corrêa, M. Precision of cone beam CT to assess periodontal bone defects: a systematic review and meta-analysis. Dentomaxillofacial Radiology. 47 (2), 20170084 (2018).
- Kamburoğlu, K., Ereş, G., Akgün, C. Qualitative and quantitative assessment of alveolar bone destruction in adult rats using CBCT. Journal of Veterinary Dentistry. 36 (4), 245-250 (2019).
- Sousa Melo, S. L., Rovaris, K., Javaheri, A. M., de Rezen de Barbosa, G. L. Cone-beam computed tomography (CBCT) imaging for the assessment of periodontal disease. Current Oral Health Reports. 7 (4), 376-380 (2020).
