Summary
В этом исследовании крысиная модель индукции пародонтита представлена с помощью комбинации ретенционной лигатуры и повторяющихся инъекций липополисахарида, полученного из Porphyromonas gingivalis, в течение 14 дней вокруг первых верхнечелюстных моляров. Методы лигирования и инъекции ЛПС были эффективны в индуцировании перидонтита, что приводило к потере альвеолярной кости и воспалению.
Abstract
Пародонтит (БП) является широко распространенным хроническим иммуновоспалительным заболеванием пародонта, которое приводит к потере мягких тканей десны, периодонтальной связки, цемента и альвеолярной кости. В данном исследовании описан простой метод индукции БП у крыс. Мы предоставляем подробные инструкции по размещению лигатурной модели вокруг первых верхнечелюстных моляров (M1) и комбинации инъекций липополисахарида (LPS), полученного из Porphyromonas gingivalis на мезио-небной стороне M1. Индукция пародонтита сохранялась в течение 14 дней, способствуя накоплению биопленки бактерий и воспалению. Для проверки животной модели IL-1β, ключевой медиатор воспаления, был определен с помощью иммуноанализа в десневой щелевой жидкости (ЗКФ), а потеря альвеолярной кости была рассчитана с использованием конусно-лучевой компьютерной томографии (КЛКТ). Этот метод был эффективен в стимулировании рецессии десны, потери альвеолярной кости и повышения уровня IL-1β в ЗКФ в конце экспериментальной процедуры через 14 дней. Этот метод был эффективен в индуцировании БП, поэтому его можно было использовать в исследованиях механизмов прогрессирования заболевания и будущих возможных методов лечения.
Introduction
Пародонтит (БП) является шестым по распространенности заболеванием общественного здравоохранения во всем мире, затрагивающим примерно 11% всего населения, являясь прогрессирующей, необратимой и деструктивной формой заболевания пародонта 1,2. БП – воспалительный процесс, поражающий ткани десны и пародонта, в результате чего происходит рецессия десны, апикальная миграция соединительного эпителия с развитием кармана, потеря альвеолярной кости3. Кроме того, болезнь Паркинсона связана с несколькими системными заболеваниями, включая сердечно-сосудистые заболевания, ожирение, диабет и ревматоидный артрит, для которых факторы окружающей среды и хозяина играют значительную роль 4,5.
Следовательно, БП является многофакторным заболеванием, инициируемым в первую очередь накоплением микробного налета в результате дисбактериоза микробных сообществ и преувеличенным иммунным ответом хозяина на патогены пародонта, что приводит к разрушению ткани пародонта 4,6. Среди нескольких пародонтальных бактерий грамотрицательная анаэробная бактерия Porphyromonas gingivalis является одним из ключевых патогенов PD4. P. gingivalis содержит в своих стенках сложный липополисахарид (ЛПС), молекулу, которая, как известно, индуцирует полиморфноядерную инфильтрацию лейкоцитов и расширение сосудов в воспаленных тканях пародонта7. Это приводит к выработке медиаторов воспаления, таких как интерлейкин 1 (IL-1), IL-6 и IL-8, фактор некроза опухоли (TNF) или простагландины, с последующей активацией остеокластов и резорбцией кости, что приводит к разрушению тканей и окончательной потере зубов3.
К различным преимуществам животных моделей можно отнести способность имитировать клеточные сложности, как у людей, или быть более точными, чем исследования in vitro , которые проводятся на пластиковых поверхностях с ограниченными типами клеток8. Для экспериментального моделирования БП in vivo использовались различные виды животных, такие как нечеловекообразные приматы, собаки, свиньи, хорьки, кролики, мыши и крысы9. Тем не менее, крысы являются наиболее широко изученной животной моделью патогенеза БП, потому что они недороги и просты в обращении10. Их зубная десневая ткань имеет схожие структурные особенности с десневой тканью человека, с неглубокой десневой бороздой и соединительным эпителием, прикрепленным к поверхности зуба. Кроме того, как и у человека, соединительный эпителий облегчает прохождение бактериальных, чужеродных материалов и экссудата из воспалительных клеток 9.
Одной из наиболее известных экспериментальных моделей индукции БП у крыс является размещение лигатур вокруг зубов, что технически сложно, но надежно10. Размещение лигатуры способствует образованию зубного налета и накоплению бактерий, вызывая дисбактериоз в десневых бороздах, что вызывает воспаление и разрушение тканей пародонта11. Потеря прикрепления пародонта и резорбция альвеолярной кости могут произойти через 7 дней у этой крысы модели8.
Другая животная модель БП состоит из инъекции ЛПС в десневую ткань. В результате стимулируется остеокластогенез и потеря костной массы. Гистопатологические особенности этой модели сходны с установленной человеком болезнью Паркинсона, характеризуются более высокими уровнями провоспалительных цитокинов, деградацией коллагена и резорбцией альвеолярной кости 6,8.
Таким образом, целью данного исследования было описание простой модели экспериментальной БП на крысах, основанной на методах инъекций P. gingivalis-LPS (Pg-LPS) в сочетании с размещением лигатуры вокруг первых верхнечелюстных моляров (M1). Это модель с характеристиками, аналогичными тем, которые наблюдаются при заболевании БП человека, которая может быть использована при изучении механизмов прогрессирования заболевания и будущих возможных методов лечения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Экспериментальный протокол исследования был одобрен Этическим комитетом по экспериментам на животных Научно-исследовательского института здравоохранения Балеарских островов (CEEA-UIB; номер ссылки 163/03/21).
1. Анестезия для животных и подготовка к процедуре
- Перед операцией стерилизуйте все хирургические инструменты (алюминиевые кляпы, стоматологический проводник, алмазное копье, хирургические ножницы, микрохирургические плоскогубцы, держатель микроиглы, резчик по полой спинке, периостальный микрохирургический элеватор и микрохирургические ножницы) (5 мин при 135 °C).
- Приготовьте все растворы, необходимые для процедуры в стерильных условиях, как описано:
- Приготовьте смесь кетамина (60 мг / мл) и ксилазина (8 мг / мл), смешав 1,6 мл кетамина с 1 мл ксилазина, разбавленного в фосфатном буферном растворе (PBS) / физиологическом растворе. Храните бульон при температуре 4 °C.
- Разбавьте атипамезол до конечной концентрации 0,25 мг / мл в PBS / физиологическом растворе. Храните бульон при температуре 4 °C.
- Разбавьте бупренорфин до конечной концентрации 0,03 мг / мл в PBS / физиологическом растворе. Храните бульон при температуре 4 °C.
- Приготовьте 1 мл Pg-LPS (1 мг / мл) в стерильном физиологическом растворе. Храните бульон при температуре -20 °C.
- Для эксперимента использовали самок и самцов крыс Вистар, в возрасте 12 недель и весом 210-350 г на момент операции. Содержание животных в группах в соответствующей среде и постоянных условиях (20-24 °C, 12 ч в сутки светлый-темный) с кормом и стандартной водой, предлагаемой ad libitum.
- Чтобы вызвать анестезию, взвесьте крысу и введите смесь кетамина / ксилазина в концентрации 80/10 мг / кг внутрибрюшинно (IP), используя стерильную иглу для подкожных инъекций 25 г и шприц объемом 1 мл.
- После того, как крыса будет обезболена, положите животное на спину на подогретую хирургическую платформу; Во время процедуры накрывайте тело животного, чтобы предотвратить потерю тепла.
ПРИМЕЧАНИЕ: Глубина анестезии оценивается по потере педального рефлекса во время процедуры и мониторингу жизненно важных функций. При необходимости используйте маленький носовой конус для поддержания анестезии с 2% изофлураном в 100% кислороде. Нанесите стерильную офтальмологическую мазь на оба глаза после индукции анестезии, чтобы защитить роговицу и предотвратить высыхание. - Во время процедур вводите 100% кислород с помощью небольшого носового конуса и контролируйте частоту пульса и насыщение кислородом с помощью пульсоксиметрии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если насыщение кислородом и частота пульса падают ниже 95% и 190 ударов в минуту соответственно, прекратите процедуру и поместите животное в положение бокового пролежня до достижения нормальных значений. - Откройте рот крысы с помощью алюминиевого ротового кляпа вокруг резцов (верхних и нижних), втягивая им язык и стабилизируя верхнюю и нижнюю челюсти в открытом, удобном рабочем положении, обеспечивая доступ к нижнечелюстным молярам.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если животное необходимо поместить в боковой пролежень, удалите ротовой кляп, прежде чем менять его положение, чтобы способствовать выздоровлению. После того, как животное будет анестезировано, соберите десневую щельную жидкость (ЗКФ) перед операцией (образец в базальных условиях) (день 0). - Соберите GCF, как описано в следующих шагах:
- Положите животное на спину на хирургическую платформу и стабилизируйте верхнюю челюсть и нижнюю челюсть в открытом положении с помощью алюминиевых ротовых кляпов.
- Соберите ЗКФ, используя в общей сложности четыре (по два на каждый M1) абсорбирующий бумажный наконечник No 30 (диаметр 0,03 см x длина 3 см), вставив его в десневую щель (пространство между десневым эпителием и прилегающей эмалью) вокруг мезио-небного отдела M1 до небольшого сопротивления. Удерживайте точку бумаги в одном и том же положении в течение 30 секунд перед немедленным удалением.
- После сбора немедленно переложите бумажную точку в пластиковый флакон и храните при температуре -80 °C до проведения анализа.
2. Техника ретенционной лигатуры и интрадесневальная инъекция Pg-LPS
ПРИМЕЧАНИЕ: Модель лигатуры была создана (день 0) путем размещения стерильной плетеной шелковой лигатуры (5/0) вокруг M1 на двусторонней основе в десневой борозде с помощью микрохирургических инструментов и закрепления ее узлами хирурга на небной поверхности. В качестве микрохирургических инструментов использовались микрохирургические плоскогубцы, держатель микроиглы, резчик по полой спине, периостальный микрохирургический лифт и микрохирургические ножницы. Также использовались хирургические лупы со светодиодным источником света (3,6-кратное увеличение).
- Расположите дистальный хвост шва на небной стороне зубного ряда и вставьте проксимальный сегмент между контактом M1 и вторыми верхнечелюстными молярами (M2).
- Используйте периостальный микрохирургический элеватор, чтобы вставить шов в борозду. Оберните лигатуру вокруг щечной поверхности М1 очень осторожно, так как ткани на этом уровне представляют собой узкую зону прикрепленной десны. Что касается небного аспекта, убедитесь, что шов затянут с обоих концов, чтобы он был вбит в десневую борозду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если при наложении шва между M1 и M2 наблюдается сопротивление, контакт можно слегка разомкнуть с помощью стоматологического проводника и ромбовидного бора. - Завяжите концы шва хирургическим узлом и обрежьте хвостики как можно короче. Вставьте узел в борозду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Наконечники хирургических инструментов могут вызвать травму полости рта и кровотечение. Подготовьте небольшие сегменты марли или ватного тампона, чтобы удалить кровь из полости рта и надавить, чтобы остановить кровоизлияние. Тщательное лечение мягких тканей с помощью микрохирургического подхода сводит к минимуму хирургические осложнения и приводит к меньшей травматизации тканей. - После лигатурного позиционирования вводят 40 мкл Pg-LPS в стерильном физиологическом растворе стерильной иглой для подкожных инъекций 25 г и шприцем объемом 1 мл в поддесневую ткань (между корнем или шейкой зуба и краем десны) на мезио-небной стороне M1 на двусторонней основе (0-й день).
3. Окончание процедуры
- После лигирования, позиционирования и применения Pg-LPS освободите крысу от хирургического состояния и поместите ее в чистую индивидуальную клетку под нагревательной лампой.
- Вводят антагонист атипамезол (0,5 мг/кг подкожно (/к)) стерильной иглой для подкожных инъекций 25 г и шприцем объемом 1 мл.
- Для облегчения боли вводят 0,03 мг/кг бупренорфина,/к.
- Следите за выздоровлением животного до тех пор, пока последствия операции полностью не исчезнут. Индивидуально размещайте каждую крысу в соответствующей среде в постоянных условиях (20-24 ° C, 12 ч в день светлый-темный циклы). Предлагайте еду и деионизированную воду ad libitum.
- В течение первых 2 дней после процедуры взвесьте животных и вводите бупренорфин SC два раза в день для облегчения боли.
ПРИМЕЧАНИЕ: Бупренорфин можно вводить перед началом процедуры для устранения эффекта завода. - Во время эксперимента наблюдайте за животными по весу и общей оценке поведения один-два раза в неделю.
4. Послеоперационное наблюдение
ПРИМЕЧАНИЕ: Индукция БП поддерживалась в течение 14 дней, способствуя накоплению биопленки бактерий и последующему воспалению. Лигатуры должны быть исследованы и скорректированы, и Pg-LPS вводится три раза в неделю (день 2, день 4, день 6, день 8, день 10 и день 12).
- Изучите и отрегулируйте лигатуру (день 2, день 4, день 6, день 8, день 10 и день 12) следующим образом:
- Анестезируют 2% изофлураном в 100% кислороде с помощью индукционной камеры анестезии.
- После того, как крыса будет анестезирована, поместите животное на спину и используйте небольшой носовой колбочку во время процедуры с 1% изофлураном в 100% кислороде для поддержания анестезии животного.
- Откройте рот крысы с помощью алюминиевого кляпа вокруг резцов (верхнего и нижнего), втягивая им язык и стабилизируя верхнюю челюсть и нижнюю челюсть в открытом, удобном рабочем положении, обеспечивая доступ к лигатурам.
- Затяните лигатуры против десны с помощью периостального микрохирургического лифта и убедитесь, что наложен шов лигатур, создавая воспаление вокруг десны.
ПРИМЕЧАНИЕ: Возможно, что через 7-10 дней после операции лигатуры будут потеряны. Если это произойдет, следуйте протоколу, описанному для инъекции Pg-LPS (шаг 2.4).
- После коррекции лигатуры двусторонне вводят 40 мкл Pg-LPS стерильной иглой для подкожных инъекций 25 г и шприцем объемом 1 мл в поддесневую ткань на мезио-небной стороне M1 (2-й день, 4-й, 6-й, 8-й, 10-й и 12-й дни).
- Удалите носовой конус для анестезии и поместите крысу в клетку. Следите за выздоровлением животного до тех пор, пока последствия анестезии полностью не исчезнут.
5. Жертвоприношение животных и анализ
ПРИМЕЧАНИЕ: Существуют различные варианты оценки прогрессирования болезни Паркинсона. Здесь описанный анализ состоит из оценки провоспалительных цитокинов в десневой щелевой жидкости (ЗКФ) и оценки потери альвеолярной кости.
- На 14-й день исследования (14-й день) принесите в жертву животных сСО2 в камере углекислого газа. Для грызунов рекомендуется скорость перемещения от 30% до 70% от объема камеры / мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Отсутствие реакции животных на педальный рефлекс и отсутствие жизненно важных функций должны быть проверены, чтобы подтвердить эвтаназию. - Соберите GCF, как описано в следующих шагах:
ПРИМЕЧАНИЕ: ЗКФ собирают до индукции БП (до операции) (0-й день) и после индукции БП (после жертвоприношения) (14-й день).- Положите животное на спину на хирургическую платформу и стабилизируйте верхнюю челюсть и нижнюю челюсть в открытом положении с помощью алюминиевых ротовых кляпов.
- Соберите ЗКФ с помощью адсорбирующей бумаги No 30 (диаметр 0,03 см x длина 3 см), вставив его в десневую щель вокруг мезио-небной части M1 до небольшого сопротивления. Удерживайте точку бумаги в одном и том же положении в течение 30 секунд перед немедленным удалением.
- После сбора немедленно переложите бумажную точку в пластиковый флакон и храните при температуре -80 °C до проведения анализа.
- Чтобы оценить белки в ЗКФ, приготовьте следующие растворы и следуйте описанным этапам метода элюирования:
ПРИМЕЧАНИЕ: IL-1β оценивается на ЗКФ (14-й день) с использованием иммуноанализа, согласно протоколу производителя.- Приготовьте буфер для элюирования в свежем виде и держите его на льду в течение всего процесса экстракции, чтобы подавить активность протеазы.
- Приготовьте все растворы, необходимые для элюирующего буфера, как описано:
- Приготовьте 1 мл апротинина (1 мг/мл) в сверхчистой воде.
- Приготовьте 10 мл фенилметилсульфонилфторида (PMSF) (200 мМ) в метаноле.
- Добавьте 125 мкл PMSF и 250 мкл апротинина к 24,5 мл раствора PBS (pH = 7,4) для приготовления элюирующего буфера.
- Растворите одну коммерческую таблетку ингибитора фосфатазы 10 мл свежеприготовленного буфера для элюирования в течение 10 мин при перемешивании при 4 ° C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность элюирования ЗКФ ограничена; Использовать немедленно для центрифугирования после добавления таблетки ингибитора фосфатазы в течение первых 30 мин. - После добавления ингибитора фосфатазы добавьте 11 мкл полного элюирующего буфера непосредственно на пробирку с бумажными точками.
- Центрифугируйте пробирку при 452 x g в течение 5 мин при 4 °C.
- Перелейте элюированное содержимое в новый пластиковый флакон. Повторите этот процесс еще четыре раза, чтобы получить общий объем 50 мкл.
- После последнего центрифугирования добавьте общий объем 60 мкл непосредственно в точку бумаги и центрифугируйте в последний раз при 452 x g в течение 5 мин при 4 °C.
- Используйте необходимый объем элюирования для оценки белка.
- После эвтаназии и сбора ЗКФ с помощью хирургических ножниц у крыс вырезают верхнюю челюсть. Постарайтесь снять маску с крысы и оставить как можно меньше мягких тканей.
- Расположите челюсть в столике микроскопа для визуализации и сделайте снимок с нужным увеличением.
- Поместите челюсть непосредственно в 4% параформальдегид (PFA), разбавленный PBS. Обновляйте два раза в неделю новым PFA в течение 12 дней для полной фиксации.
ВНИМАНИЕ: Действия, связанные с PFA, следует выполнять в вытяжном шкафу в соответствии с рекомендациями паспорта безопасности. - После полной фиксации челюсти оцените потерю костной массы с помощью конусно-лучевой компьютерной томографии (КЛКТ) следующим образом:
- Откройте компьютер.
- Откройте программу анализа КЛКТ.
- Выберите «Протокол сканирования» > режим сканирования зубных протезов.
- Выберите поле зрения (FOV) > (11x8) HIRes (напряжение 90 кВ и ток 3 мА).
- Поместите фиксированную верхнюю челюсть крыс в портал.
- Нажмите кнопку Далее.
- Нажмите кнопку запуска рентгеновского излучения (нажмите на пульт дистанционного управления рентгеновским излучением, чтобы сделать излучение, и удерживайте ее нажатой в течение всего сканирования).
- При необходимости переместите верхнюю челюсть в центр фронтальной плоскости, нажав кнопку управления, затем нажмите кнопку рентгеновского излучения (нажмите рентгеновский пульт дистанционного управления, чтобы сделать излучение, и удерживайте его нажатым в течение всего времени сканирования).
- Нажмите кнопку Далее.
- Нажмите кнопку запуска рентгеновского излучения (нажмите на пульт дистанционного управления рентгеновским излучением, чтобы сделать излучение, и удерживайте ее нажатой в течение всего сканирования).
- При необходимости переместите протез в центр сагиттальной плоскости, нажав кнопку управления, затем нажмите кнопку рентгеновского излучения (нажмите рентгеновский пульт дистанционного управления, чтобы сделать излучение, и удерживайте его нажатым в течение всего времени сканирования).
- Нажмите кнопку Далее.
- Нажмите кнопку «Пуск» (нажмите на рентгеновский пульт дистанционного управления, чтобы сделать излучение, и удерживайте его нажатым в течение всего исследования). Дождитесь получения сообщения об обработке, а затем следуйте приведенным инструкциям.
- Появится окно. Отрегулируйте серый цвет на 65% и нажмите «Применить».
- Для сохранения сканирования нажмите « Файл » и сохраните его в формате DICOM. Затем нажмите « Все изображения » и в окне выбора экспорта DICOM выберите все отображаемые параметры (исходное изображение, исходное осевое, переформатированное осевое, многоплоскостное) и выберите предопределенный тип.
- Обработайте двумерные и сагиттальные репрезентативные изображения верхнечелюстных моляров с помощью аналитической программы следующим образом:
- Откройте программное обеспечение.
- Нажмите «Файл» и «Открыть», а затем выберите папку с изображениями в формате DICOM и нажмите «Открыть».
- Дождитесь появления окна «Преобразовать в 8 бит», выберите диапазон от 0 до 6 000 и нажмите «ОК».
- Нажмите Необработанные изображения.
- Определите верхнюю и нижнюю части выделенной области, чтобы ограничить интересующую область. Найдите первое и последнее изображения, на которых появляется альвеолярная кость, и выделите его с помощью команд «Верхняя часть выделения» и «Нижняя часть выделения ».
ПРИМЕЧАНИЕ: Репрезентативные двумерные изображения альвеолярной кости моляров могут быть экспортированы, как показано на рисунке 3A, B. - Для сагиттальных репрезентативных изображений нажмите « Переключить панель профиля».
- Нарисуйте сагиттальную линию в середине неба и нажмите « Срезать модель». Определите параметры для разграничения интересующей области (интервал между фрагментами: 1; количество фрагментов: 100) и нажмите кнопку «ОК». Дождитесь окончания нарезки модели. Наконец, нажмите « Сохранить нарезанные изображения».
ПРИМЕЧАНИЕ: Репрезентативные сагиттальные представления альвеолярной кости моляров могут быть экспортированы, как показано на рисунке 3C, D.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
График экспериментальных шагов представлен на рисунке 1. На рисунке 2А показано изображение нижней челюсти после хирургического вмешательства с размещением лигатуры вокруг борозды М1 в момент 0 эксперимента. На рисунке 2B показано, как через 14 дней после процедуры лигатура вокруг М1 попадает в десневую борозду, вызывая воспаление десны и инфильтрирующее скопление.
Рисунок 1: Схематическое изображение временной шкалы экспериментальной процедуры индукции пародонтита (ПД) у крыс. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Репрезентативные двумерные изображения (рис. 3; красный квадрат) демонстрируют различия в потере альвеолярной костной массы в мандибуле между базальным контролем, демонстрирующим больший объем кости (рис. 3A), и после установления БП, демонстрирующим более высокую альвеолярную потерю костной массы (рис. 3B). Кроме того, анализ сагиттальных изображений подчеркивает большую альвеолярную потерю костной ткани в межкорешковой костной области M1 (рис. 3D; красная стрелка) и M2 (рис. 3D; зеленая стрелка) после установления БП по сравнению с базальной контрольной группой (рис. 3C). Кроме того, резорбция альвеолярной кости характеризовалась увеличением пространства между цементно-эмалевым соединением (CEJ) и альвеолярным гребнем кости (ABC). Расстояние между CEJ и ABC в обеих группах крыс показано на рисунке 3C, D синими стрелками. Установленная болезнь Паркинсона развила большие промежутки между CEJ и ABC (рис. 3D) по сравнению с базальным контролем (рис. 3C).
В момент жертвоприношения изображения неба показали различия в рецессии десен в M1 в разных группах (рис. 4A, B). Группа PD (рис. 4B) демонстрирует большую апикальную миграцию десен из-за потери опоры кости и обнажения корней по сравнению с базальной контрольной группой (рис. 4A). Кроме того, в группе PD (рис. 4B) наблюдалось большее воспаление десны вокруг верхнечелюстных моляров по сравнению с базальной контрольной группой (рис. 4A). На рисунке 4C показаны результаты анализа провоспалительного цитокина IL-1β из ЗКФ, показывающие значительно более высокое высвобождение IL-1β, отображаемое в группе БП по сравнению с контрольной группой. Согласно литературным данным, IL-1β участвует в воспалении, иммунной регуляции и резорбции кости при пародонтите, а также является сильным стимулятором разрушения тканей пародонта12.
Рисунок 2: Изображения лигатуры, вставленной в борозду М1 в разное время. (A) Крысиное небо с размещением лигатуры вокруг М1, через 0 дней после введения лигатуры. (B) Крысиное небо с размещением лигатуры вокруг M1 через 14 дней после введения лигатуры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Репрезентативные двумерные изображения альвеолярной кости и верхнечелюстных моляров. Репрезентативные двумерные фотографии, полученные с помощью КЛКТ альвеолярной кости верхнечелюстных моляров (красный квадрат) (А) базального контроля и (Б) установленного пародонтита (ПД) в течение 14 дней с введением лигатуры и инъекцией Pg-LPS. Репрезентативные сагиттальные двумерные виды верхнечелюстных моляров (C) базального контроля и (D) PD. Красными стрелками обозначена межкорешковая альвеолярная область кости M1, синими стрелками указано расстояние между CEJ и ABC, а зелеными стрелками обозначена межкорешковая альвеолярная область кости M2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Репрезентативные изображения неба. Репрезентативные изображения неба после жертвоприношения в группе (А) базальной контрольной группы и (В) группы пародонтита (ПД), обработанных в течение 14 дней введением лигатуры и инъекцией Pg-LPS. (C) Определение концентраций IL-1β в ЗКФ базальной контрольной группы и группы БП (n = 9). Данные представляют собой среднее значение ± SEM. Результаты были статистически сравнены по методу Крускала-Уоллиса: * p < 0,05 группы PD по сравнению с базальной контрольной группой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот метод описывает индукцию БП у крыс после комбинированной техники инъекций Pg-LPS и размещения лигатуры вокруг M1, показывая, что значительные изменения в тканях пародонта и альвеолярной кости могут быть вызваны через 14 дней после этого метода.
Во время этой процедуры необходимо уделять внимание различным критическим шагам. Во время анестезии животных и подготовки к процедуре оценка правильной анестезии во время хирургического процесса имеет решающее значение для его успеха, как и обеспечение правильного положения животного, стабилизация открытого рта крысы с помощью алюминиевого ротового кляпа вокруг резцов и предотвращение травмирования животных кляпом и хирургическими инструментами. Если насыщение кислородом и частота пульса падают, процедуру следует прекратить, а животное поместить в боковое положение пролежня до достижения нормальных значений. Во время лигатурного положения важно, чтобы шов и узел были правильно вставлены в борозду, учитывая, что травма мягких тканей должна быть сведена к минимуму, чтобы предотвратить боль и воспаление в других областях. Принимая во внимание этические вопросы, касающиеся благополучия животных, важно следить за выздоровлением животного до тех пор, пока последствия анестезии не будут полностью устранены. Обезболивающие препараты в течение первых 2 дней после процедуры незаменимы. Также важно следить за весом и поведением животных, чтобы оценить, насколько хорошо крыса переносит процедуру, и убедиться, что она не проявляет каких-либо крайних страданий. Во время постпроцедурного протокола инъекции Pg-LPS и подгонки лигатуры к поддесневой ткани вокруг М1, прежде всего, важно подтянуть и переместить лигатуру в апикальное положение для создания воспаления. Во-вторых, важно вводить Pg-LPS с осторожностью на двусторонней основе, чтобы не вызвать травму полости рта. Также необходимо соблюдать осторожность во время обезболивания животного, и следить за ним до выздоровления. Во время сбора НОК калиброванная бумага должна находиться в одном и том же положении в течение того же общего времени, и важно вставлять ее в одну и ту же десневую щель вокруг мезио-небного M1. На этапах элюирования ЗКФ важно использовать буфер элюирования сразу после добавления коммерческой таблетки ингибитора фосфатазы. Последний важный шаг протокола - это сканирование КЛКТ; Правильное выравнивание образцов и протокола анализа имеет решающее значение для получения интерпретируемых результатов.
Изменение специфического воздействия на каждое животное инъекции Pg-LPS и ретенционной лигатуры вокруг M1 может быть включено в качестве причин недостижения правильного воспаления и последующей резорбции кости. Несмотря на то, что с помощью этой процедуры достигаются хорошие результаты в индукции БП, важно точно уменьшить различия между животными, строго следуя протоколу. Одной из наиболее значительных модификаций метода является размещение удерживающей лигатуры вокруг М1, а не вокруг М2, наиболее традиционной модели лигатуры в литературе13,14,15. Операционная процедура наложения лигатуры у мышей или крыс представляет собой техническую сложность и представляет собой потенциальную проблему для многих исследователей из-за небольшого размера полости рта и зубов мышей11,16. Использование крыс и размещение лигатуры вокруг М1 облегчило манипуляцию и доступ к области, что также снизило стресс животного во время процедуры. Во время протокола не наблюдалось никаких страданий животных, но если какая-либо крыса проявляет признаки дистресса, подумайте о том, чтобы исключить их из эксперимента, чтобы предотвратить страдания. Наконец, наиболее ограничивающим этапом процедуры является предотвращение потери лигатуры, которая может произойти через 7-10 дней после операции. Для увеличения и поддержания интенсивности заболевания со временем важно корректировать лигатуры для поддержания тесного контакта с тканями десны, смягчая вариабельность интенсивности индукции пародонтита между животными15. В целом, если процедура выполнена правильно, никаких модификаций не требуется, и будут получены стабильные результаты.
Важно отметить, что эта модель имеет несколько ограничений. Прежде всего, была разработана методика изучения БП, вызванной травматическим повреждением (положение лигатуры), которая, как считается, способствует локальному накоплению бактерий и тем самым усиливает бактериологически опосредованное воспаление и потерю костной массы13,10 с комбинацией инъекций Pg-LPS. Но, собственно говоря, метод не имитирует естественные этиологические факторы, ответственные за дисбактериоз микробиоты при пародонтите человека, и не имитирует несколько других возможных механизмов, с помощью которых может возникнуть пародонтит. Кроме того, мышиные зубные структуры не идентичны человеческим15. Кроме того, хотя представленный метод эффективен для изучения острой БП, он может не отражать долгосрочные характеристики потери костной массы и воспалительной инфильтрации при хронической БП16. Подробно с методологией, предложенной для оценки альвеолярной потери костной массы, наиболее часто используемым методом многомерной оценки кости является микро-КТ, которая позволяет оценить внешние факторы и обеспечивает трехмерные изображения кости. Кроме того, параметры трабекулярной кости, объем кости и минеральная плотность кости могут быть проанализированы без разрушения костей14,17. Тем не менее, использование КЛКТ для оценки потери альвеолярной кости было предложено здесь (рис. 3) в качестве альтернативы микро-КТ; Несмотря на то, что получаются изображения с более низким разрешением, они также обеспечивают полезный качественный и количественный анализ прогрессирования пародонтита18,19,20. Таким образом, КЛКТ-исследования обеспечивают точный метод визуализации, более доступный и доступный, чем микро-КТ, что облегчит изучение индукции пародонтита у крыс.
Среди различных моделей животных, которые использовались для имитации БП in vivo16 для оценки тканей, поддерживающих зубы (десна и кость) в хорошо контролируемых условиях, лигатурно-индуцированная модель БП широко использовалась у крыс, собак и нечеловекообразных приматов13. В литературе также указывается, что, несмотря на использование в некоторых протоколах, использование мышей, которые представляют собой удобную, недорогую и универсальную модель, приводит к более технической проблеме из-за относительно небольшого размера полости рта мыши по сравнению с крысами13. По сравнению с другими моделями, лигатурно-индуцированная модель БП крыс предлагает ряд преимуществ, включая быструю индукцию заболевания, которая может начаться в предсказуемое время и завершиться потерей альвеолярной кости в течение нескольких дней (мыши и крысы)13. У этого метода есть и другие преимущества, такие как возможность изучения ткани пародонта и регенерации альвеолярной кости, а также возможность обнаруживать и рассекать воспаленную десневую ткань с целью оценки уровня воспаления15. Метод совмещения лигатурно-индуцированной модели БП с инъекцией ЛПС добавляет локальную деструктивную воспалительную реакцию в пародонте, что усиливает потерю прикрепления соединительной ткани и резорбцию альвеолярной кости, генерируемую лигатурой. Этот аддитивный эффект целесообразно усиливать с увеличением концентрации и частоты инъекций ЛПС10. Метод, описанный здесь, представляет собой оптимизированный протокол комбинации лигатуры с инъекцией Pg-LPS с преимуществами и значимостью обоих методов.
Оптимизация и разработка безопасных и экономичных моделей БП in vivo имеют решающее значение для облегчения понимания патогенеза заболеваний пародонта и тестирования новых терапевтических подходов. Представленная здесь модель БП комбинированной техники инъекций Pg-LPS и размещения лигатуры вокруг M1 оценивается как привлекательная модель исследования для изучения взаимодействий хозяина и микроба, воспаления при пародонтите и резорбции альвеолярной кости. Эта модель определяет наиболее важные наборы протокола, описывает их в технических деталях на основе изображений, а также стандартизирует и оптимизирует использование этих комбинированных методов. Возможно использование дополнительных методов оценки прогрессирования пародонтита, включая гистологические анализы как альвеолярной кости, так и окружающей прикрепленной десны, определение других цитокинов, участвующих в воспалении, и характеристику микробиоты полости рта. Хотя модель не может отразить все аспекты механизмов или причин БП у людей, это исследование показывает, что значительные дегенеративные и воспалительные изменения в тканях пародонта и альвеолярной кости могут быть вызваны через 14 дней после вмешательства, что обеспечивает основу для будущих доклинических профилактических или лечебных исследований заболеваний пародонта.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Fundació Universitat-Empresa de les Illes Balears (Proof of concept call 2020), Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competividad, совместно финансируемым Европейским социальным фондом ESF и Европейским фондом регионального развития ERDF (контракт с M.M.B; FI18/00104) и Генеральным управлением расследований, Conselleria d'Investigació, Govern Balear (контракт с M.M.F.C.; FPI/040/2020). Авторы благодарят доктора Анну Томас и Марию Тортосу за их помощь в экспериментальной хирургии и платформе IdISBa. Наконец, спасибо Школе стоматологии ADEMA за доступ к сканеру КЛКТ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adsorbent paper point nº30 | Proclinc | 8187 | |
| Aprotinin | Sigma-Aldrich | A1153 | |
| Atipamezole | Dechra | 573751.5 | Revanzol 5 mg/mL |
| Braided silk ligature (5/0) | Laboratorio Arago Sl | 613112 | |
| Buprenorphine | Richter pharma | 578816.6 | Bupaq 0.3 mg/mL |
| Cone-beam computed tomography (CBCT) Scanner | MyRay | hyperion X9 | Model Hyperion X9 |
| CTAn software | SkyScan | Version 1.13.4.0 | |
| Dental explorer | Proclinc | 99743 | |
| Diamond lance-shaped bur | Dentaltix | IT21517 | |
| Food maintenance diet | Sodispain research | ROD14 | |
| Heated surgical platform | PetSavers | ||
| Hollenback carver | Hu-FRIEDY | HF45234 | |
| Hypodermic needle | BD | 300600 | 25G X 5/8” - 0,5 X 16 MM |
| Isoflurane | Karizoo | Isoflutek 1000mg/g | |
| Ketamine | Dechra | 581140.6 | Anesketin 100 mg/mL |
| Lipopolysaccharide derived from P.Gingivalis | InvivoGen | TLRL-PGLPS | |
| Methanol | Fisher Scientific | M/4000/PB08 | |
| Micro needle holter | Fehling Surgical Instruments | KOT-6 | |
| Microsurgical pliers | KLS Martin | 12-384-06-07 | |
| microsurgical scissors | S&T microsurgical instruments | SDC-15 RV | |
| Monitor iMEC 8 Vet | Mindray | ||
| Multiplex bead immunoassay | Procartaplex, Thermo fisher Scientific | PPX-05 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 8187151000 | |
| Periosteal microsurgical elevator | Dentaltix | CU19112468 | |
| Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) | Roche | 10837091001 | |
| Phosphate Buffer Solution (PBS) | Capricorn Scientific | PBS-1A | |
| PhosSTOP | Roche | 4906845001 | Commercial phosphatase inhibitor tablet |
| Plastic vial | SPL Lifesciencies | 60015 | 1.5mL |
| Saline | Cinfa | 204024.3 | |
| Stereo Microscope | Zeiss | Model SteREO Discovery.V12 | |
| Surgical loupes led light | Zeiss | ||
| Surgical scissors | Zepf Surgical | 08-1701-17 | |
| Syringe | BD plastipak | 303172 | 1mL |
| Veterinary dental micromotor | Eickemeyer | 174028 | |
| Xylazine | Calier | 20102-003 | Xilagesic 20 mg/mL |
References
- Carvalho, J. D. S., et al. Impact of citrus flavonoid supplementation on inflammation in lipopolysaccharide-induced periodontal disease in mice. Food and Function. 12 (11), 5007-5017 (2021).
- Nazir, M. A. Prevalence of periodontal disease, its association with systemic diseases and prevention. International Journal of Health Sciences. 1 (2), 72-80 (2017).
- Dumitrescu, A. L., El-Aleem, S. A., Morales-Aza, B., Donaldson, L. F. A model of periodontitis in the rat: Effect of lipopolysaccharide on bone resorption, osteoclast activity, and local peptidergic innervation. Journal of Clinical Periodontology. 31 (8), 596-603 (2004).
- Wang, H. Y., et al. Preventive effects of the novel antimicrobial peptide Nal-P-113 in a rat Periodontitis model by limiting the growth of Porphyromonas gingivalis and modulating IL-1β and TNF-α production. BMC Complementary and Alternative Medicine. 17 (1), 1-10 (2017).
- Guan, J., Zhang, D., Wang, C. Identifying periodontitis risk factors through a retrospective analysis of 80 cases. Pakistan Journal of Medical Sciences. 38 (1), 293-296 (2021).
- Khajuria, D. K., Patil, O. N., Karasik, D., Razdan, R. Development and evaluation of novel biodegradable chitosan based metformin intrapocket dental film for the management of periodontitis and alveolar bone loss in a rat model. Archives of Oral Biology. 85, 120-129 (2018).
- Nishida, E., et al. Bone resorption and local interleukin-1alpha and interleukin-1beta synthesis induced by Actinobacillus actinomycetemcomitans and Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide. Journal of Periodontal Research. 36 (1), 1-8 (2001).
- Graves, D. T., Kang, J., Andriankaja, O., Wada, K., Rossa, C. Animal models to study host-bacteria interactions involved in periodontitis. Bone. 23 (1), 1-7 (2008).
- Struillou, X., Boutigny, H., Soueidan, A., Layrolle, P. Experimental animal models in periodontology: a review. The Open Dentistry Journal. 4 (1), 37-47 (2010).
- Mustafa, H., et al. Induction of periodontal disease via retentive ligature, lipopolysaccharide injection, and their combination in a rat model. Polish Journal of Veterinary Sciences. 24 (3), 365-373 (2021).
- Chadwick, J. W., Glogauer, M. Robust ligature-induced model of murine periodontitis for the evaluation of oral neutrophils. Journal of Visualized Experiments. 2020 (155), 6-13 (2019).
- Cheng, R., Wu, Z., Li, M., Shao, M., Hu, T. Interleukin-1β is a potential therapeutic target for periodontitis: a narrative review. International Journal of Oral Science. 12 (1), 1-9 (2020).
- Abe, T., Hajishengallis, G. Optimization of the ligature-induced periodontitis model in mice. Journal of Immunological Methods. 394 (1-2), 49-54 (2013).
- Jeong-Hyon, K., Bon-Hyuk, G., Sang-Soo, N., Yeon-Cheol, P. A review of rat models of periodontitis treated with natural extracts. Journal of Traditional Chinese Medical Sciences. 7 (2), 95-103 (2020).
- Marchesan, J., et al. An experimental murine model to study periodontitis. Nature Protocols. 13 (10), 2247-2267 (2018).
- Lin, P., et al. Application of ligature-induced periodontitis in mice to explore the molecular mechanism of periodontal disease. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 8900 (2021).
- Irie, M. S., et al. Use of micro-computed tomography for bone evaluation in dentistry. Brazilian Dental Journal. 29 (3), 227-238 (2018).
- Haas, L. F., Zimmermann, G. S., De Luca Canto, G., Flores-Mir, C., Corrêa, M. Precision of cone beam CT to assess periodontal bone defects: a systematic review and meta-analysis. Dentomaxillofacial Radiology. 47 (2), 20170084 (2018).
- Kamburoğlu, K., Ereş, G., Akgün, C. Qualitative and quantitative assessment of alveolar bone destruction in adult rats using CBCT. Journal of Veterinary Dentistry. 36 (4), 245-250 (2019).
- Sousa Melo, S. L., Rovaris, K., Javaheri, A. M., de Rezen de Barbosa, G. L. Cone-beam computed tomography (CBCT) imaging for the assessment of periodontal disease. Current Oral Health Reports. 7 (4), 376-380 (2020).
