Summary
En este estudio, un modelo de rata de inducción de periodontitis se presenta a través de una combinación de ligadura retentiva e inyecciones repetitivas de lipopolisacárido derivado de Porphyromonas gingivalis, durante 14 días alrededor de los primeros molares maxilares. Las técnicas de ligadura e inyección de LPS fueron efectivas para inducir peridontitis, lo que resultó en pérdida ósea alveolar e inflamación.
Abstract
La periodontitis (EP) es una enfermedad inmunoinflamatoria crónica altamente prevalente del periodonto, que resulta en una pérdida de tejido blando gingival, ligamento periodontal, cemento y hueso alveolar. En este estudio, se describe un método simple de inducción de EP en ratas. Proporcionamos instrucciones detalladas para la colocación del modelo de ligadura alrededor de los primeros molares maxilares (M1) y una combinación de inyecciones de lipopolisacárido (LPS), derivado de Porphyromonas gingivalis en el lado mesio-palatino del M1. La inducción de periodontitis se mantuvo durante 14 días, promoviendo la acumulación de biofilm bacteriano y la inflamación. Para validar el modelo animal, la IL-1β, un mediador inflamatorio clave, se determinó mediante un inmunoensayo en el líquido crevicular gingival (GCF), y la pérdida ósea alveolar se calculó mediante tomografía computarizada de haz cónico (CBCT). Esta técnica fue efectiva para promover la recesión gingiva, la pérdida ósea alveolar y un aumento en los niveles de IL-1β en el GCF al final del procedimiento experimental después de 14 días. Este método fue eficaz para inducir la EP, pudiendo así ser utilizado en estudios sobre mecanismos de progresión de la enfermedad y posibles tratamientos futuros.
Introduction
La periodontitis (EP) es la sexta condición de salud pública más prevalente a nivel mundial, afectando aproximadamente al 11% de la población total, siendo una forma avanzada, irreversible y destructiva de enfermedad periodontal 1,2. La EP es un proceso inflamatorio que afecta los tejidos gingival y periodontal, lo que resulta en recesión gingiva, migración apical del epitelio de unión con desarrollo de bolsas y pérdida de hueso alveolar3. Además, la EP está asociada a varias enfermedades sistémicas, como enfermedades cardiovasculares, obesidad, diabetes y artritis reumatoide, para las cuales los factores ambientales y específicos del huésped juegan un papel significativo 4,5.
Por lo tanto, la EP es una enfermedad multifactorial iniciada principalmente por la acumulación de placa microbiana - resultante de la disbiosis de las comunidades microbianas - y por una respuesta inmune exagerada del huésped a los patógenos periodontales, que conduce a la descomposición del tejido periodontal 4,6. Entre varias bacterias periodontales, la bacteria gramnegativa anaerobia Porphyromonas gingivalis es uno de los patógenos clave en la EP4. P. gingivalis contiene un complejo lipopolisacárido (LPS) en sus paredes, una molécula conocida por inducir infiltración de leucocitos polimorfonucleares y dilatación vascular en tejidos periodontales inflamados7. Esto resulta en la producción de mediadores inflamatorios, como la interleucina 1 (IL-1), IL-6 e IL-8, factor de necrosis tumoral (TNF) o prostaglandinas, con una posterior activación de osteoclastos y resorción ósea, lo que lleva a la destrucción del tejido y la pérdida final de dientes3.
Entre las diferentes ventajas de los modelos animales destacan la capacidad de imitar complejidades celulares como en humanos, o de ser más precisos que los estudios in vitro , que se realizan sobre superficies plásticas con tipos celulares limitados8. Para modelar la EP experimentalmente in vivo, se han utilizado diferentes especies animales, como primates no humanos, perros, cerdos, hurones, conejos, ratones y ratas9. Sin embargo, las ratas son el modelo animal más ampliamente estudiado para la patogénesis de la EP porque son baratas y fáciles de manejar10. Su tejido gingival dental tiene características estructurales similares al tejido gingival humano, con un surco gingival poco profundo y epitelio de unión unido a la superficie del diente. Además, como en los humanos, el epitelio de unión facilita el paso de bacterias, materiales extraños y exudados de células inflamatorias 9.
Uno de los modelos experimentales más reportados de inducción de EP en ratas es la colocación de ligaduras alrededor de los dientes, que es técnicamente desafiante pero confiable10. La colocación de la ligadura facilita la placa dental y la acumulación bacteriana, generando una disbiosis en los surcos gingivales, que causa inflamación y destrucción del tejido periodontal11. La pérdida de la inserción periodontal y la reabsorción del hueso alveolar podrían ocurrir en 7 días en este modelo de rata8.
Otro modelo animal para la EP consiste en la inyección de LPS en el tejido gingival. Como resultado, se estimulan la osteoclastogénesis y la pérdida ósea. Las características histopatológicas de este modelo son similares a la EP establecida en humanos, caracterizada por niveles más altos de citoquinas proinflamatorias, degradación del colágeno y resorción ósea alveolar 6,8.
Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue describir un modelo simple de rata de EP experimental basado en las técnicas de inyecciones de P. gingivalis-LPS (Pg-LPS), combinadas con la colocación de ligaduras alrededor de los primeros molares maxilares (M1). Se trata de un modelo con características similares a las observadas en la enfermedad de EP humana, que podría ser utilizado en el estudio de los mecanismos de progresión de la enfermedad y futuros posibles tratamientos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTA: El protocolo experimental del estudio fue aprobado por el Comité Ético de Experimentación Animal del Instituto de Investigación Sanitaria de las Islas Baleares (CEEA-UIB; número de referencia 163/03/21).
1. Anestesia animal y preparación del procedimiento
- Esterilice todos los instrumentos quirúrgicos (mordazas bucales de aluminio, explorador dental, lanza de diamante, tijeras quirúrgicas, alicates microquirúrgicos, un portaagujas, un tallador de hollenback, un elevador microquirúrgico perióstico y tijeras microquirúrgicas) (5 min a 135 °C) antes de la cirugía.
- Preparar todas las soluciones necesarias para el procedimiento en condiciones estériles, como se describe:
- Prepare una mezcla de ketamina (60 mg / ml) y xilazina (8 mg / ml) mezclando 1.6 ml de ketamina con 1 ml de xilazina diluida en solución tampón de fosfato (PBS) / solución salina. Conservar el caldo a 4 °C.
- Diluir atipamezol a una concentración final de 0,25 mg/ml en PBS/solución salina. Conservar el caldo a 4 °C.
- Diluir la buprenorfina a una concentración final de 0,03 mg/ml en PBS/solución salina. Conservar el caldo a 4 °C.
- Prepare 1 ml de Pg-LPS (1 mg/ml) en solución salina estéril. Conservar el caldo a -20 °C.
- Para el experimento, use ratas Wistar hembras y machos, de 12 semanas de edad y con un peso de 210-350 g en el momento de la cirugía. Mantener a los animales alojados en grupos en el ambiente apropiado y en condiciones constantes (20-24 °C, 12 h por día ciclos de luz-oscuridad), con alimentos y agua estándar, ofrecidos ad libitum.
- Para inducir la anestesia, pesar la rata y administrar la mezcla de ketamina/xilazina a una concentración de 80/10 mg/kg por vía intraperitoneal (IP), utilizando una aguja hipodérmica estéril de 25 g y una jeringa de 1 ml.
- Después de anestesiar a la rata, coloque al animal boca arriba en una plataforma quirúrgica calentada; Durante el procedimiento, cubra el cuerpo del animal para evitar la pérdida de calor.
NOTA: La profundidad de la anestesia se evalúa mediante la pérdida del reflejo pedal durante el procedimiento y mediante el monitoreo de los signos vitales. Si es necesario, use un pequeño cono nasal para mantener la anestesia con isoflurano al 2% en oxígeno al 100%. Aplique ungüento oftálmico estéril en ambos ojos después de la inducción de la anestesia para proteger las córneas y evitar la sequedad. - Durante los procedimientos, administre oxígeno al 100% usando un pequeño cono nasal y controle la frecuencia del pulso y la saturación de oxígeno mediante oximetría de pulso.
NOTA: Si la saturación de oxígeno y la frecuencia del pulso caen por debajo del 95% y 190 lpm, respectivamente, detener el procedimiento y colocar al animal en la posición de decúbito lateral hasta alcanzar los valores normales. - Abra la boca de la rata con una mordaza bucal de aluminio alrededor de los incisivos (superior e inferior), retrayendo la lengua con ella y estabilizando el maxilar y la mandíbula en una posición de trabajo abierta y cómoda, permitiendo el acceso a los molares mandibulares.
NOTA: Si el animal necesita ser colocado en decúbito lateral, retire la mordaza bucal antes de cambiar su posición para favorecer la recuperación. Una vez anestesiado el animal, recoger líquido gingival crevicular (GCF) antes de la cirugía (muestra en condiciones basales) (día 0). - Recopile GCF como se describe en los siguientes pasos:
- Coloque al animal boca arriba en una plataforma quirúrgica y estabilice el maxilar y la mandíbula en una posición abierta con mordazas bucales de aluminio.
- Recolectar GCF utilizando un total de cuatro (dos para cada M1) papel absorbente punto nº 30 (0,03 cm diámetro x 3 cm largo), insertándolo en la grieta gingival (espacio entre el epitelio gingival y el esmalte adyacente) alrededor del mesio-palatal del M1 hasta una ligera resistencia. Conserve el punto de papel en la misma posición durante un total de 30 s antes de retirarlo inmediatamente.
- Después de la recolección, transferir el punto de papel inmediatamente a un vial de plástico y almacenar a -80 °C hasta el rendimiento del ensayo.
2. Técnica de ligadura retentiva e inyección intragingival de Pg-LPS
NOTA: El modelo de ligadura se creó (día 0) colocando una ligadura de seda trenzada estéril (5/0) alrededor del M1 bilateralmente dentro del surco gingival utilizando instrumentos microquirúrgicos y asegurándolo con los nudos del cirujano en la superficie palatina. Los instrumentos microquirúrgicos utilizados fueron alicates microquirúrgicos, un portaagujas micro, un tallador de hollenback, un elevador microquirúrgico perióstico y tijeras microquirúrgicas. También se utilizaron lupas quirúrgicas con fuente de luz LED (aumento de 3,6x).
- Coloque la cola distal de la sutura en el lado palatino de la dentición e inserte el segmento proximal entre el contacto de M1 y los segundos molares maxilares (M2).
- Use el elevador microquirúrgico perióstico para insertar la sutura dentro del surco. Envuelva la ligadura alrededor de la superficie bucal de la M1 con mucho cuidado, ya que los tejidos en este nivel presentan una zona estrecha de encía adherida. En el aspecto palatino, asegúrese de que la sutura esté apretada en ambos extremos para asegurarse de que se introduce en el surco gingival.
NOTA: Si se observa resistencia al insertar la sutura entre el M1 y el M2, el contacto puede abrirse ligeramente con un explorador dental y una fresa en forma de lanza de diamante. - Ate los extremos de la sutura con un nudo de cirujano y recorte las colas lo más cortas posible. Inserte el nudo en el surco.
NOTA: Las puntas de los instrumentos quirúrgicos pueden causar traumatismo oral y sangrado. Prepare pequeños segmentos de gasa o un hisopo de algodón para eliminar la sangre de la cavidad oral y aplique presión para detener cualquier hemorragia. El manejo cuidadoso de los tejidos blandos con un enfoque microquirúrgico minimiza las complicaciones quirúrgicas y conduce a menos traumatismos tisulares. - Después de la posición de la ligadura, inyecte 40 μL de Pg-LPS en solución salina estéril con una aguja hipodérmica estéril de 25 G y una jeringa de 1 ml en el tejido subgingival (entre la raíz o el cuello de un diente y el margen de la encía) en el lado mesio-palatino de la M1 bilateralmente (día 0).
3. Fin del procedimiento
- Después del posicionamiento de ligadura y la aplicación de Pg-LPS, libere a la rata del estado quirúrgico y colóquela en una jaula individual limpia bajo una lámpara de calor.
- Inyecte el antagonista Atipamezole (0,5 mg/kg por vía subcutánea [SC]) con una aguja hipodérmica estéril de 25 G y una jeringa de 1 ml.
- Para aliviar el dolor, inyecte 0,03 mg/kg de buprenorfina, SC.
- Monitorear la recuperación del animal hasta que los efectos de la operación se reviertan por completo. Aloje individualmente a cada rata en el ambiente apropiado en condiciones constantes (20-24 ° C, 12 h por día ciclos de luz-oscuridad). Ofrecer alimentos y agua desionizada ad libitum.
- Durante los primeros 2 días después del procedimiento, pesar los animales e inyectar buprenorfina SC dos veces al día para aliviar el dolor.
NOTA: La buprenorfina se puede administrar antes de comenzar el procedimiento para eliminar el efecto de liquidación. - Durante el tiempo del experimento, monitoree a los animales por peso y evaluación general del comportamiento una o dos veces por semana.
4. Seguimiento posterior al procedimiento
NOTA: La inducción de DP se mantuvo durante 14 días para promover la acumulación de biofilm bacteriano y la consecuente inflamación. Las ligaduras deben examinarse y ajustarse, y Pg-LPS se inyecta tres veces por semana (día 2, día 4, día 6, día 8, día 10 y día 12).
- Examine y ajuste la ligadura (día 2, día 4, día 6, día 8, día 10 y día 12) de la siguiente manera:
- Anestesiar con isoflurano al 2% en oxígeno al 100% utilizando una cámara de inducción de anestesia.
- Después de anestesiar a la rata, coloque al animal boca arriba y use un pequeño cono nasal durante el procedimiento con isoflurano al 1% en oxígeno al 100% para el mantenimiento de la anestesia animal.
- Abra la boca de la rata con la mordaza bucal de aluminio alrededor de los incisivos (superior e inferior), retrayendo la lengua con ella y estabilizando el maxilar y la mandíbula en una posición de trabajo abierta y cómoda, permitiendo el acceso a las ligaduras.
- Apriete las ligaduras contra la encía con la ayuda de un elevador microquirúrgico perióstico y asegúrese de que se inserte la sutura de las ligaduras, creando inflamación alrededor de la encía.
NOTA: Es posible que 7-10 días después de la cirugía, las ligaduras se pierdan. Si esto sucede, siga el protocolo explicado para la inyección de Pg-LPS (paso 2.4).
- Después del ajuste de la ligadura, inyecte bilateralmente 40 μL de Pg-LPS con una aguja hipodérmica estéril de 25 G y una jeringa de 1 ml en el tejido subgingival en el lado mesio-palatino de la M1 (día 2, día 4, día 6, día 8, día 10 y día 12).
- Retire el cono de la nariz para la anestesia y coloque a la rata en su jaula. Monitorear la recuperación del animal hasta que los efectos de la anestesia se reviertan por completo.
5. Sacrificio y análisis de animales
NOTA: Existen diferentes opciones para evaluar la progresión de la EP. Aquí, el análisis descrito consiste en una evaluación de citoquinas proinflamatorias en el líquido crevicular gingival (GCF) y una evaluación de la pérdida de hueso alveolar.
- En el día 14 del estudio (día 14), sacrifique a los animales conCO2 en una cámara de dióxido de carbono. Se recomienda una tasa de desplazamiento del 30% al 70% del volumen / min de la cámara para roedores.
NOTA: La falta de respuesta animal al reflejo pedal y la ausencia de signos vitales deben verificarse para confirmar la eutanasia. - Recopile GCF como se describe en los siguientes pasos:
NOTA: El GCF se recolecta antes de la inducción de DP (antes de la cirugía) (día 0) y después de la inducción de DP (después del sacrificio) (día 14).- Coloque al animal boca arriba en una plataforma quirúrgica y estabilice el maxilar y la mandíbula en una posición abierta con mordazas bucales de aluminio.
- Recoger el GCF utilizando papel adsorbente punto nº 30 (0,03 cm de diámetro x 3 cm de largo) insertándolo en la grieta gingival alrededor del mesio-palatal del M1 hasta una ligera resistencia. Conserve el punto de papel en la misma posición durante un total de 30 s antes de retirarlo inmediatamente.
- Después de la recolección, transferir el punto de papel inmediatamente a un vial de plástico y almacenar a -80 °C hasta el rendimiento del ensayo.
- Para evaluar las proteínas dentro del GCF, prepare las siguientes soluciones y siga los pasos del método de elución como se describe:
NOTA: La IL-1β se evalúa en el GCF (día 14) mediante un inmunoensayo, de acuerdo con el protocolo del fabricante.- Prepare el tampón de elución fresco y manténgalo en hielo durante todo el proceso de extracción para inhibir la actividad de la proteasa.
- Prepare todas las soluciones necesarias para el tampón de elución como se describe:
- Prepare 1 ml de aprotinina (1 mg/ml) en agua ultrapura.
- Prepare 10 ml de fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) (200 mM) en metanol.
- Añadir 125 μL de PMSF y 250 μL de aprotinina a 24,5 ml de solución de PBS (pH = 7,4) para preparar el tampón de elución.
- Disolver un comprimido comercial inhibidor de la fosfatasa con 10 ml de tampón de elución recién preparado durante 10 minutos bajo agitación a 4 °C.
NOTA: La duración de la elución del GCF es limitada; Usar inmediatamente para centrifugaciones después de la adición de la tableta inhibidora de la fosfatasa dentro de los primeros 30 minutos. - Después de agregar el inhibidor de fosfatasa, agregue 11 μL de tampón de elución completo directamente sobre el tubo con los puntos de papel.
- Centrifugar el tubo a 452 x g durante 5 min a 4 °C.
- Transfiera el contenido eluyido a un nuevo vial de plástico. Repita este proceso cuatro veces más para obtener un volumen total de 50 μL.
- Después de la última centrifugación, añadir un volumen total de 60 μL directamente sobre el punto de papel y centrifugar una última vez a 452 x g durante 5 min a 4 °C.
- Utilice el volumen requerido para la evaluación de proteínas.
- Después de la eutanasia y la recolección de GCF, con la ayuda de tijeras quirúrgicas, corte la mandíbula superior de las ratas. Trate de quitar la máscara de la rata y deje la menor cantidad de tejido blando posible.
- Coloque la mandíbula en la etapa de microscopio para la visualización y tome una fotografía con el aumento deseado.
- Coloque la mandíbula directamente en paraformaldehído al 4% (PFA) diluido en PBS. Refrésquese dos veces por semana con un nuevo PFA durante 12 días para una fijación completa.
PRECAUCIÓN: Los pasos que involucran PFA deben realizarse en una campana extractora siguiendo las recomendaciones de la Hoja de datos de seguridad. - Después de la fijación completa de la mandíbula, evalúe la pérdida ósea utilizando un escáner de tomografía computarizada de haz cónico (CBCT), de la siguiente manera:
- Abra el PC.
- Abra el programa de análisis CBCT.
- Seleccione Protocolo de escaneo > Modo de escaneo de dentadura.
- Seleccione Campo de visión (FOV) > (11x8) HIRes (90 kV de tensión y 3 mA de corriente).
- Coloque el maxilar superior fijo de las ratas en el pórtico.
- Haga clic en Siguiente.
- Haga clic en el botón de disparo de rayos X (presione el control remoto de rayos X para realizar la emisión y manténgalo presionado durante toda la duración del escaneo).
- Si es necesario, reubique el maxilar superior en el centro del plano frontal presionando el botón de control, luego haga clic en el botón de disparo de rayos X (presione el control remoto de rayos X para realizar la emisión y manténgalo presionado durante toda la duración del escaneo).
- Haga clic en Siguiente.
- Haga clic en el botón de disparo de rayos X (presione el control remoto de rayos X para realizar la emisión y manténgalo presionado durante toda la duración del escaneo).
- Si es necesario, reubique la dentadura postiza en el centro del plano sagital presionando el botón de control, luego haga clic en el botón de disparo de rayos X (presione el control remoto de rayos X para realizar la emisión y manténgalo presionado durante toda la duración del escaneo).
- Haga clic en Siguiente.
- Haga clic en el botón Inicio (pulse el mando a distancia de rayos X para realizar la emisión y manténgalo presionado durante toda la duración del examen). Espere hasta recibir un mensaje de procesamiento y, a continuación, siga las instrucciones que se muestran.
- Aparece una vista de ventana. Regula el gris al 65% y haz clic en Aplicar.
- Para guardar el escaneo, haga clic en Archivo y guárdelo en formato DICOM. Luego, haga clic en Todas las imágenes y en la ventana de selección de exportación DICOM, seleccione todos los parámetros mostrados (imagen inicial, axial original, axial reformateada, multiplanar) y seleccione el tipo predefinido.
- Procese las imágenes representativas bidimensionales y sagitales de los molares maxilares utilizando un programa de análisis, de la siguiente manera:
- Abra el software.
- Haga clic en Archivo y abrir y, a continuación, seleccione la carpeta con imágenes en formato DICOM y haga clic en Abrir.
- Espere hasta que aparezca la ventana "Convertir a 8 bits", seleccione el rango de 0 a 6,000 y haga clic en Aceptar.
- Haga clic en Imágenes sin procesar.
- Defina la parte superior e inferior de la selección para limitar la región de interés. Busque la primera y la última imagen donde aparece el hueso alveolar y selecciónelo con la parte superior de selección y la parte inferior de los comandos de selección .
NOTA: Se pueden exportar imágenes bidimensionales representativas del hueso alveolar de los molares, como en la Figura 3A,B. - Para imágenes representativas sagitales, haga clic en Alternar barra de perfil.
- Dibuje una línea sagital en el centro del paladar y haga clic en Modelo de rebanada. Determine los parámetros para delimitar la región de interés (espaciado entre sectores: 1; número de sectores: 100) y haga clic en Aceptar. Espere hasta que finalice el modelo de resegmentación. Finalmente, haga clic en guardar imágenes recortadas.
NOTA: Se podrían exportar imágenes sagitales representativas del hueso alveolar de los molares, como en la Figura 3C,D.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En la Figura 1 se presenta una línea de tiempo de los pasos experimentales. La Figura 2A muestra una imagen de la mandibula, después de la intervención quirúrgica, con colocación de ligaduras alrededor del surco del M1 en el momento 0 del experimento. La Figura 2B muestra cómo, después de 14 días del procedimiento, la ligadura alrededor del M1 ingresa al surco gingival, causando inflamación de la encía y acumulación infiltrante.
Figura 1: Representación esquemática de la línea de tiempo del procedimiento experimental de inducción de periodontitis (EP) en ratas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Las imágenes bidimensionales representativas (Figura 3; cuadrado rojo) muestran diferencias de pérdida ósea alveolar en la mandibula entre el control basal, mostrando más volumen óseo (Figura 3A), y después del establecimiento de la EP, mostrando una mayor pérdida ósea alveolar (Figura 3B). Además, el análisis de las imágenes sagitales destaca la mayor pérdida ósea alveolar en el área ósea interradicular de M1 (Figura 3D; flecha roja) y M2 (Figura 3D; flecha verde) después del establecimiento de la EP, en comparación con el grupo de control basal (Figura 3C). Además, la resorción ósea alveolar se caracterizó por un aumento en el espacio entre la unión del esmalte de cemento (CEJ) y la cresta ósea alveolar (ABC). La distancia entre el CEJ y ABC en ambos grupos de ratas se muestra en la Figura 3C,D con flechas azules. Los DP establecidos desarrollaron grandes espacios entre el CEJ y el ABC (Figura 3D), en comparación con el control basal (Figura 3C).
En el momento del sacrificio, las imágenes del paladar presentaron diferencias en la recesión gingival en el M1 en los diferentes grupos (Figuras 4A,B). El grupo de DP (Figura 4B) muestra una mayor migración gingival apical debido a la pérdida de soporte óseo y exposición radicular, en comparación con el grupo control basal (Figura 4A). Además, el grupo DP (Figura 4B) presentó una mayor inflamación de la encía alrededor de los molares maxilares, en comparación con el grupo control basal (Figura 4A). La Figura 4C muestra los resultados del análisis de la citoquina proinflamatoria IL-1β de GCF, mostrando una liberación significativamente mayor de IL-1β mostrada en el grupo de DP en comparación con el grupo control. De acuerdo con la literatura, la IL-1β participa en la inflamación, la regulación inmune y la resorción ósea en la periodontitis, y es un fuerte estimulador de la destrucción del tejido periodontal12.
Figura 2: Imágenes de la ligadura insertada en el surco del M1 en diferentes momentos. (A) Paladar de rata con colocación de ligadura alrededor del M1, 0 días después de la inserción de la ligadura. (B) Paladar de rata con colocación de ligadura alrededor del M1, 14 días después de la inserción de la ligadura. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Imágenes bidimensionales representativas del hueso alveolar y molares maxilares. Fotos bidimensionales representativas obtenidas por CBCT del hueso alveolar de molares maxilares (cuadrado rojo) de (A) el control basal, y (B) periodontitis establecida (DP) durante 14 días con inserción de ligadura e inyección de Pg-LPS. Vistas bidimensionales sagitales representativas de los molares maxilares de (C) el control basal y (D) la DP. Las flechas rojas indican el área del hueso alveolar interradicular del M1, las flechas azules indican la distancia entre el CEJ y el ABC, y las flechas verdes indican el área del hueso alveolar interradicular del M2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Imágenes representativas del paladar. Imágenes representativas del paladar después del sacrificio del grupo control basal (A) y del grupo (B) periodontitis (DP), tratadas durante 14 días con inserción de ligadura e inyección de Pg-LPS. (C) Determinación de las concentraciones de IL-1β en el GCF del grupo control basal y el grupo PD (n = 9). Los datos representan la media ± SEM. Los resultados fueron comparados estadísticamente por Kruskal-Wallis: * p < 0,05 grupo PD versus grupo control basal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Este método describe la inducción de DP en ratas siguiendo una técnica combinada de inyecciones de Pg-LPS y colocación de ligaduras alrededor del M1, revelando que se podrían inducir cambios significativos en los tejidos periodontales y el hueso alveolar en 14 días después de este método.
Durante este procedimiento, se debe prestar atención a diferentes pasos críticos. Durante la anestesia animal y la preparación del procedimiento, evaluar la anestesia adecuada durante el proceso quirúrgico es fundamental para su éxito, al igual que garantizar el posicionamiento correcto del animal, estabilizar la boca abierta de la rata con la mordaza bucal de aluminio alrededor de los incisivos y evitar que los animales se lastimen con la mordaza y los instrumentos quirúrgicos. Si la saturación de oxígeno y la frecuencia del pulso disminuyen, se debe detener el procedimiento y colocar al animal en la posición de decúbito lateral hasta alcanzar los valores normales. Durante la posición de ligadura, es esencial que la sutura y el nudo se inserten correctamente en el surco, considerando que la lesión de los tejidos blandos debe minimizarse para prevenir el dolor y la inflamación en otras áreas. Teniendo en cuenta las cuestiones éticas relativas al bienestar de los animales, es esencial controlar la recuperación del animal hasta que los efectos de la anestesia se inviertan por completo. La medicación para el dolor durante los primeros 2 días después del procedimiento es indispensable. El monitoreo del peso y el comportamiento de los animales también es importante, para evaluar qué tan bien la rata tolera el procedimiento y asegurarse de que no presente ninguna angustia extrema. Durante el protocolo posterior al procedimiento de inyección de Pg-LPS y el ajuste de la ligadura al tejido subgingival alrededor del M1, en primer lugar, es importante apretar y reubicar la ligadura en posición apical para crear la inflamación. En segundo lugar, es importante inyectar bilateralmente el Pg-LPS con cuidado, para no causar trauma oral. Además, se debe tener cuidado al anestesiar al animal, y se debe controlar hasta la recuperación. Durante la recolección de GCF, el papel calibrado debe mantenerse en la misma posición durante el mismo tiempo total, y es importante insertarlo en la misma grieta gingival alrededor del mesio-palatal M1. Durante los pasos de elución del GCF, es importante usar el tampón de elución inmediatamente después de agregar la tableta comercial inhibidora de la fosfatasa. Un último paso crítico del protocolo es durante las exploraciones CBCT; Una alineación adecuada de las muestras y el protocolo de análisis es fundamental para obtener resultados interpretables.
La variación de la exposición específica de cada animal a la inyección de Pg-LPS y la ligadura retentiva alrededor del M1 podrían incluirse como razones para no lograr la inflamación correcta y la consiguiente resorción ósea. Si bien se logran buenos resultados en la inducción de la EP mediante el uso de este procedimiento, es importante reducir estrechamente la variación entre los animales siguiendo de cerca el protocolo. Una de las modificaciones más significativas del método es la colocación de la ligadura retentiva alrededor del M1, y no alrededor del M2, el modelo de ligadura más tradicional en la literatura13,14,15. El procedimiento quirúrgico para la colocación de ligaduras en ratones o ratas presenta dificultad técnica, y representa un desafío potencial para muchos investigadores debido al pequeño tamaño de la cavidad oral murina y los dientes11,16. El uso de ratas y la colocación de la ligadura alrededor del M1 facilitaron la manipulación y el acceso al área, lo que también redujo el estrés del animal durante el procedimiento. No se observó sufrimiento animal durante el protocolo, pero si alguna rata muestra signos de angustia, considere eliminarla del experimento para evitar el sufrimiento. Finalmente, el paso más limitante del procedimiento es evitar la pérdida de la ligadura, que podría ocurrir 7-10 días después de la cirugía. Para aumentar y mantener la intensidad de la enfermedad con el tiempo, es importante ajustar las ligaduras para mantener el contacto íntimo con los tejidos de la encía, mitigando la variabilidad de las intensidades en la inducción de la periodontitis entre animales15. En general, si el procedimiento se realiza correctamente, no se deben necesitar modificaciones y se obtendrán resultados consistentes.
Es importante tener en cuenta que este modelo presenta varias limitaciones. En primer lugar, se desarrolló una técnica para el estudio de la EP causada por una lesión traumática (posición de ligadura), que se cree que facilita la acumulación local de bacterias y, por lo tanto, aumenta la inflamación mediada por bacterias y la pérdida ósea13,10, con la combinación de la inyección de Pg-LPS. Pero, de hecho, el método no imita los factores etiológicos naturales que son responsables de la disbiosis de la microbiota en la periodontitis humana y no imita varios otros posibles mecanismos por los cuales puede surgir la periodontitis. Además, las estructuras dentales murinas no son idénticas a las humanas15. Además, aunque el método presentado es efectivo para el estudio de la EP aguda, puede no reflejar las características de pérdida ósea a largo plazo e infiltración inflamatoria en la EP crónica16. En detalle con la metodología propuesta para la evaluación de la pérdida ósea alveolar, el método más utilizado de evaluación multidimensional del hueso es la micro-TC, que permite la evaluación de factores externos y proporciona imágenes tridimensionales del hueso. Además, los parámetros del hueso trabecular, el volumen óseo y la densidad mineral ósea pueden ser analizados sin romper los huesos14,17. Sin embargo, el uso de CBCT para la evaluación de la pérdida ósea alveolar se propuso aquí (Figura 3) como una alternativa a la micro-TC; Aunque se obtienen imágenes de menor resolución, también proporciona un análisis cualitativo y cuantitativo útil de la progresión de la periodontitis18,19,20. Por lo tanto, los exámenes CBCT proporcionan un método preciso para la obtención de imágenes, más disponible y accesible que la micro-TC, lo que facilitaría los estudios de inducción de periodontitis en ratas.
Entre los diversos modelos animales que se han utilizado para imitar la EP in vivo16 para evaluar los tejidos de soporte dental (encía y hueso) en condiciones bien controladas, el modelo de EP inducida por ligaduras se ha utilizado ampliamente en ratas, perros y primates no humanos13. La literatura también indica que, a pesar de ser utilizado en algunos protocolos, el uso de ratones, que representa un modelo conveniente, económico y versátil, resulta en un desafío más técnico debido al tamaño relativamente pequeño de la cavidad oral del ratón en comparación con las ratas13. En comparación con otros modelos, el modelo de rata con EP inducida por ligaduras ofrece varias ventajas, incluida la inducción rápida de la enfermedad, que puede comenzar en un momento predecible y culminar en la pérdida ósea alveolar en pocos días (ratones y ratas)13. Existen otras ventajas de este método, como el potencial para estudiar el tejido periodontal y la regeneración ósea alveolar, así como la capacidad de localizar y diseccionar el tejido gingival inflamado para evaluar el nivel de inflamación15. El método de combinar el modelo de EP inducida por ligadura con la inyección de LPS agrega una respuesta inflamatoria destructiva local en el periodonto que mejora la pérdida de unión del tejido conectivo y la reabsorción ósea alveolar generada por la ligadura. Este efecto aditivo es aconsejable aumentar con la concentración y frecuencia de las inyecciones de LPS10. El método aquí descrito presenta un protocolo optimizado de una combinación de ligadura con inyección de Pg-LPS, con las ventajas y la importancia de ambos métodos.
La optimización y el desarrollo de modelos in vivo seguros y económicos de EP son fundamentales para facilitar la comprensión de la patogénesis de la enfermedad periodontal y probar nuevos enfoques terapéuticos. El modelo PD de la técnica combinada de inyecciones de Pg-LPS y colocación de ligaduras alrededor del M1 presentado aquí se evalúa como un modelo de estudio atractivo, para investigar las interacciones huésped-microbio, la inflamación en la periodontitis y la resorción ósea alveolar. Este modelo identifica los conjuntos más críticos del protocolo, los describe en detalle técnico basado en imágenes y estandariza y optimiza el uso de estas técnicas combinadas. Podría ser posible el uso de técnicas adicionales para la evaluación de la progresión de la periodontitis, incluidos análisis histológicos tanto del hueso alveolar como de la encía adjunta circundante, la determinación de otras citoquinas involucradas en la inflamación y la caracterización de la microbiota oral. Aunque el modelo no puede reflejar todos los aspectos de los mecanismos o causas de la EP en humanos, este estudio revela que se podrían inducir cambios degenerativos e inflamatorios significativos en los tejidos periodontales y el hueso alveolar a los 14 días posteriores a la intervención, proporcionando la base para futuros estudios preclínicos preventivos o de tratamiento para la enfermedad periodontal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo ha contado con el apoyo de la Fundació Universitat-Empresa de les Illes Balears (convocatoria Prueba de concepto 2020), del Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competitividad, cofinanciado por el Fondo Social Europeo del FSE y el Fondo Europeo de Desarrollo Regional FEDER (contrato con M.M.B; FI18/00104) y por la Direcció General d'Investigació, Conselleria d'Investigació, Govern Balear (contrato con M.M.F.C; FPI/040/2020). Los autores agradecen a la Dra. Anna Tomás y María Tortosa su ayuda en la cirugía experimental y plataforma de IdISBa. Finalmente, gracias a la Facultad de Odontología de ADEMA por el acceso al escáner CBCT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adsorbent paper point nº30 | Proclinc | 8187 | |
| Aprotinin | Sigma-Aldrich | A1153 | |
| Atipamezole | Dechra | 573751.5 | Revanzol 5 mg/mL |
| Braided silk ligature (5/0) | Laboratorio Arago Sl | 613112 | |
| Buprenorphine | Richter pharma | 578816.6 | Bupaq 0.3 mg/mL |
| Cone-beam computed tomography (CBCT) Scanner | MyRay | hyperion X9 | Model Hyperion X9 |
| CTAn software | SkyScan | Version 1.13.4.0 | |
| Dental explorer | Proclinc | 99743 | |
| Diamond lance-shaped bur | Dentaltix | IT21517 | |
| Food maintenance diet | Sodispain research | ROD14 | |
| Heated surgical platform | PetSavers | ||
| Hollenback carver | Hu-FRIEDY | HF45234 | |
| Hypodermic needle | BD | 300600 | 25G X 5/8” - 0,5 X 16 MM |
| Isoflurane | Karizoo | Isoflutek 1000mg/g | |
| Ketamine | Dechra | 581140.6 | Anesketin 100 mg/mL |
| Lipopolysaccharide derived from P.Gingivalis | InvivoGen | TLRL-PGLPS | |
| Methanol | Fisher Scientific | M/4000/PB08 | |
| Micro needle holter | Fehling Surgical Instruments | KOT-6 | |
| Microsurgical pliers | KLS Martin | 12-384-06-07 | |
| microsurgical scissors | S&T microsurgical instruments | SDC-15 RV | |
| Monitor iMEC 8 Vet | Mindray | ||
| Multiplex bead immunoassay | Procartaplex, Thermo fisher Scientific | PPX-05 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 8187151000 | |
| Periosteal microsurgical elevator | Dentaltix | CU19112468 | |
| Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) | Roche | 10837091001 | |
| Phosphate Buffer Solution (PBS) | Capricorn Scientific | PBS-1A | |
| PhosSTOP | Roche | 4906845001 | Commercial phosphatase inhibitor tablet |
| Plastic vial | SPL Lifesciencies | 60015 | 1.5mL |
| Saline | Cinfa | 204024.3 | |
| Stereo Microscope | Zeiss | Model SteREO Discovery.V12 | |
| Surgical loupes led light | Zeiss | ||
| Surgical scissors | Zepf Surgical | 08-1701-17 | |
| Syringe | BD plastipak | 303172 | 1mL |
| Veterinary dental micromotor | Eickemeyer | 174028 | |
| Xylazine | Calier | 20102-003 | Xilagesic 20 mg/mL |
References
- Carvalho, J. D. S., et al. Impact of citrus flavonoid supplementation on inflammation in lipopolysaccharide-induced periodontal disease in mice. Food and Function. 12 (11), 5007-5017 (2021).
- Nazir, M. A. Prevalence of periodontal disease, its association with systemic diseases and prevention. International Journal of Health Sciences. 1 (2), 72-80 (2017).
- Dumitrescu, A. L., El-Aleem, S. A., Morales-Aza, B., Donaldson, L. F. A model of periodontitis in the rat: Effect of lipopolysaccharide on bone resorption, osteoclast activity, and local peptidergic innervation. Journal of Clinical Periodontology. 31 (8), 596-603 (2004).
- Wang, H. Y., et al. Preventive effects of the novel antimicrobial peptide Nal-P-113 in a rat Periodontitis model by limiting the growth of Porphyromonas gingivalis and modulating IL-1β and TNF-α production. BMC Complementary and Alternative Medicine. 17 (1), 1-10 (2017).
- Guan, J., Zhang, D., Wang, C. Identifying periodontitis risk factors through a retrospective analysis of 80 cases. Pakistan Journal of Medical Sciences. 38 (1), 293-296 (2021).
- Khajuria, D. K., Patil, O. N., Karasik, D., Razdan, R. Development and evaluation of novel biodegradable chitosan based metformin intrapocket dental film for the management of periodontitis and alveolar bone loss in a rat model. Archives of Oral Biology. 85, 120-129 (2018).
- Nishida, E., et al. Bone resorption and local interleukin-1alpha and interleukin-1beta synthesis induced by Actinobacillus actinomycetemcomitans and Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide. Journal of Periodontal Research. 36 (1), 1-8 (2001).
- Graves, D. T., Kang, J., Andriankaja, O., Wada, K., Rossa, C. Animal models to study host-bacteria interactions involved in periodontitis. Bone. 23 (1), 1-7 (2008).
- Struillou, X., Boutigny, H., Soueidan, A., Layrolle, P. Experimental animal models in periodontology: a review. The Open Dentistry Journal. 4 (1), 37-47 (2010).
- Mustafa, H., et al. Induction of periodontal disease via retentive ligature, lipopolysaccharide injection, and their combination in a rat model. Polish Journal of Veterinary Sciences. 24 (3), 365-373 (2021).
- Chadwick, J. W., Glogauer, M. Robust ligature-induced model of murine periodontitis for the evaluation of oral neutrophils. Journal of Visualized Experiments. 2020 (155), 6-13 (2019).
- Cheng, R., Wu, Z., Li, M., Shao, M., Hu, T. Interleukin-1β is a potential therapeutic target for periodontitis: a narrative review. International Journal of Oral Science. 12 (1), 1-9 (2020).
- Abe, T., Hajishengallis, G. Optimization of the ligature-induced periodontitis model in mice. Journal of Immunological Methods. 394 (1-2), 49-54 (2013).
- Jeong-Hyon, K., Bon-Hyuk, G., Sang-Soo, N., Yeon-Cheol, P. A review of rat models of periodontitis treated with natural extracts. Journal of Traditional Chinese Medical Sciences. 7 (2), 95-103 (2020).
- Marchesan, J., et al. An experimental murine model to study periodontitis. Nature Protocols. 13 (10), 2247-2267 (2018).
- Lin, P., et al. Application of ligature-induced periodontitis in mice to explore the molecular mechanism of periodontal disease. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 8900 (2021).
- Irie, M. S., et al. Use of micro-computed tomography for bone evaluation in dentistry. Brazilian Dental Journal. 29 (3), 227-238 (2018).
- Haas, L. F., Zimmermann, G. S., De Luca Canto, G., Flores-Mir, C., Corrêa, M. Precision of cone beam CT to assess periodontal bone defects: a systematic review and meta-analysis. Dentomaxillofacial Radiology. 47 (2), 20170084 (2018).
- Kamburoğlu, K., Ereş, G., Akgün, C. Qualitative and quantitative assessment of alveolar bone destruction in adult rats using CBCT. Journal of Veterinary Dentistry. 36 (4), 245-250 (2019).
- Sousa Melo, S. L., Rovaris, K., Javaheri, A. M., de Rezen de Barbosa, G. L. Cone-beam computed tomography (CBCT) imaging for the assessment of periodontal disease. Current Oral Health Reports. 7 (4), 376-380 (2020).
