Summary
I denne undersøgelse præsenteres en rottemodel for induktion af parodontitis via en kombination af retentiv ligatur og gentagne injektioner af lipopolysaccharid afledt af Porphyromonas gingivalis, over 14 dage omkring de første maksillære molarer. Ligerings- og LPS-injektionsteknikkerne var effektive til at inducere peridontitis, hvilket resulterede i alveolært knogletab og betændelse.
Abstract
Parodontitis (PD) er en meget udbredt, kronisk immuninflammatorisk sygdom i periodontium, der resulterer i tab af tandkødsblødt væv, parodontalt ledbånd, cementum og alveolær knogle. I denne undersøgelse beskrives en simpel metode til PD-induktion hos rotter. Vi giver detaljerede instruktioner til placering af ligaturmodellen omkring de første maksillære molarer (M1) og en kombination af injektioner af lipopolysaccharid (LPS), afledt af Porphyromonas gingivalis på mesio-palatal side af M1. Induktionen af parodontitis blev opretholdt i 14 dage, hvilket fremmer akkumulering af bakterier biofilm og inflammation. For at validere dyremodellen blev IL-1β, en vigtig inflammatorisk mediator, bestemt ved et immunoassay i tandkødscrevikulær væske (GCF), og alveolært knogletab blev beregnet ved anvendelse af keglestrålecomputertomografi (CBCT). Denne teknik var effektiv til at fremme tandkødsrecession, alveolært knogletab og en stigning i IL-1β-niveauer i GCF ved afslutningen af den eksperimentelle procedure efter 14 dage. Denne metode var effektiv til at inducere PD og kunne således anvendes i undersøgelser af sygdomsprogressionsmekanismer og fremtidige mulige behandlinger.
Introduction
Parodontitis (PD) er den sjette mest udbredte folkesundhedstilstand på verdensplan, der påvirker ca. 11% af den samlede befolkning og er en avanceret, irreversibel og destruktiv form for periodontal sygdom 1,2. PD er en inflammatorisk proces, der påvirker tandkøds- og periodontalvævet, hvilket resulterer i tandkødsrecession, apikal migration af krydsepitelet med lommeudvikling og tab af alveolær knogle3. Desuden er PD forbundet med flere systemiske sygdomme, herunder hjerte-kar-sygdomme, fedme, diabetes og leddegigt, hvor miljømæssige og værtsspecifikke faktorer spiller en væsentlig rolle 4,5.
Derfor er PD en multifaktoriel sygdom, der primært initieres af akkumulering af mikrobiel plak - som følge af dysbiose af mikrobielle samfund - og af et overdrevet værtsimmunrespons på periodontale patogener, hvilket fører til nedbrydning af periodontalt væv 4,6. Blandt flere periodontale bakterier er den gramnegative anaerobe bakterie Porphyromonas gingivalis et af de vigtigste patogener i PD4. P. gingivalis indeholder et komplekst lipopolysaccharid (LPS) i dets vægge, et molekyle kendt for at inducere polymorfonukleær leukocytinfiltration og vaskulær dilatation i betændt parodontalt væv7. Dette resulterer i produktion af inflammatoriske mediatorer, såsom interleukin 1 (IL-1), IL-6 og IL-8, tumornekrosefaktor (TNF) eller prostaglandiner, med en efterfølgende osteoklastaktivering og knogleresorption, hvilket fører til vævsødelæggelse og ultimativt tandtab3.
Blandt de forskellige fordele ved dyremodeller er evnen til at efterligne cellulære kompleksiteter som hos mennesker eller være mere nøjagtige end in vitro-undersøgelser , der udføres på plastoverflader med begrænsede celletyper8. Til modellering af PD eksperimentelt in vivo er forskellige dyrearter blevet brugt, som ikke-menneskelige primater, hunde, svin, fritter, kaniner, mus og rotter9. Rotter er imidlertid den mest omfattende undersøgte dyremodel for patogenesen af PD, fordi de er billige og nemme at håndtere10. Deres dental tandkødsvæv har lignende strukturelle træk som humant tandkødsvæv, med en lav gingival sulcus og junctional epitel fastgjort til tandoverfladen. Desuden, som hos mennesker, letter forbindelsesepitelet passagen af bakterielle, fremmede materialer og ekssudater fra inflammatoriske celler 9.
En af de mest rapporterede eksperimentelle modeller af PD-induktion hos rotter er placeringen af ligaturer omkring tænderne, hvilket er teknisk udfordrende, men pålideligt10. Ligaturplaceringen letter tandplak og bakteriel akkumulering, hvilket genererer en dysbiose i tandkødssulci, der forårsager periodontal vævsbetændelse og ødelæggelse11. Tab af periodontal binding og resorption af alveolær knogle kan forekomme på 7 dage i denne rottemodel8.
En anden dyremodel for PD består af injektion af LPS i tandkødsvævet. Som følge heraf stimuleres osteoklastogenese og knogletab. De histopatologiske træk ved denne model ligner humant etableret PD, karakteriseret ved højere niveauer af proinflammatoriske cytokiner, kollagennedbrydning og alveolær knogleresorption 6,8.
Formålet med denne undersøgelse var således at beskrive en simpel rottemodel af eksperimentel PD baseret på teknikkerne til P. gingivalis-LPS (Pg-LPS) injektioner kombineret med ligaturplacering omkring de første maksillære molarer (M1). Dette er en model med lignende karakteristika som dem, der observeres ved human PD-sygdom, som kan bruges i studiet af sygdomsprogressionsmekanismer og fremtidige mulige behandlinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Forsøgsprotokollen for undersøgelsen blev godkendt af den etiske komité for dyreforsøg ved Balearerne Health Research Institute (CEEA-UIB; referencenummer 163/03/21).
1. Forberedelse af dyrebedøvelse og procedure
- Steriliser alle kirurgiske instrumenter (mundgags i aluminium, tandforsker, diamantlanse, kirurgisk saks, mikrokirurgisk tang, en mikronåleholder, en hulskærer, en periosteal mikrokirurgisk elevator og mikrokirurgisk saks) (5 min ved 135 °C) før operationen.
- Forbered alle de nødvendige opløsninger til proceduren under sterile forhold som beskrevet:
- Forbered en blanding af Ketamin (60 mg / ml) og Xylazin (8 mg / ml) ved at blande 1,6 ml Ketamin med 1 ml xylazin fortyndet i fosfatbufferopløsning (PBS) / saltvand. Opbevar fonden ved 4 °C.
- Atipamezol fortyndes til en slutkoncentration på 0,25 mg/ml i PBS/saltvand. Opbevar fonden ved 4 °C.
- Buprenorphin fortyndes til en slutkoncentration på 0,03 mg/ml i PBS/saltvand. Opbevar fonden ved 4 °C.
- Forbered 1 ml Pg-LPS (1 mg / ml) i sterilt saltvand. Opbevar lageret ved -20 °C.
- Til forsøget skal du bruge kvindelige og mandlige Wistar-rotter i alderen 12 uger og vejer 210-350 g på operationstidspunktet. Opstalde dyrene i grupper under passende omgivelser og konstante forhold (20-24 °C, 12 timer pr. dag lys-mørke cyklusser) med foder og standardvand, der tilbydes ad libitum.
- For at fremkalde anæstesi vejes rotten og blandingen af ketamin/xylazin i en koncentration på 80/10 mg/kg intraperitonealt (IP) ved hjælp af en 25 G steril kanyle og 1 ml sprøjte.
- Når rotten er bedøvet, skal du placere dyret på ryggen på en opvarmet kirurgisk platform; Under proceduren skal du dække dyrets krop for at forhindre varmetab.
BEMÆRK: Anæstesidybden vurderes ved tab af pedalrefleks under proceduren og ved overvågning af vitale tegn. Brug om nødvendigt en lille næsekegle til at opretholde anæstesi med 2% isofluran i 100% ilt. Påfør steril oftalmisk salve på begge øjne efter anæstesiinduktion for at beskytte hornhinderne og forhindre tørring. - Under procedurerne skal du administrere 100% ilt ved hjælp af en lille næsekegle og overvåge pulsfrekvensen og iltmætningen ved pulsoximetri.
BEMÆRK: Hvis iltmætning og puls falder til henholdsvis 95% og 190 bpm, skal du stoppe proceduren og placere dyret i lateral decubitusposition, indtil det når normale værdier. - Åbn rottemundingen ved hjælp af en mundgag af aluminium omkring fortænderne (øvre og nedre), træk tungen tilbage med den og stabiliser maxilla og underkæben i en åben, behagelig arbejdsstilling, hvilket giver adgang til mandibulære molarer.
BEMÆRK: Hvis dyret skal placeres i lateral decubitus, skal du fjerne mundgaggen, før du ændrer sin position for at favorisere genopretning. Når dyret er bedøvet, skal du indsamle tandkødscrevikulær væske (GCF) før operationen (prøve under basale forhold) (dag 0). - Indsaml GCF som beskrevet ved følgende trin:
- Placer dyret på ryggen på en kirurgisk platform og stabiliser maxilla og underkæben i åben position med aluminium mundgags.
- GCF opsamles ved hjælp af i alt fire (to for hver M1) absorberende papirpunkt nº 30 (0,03 cm diameter x 3 cm længde) ved at indsætte det i tandkødssprækken (mellemrum mellem tandkødepitel og tilstødende emalje) omkring mesio-palatalen af M1 indtil let modstand. Hold papirpunktet i samme position i i alt 30 sekunder, før det straks fjernes.
- Efter opsamling overføres papirpunktet straks til et hætteglas af plast og opbevares ved -80 °C indtil analyseydelse.
2. Retentiv ligaturteknik og intragingival Pg -LPS-injektion
BEMÆRK: Ligaturmodellen blev oprettet (dag 0) ved at placere en steril flettet silkeligatur (5/0) omkring M1 bilateralt inden for tandkødssulcus ved hjælp af mikrokirurgiske instrumenter og sikre den med kirurgens knuder på den palatale overflade. De anvendte mikrokirurgiske instrumenter var mikrokirurgisk tang, en mikronåleholder, en hollenback carver, en periosteal mikrokirurgisk elevator og mikrokirurgisk saks. Kirurgiske loupes med en LED-lyskilde blev også brugt (3.6x forstørrelse).
- Placer suturens distale hale på den palatale side af tandprotesen, og indsæt det proksimale segment mellem kontakten mellem M1 og anden maksillær molarer (M2).
- Brug den periosteale mikrokirurgiske elevator til at indsætte suturen i sulcus. Sæt ligaturen rundt om bukkaloverfladen af M1 meget omhyggeligt, da vævene på dette niveau præsenterer en smal zone med vedhæftet gingiva. På det palatale aspekt skal du sørge for, at suturen strammes i begge ender for at sikre, at den drives ind i tandkødssulcus.
BEMÆRK: Hvis der observeres modstand ved indsættelse af suturen mellem M1 og M2, kan kontakten åbnes let ved hjælp af en tandforsker og diamantlanseformet bur. - Bind enderne af suturen med en kirurgknude og trim halerne så korte som muligt. Indsæt knuden i sulcus.
BEMÆRK: Tips om kirurgiske instrumenter kan forårsage oral traume og blødning. Forbered små segmenter af gasbind eller en vatpind for at fjerne blod fra mundhulen og påfør tryk for at stoppe blødning. Omhyggelig bløddelsstyring med en mikrokirurgisk tilgang minimerer kirurgiske komplikationer og fører til mindre vævstraumer. - Efter ligaturpositionering injiceres 40 μL Pg-LPS i sterilt saltvand med en 25 G steril kanyle og en 1 ml sprøjte til det subgingivalvæv (mellem roden eller halsen af en tand og tandkødsmargenen) på mesio-palatalsiden af M1 bilateralt (dag 0).
3. Procedurens afslutning
- Efter ligeringspositionering og Pg-LPS-applikation frigøres rotten fra den kirurgiske tilstand og placeres i et rent individuelt bur under en varmelampe.
- Injicer antagonisten Atipamezol (0,5 mg/kg subkutant (SC)) med en 25 G steril kanyle og en 1 ml sprøjte.
- Til smertelindring injiceres 0,03 mg/kg Buprenorphin, SC.
- Overvåg dyrets opsving, indtil virkningerne af operationen er helt vendt. Opstald hver rotte individuelt i det rette miljø under konstante forhold (20-24 °C, 12 timer pr. dag lys-mørke cyklusser). Tilbyd mad og deioniseret vand ad libitum.
- I løbet af de første 2 dage efter proceduren vejes dyrene og injiceres Buprenorphin SC to gange dagligt til smertelindring.
BEMÆRK: Buprenorphin kan administreres før påbegyndelse af proceduren for at eliminere afviklingseffekten. - I løbet af eksperimentet overvåges dyrene efter vægt og generel adfærdsvurdering en eller to gange om ugen.
4. Opfølgning efter proceduren
BEMÆRK: Induktionen af PD blev opretholdt i 14 dage for at fremme akkumulering af bakteriers biofilm og deraf følgende inflammation. Ligaturerne skal undersøges og justeres, og Pg-LPS injiceres tre gange om ugen (dag 2, dag 4, dag 6, dag 8, dag 10 og dag 12).
- Undersøg og juster ligaturen (dag 2, dag 4, dag 6, dag 8, dag 10 og dag 12) som følger:
- Anæstetiser med 2% isofluran i 100% ilt ved hjælp af et anæstesiinduktionskammer.
- Når rotten er bedøvet, skal du placere dyret på ryggen og bruge en lille næsekegle under proceduren med 1% isofluran i 100% ilt til vedligeholdelse af dyrebedøvelsen.
- Åbn rottemundingen ved hjælp af aluminiumsmundgaggen omkring fortænderne (øvre og nedre), træk tungen tilbage med den og stabiliser maxilla og underkæben i en åben, behagelig arbejdsstilling, hvilket giver adgang til ligaturer.
- Stram ligaturerne mod tandkødet ved hjælp af en periosteal mikrokirurgisk elevator, og sørg for, at ligaturernes sutur indsættes, hvilket skaber betændelse omkring tandkødet.
BEMÆRK: Det er muligt, at ligaturer går tabt 7-10 dage efter operationen. Hvis dette sker, skal du følge protokollen som forklaret for injektion af Pg-LPS (trin 2.4).
- Efter ligaturjusteringen injiceres bilateralt 40 μL Pg-LPS med en 25 G steril kanyle og en 1 ml sprøjte til det subgingivalvæv på den mesio-palatale side af M1 (dag 2, dag 4, dag 6, dag 8, dag 10 og dag 12).
- Fjern næsekeglen til anæstesi og læg rotten i buret. Overvåg dyrets genopretning, indtil anæstesiens virkninger er helt vendt.
5. Dyreofring og analyse
BEMÆRK: Der er forskellige muligheder for at evaluere udviklingen af PD. Her består den beskrevne analyse af en evaluering af proinflammatoriske cytokiner ved tandkødscrevikulær væske (GCF) og en evaluering af tabet af alveolær knogle.
- På dag 14 i undersøgelsen (dag 14) ofres dyrene med CO2 i et kuldioxidkammer. En forskydningshastighed på 30% til 70% af kammerets volumen / min anbefales til gnavere.
BEMÆRK: Manglende dyrs reaktion på pedalrefleks og fravær af vitale tegn skal verificeres for at bekræfte eutanasi. - Indsaml GCF som beskrevet ved følgende trin:
BEMÆRK: GCF indsamles før PD-induktion (før operation) (dag 0) og efter PD-induktion (efter ofring) (dag 14).- Placer dyret på ryggen på en kirurgisk platform, og stabiliser maxilla og underkæbe i åben position med aluminium mundgags.
- GCF opsamles ved hjælp af adsorberende papirpunkt nº 30 (0,03 cm diameter x 3 cm længde) ved at indsætte det i tandkødssprækken omkring mesio-palatalen af M1 indtil let modstand. Hold papirpunktet i samme position i i alt 30 sekunder, før det straks fjernes.
- Efter opsamling overføres papirpunktet straks til et hætteglas af plast og opbevares ved -80 °C, indtil det er korrekt.
- For at evaluere proteiner i GCF skal du forberede følgende opløsninger og følge trinnene i elueringsmetoden som beskrevet:
BEMÆRK: IL-1β evalueres på GCF (dag 14) ved hjælp af et immunoassay i henhold til producentens protokol.- Forbered elueringsbufferen frisk og hold den på is gennem hele ekstraktionsprocessen for at hæmme proteaseaktivitet.
- Alle nødvendige opløsninger til elueringsbufferen fremstilles som beskrevet:
- Forbered 1 ml Aprotinin (1 mg / ml) i ultrarent vand.
- Der fremstilles 10 ml phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) (200 mM) i methanol.
- Der tilsættes 125 μL PMSF og 250 μL Aprotinin til 24,5 ml PBS-opløsning (pH = 7,4) for at forberede elueringsbufferen.
- En kommerciel fosfatasehæmmertablet opløses med 10 ml frisklavet elueringsbuffer i 10 minutter under omrystning ved 4 °C.
BEMÆRK: Varigheden af GCF-eluering er begrænset; anvendes straks til centrifugering efter tilsætning af fosfatasehæmmer tablet inden for de første 30 minutter. - Efter tilsætning af fosfatasehæmmeren tilsættes 11 μL komplet elueringsbuffer direkte på røret med papirpunkterne.
- Centrifuger glasset ved 452 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Overfør det eluerede indhold til et nyt hætteglas af plast. Gentag denne proces yderligere fire gange for at opnå et samlet volumen på 50 μL.
- Efter den sidste centrifugering tilsættes et samlet volumen på 60 μL direkte på papirpunktet, og centrifugeres en sidste gang ved 452 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Brug det krævede volumen, der elueres til proteinevaluering.
- Efter eutanasi og GCF-indsamling skal du ved hjælp af kirurgisk saks skære rotternes overlegne kæbe ud. Prøv at skrælle rottens maske af og efterlade så lidt blødt væv som muligt.
- Placer kæben i mikroskopstadiet for visualisering og tag et billede med den ønskede forstørrelse.
- Placer kæben direkte i 4% paraformaldehyd (PFA) fortyndet i PBS. Opdater to gange om ugen med ny PFA i 12 dage for en komplet fiksering.
FORSIGTIG: Trin, der involverer PFA, skal udføres i en stinkhætte i henhold til anbefalingerne i sikkerhedsdatabladet. - Efter fuldstændig kæbefiksering skal du evaluere knogletab ved hjælp af en keglestrålecomputertomografi (CBCT) scanner som følger:
- Åbn pc'en.
- Åbn CBCT-analyseprogrammet.
- Vælg Scan Protocol > Denture Scan Mode.
- Vælg synsfelt (FOV) > ( 11x8) HIRes ( 90 kV spænding og 3 mA strøm).
- Placer rotternes faste øvre maxilla i portalen.
- Klik på Næste.
- Klik på knappen Røntgenaffyring (tryk på røntgenfjernbetjeningen for at foretage udsendelsen, og hold den nede under hele scanningen).
- Flyt om nødvendigt den øverste maxilla i midten af frontplanet ved at trykke på kontrolknappen, og klik derefter på røntgenaffyringsknappen (tryk på røntgenfjernbetjeningen for at foretage emissionen, og hold den nede under hele scanningens varighed).
- Klik på Næste.
- Klik på knappen Røntgenaffyring (tryk på røntgenfjernbetjeningen for at foretage udsendelsen, og hold den nede under hele scanningen).
- Flyt om nødvendigt protesen i midten af sagittalplanet ved at trykke på kontrolknappen, og klik derefter på røntgenaffyringsknappen (tryk på røntgenfjernbetjeningen for at foretage udsendelsen og hold den nede under hele scanningens varighed).
- Klik på Næste.
- Klik på Start-knappen (tryk på røntgenfjernbetjeningen for at foretage emissionen, og hold den nede under hele eksamensvarigheden). Vent, indtil du modtager en behandlingsmeddelelse, og følg derefter de viste instruktioner.
- Der vises en vinduesvisning. Reguler det grå ved 65%, og klik på Anvend.
- For at gemme scanningen skal du klikke på Filer og gemme den i DICOM-format. Klik derefter på Alle billeder , og i vinduet DICOM-eksportvalg skal du vælge alle de viste parametre (indledende billede, originalt aksial, omformateret aksial, multiplan) og vælge foruddefineret type.
- Behandl de maksillære molarers todimensionelle og sagittale repræsentative billeder ved hjælp af et analyseprogram som følger:
- Åbn softwaren.
- Klik på Filer og åbn, vælg derefter mappen med billeder i DICOM-format, og klik på Åbn.
- Vent, indtil vinduet "Konverter til 8 bit" vises, vælg området fra 0 til 6.000, og klik på OK.
- Klik på Raw-billeder.
- Definer toppen og bunden af markeringen for at begrænse interesseområdet. Søg efter det første og sidste billede, hvor alveolær knogle vises, og vælg det med toppen af markeringen og bunden af markeringskommandoerne.
BEMÆRK: Repræsentative todimensionale billeder af molarernes alveolære knogle kunne eksporteres, som i figur 3A, B. - For sagittale repræsentative billeder skal du klikke på Skift profillinje.
- Tegn en sagittal linje midt i ganen, og klik på Udsnitsmodel. Bestem parametre til afgrænsning af interesseområdet (udsnitsafstand: 1; antal udsnit: 100), og klik på OK. Vent, indtil udsnitsmodellen slutter. Klik til sidst på Gem udskårne billeder.
BEMÆRK: Repræsentative sagittale forestillinger om den alveolære knogle i kindtænderne kunne eksporteres, som i figur 3C, D.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En tidslinje over de eksperimentelle trin er vist i figur 1. Figur 2A viser et billede af mandibula efter kirurgisk indgreb med ligaturplacering omkring sulcus af M1 på tidspunktet 0 for eksperimentet. Figur 2B viser, hvordan ligaturen omkring M1 efter 14 dage efter proceduren kommer ind i tandkødssulcus, hvilket forårsager betændelse i tandkødet og infiltrerer ophobning.
Figur 1: Skematisk gengivelse af tidslinjen for forsøgsproceduren for parodontitis (PD) induktion hos rotter. Klik her for at se en større version af denne figur.
Repræsentative todimensionelle billeder (figur 3; rød firkant) viser alveolære knogletabsforskelle i mandibula mellem basalkontrollen, der viser mere knoglevolumen (figur 3A), og efter PD-etablering, der viser højere alveolært knogletab (figur 3B). Desuden fremhæver analyse af sagittale billeder det større alveolære knogletab i det interradikulære knogleområde i M1 (figur 3D; rød pil) og M2 (figur 3D; grøn pil) efter PD-etablering sammenlignet med den basale kontrolgruppe (figur 3C). Desuden var alveolær knogleresorption karakteriseret ved en stigning i rummet mellem cementemaljeforbindelsen (CEJ) og alveolær knoglekam (ABC). Afstanden mellem CEJ og ABC i begge rottegrupper er vist i figur 3C,D med blå pile. Etableret PD udviklede store mellemrum mellem CEJ og ABC (figur 3D) sammenlignet med basalstyringen (figur 3C).
På offertidspunktet viste billeder af ganen forskelle i tandkødsrecession i M1 i de forskellige grupper (figur 4A, B). PD-gruppen (figur 4B) viser en større apikal tandkødsmigration på grund af tabet af knoglestøtte og rodeksponering sammenlignet med basalkontrolgruppen (figur 4A). PD-gruppen (figur 4B) præsenterede også en større betændelse i tandkødet omkring de maksillære molarer sammenlignet med basalkontrolgruppen (figur 4A). Figur 4C viser resultaterne af analysen af proinflammatorisk cytokin IL-1β fra GCF, der viser en signifikant højere frigivelse af IL-1β vist i PD-gruppen sammenlignet med kontrolgruppen. Ifølge litteraturen deltager IL-1β i inflammation, immunregulering og knogleresorption i parodontitis og er en stærk stimulator for periodontal vævsødelæggelse12.
Figur 2: Billeder af ligaturen indsat i sulcus af M1 på forskellige tidspunkter. (A) Rottegane med ligaturplacering omkring M1, 0 dage efter indsættelse af ligaturen. (B) Rottegane med ligaturplacering omkring M1, 14 dage efter indsættelse af ligaturen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Repræsentative todimensionelle billeder af alveolære knogler og maksillære molarer. Repræsentative todimensionelle fotos opnået ved CBCT af alveolær knogle af maksillære molarer (rød firkant) af (A) basalkontrollen og (B) etableret parodontitis (PD) i 14 dage med ligaturindsættelse og Pg-LPS-injektion. Repræsentative sagittale todimensionelle visninger af de maksillære molarer af (C) basalkontrollen og (D) PD. De røde pile angiver det interradikulære alveolære knogleområde af M1, de blå pile angiver afstanden mellem CEJ og ABC, og de grønne pile angiver det interradikulære alveolære knogleområde af M2. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Repræsentative billeder af ganen. Repræsentative billeder af ganen efter ofring af (A) basal kontrolgruppe og (B) parodontitis (PD) gruppe, behandlet i 14 dage med ligaturindsættelse og Pg-LPS-injektion. (C) Bestemmelse af IL-1β-koncentrationer i GCF i basalkontrolgruppen og PD-gruppen (n = 9). Data repræsenterer den gennemsnitlige ± SEM. Resultaterne blev statistisk sammenlignet af Kruskal-Wallis: * p < 0,05 PD gruppe versus basal kontrolgruppe. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne metode beskriver induktionen af PD hos rotter efter en kombineret teknik med Pg-LPS-injektioner og ligaturplacering omkring M1, hvilket afslører, at signifikante ændringer i parodontalt væv og alveolær knogle kunne induceres i 14 dage efter denne metode.
Under denne procedure skal der lægges vægt på forskellige kritiske trin. Under dyrebedøvelse og procedureforberedelse er vurdering af den korrekte anæstesi under den kirurgiske proces afgørende for dens succes, ligesom det er at sikre den korrekte placering af dyret, stabilisere den åbne rottemund med aluminiumsmundgaggen omkring fortænderne og undgå, at dyrene bliver skadet med gag og kirurgiske instrumenter. Hvis iltmætning og puls falder, skal proceduren stoppes, og dyret placeres i lateral decubitusposition, indtil det når normale værdier. Under ligaturpositionen er det vigtigt, at suturen og knuden indsættes korrekt i sulcus, i betragtning af at blødt vævsskade bør minimeres for at forhindre smerte og betændelse i andre områder. Under hensyntagen til etiske spørgsmål vedrørende dyrenes velfærd er det vigtigt at overvåge dyrets bedring, indtil virkningerne af bedøvelsen er helt vendt. Smertestillende medicin i de første 2 dage efter proceduren er uundværlig. Det er også vigtigt at overvåge dyrenes vægt og adfærd for at vurdere, hvor godt rotten tåler forsøget, og sikre, at den ikke udviser ekstrem angst. Under post-procedureprotokollen for injektion af Pg-LPS og justering af ligaturen til det subgingivalvæv omkring M1 er det først og fremmest vigtigt at stramme og flytte ligaturen i en apikal position for at skabe betændelsen. For det andet er det vigtigt at bilateralt injicere Pg-LPS med omhu for ikke at forårsage oralt traume. Der skal også udvises forsigtighed under bedøvelse af dyret, og det skal overvåges indtil genopretning. Under indsamlingen af GCF skal det kalibrerede papir holdes i samme position i samme samlede tid, og det er vigtigt at indsætte det i den samme tandkødssprække omkring mesio-palatal M1. Under GCF-elueringstrinnene er det vigtigt at anvende elueringsbufferen umiddelbart efter tilsætning af den kommercielle fosfatasehæmmertablet. Et sidste kritisk trin i protokollen er under CBCT-scanninger; En korrekt justering af prøverne og analyseprotokollen er afgørende for at opnå fortolkelige resultater.
Variationen i hvert dyrs specifikke eksponering for Pg-LPS-injektion og den retentive ligatur omkring M1 kan indgå som årsager til ikke at opnå den korrekte inflammation og den deraf følgende knogleresorption. Mens der opnås gode resultater ved induktion af PD ved hjælp af denne procedure, er det vigtigt nøje at reducere variationen mellem dyr ved at følge protokollen nøje. En af de mest betydningsfulde ændringer af metoden er placeringen af den retentive ligatur omkring M1 og ikke omkring M2, den mest traditionelle ligaturmodel i litteraturen13,14,15. Operationsproceduren for ligaturplacering hos mus eller rotter giver tekniske vanskeligheder og udgør en potentiel udfordring for mange forskere på grund af den lille størrelse af murin mundhule og tænder11,16. Brugen af rotter og placering af ligaturen omkring M1 lettede manipulationen og adgangen til området, hvilket også reducerede dyrets stress under proceduren. Der blev ikke observeret nogen dyrs lidelse under protokollen, men hvis en rotte viser tegn på nød, kan du overveje at fjerne dem fra forsøget for at forhindre lidelse. Endelig er det mest begrænsende trin i proceduren at undgå tab af ligaturen, hvilket kan ske 7-10 dage efter operationen. For at øge og opretholde sygdomsintensiteten med tiden er det vigtigt at justere ligaturerne for at opretholde intim kontakt med tandkødsvæv, hvilket mindsker variationen af intensiteter ved induktion af parodontitismellem dyr 15. Generelt, hvis proceduren udføres korrekt, bør der ikke være behov for ændringer, og der opnås konsistente resultater.
Det er vigtigt at bemærke, at denne model præsenterer flere begrænsninger. Først og fremmest blev der udviklet en teknik til undersøgelse af PD forårsaget af en traumatisk skade (ligaturposition), som menes at lette den lokale ophobning af bakterier og derved forbedre bakteriemedieret inflammation og knogletab13,10 med kombinationen af Pg-LPS-injektion. Men faktisk efterligner metoden ikke de naturlige etiologiske faktorer, der er ansvarlige for mikrobiota dysbiose i human parodontitis og efterligner ikke flere andre mulige mekanismer, hvormed periodontitis kan opstå. Derudover er murin tandstrukturer ikke identiske med menneskelige15. Selvom den præsenterede metode er effektiv til at studere akut PD, afspejler den muligvis ikke det langsigtede knogletab og inflammatoriske infiltrationsegenskaber ved kronisk PD16. I detaljer med den foreslåede metode til evaluering af alveolært knogletab er den mest almindeligt anvendte metode til multidimensionel evaluering af knogle mikro-CT, som muliggør evaluering af eksterne faktorer og giver tredimensionale billeder af knoglen. Derudover kan trabekulære knogleparametre, knoglevolumen og knoglemineraltæthed analyseres uden at bryde knoglerne14,17. Imidlertid blev brugen af CBCT til vurdering af alveolært knogletab foreslået her (figur 3) som et alternativ til mikro-CT; Selvom der opnås billeder med lavere opløsning, giver det også en nyttig kvalitativ og kvantitativ analyse af parodontitisprogression18,19,20. Så CBCT-eksamener giver en nøjagtig metode til billeddannelse, mere tilgængelig og tilgængelig end mikro-CT, hvilket ville lette undersøgelser af parodontitis induktion hos rotter.
Blandt de forskellige dyremodeller, der er blevet brugt til at efterligne PD in vivo16 for at vurdere tandstøttende væv (tandkød og knogler) under velkontrollerede forhold, er den ligaturinducerede PD-model blevet brugt i vid udstrækning hos rotter, hunde og ikke-menneskelige primater13. Litteraturen indikerer også, at på trods af at det bruges i nogle protokoller, resulterer brugen af mus - der repræsenterer en praktisk, billig og alsidig model - i en mere teknisk udfordring på grund af den relativt lille størrelse af musens mundhule sammenlignet med rotter13. Sammenlignet med andre modeller tilbyder den ligaturinducerede PD-rottemodel flere fordele, herunder hurtig sygdomsinduktion, som kan begynde på et forudsigeligt tidspunkt og kulminere i alveolært knogletab inden for få dage (mus og rotter)13. Der er andre fordele ved denne metode, såsom potentialet til at studere periodontalt væv og alveolær knogleregenerering samt evnen til at lokalisere og dissekere betændt tandkødsvæv for at vurdere niveauet af inflammation15. Metoden til at kombinere den ligaturinducerede PD-model med LPS-injektionen tilføjer et lokalt destruktivt inflammatorisk respons i periodontium, der forbedrer tabet af bindevævsbinding og alveolær knogleresorption genereret af ligaturen. Denne additiv virkning anbefales at øge med koncentrationen og hyppigheden af LPS-injektioner10. Metoden rapporteret her præsenterer en optimeret protokol for en kombination af ligatur med Pg-LPS-injektion med fordelene og betydningen af begge metoder.
Optimering og udvikling af sikre og økonomiske in vivo-modeller af PD er afgørende for at lette forståelsen af patogenesen af periodontal sygdom og teste nye terapeutiske tilgange. PD-modellen af den kombinerede teknik med Pg-LPS-injektioner og ligaturplacering omkring M1, der præsenteres her, vurderes at være en attraktiv undersøgelsesmodel til undersøgelse af værtsmikrobeinteraktioner, betændelse i parodontitis og alveolær knogleresorption. Denne model identificerer de mest kritiske sæt af protokollen, beskriver dem i billedbaserede tekniske detaljer og standardiserer og optimerer brugen af disse kombinerede teknikker. Anvendelse af yderligere teknikker til evaluering af parodontitis progression kan være mulig, herunder histologiske analyser af både den alveolære knogle og omgivende vedhæftede gingiva, bestemmelse af andre cytokiner involveret i inflammation og karakterisering af oral mikrobiota. Selvom modellen ikke kan afspejle alle aspekter af mekanismerne eller årsagerne til PD hos mennesker, afslører denne undersøgelse, at signifikante degenerative og inflammatoriske ændringer i periodontale væv og alveolær knogle kunne induceres 14 dage efter interventionen, hvilket danner grundlag for fremtidige prækliniske forebyggende eller behandlingsundersøgelser for periodontal sygdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Fundació Universitat-Empresa de les Illes Balears (Proof of concept-indkaldelse 2020), af Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competividad, medfinansieret af ESF Den Europæiske Socialfond og EFRU Den Europæiske Fond for Regionaludvikling (kontrakt med M.M.B; FI18/00104) og af Direcció General d'Investigació, Conselleria d'Investigació, Govern Balear (kontrakt med M.M.F.C; FPI/040/2020). Forfatterne takker Dr. Anna Tomás og Maria Tortosa for deres hjælp på den eksperimentelle kirurgi og platform for IdISBa. Endelig tak til ADEMA School of Dentistry for adgangen til CBCT-scanneren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adsorbent paper point nº30 | Proclinc | 8187 | |
| Aprotinin | Sigma-Aldrich | A1153 | |
| Atipamezole | Dechra | 573751.5 | Revanzol 5 mg/mL |
| Braided silk ligature (5/0) | Laboratorio Arago Sl | 613112 | |
| Buprenorphine | Richter pharma | 578816.6 | Bupaq 0.3 mg/mL |
| Cone-beam computed tomography (CBCT) Scanner | MyRay | hyperion X9 | Model Hyperion X9 |
| CTAn software | SkyScan | Version 1.13.4.0 | |
| Dental explorer | Proclinc | 99743 | |
| Diamond lance-shaped bur | Dentaltix | IT21517 | |
| Food maintenance diet | Sodispain research | ROD14 | |
| Heated surgical platform | PetSavers | ||
| Hollenback carver | Hu-FRIEDY | HF45234 | |
| Hypodermic needle | BD | 300600 | 25G X 5/8” - 0,5 X 16 MM |
| Isoflurane | Karizoo | Isoflutek 1000mg/g | |
| Ketamine | Dechra | 581140.6 | Anesketin 100 mg/mL |
| Lipopolysaccharide derived from P.Gingivalis | InvivoGen | TLRL-PGLPS | |
| Methanol | Fisher Scientific | M/4000/PB08 | |
| Micro needle holter | Fehling Surgical Instruments | KOT-6 | |
| Microsurgical pliers | KLS Martin | 12-384-06-07 | |
| microsurgical scissors | S&T microsurgical instruments | SDC-15 RV | |
| Monitor iMEC 8 Vet | Mindray | ||
| Multiplex bead immunoassay | Procartaplex, Thermo fisher Scientific | PPX-05 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 8187151000 | |
| Periosteal microsurgical elevator | Dentaltix | CU19112468 | |
| Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) | Roche | 10837091001 | |
| Phosphate Buffer Solution (PBS) | Capricorn Scientific | PBS-1A | |
| PhosSTOP | Roche | 4906845001 | Commercial phosphatase inhibitor tablet |
| Plastic vial | SPL Lifesciencies | 60015 | 1.5mL |
| Saline | Cinfa | 204024.3 | |
| Stereo Microscope | Zeiss | Model SteREO Discovery.V12 | |
| Surgical loupes led light | Zeiss | ||
| Surgical scissors | Zepf Surgical | 08-1701-17 | |
| Syringe | BD plastipak | 303172 | 1mL |
| Veterinary dental micromotor | Eickemeyer | 174028 | |
| Xylazine | Calier | 20102-003 | Xilagesic 20 mg/mL |
References
- Carvalho, J. D. S., et al. Impact of citrus flavonoid supplementation on inflammation in lipopolysaccharide-induced periodontal disease in mice. Food and Function. 12 (11), 5007-5017 (2021).
- Nazir, M. A. Prevalence of periodontal disease, its association with systemic diseases and prevention. International Journal of Health Sciences. 1 (2), 72-80 (2017).
- Dumitrescu, A. L., El-Aleem, S. A., Morales-Aza, B., Donaldson, L. F. A model of periodontitis in the rat: Effect of lipopolysaccharide on bone resorption, osteoclast activity, and local peptidergic innervation. Journal of Clinical Periodontology. 31 (8), 596-603 (2004).
- Wang, H. Y., et al. Preventive effects of the novel antimicrobial peptide Nal-P-113 in a rat Periodontitis model by limiting the growth of Porphyromonas gingivalis and modulating IL-1β and TNF-α production. BMC Complementary and Alternative Medicine. 17 (1), 1-10 (2017).
- Guan, J., Zhang, D., Wang, C. Identifying periodontitis risk factors through a retrospective analysis of 80 cases. Pakistan Journal of Medical Sciences. 38 (1), 293-296 (2021).
- Khajuria, D. K., Patil, O. N., Karasik, D., Razdan, R. Development and evaluation of novel biodegradable chitosan based metformin intrapocket dental film for the management of periodontitis and alveolar bone loss in a rat model. Archives of Oral Biology. 85, 120-129 (2018).
- Nishida, E., et al. Bone resorption and local interleukin-1alpha and interleukin-1beta synthesis induced by Actinobacillus actinomycetemcomitans and Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide. Journal of Periodontal Research. 36 (1), 1-8 (2001).
- Graves, D. T., Kang, J., Andriankaja, O., Wada, K., Rossa, C. Animal models to study host-bacteria interactions involved in periodontitis. Bone. 23 (1), 1-7 (2008).
- Struillou, X., Boutigny, H., Soueidan, A., Layrolle, P. Experimental animal models in periodontology: a review. The Open Dentistry Journal. 4 (1), 37-47 (2010).
- Mustafa, H., et al. Induction of periodontal disease via retentive ligature, lipopolysaccharide injection, and their combination in a rat model. Polish Journal of Veterinary Sciences. 24 (3), 365-373 (2021).
- Chadwick, J. W., Glogauer, M. Robust ligature-induced model of murine periodontitis for the evaluation of oral neutrophils. Journal of Visualized Experiments. 2020 (155), 6-13 (2019).
- Cheng, R., Wu, Z., Li, M., Shao, M., Hu, T. Interleukin-1β is a potential therapeutic target for periodontitis: a narrative review. International Journal of Oral Science. 12 (1), 1-9 (2020).
- Abe, T., Hajishengallis, G. Optimization of the ligature-induced periodontitis model in mice. Journal of Immunological Methods. 394 (1-2), 49-54 (2013).
- Jeong-Hyon, K., Bon-Hyuk, G., Sang-Soo, N., Yeon-Cheol, P. A review of rat models of periodontitis treated with natural extracts. Journal of Traditional Chinese Medical Sciences. 7 (2), 95-103 (2020).
- Marchesan, J., et al. An experimental murine model to study periodontitis. Nature Protocols. 13 (10), 2247-2267 (2018).
- Lin, P., et al. Application of ligature-induced periodontitis in mice to explore the molecular mechanism of periodontal disease. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 8900 (2021).
- Irie, M. S., et al. Use of micro-computed tomography for bone evaluation in dentistry. Brazilian Dental Journal. 29 (3), 227-238 (2018).
- Haas, L. F., Zimmermann, G. S., De Luca Canto, G., Flores-Mir, C., Corrêa, M. Precision of cone beam CT to assess periodontal bone defects: a systematic review and meta-analysis. Dentomaxillofacial Radiology. 47 (2), 20170084 (2018).
- Kamburoğlu, K., Ereş, G., Akgün, C. Qualitative and quantitative assessment of alveolar bone destruction in adult rats using CBCT. Journal of Veterinary Dentistry. 36 (4), 245-250 (2019).
- Sousa Melo, S. L., Rovaris, K., Javaheri, A. M., de Rezen de Barbosa, G. L. Cone-beam computed tomography (CBCT) imaging for the assessment of periodontal disease. Current Oral Health Reports. 7 (4), 376-380 (2020).
