Summary
I denne studien presenteres en rottemodell for induksjon av periodontitt via en kombinasjon av retentiv ligatur og repeterende injeksjoner av lipopolysakkarid avledet fra Porphyromonas gingivalis, over 14 dager rundt de første maksillære jekslene. Ligerings- og LPS-injeksjonsteknikkene var effektive for å indusere peridontitt, noe som resulterte i alveolær bentap og betennelse.
Abstract
Periodontitt (PD) er en svært utbredt, kronisk immun-inflammatorisk sykdom i periodontium, som resulterer i tap av gingival bløtvev, periodontal ligament, sementum, og alveolar bein. I denne studien er det beskrevet en enkel metode for PD-induksjon hos rotter. Vi gir detaljerte instruksjoner for plassering av ligaturmodellen rundt de første kjevemolarene (M1) og en kombinasjon av injeksjoner av lipopolysakkarid (LPS), avledet fra Porphyromonas gingivalis på mesio-palatal side av M1. Induksjonen av periodontitt ble opprettholdt i 14 dager, noe som fremmer akkumulering av bakteriebiofilm og inflammasjon. For å validere dyremodellen ble IL-1β, en viktig inflammatorisk mediator, bestemt av et immunoassay i gingival crevicular fluid (GCF), og alveolært bentap ble beregnet ved hjelp av keglestråle computertomografi (CBCT). Denne teknikken var effektiv for å fremme gingiva resesjon, alveolar bentap og en økning i IL-1β nivåer i GCF ved slutten av eksperimentell prosedyre etter 14 dager. Denne metoden var effektiv for å indusere PD, og kunne dermed brukes i studier på sykdomsprogresjonsmekanismer og fremtidige mulige behandlinger.
Introduction
Periodontitt (PD) er den sjette mest utbredte folkehelsetilstanden over hele verden, og påvirker omtrent 11% av den totale befolkningen, og er en avansert, irreversibel og destruktiv form for periodontal sykdom 1,2. PD er en inflammatorisk prosess som påvirker gingival og periodontale vev, noe som resulterer i gingiva resesjon, apikal migrasjon av kryssepitelet med lommeutvikling og tap av alveolar bein3. Videre er PD assosiert med flere systemiske sykdommer, inkludert kardiovaskulær sykdom, fedme, diabetes og revmatoid artritt, for hvilke miljø- og vertsspesifikke faktorer spiller en betydelig rolle 4,5.
Derfor er PD en multifaktoriell sykdom primært initiert av akkumulering av mikrobiell plakk - som skyldes dysbiose av mikrobielle samfunn - og ved en overdrevet vertsimmunrespons mot periodontale patogener, noe som fører til nedbrytning av periodontalt vev 4,6. Blant flere periodontale bakterier er den gramnegative anaerobe bakterien Porphyromonas gingivalis et av nøkkelpatogenene i PD4. P. gingivalis inneholder et komplekst lipopolysakkarid (LPS) i veggene, et molekyl kjent for å indusere polymorfonukleær leukocyttinfiltrasjon og vaskulær dilatasjon i betent periodontalt vev7. Dette resulterer i produksjon av inflammatoriske mediatorer, som interleukin 1 (IL-1), IL-6 og IL-8, tumornekrosefaktor (TNF) eller prostaglandiner, med en påfølgende osteoklastaktivering og benresorpsjon, noe som fører til vevsødeleggelse og endelig tanntap3.
Blant de forskjellige fordelene med dyremodeller er kapasiteten til å etterligne cellulære kompleksiteter som hos mennesker, eller å være mer nøyaktig enn in vitro-studier , som utføres på plastoverflater med begrensede celletyper8. For modellering av PD eksperimentelt in vivo har forskjellige dyrearter blitt brukt, som ikke-menneskelige primater, hunder, griser, ildere, kaniner, mus og rotter9. Imidlertid er rotter den mest omfattende studerte dyremodellen for patogenesen av PD fordi de er billige og enkle å håndtere10. Deres dental gingivalvev har lignende strukturelle egenskaper som menneskelig gingivalvev, med et grunt gingival sulcus og kryssepitel festet til tannoverflaten. Videre, som hos mennesker, letter kryssepitelet passasjen av bakterielle, fremmede materialer og ekssudater fra inflammatoriske celler 9.
En av de mest rapporterte eksperimentelle modellene av PD-induksjon hos rotter er plasseringen av ligaturer rundt tennene, noe som er teknisk utfordrende, men pålitelig10. Ligaturplasseringen letter tannplakk og bakteriell akkumulering, og genererer en dysbiose i gingival sulci, som forårsaker periodontalvevbetennelse og ødeleggelse11. Tap av periodontal tilknytning og resorpsjon av alveolær ben kan forekomme i løpet av 7 dager i denne rottemodellen8.
En annen dyremodell for PD består av injeksjon av LPS i gingivalvevet. Som et resultat stimuleres osteoklastogenese og bentap. De histopatologiske egenskapene til denne modellen ligner menneskelig etablert PD, karakterisert ved høyere nivåer av proinflammatoriske cytokiner, kollagennedbrytning og alveolær benresorpsjon 6,8.
Målet med denne studien var derfor å beskrive en enkel rottemodell av eksperimentell PD basert på teknikkene til P. gingivalis-LPS (Pg-LPS) injeksjoner, kombinert med ligaturplassering rundt de første maksillære jekslene (M1). Dette er en modell med lignende egenskaper som de som er observert i human PD-sykdom, som kan brukes i studiet av sykdomsprogresjonsmekanismer og fremtidige mulige behandlinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Den eksperimentelle protokollen for studien ble godkjent av den etiske komiteen for dyreforsøk ved Balearene Health Research Institute (CEEA-UIB; referansenummer 163/03/21).
1. Dyrebedøvelse og prosedyreforberedelse
- Steriliser alle kirurgiske instrumenter (aluminium munngags, dental explorer, diamantlanse, kirurgisk saks, mikrokirurgisk tang, en mikronålholder, en hollenback carver, en periosteal mikrokirurgisk heis og mikrokirurgisk saks) (5 min ved 135 ° C) før kirurgi.
- Forbered alle løsningene som trengs for prosedyren under sterile forhold, som beskrevet:
- Tilbered en blanding av ketamin (60 mg/ml) og xylazin (8 mg/ml) ved å blande 1,6 ml ketamin med 1 ml xylazin fortynnet i fosfatbufferløsning (PBS)/saltvann. Oppbevar lageret ved 4 °C.
- Fortynn atipamezol til en endelig konsentrasjon på 0,25 mg/ml i PBS/saltvann. Oppbevar lageret ved 4 °C.
- Fortynn buprenorfin til en endelig konsentrasjon på 0,03 mg/ml i PBS/saltvann. Oppbevar lageret ved 4 °C.
- Tilbered 1 ml Pg-LPS (1 mg/ml) i steril saltvann. Oppbevar lageret ved -20 °C.
- For forsøket, bruk kvinnelige og mannlige Wistar-rotter, i alderen 12 uker og veier 210-350 g på operasjonstidspunktet. Hold dyrene plassert i grupper under passende miljø og konstante forhold (20-24 ° C, 12 timer per dag lys-mørke sykluser), med mat og standard vann, tilbys ad libitum.
- For å indusere anestesi, vei rotta og administrer blandingen av ketamin / xylazin i en konsentrasjon på 80/10 mg / kg intraperitonealt (IP), ved å bruke en 25 G steril hypodermisk nål og 1 ml sprøyte.
- Etter at rotta er bedøvet, legg dyret på ryggen på en oppvarmet kirurgisk plattform; Under prosedyren, dekk dyrets kropp for å forhindre varmetap.
MERK: Anestesidybden vurderes ved tap av pedalrefleks under prosedyren og ved å overvåke vitale tegn. Bruk om nødvendig en liten nesekjegle for å opprettholde anestesi med 2% isofluran i 100% oksygen. Påfør steril oftalmisk salve på begge øynene etter anestesiinduksjon for å beskytte hornhinnene og forhindre tørking. - Under prosedyrene, administrer 100% oksygen ved hjelp av en liten nesekegle, og overvåk pulsfrekvensen og oksygenmetningen ved pulsoksimetri.
MERK: Hvis oksygenmetningen og pulsfrekvensen faller under henholdsvis 95 % og 190 bpm, må du stoppe prosedyren og plassere dyret i lateral decubitusstilling til det når normale verdier. - Åpne rottemunnen ved hjelp av en aluminiumsmunngag rundt fortennene (øvre og nedre), trekk tungen med den og stabiliser maxillaen og kjeven i en åpen, komfortabel arbeidsstilling, noe som gir tilgang til mandibulære jeksler.
MERK: Hvis dyret må plasseres i lateral decubitus, fjern munngagen før du endrer posisjonen for å favorisere utvinning. Når dyret er bedøvet, samle gingival krevikulær væske (GCF) før kirurgi (prøve i basale forhold) (dag 0). - Samle inn GCF som beskrevet i følgende trinn:
- Plasser dyret på ryggen på en kirurgisk plattform og stabiliser maxillaen og kjeven i åpen stilling med aluminiummunngags.
- Samle GCF ved hjelp av totalt fire (to for hver M1) absorberende papirpunkt nº 30 (0,03 cm diameter x 3 cm lengde), ved å sette det inn i gingivalsprekken (mellomrom mellom gingivalepitel og tilstøtende emalje) rundt mesio-palatal av M1 til svak motstand. Hold papirpunktet i samme posisjon i totalt 30 sekunder før umiddelbar fjerning.
- Etter oppsamling, overfør papirpunktet umiddelbart til et hetteglass av plast, og oppbevar ved -80 °C til analysen er utført.
2. Retentiv ligaturteknikk og intragingival Pg -LPS-injeksjon
MERK: Ligaturmodellen ble opprettet (dag 0) ved å plassere en steril flettet silkeligatur (5/0) rundt M1 bilateralt i gingivalsulcus ved hjelp av mikrokirurgiske instrumenter og sikre den med kirurgens knuter på palataloverflaten. De mikrokirurgiske instrumentene som ble brukt var mikrokirurgisk tang, en mikronålholder, en hollenback-skjærer, en periosteal mikrokirurgisk heis og mikrokirurgisk saks. Kirurgiske luper med LED-lyskilde ble også brukt (3,6x forstørrelse).
- Plasser suturens distale hale på palatalsiden av tannkjøttet og sett inn det proksimale segmentet mellom kontakten til M1 og andre maksillære jeksler (M2).
- Bruk den periosteale mikrokirurgiske heisen for å sette suturen inn i sulcus. Pakk ligaturen rundt bukkaloverflaten av M1 veldig nøye, da vevene på dette nivået presenterer en smal sone med festet gingiva. På palatal aspektet, sørg for at suturen er strammet i begge ender for å sikre at den blir drevet inn i gingival sulcus.
MERK: Hvis motstand observeres når suturen mellom M1 og M2 settes inn, kan kontakten åpnes litt ved hjelp av en tannutforsker og diamantlelanseformet bur. - Bind endene av suturen med en kirurgs knute og trim haler så kort som mulig. Sett knuten i sulcus.
MERK: Tips av kirurgiske instrumenter kan forårsake oral traumer og blødning. Forbered små segmenter av gasbind eller en bomullspinne for å fjerne blod fra munnhulen og trykk for å stoppe blødning. Forsiktig bløtvevsbehandling med en mikrokirurgisk tilnærming minimerer kirurgiske komplikasjoner og fører til mindre vevstraumer. - Etter ligaturposisjonering, injiser 40 μL Pg-LPS i steril saltoppløsning med en 25 G steril hypodermisk nål og en 1 ml sprøyte til subgingivalvevet (mellom roten eller nakken av en tann og tannkjøttmarginen) på mesio-palatal side av M1 bilateralt (dag 0).
3. Slutt på prosedyren
- Etter ligeringsposisjonering og Pg-LPS-applikasjon, slipp rotta fra kirurgisk tilstand og plasser den i et rent individuelt bur under en varmelampe.
- Injiser antagonisten atipamezol (0,5 mg/kg subkutant (s.c.)) med en 25 G steril hypodermisk nål og en 1 ml sprøyte.
- For smertelindring, injiser 0,03 mg/kg buprenorfin, SC.
- Overvåk dyrets utvinning til effekten av operasjonen er fullstendig reversert. Plasser hver rotte individuelt i passende miljø under konstante forhold (20-24 °C, 12 timer per dag lys-mørke sykluser). Tilby mat og avionisert vann ad libitum.
- I løpet av de første 2 dagene etter inngrepet, veier dyrene og injiserer buprenorfin subkutan to ganger daglig for smertelindring.
MERK: Buprenorfin kan administreres før prosedyren påbegynnes for å eliminere avviklingseffekten. - I løpet av forsøkstiden, overvåke dyrene etter vekt og generell atferdsvurdering en eller to ganger i uken.
4. Oppfølging etter prosedyren
MERK: Induksjonen av PD ble opprettholdt i 14 dager for å fremme akkumulering av bakteriebiofilm og påfølgende betennelse. Ligaturene må undersøkes og justeres, og Pg-LPS injiseres tre ganger per uke (dag 2, dag 4, dag 6, dag 8, dag 10 og dag 12).
- Undersøk og juster ligaturen (dag 2, dag 4, dag 6, dag 8, dag 10 og dag 12) som følger:
- Bedøve med 2% isofluran i 100% oksygen ved hjelp av et anestesiinduksjonskammer.
- Etter at rotta er bedøvet, legg dyret på ryggen og bruk en liten nesekegle under prosedyren med 1% isofluran i 100% oksygen for vedlikehold av dyrebedøvelsen.
- Åpne rottemunnen ved hjelp av aluminiummunngaggen rundt fortennene (øvre og nedre), trekk tungen med den og stabiliser maxillaen og kjeven i en åpen, komfortabel arbeidsstilling, noe som gir tilgang til ligaturer.
- Stram ligaturene mot gingiva ved hjelp av en periosteal mikrokirurgisk heis, og sørg for at suturen av ligaturene er satt inn, noe som skaper betennelse rundt gingiva.
MERK: Det er mulig at 7-10 dager etter operasjonen går ligaturer tapt. Hvis dette skjer, følg protokollen som forklart for injeksjon av Pg-LPS (trinn 2.4).
- Etter ligaturjusteringen, injiser bilateralt 40 μL Pg-LPS med en 25 G steril hypodermisk nål og en 1 ml sprøyte til subgingivalvevet på mesio-palatal siden av M1 (dag 2, dag 4, dag 6, dag 8, dag 10 og dag 12).
- Fjern nesekeglen for anestesi og legg rotta i buret. Overvåk dyrets utvinning til effekten av anestesien er fullstendig reversert.
5. Dyreoffer og analyse
MERK: Det finnes ulike alternativer for å evaluere progresjonen av PD. Her består den beskrevne analysen av en evaluering av proinflammatoriske cytokiner ved gingival crevicular fluid (GCF), og en evaluering av tap av alveolær bein.
- På dag 14 av studien (dag 14), ofre dyrene med CO2 i et karbondioksidkammer. En forskyvningshastighet på 30% til 70% av kammervolumet/min anbefales for gnagere.
MERK: Manglende dyrerespons på pedalrefleks og fravær av vitale tegn må verifiseres for å bekrefte avlivning. - Samle inn GCF som beskrevet i følgende trinn:
MERK: GCF samles før PD-induksjon (før kirurgi) (dag 0) og etter PD-induksjon (etter ofring) (dag 14).- Plasser dyret på ryggen på en kirurgisk plattform, og stabiliser maxillaen og kjeven i åpen stilling med aluminiumsmunngags.
- Samle GCF ved hjelp av adsorbentpapirpunkt nº 30 (0,03 cm diameter x 3 cm lengde) ved å sette den inn i gingivalsprekken rundt mesio-palatal av M1 til liten motstand. Hold papirpunktet i samme posisjon i totalt 30 sekunder før umiddelbar fjerning.
- Etter oppsamling overføres papirpunktet umiddelbart til et hetteglass av plast og oppbevares ved -80 °C til analysen er utført.
- For å evaluere proteiner i GCF, lag følgende løsninger og følg trinnene i elueringsmetoden som beskrevet:
MERK: IL-1β evalueres på GCF (dag 14) ved hjelp av en immunoassay, i henhold til produsentens protokoll.- Forbered elueringsbufferen frisk og hold den på is gjennom hele ekstraksjonsprosessen for å hemme proteaseaktivitet.
- Forbered alle løsninger som trengs for elueringsbufferen som beskrevet:
- Tilbered 1 ml Aprotinin (1 mg/ml) i ultrarent vann.
- Klargjør 10 ml fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF) (200 mM) i metanol.
- Tilsett 125 mikrol PMSF og 250 mikrol aprotinin til 24,5 ml PBS-oppløsning (pH = 7,4) for å klargjøre elueringsbufferen.
- Løs opp en kommersiell fosfatasehemmertablett med 10 ml nylaget elueringsbuffer i 10 minutter under omrysting ved 4 °C.
MERK: Varigheten av GCF-eluering er begrenset; Brukes umiddelbart til sentrifugeringer etter tilsetning av fosfataseinhibitortablett innen de første 30 minuttene. - Etter tilsetning av fosfatasehemmeren, tilsett 11 μL fullstendig elueringsbuffer direkte på røret med papirpunktene.
- Sentrifuger røret ved 452 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Overfør det eluerte innholdet til et nytt hetteglass av plast. Gjenta denne prosessen ytterligere fire ganger for å få et totalvolum på 50 μL.
- Etter siste sentrifugering tilsettes et totalvolum på 60 μL direkte på papirpunktet, og sentrifugerer en siste gang ved 452 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Bruk ønsket volum eluert for proteinevaluering.
- Etter eutanasi og GCF-innsamling, ved hjelp av kirurgisk saks, kutt ut rotternes overlegne kjeve. Prøv å skrelle av rottemasken og la så lite bløtvev som mulig.
- Plasser kjeven i mikroskoptrinnet for visualisering og ta et bilde ved ønsket forstørrelse.
- Plasser kjeven direkte i 4% paraformaldehyd (PFA) fortynnet i PBS. Oppdater to ganger i uken med ny PFA i 12 dager for en fullstendig fiksering.
FORSIKTIG: Trinn som involverer PFA skal utføres i en avtrekkshette i henhold til anbefalingene fra sikkerhetsdatabladet. - Etter fullstendig kjevefiksering, vurder bentap ved hjelp av en keglestråle computertomografi (CBCT) skanner, som følger:
- Åpne PC-en.
- Åpne CBCT-analyseprogrammet.
- Velg Skanneprotokoll > proteseskannemodus.
- Velg Synsfelt (FOV) > ( 11x8) HIRes ( 90 kV spenning og 3 mA strøm).
- Plasser den faste øvre maxillaen til rottene i portalen.
- Klikk på Neste.
- Klikk på røntgenavfyringsknappen (trykk på røntgenfjernkontrollen for å gjøre utslippet og holde det nede under hele skanningen).
- Flytt om nødvendig den øvre maxillaen i midten av frontplanet ved å trykke på kontrollknappen, og klikk deretter på røntgenavfyringsknappen (trykk på røntgenfjernkontrollen for å gjøre utslippet og holde det nede i hele skanningen).
- Klikk på Neste.
- Klikk på røntgenavfyringsknappen (trykk på røntgenfjernkontrollen for å gjøre utslippet og holde det nede under hele skanningen).
- Flytt om nødvendig protesen i midten av sagittalplanet ved å trykke på kontrollknappen, og klikk deretter på røntgenavfyringsknappen (trykk på røntgenfjernkontrollen for å gjøre utslippet og holde det nede i hele skanningen).
- Klikk på Neste.
- Klikk på Start-knappen (trykk på røntgenfjernkontrollen for å gjøre utslippet og holde det nede i hele eksamenens varighet). Vent til du mottar en behandlingsmelding, og følg deretter instruksjonene som vises.
- En vindusvisning vises. Reguler gråfargen til 65 %, og klikk på Bruk.
- For å lagre skanningen, klikk på Fil og lagre den i DICOM-format . Klikk deretter på Alle bilder , og i DICOM-eksportvalgvinduet velger du alle parametrene som vises (startbilde, original aksial, omformatert aksial, multiplanar) og velger forhåndsdefinert type.
- Bearbeide de maksillære jekslenes todimensjonale og sagittale representative bilder ved hjelp av et analyseprogram, som følger:
- Åpne programvaren.
- Klikk Fil og åpne, og velg deretter mappen med bilder i DICOM-format, og klikk Åpne.
- Vent til vinduet "Konverter til 8 bit" vises, velg området fra 0 til 6000, og klikk OK.
- Klikk på Raw-bilder.
- Definer toppen og bunnen av utvalget for å begrense interesseområdet. Søk etter det første og siste bildet der alveolær bein vises, og merk det med kommandoene øverst i merket område og nederst i markering .
MERK: Representative todimensjonale bilder av jekslenes alveolære bein kunne eksporteres, som i figur 3A,B. - For sagittale representative bilder, klikk på Bytt profillinje.
- Tegn en sagittal linje midt i ganen, og klikk Stykkemodell på nytt. Bestem parametere for å avgrense interesseområdet (stykkeavstand: 1; antall stykker: 100), og klikk OK. Vent til oppdelingsmodellen slutter. Til slutt klikker du lagre oppskårne bilder.
MERK: Representative sagittale forestillinger av jekslenes alveolære bein kunne eksporteres, som i figur 3C,D.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En tidslinje for de eksperimentelle trinnene er presentert i figur 1. Figur 2A viser et bilde av mandibula etter kirurgisk inngrep, med ligaturplassering rundt sulcus av M1 ved tidspunkt 0 av forsøket. Figur 2B viser hvordan ligaturen rundt M1 etter 14 dager av prosedyren kommer inn i gingival sulcus, forårsaker betennelse i gingiva og infiltrerende akkumulering.
Figur 1: Skjematisk fremstilling av tidslinjen for eksperimentell prosedyre for periodontitt (PD) induksjon hos rotter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Representative todimensjonale bilder (figur 3; rød firkant) viser forskjeller i alveolær bentap i mandibula mellom basalkontrollen, som viser mer benvolum (figur 3A), og etter PD-etablering, som viser høyere alveolær bentap (figur 3B). Videre fremhever analyse av sagittalbildene det større alveolære bentapet i det interradikulære beinområdet til M1 (figur 3D; rød pil) og M2 (figur 3D; grønn pil) etter PD-etablering, sammenlignet med basal kontrollgruppe (figur 3C). Videre ble alveolær benresorpsjon karakterisert ved en økning i rommet mellom sementemaljeovergangen (CEJ) og alveolær benkam (ABC). Avstanden mellom CEJ og ABC i begge rottegruppene er vist i figur 3C,D med blå piler. Etablert PD utviklet store mellomrom mellom CEJ og ABC (figur 3D), sammenlignet med basalkontrollen (figur 3C).
I offerøyeblikket presenterte bilder av ganen forskjeller i gingivalresesjon i M1 i de forskjellige gruppene (figur 4A,B). PD-gruppen (figur 4B) viser en større apikal gingivalmigrasjon på grunn av tap av benstøtte og roteksponering, sammenlignet med basal kontrollgruppe (figur 4A). PD-gruppen (figur 4B) hadde også større inflammasjon i gingiva rundt de kjevemolarene maxillar, sammenlignet med basal kontrollgruppe (figur 4A). Figur 4C viser resultatene av analysen av proinflammatorisk cytokin IL-1β fra GCF, som viser en signifikant høyere frigjøring av IL-1β vist i PD-gruppen sammenlignet med kontrollgruppen. Ifølge litteraturen deltar IL-1β i betennelse, immunregulering og benresorpsjon i periodontitt, og er en sterk stimulator for periodontal vevsødeleggelse12.
Figur 2: Bilder av ligaturen satt inn i sulcus av M1 på forskjellige tidspunkter. (A) Rottegane med ligaturplassering rundt M1, 0 dager etter innsetting av ligaturen. (B) Rottegane med ligaturplassering rundt M1, 14 dager etter innsetting av ligaturen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3 Representative todimensjonale bilder av alveolær ben og kjekler i kjekler. Representative todimensjonale fotografier tatt ved CBCT av alveolær bein av maksillære jeksler (rød firkant) av (A) basalkontrollen, og (B) etablerte periodontitt (PD) i 14 dager med ligaturinnsetting og Pg-LPS-injeksjon. Representative sagittale todimensjonale visninger av de maksillære jekslene til (C) basalkontrollen og (D) PD. De røde pilene indikerer det interradikulære alveolære beinområdet til M1, de blå pilene indikerer avstanden mellom CEJ og ABC, og de grønne pilene indikerer det interradikulære alveolære beinområdet til M2. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Representative bilder av ganen. Representative bilder av ganen etter ofring av (A) basal kontrollgruppe og (B) periodontitt (PD) gruppe, behandlet i 14 dager med ligaturinnsetting og Pg-LPS-injeksjon. (C) Bestemmelse av IL-1β-konsentrasjoner i GCF i basal kontrollgruppe og PD-gruppe (n = 9). Data representerer gjennomsnittet ± SEM. Resultatene ble statistisk sammenlignet av Kruskal-Wallis: * p < 0,05 PD-gruppe versus basal kontrollgruppe. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne metoden beskriver induksjon av PD hos rotter etter en kombinert teknikk med Pg-LPS-injeksjoner og ligaturplassering rundt M1, og avslører at signifikante endringer i periodontalt vev og alveolær ben kan induseres i 14 dager etter denne metoden.
Under denne prosedyren må det tas hensyn til ulike kritiske trinn. Under anestesi på dyr og forberedelse av prosedyrer er vurdering av riktig anestesi under den kirurgiske prosessen avgjørende for suksess, og det er å sikre riktig posisjonering av dyret, stabilisere den åpne rottemunnen med aluminiummunnen gag rundt fortennene, og unngå at dyrene blir skadet med gag og kirurgiske instrumenter. Hvis oksygenmetning og pulsfrekvens faller, bør prosedyren stoppes og dyret plasseres i lateral decubitusstilling til det når normale verdier. Under ligaturposisjonen er det viktig at suturen og knuten settes riktig inn i sulcus, med tanke på bløtvevsskade bør minimeres for å forhindre smerte og betennelse i andre områder. Tatt i betraktning etiske spørsmål vedrørende dyrenes velvære, er det viktig å overvåke dyrets restitusjon inntil virkningene av anestesien er fullstendig reversert. Smertestillende medisiner i løpet av de første 2 dagene etter prosedyren er uunnværlig. Overvåking av dyrenes vekt og oppførsel er også viktig for å vurdere hvor godt rotta tolererer prosedyren og sikre at den ikke viser ekstrem nød. Under postprosedyreprotokollen for injeksjon av Pg-LPS og justering av ligaturen til subgingivalvevet rundt M1, er det først og fremst viktig å stramme og flytte ligaturen i en apikal stilling for å skape betennelsen. For det andre er det viktig å bilateralt injisere Pg-LPS med forsiktighet, for ikke å forårsake oral traumer. Det må også tas forsiktighet mens du bedøver dyret, og det bør overvåkes til utvinning. Under samlingen av GCF skal det kalibrerte papiret holdes i samme posisjon i samme totale tid, og det er viktig å sette det inn i samme gingivalsprekk rundt mesio-palatal M1. Under GCF-elueringstrinnene er det viktig å bruke elueringsbufferen umiddelbart etter tilsetning av den kommersielle fosfatasehemmertabletten. Et siste kritisk trinn i protokollen er under CBCT-skanninger; En riktig justering av prøvene og analyseprotokollen er avgjørende for å oppnå tolkbare resultater.
Variasjonen i den spesifikke eksponeringen av hvert dyr for Pg-LPS-injeksjon og den retentive ligaturen rundt M1 kan inkluderes som årsaker til ikke å oppnå riktig inflammasjon og påfølgende benresorpsjon. Selv om det oppnås gode resultater ved induksjon av PD ved bruk av denne prosedyren, er det viktig å redusere variasjonen mellom dyr nøye ved å følge protokollen nøye. En av de viktigste modifikasjonene av metoden er plasseringen av den retentive ligaturen rundt M1, og ikke rundt M2, den mest tradisjonelle ligaturmodellen i litteraturen13,14,15. Operasjonsprosedyren for ligaturplassering hos mus eller rotter gir tekniske problemer, og representerer en potensiell utfordring for mange forskere på grunn av den lille størrelsen på murine munnhule og tenner11,16. Bruken av rotter og plassering av ligaturen rundt M1 lettet manipulasjonen og tilgangen til området, noe som også reduserte dyrets stress under prosedyren. Ingen dyrs lidelse ble observert under protokollen, men hvis noen rotter viser tegn på nød, bør du vurdere å fjerne dem fra forsøket for å forhindre lidelse. Til slutt er det mest begrensende trinnet i prosedyren å unngå tap av ligaturen, noe som kan skje 7-10 dager etter operasjonen. For å øke og opprettholde sykdomsintensiteten med tiden, er det viktig å justere ligaturene for å opprettholde intim kontakt med gingiva vev, og redusere variasjonen av intensiteter på periodontittinduksjon mellom dyr15. Generelt, hvis prosedyren utføres riktig, bør det ikke være behov for endringer, og konsistente resultater vil bli oppnådd.
Det er viktig å merke seg at denne modellen presenterer flere begrensninger. Først og fremst ble det utviklet en teknikk for studier av PD forårsaket av en traumatisk skade (ligaturposisjon), som antas å lette lokal opphopning av bakterier og derved forbedre bakteriemediert betennelse og bentap13,10, med kombinasjonen av Pg-LPS-injeksjon. Men faktisk etterligner metoden ikke de naturlige etiologiske faktorene som er ansvarlige for mikrobiota dysbiose i human periodontitt og etterligner ikke flere andre mulige mekanismer ved hvilke periodontitt kan oppstå. I tillegg er murine tannstrukturer ikke identiske med mennesker15. Videre, mens metoden som presenteres er effektiv for å studere akutt PD, kan den ikke gjenspeile det langsiktige bentapet og inflammatoriske infiltrasjonsegenskapene ved kronisk PD16. I detalj med metoden foreslått for evaluering av alveolært bentap, er den mest brukte metoden for flerdimensjonal evaluering av bein mikro-CT, som tillater evaluering av eksterne faktorer og gir tredimensjonale bilder av beinet. I tillegg kan trabekulære beinparametere, beinvolum og beinmineraltetthet analyseres uten å bryte beinene14,17. Imidlertid ble bruk av CBCT for vurdering av alveolær bentap foreslått her (figur 3) som et alternativ til mikro-CT; Selv om bilder med lavere oppløsning oppnås, gir det også en nyttig kvalitativ og kvantitativ analyse av periodontittprogresjon18,19,20. Så, CBCT-eksamener gir en nøyaktig metode for avbildning, mer tilgjengelig og tilgjengelig enn mikro-CT, noe som vil lette studier av periodontittinduksjon hos rotter.
Blant de forskjellige dyremodellene som har blitt brukt til å etterligne PD in vivo16 for å vurdere tannstøttende vev (gingiva og bein) under velkontrollerte forhold, har den ligaturinduserte PD-modellen blitt mye brukt hos rotter, hunder og ikke-menneskelige primater13. Litteraturen indikerer også at, til tross for at de brukes i noen protokoller, resulterer bruken av mus - som representerer en praktisk, billig og allsidig modell - i en mer teknisk utfordring på grunn av den relativt små størrelsen på musens munnhule sammenlignet med rotter13. Sammenlignet med andre modeller gir den ligaturinduserte PD-rottemodellen flere fordeler, inkludert rask sykdomsinduksjon, som kan begynne på et forutsigbart tidspunkt og kulminere i alveolær bentap i løpet av få dager (mus og rotter)13. Det er andre fordeler med denne metoden, for eksempel potensialet til å studere periodontalt vev og alveolær beinregenerering, samt evnen til å lokalisere og dissekere betent gingivalvev for å vurdere nivået av betennelse15. Metoden for å kombinere den ligaturinduserte PD-modellen med LPS-injeksjonen legger til en lokal destruktiv inflammatorisk respons i periodontium som forbedrer tapet av bindevevsvedlegg og alveolær benresorpsjon generert av ligaturen. Denne additive effekten anbefales å øke med konsentrasjonen og frekvensen av LPS-injeksjoner10. Metoden rapportert her presenterer en optimalisert protokoll for en kombinasjon av ligatur med Pg-LPS-injeksjon, med fordelene og betydningen av begge metodene.
Optimalisering og utvikling av sikre og økonomiske in vivo-modeller av PD er avgjørende for å lette forståelsen av patogenesen av periodontal sykdom og testing av nye terapeutiske tilnærminger. PD-modellen av den kombinerte teknikken med Pg-LPS-injeksjoner og ligaturplassering rundt M1 presentert her vurderes å være en attraktiv studiemodell, for å undersøke vertsmikrobeinteraksjoner, betennelse i periodontitt og alveolær benresorpsjon. Denne modellen identifiserer de mest kritiske settene i protokollen, beskriver dem i bildebaserte tekniske detaljer, og standardiserer og optimaliserer bruken av disse kombinerte teknikkene. Bruk av tilleggsteknikker for evaluering av periodontittprogresjon kan være mulig, inkludert histologiske analyser av både alveolarbenet og omkringliggende festet gingiva, bestemmelse av andre cytokiner involvert i inflammasjon og karakterisering av oral mikrobiota. Selv om modellen ikke kan gjenspeile alle aspekter av mekanismene eller årsakene til PD hos mennesker, viser denne studien at signifikante degenerative og inflammatoriske endringer i periodontale vev og alveolær bein kan induseres 14 dager etter intervensjonen, noe som gir grunnlag for fremtidige prekliniske forebyggende eller behandlingsstudier for periodontal sykdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Fundació Universitat-Empresa de les Illes Balears (Proof of concept call 2020), av Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competividad, medfinansiert av ESF European Social Fund og ERDF European Regional Development Fund (kontrakt til M.M.B; FI18/00104) og av Direcció General d'Investigació, Conselleria d'Investigació, Govern Balear (kontrakt med M.M.F.C; FPI/040/2020). Forfatterne takker Dr. Anna Tomás og Maria Tortosa for deres hjelp på eksperimentell kirurgi og plattform av IdISBa. Til slutt, takk til ADEMA School of Dentistry for tilgangen til CBCT-skanneren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adsorbent paper point nº30 | Proclinc | 8187 | |
| Aprotinin | Sigma-Aldrich | A1153 | |
| Atipamezole | Dechra | 573751.5 | Revanzol 5 mg/mL |
| Braided silk ligature (5/0) | Laboratorio Arago Sl | 613112 | |
| Buprenorphine | Richter pharma | 578816.6 | Bupaq 0.3 mg/mL |
| Cone-beam computed tomography (CBCT) Scanner | MyRay | hyperion X9 | Model Hyperion X9 |
| CTAn software | SkyScan | Version 1.13.4.0 | |
| Dental explorer | Proclinc | 99743 | |
| Diamond lance-shaped bur | Dentaltix | IT21517 | |
| Food maintenance diet | Sodispain research | ROD14 | |
| Heated surgical platform | PetSavers | ||
| Hollenback carver | Hu-FRIEDY | HF45234 | |
| Hypodermic needle | BD | 300600 | 25G X 5/8” - 0,5 X 16 MM |
| Isoflurane | Karizoo | Isoflutek 1000mg/g | |
| Ketamine | Dechra | 581140.6 | Anesketin 100 mg/mL |
| Lipopolysaccharide derived from P.Gingivalis | InvivoGen | TLRL-PGLPS | |
| Methanol | Fisher Scientific | M/4000/PB08 | |
| Micro needle holter | Fehling Surgical Instruments | KOT-6 | |
| Microsurgical pliers | KLS Martin | 12-384-06-07 | |
| microsurgical scissors | S&T microsurgical instruments | SDC-15 RV | |
| Monitor iMEC 8 Vet | Mindray | ||
| Multiplex bead immunoassay | Procartaplex, Thermo fisher Scientific | PPX-05 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 8187151000 | |
| Periosteal microsurgical elevator | Dentaltix | CU19112468 | |
| Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) | Roche | 10837091001 | |
| Phosphate Buffer Solution (PBS) | Capricorn Scientific | PBS-1A | |
| PhosSTOP | Roche | 4906845001 | Commercial phosphatase inhibitor tablet |
| Plastic vial | SPL Lifesciencies | 60015 | 1.5mL |
| Saline | Cinfa | 204024.3 | |
| Stereo Microscope | Zeiss | Model SteREO Discovery.V12 | |
| Surgical loupes led light | Zeiss | ||
| Surgical scissors | Zepf Surgical | 08-1701-17 | |
| Syringe | BD plastipak | 303172 | 1mL |
| Veterinary dental micromotor | Eickemeyer | 174028 | |
| Xylazine | Calier | 20102-003 | Xilagesic 20 mg/mL |
References
- Carvalho, J. D. S., et al. Impact of citrus flavonoid supplementation on inflammation in lipopolysaccharide-induced periodontal disease in mice. Food and Function. 12 (11), 5007-5017 (2021).
- Nazir, M. A. Prevalence of periodontal disease, its association with systemic diseases and prevention. International Journal of Health Sciences. 1 (2), 72-80 (2017).
- Dumitrescu, A. L., El-Aleem, S. A., Morales-Aza, B., Donaldson, L. F. A model of periodontitis in the rat: Effect of lipopolysaccharide on bone resorption, osteoclast activity, and local peptidergic innervation. Journal of Clinical Periodontology. 31 (8), 596-603 (2004).
- Wang, H. Y., et al. Preventive effects of the novel antimicrobial peptide Nal-P-113 in a rat Periodontitis model by limiting the growth of Porphyromonas gingivalis and modulating IL-1β and TNF-α production. BMC Complementary and Alternative Medicine. 17 (1), 1-10 (2017).
- Guan, J., Zhang, D., Wang, C. Identifying periodontitis risk factors through a retrospective analysis of 80 cases. Pakistan Journal of Medical Sciences. 38 (1), 293-296 (2021).
- Khajuria, D. K., Patil, O. N., Karasik, D., Razdan, R. Development and evaluation of novel biodegradable chitosan based metformin intrapocket dental film for the management of periodontitis and alveolar bone loss in a rat model. Archives of Oral Biology. 85, 120-129 (2018).
- Nishida, E., et al. Bone resorption and local interleukin-1alpha and interleukin-1beta synthesis induced by Actinobacillus actinomycetemcomitans and Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide. Journal of Periodontal Research. 36 (1), 1-8 (2001).
- Graves, D. T., Kang, J., Andriankaja, O., Wada, K., Rossa, C. Animal models to study host-bacteria interactions involved in periodontitis. Bone. 23 (1), 1-7 (2008).
- Struillou, X., Boutigny, H., Soueidan, A., Layrolle, P. Experimental animal models in periodontology: a review. The Open Dentistry Journal. 4 (1), 37-47 (2010).
- Mustafa, H., et al. Induction of periodontal disease via retentive ligature, lipopolysaccharide injection, and their combination in a rat model. Polish Journal of Veterinary Sciences. 24 (3), 365-373 (2021).
- Chadwick, J. W., Glogauer, M. Robust ligature-induced model of murine periodontitis for the evaluation of oral neutrophils. Journal of Visualized Experiments. 2020 (155), 6-13 (2019).
- Cheng, R., Wu, Z., Li, M., Shao, M., Hu, T. Interleukin-1β is a potential therapeutic target for periodontitis: a narrative review. International Journal of Oral Science. 12 (1), 1-9 (2020).
- Abe, T., Hajishengallis, G. Optimization of the ligature-induced periodontitis model in mice. Journal of Immunological Methods. 394 (1-2), 49-54 (2013).
- Jeong-Hyon, K., Bon-Hyuk, G., Sang-Soo, N., Yeon-Cheol, P. A review of rat models of periodontitis treated with natural extracts. Journal of Traditional Chinese Medical Sciences. 7 (2), 95-103 (2020).
- Marchesan, J., et al. An experimental murine model to study periodontitis. Nature Protocols. 13 (10), 2247-2267 (2018).
- Lin, P., et al. Application of ligature-induced periodontitis in mice to explore the molecular mechanism of periodontal disease. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 8900 (2021).
- Irie, M. S., et al. Use of micro-computed tomography for bone evaluation in dentistry. Brazilian Dental Journal. 29 (3), 227-238 (2018).
- Haas, L. F., Zimmermann, G. S., De Luca Canto, G., Flores-Mir, C., Corrêa, M. Precision of cone beam CT to assess periodontal bone defects: a systematic review and meta-analysis. Dentomaxillofacial Radiology. 47 (2), 20170084 (2018).
- Kamburoğlu, K., Ereş, G., Akgün, C. Qualitative and quantitative assessment of alveolar bone destruction in adult rats using CBCT. Journal of Veterinary Dentistry. 36 (4), 245-250 (2019).
- Sousa Melo, S. L., Rovaris, K., Javaheri, A. M., de Rezen de Barbosa, G. L. Cone-beam computed tomography (CBCT) imaging for the assessment of periodontal disease. Current Oral Health Reports. 7 (4), 376-380 (2020).
