Summary
Bu çalışmada, periodontitis indüksiyonunun sıçan modeli, ilk maksiller azı dişlerinin etrafında 14 gün boyunca, Porphyromonas gingivalis'ten türetilen tekrarlayan lipopolisakkarit enjeksiyonları ve geciktirici ligatür kombinasyonu ile sunulmuştur. Ligasyon ve LPS enjeksiyon teknikleri peridonti indüklemede etkiliydi, bu da alveoler kemik kaybı ve inflamasyona neden oldu.
Abstract
Periodontitis (PD), periodonsiyumun oldukça yaygın, kronik immün-inflamatuar bir hastalığı olup, dişeti yumuşak dokusu, periodontal ligament, sementum ve alveoler kemik kaybına neden olur. Bu çalışmada, sıçanlarda basit bir PD indüksiyon yöntemi tanımlanmıştır. Ligatür modelinin ilk maksiller azı dişlerinin (M1) etrafına yerleştirilmesi ve M1'in mesio-palatal tarafındaki Porphyromonas gingivalis'ten türetilen lipopolisakkarit (LPS) enjeksiyonlarının bir kombinasyonu için ayrıntılı talimatlar sunuyoruz. Periodontitisin indüksiyonu 14 gün boyunca korundu ve bakteri biyofilm ve inflamasyon birikimini teşvik etti. Hayvan modelini doğrulamak için, anahtar bir inflamatuar mediatör olan IL-1β, dişeti oluk sıvısında (GCF) bir immünoassay ile belirlendi ve koni ışınlı bilgisayarlı tomografi (CBCT) kullanılarak alveoler kemik kaybı hesaplandı. Bu teknik, 14 gün sonra deneysel prosedürün sonunda dişeti çekilmesini, alveoler kemik kaybını ve GCF'de IL-1β düzeylerinde bir artışı teşvik etmede etkiliydi. Bu yöntem PD'yi indüklemede etkiliydi, böylece hastalık ilerleme mekanizmaları ve gelecekteki olası tedaviler üzerine yapılan çalışmalarda kullanılabiliyordu.
Introduction
Periodontitis (PH), dünya çapında en sık görülen altıncı halk sağlığı durumudur ve toplam popülasyonun yaklaşık %11'ini etkileyen, periodontal hastalığın gelişmiş, geri dönüşümsüz ve yıkıcı bir formudur 1,2. PD, dişeti ve periodontal dokuları etkileyen, dişeti çekilmesi, bileşke epitelinin cep gelişimi ile apikal migrasyonu ve alveoler kemik kaybı ile sonuçlanan inflamatuar bir süreçtir3. Ayrıca, PH kardiyovasküler hastalık, obezite, diyabet ve romatoid artrit gibi çevresel ve konakçıya özgü faktörlerin önemli rol oynadığı çeşitli sistemik hastalıklarla ilişkilidir 4,5.
Bu nedenle, PD esas olarak mikrobiyal plak birikimi ile başlayan multifaktöriyel bir hastalıktır - mikrobiyal toplulukların disbiyozundan kaynaklanır - ve periodontal patojenlere karşı abartılı bir konakçı immün yanıtı ile başlar ve periodontal dokunun parçalanmasına yol açar 4,6. Birkaç periodontal bakteri arasında, gram-negatif anaerobik bakteri Porphyromonas gingivalis, PD4'teki anahtar patojenlerden biridir. P. gingivalis, duvarlarında kompleks bir lipopolisakkarit (LPS), iltihaplı periodontal dokularda polimorfonükleer lökosit infiltrasyonu ve vasküler dilatasyonu indüklediği bilinen bir moleküliçerir 7. Bu, interlökin 1 (IL-1), IL-6 ve IL-8, tümör nekroz faktörü (TNF) veya prostaglandinler gibi enflamatuar mediatörlerin üretilmesiyle sonuçlanır, daha sonra osteoklast aktivasyonu ve kemik rezorpsiyonu ile doku yıkımına ve nihai diş kaybına yol açar3.
Hayvan modellerinin farklı avantajları arasında, insanlarda olduğu gibi hücresel karmaşıklıkları taklit etme veya sınırlı hücre tiplerine sahip plastik yüzeylerde gerçekleştirilen in vitro çalışmalardan daha doğru olma kapasitesibulunmaktadır 8. PD'yi deneysel olarak in vivo olarak modellemek için, insan olmayan primatlar, köpekler, domuzlar, yaban gelinciği, tavşanlar, fareler ve sıçanlar gibi farklı hayvan türleri kullanılmıştır9. Bununla birlikte, sıçanlar PD'nin patogenezi için en çok çalışılan hayvan modelidir, çünkü ucuz ve kullanımı kolaydır10. Diş eti dokusu, insan dişeti dokusuna benzer yapısal özelliklere sahiptir, sığ bir dişeti sulkusu ve diş yüzeyine bağlı bileşke epitelidir. Ayrıca, insanlarda olduğu gibi, bileşke epiteli, bakteriyel, yabancı maddelerin ve eksüdaların enflamatuar hücrelerden geçişini kolaylaştırır 9.
Sıçanlarda PD indüksiyonunun en çok bildirilen deneysel modellerinden biri, teknik olarak zor ama güvenilir olan dişlerin etrafına ligatürlerin yerleştirilmesidir10. Ligatür yerleşimi diş plağı ve bakteri birikimini kolaylaştırır, dişeti sulcisinde periodontal doku iltihabına ve yıkımına neden olan bir dysbiosis oluşturur11. Bu sıçan model8'de periodontal ataşman kaybı ve alveoler kemiğin rezorpsiyonu 7 gün içinde ortaya çıkabilir.
PD için başka bir hayvan modeli, LPS'nin dişeti dokusuna enjekte edilmesinden oluşur. Sonuç olarak, osteoklastogenez ve kemik kaybı uyarılır. Bu modelin histopatolojik özellikleri, daha yüksek proinflamatuar sitokinler, kollajen yıkımı ve alveoler kemik rezorpsiyonu 6,8 ile karakterize insan tarafından kurulan PD'ye benzer.
Bu nedenle, bu çalışmanın amacı, P. gingivalis-LPS (Pg-LPS) enjeksiyonlarının tekniklerine dayanan deneysel PD'nin basit bir sıçan modelini ve ilk maksiller azı dişlerinin (M1) etrafına ligatür yerleştirilmesini tanımlamaktır. Bu, insan PD hastalığında gözlenenlere benzer özelliklere sahip, hastalık ilerleme mekanizmalarının ve gelecekteki olası tedavilerin incelenmesinde kullanılabilecek bir modeldir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Çalışmanın deneysel protokolü Balear Adaları Sağlık Araştırma Enstitüsü Hayvan Deneyleri Etik Kurulu (CEEA-UIB; referans numarası 163/03/21) tarafından onaylanmıştır.
1. Hayvan anestezisi ve prosedür hazırlama
- Ameliyattan önce tüm cerrahi aletleri (alüminyum ağız tıkaçları, diş kaşifi, elmas mızrak, cerrahi makas, mikrocerrahi pense, mikro iğne tutucu, hollenback oymacı, periosteal mikrocerrahi asansör ve mikrocerrahi makas) sterilize edin (135 ° C'de 5 dakika).
- Açıklandığı gibi steril koşullarda prosedür için gerekli tüm çözeltileri hazırlayın:
- 1.6 mL Ketamin'i Fosfat Tampon Çözeltisi (PBS) / salin içinde seyreltilmiş 1 mL Ksilazin ile karıştırarak Ketamin (60 mg / mL) ve Ksilazin (8 mg / mL) karışımı hazırlayın. Stoğu 4 °C'de saklayın.
- Atipamezol'ü PBS / salin içinde 0.25 mg / mL'lik bir nihai konsantrasyona seyreltin. Stoğu 4 °C'de saklayın.
- Buprenorfin'i PBS / salin içinde 0.03 mg / mL'lik nihai bir konsantrasyona seyreltin. Stoğu 4 °C'de saklayın.
- Steril salin içinde 1 mL Pg-LPS (1 mg/mL) hazırlayın. Stoğu -20 °C'de saklayın.
- Deney için, 12 haftalık ve ameliyat sırasında 210-350 g ağırlığında dişi ve erkek Wistar sıçanları kullanın. Hayvanları uygun ortam ve sabit koşullar altında (20-24 ° C, günde 12 saat aydınlık-karanlık döngüleri), yiyecek ve standart su ile ad libitum sunulan gruplar halinde barındırın.
- Anesteziyi indüklemek için, sıçanı tartın ve 25 G steril hipodermik iğne ve 1 mL şırınga kullanarak intraperitoneal olarak 80/10 mg / kg (IP) konsantrasyonda Ketamin / Ksilazin karışımını uygulayın.
- Sıçan uyuşturulduktan sonra, hayvanı ısıtılmış bir cerrahi platforma sırt üstü yerleştirin; İşlem sırasında, ısı kaybını önlemek için hayvanın vücudunu örtün.
NOT: Anestezi derinliği, işlem sırasında pedal refleksinin kaybı ve vital bulguların izlenmesi ile değerlendirilir. Gerekirse,% 100 oksijende% 2 İzofluran ile anesteziyi sürdürmek için küçük bir burun konisi kullanın. Korneaları korumak ve kurumayı önlemek için anestezi indüksiyonundan sonra her iki göze steril oftalmik merhem uygulayın. - İşlemler sırasında, küçük bir burun konisi kullanarak% 100 oksijen uygulayın ve nabız oksimetresi ile nabız hızını ve oksijen doygunluğunu izleyin.
NOT: Oksijen doygunluğu ve nabız hızı sırasıyla% 95 ve 190 bpm'nin altına düşerse, prosedürü durdurun ve normal değerlere ulaşana kadar hayvanı lateral dekübit pozisyonuna getirin. - Kesici dişlerin etrafında (üst ve alt) alüminyum bir ağız tıkaç kullanarak sıçan ağzını açın, dili onunla geri çekin ve maksilla ve mandibulayı açık, rahat bir çalışma pozisyonunda stabilize ederek mandibular azı dişlerine erişim sağlayın.
NOT: Hayvanın lateral dekübitusa yerleştirilmesi gerekiyorsa, iyileşmeyi desteklemek için konumunu değiştirmeden önce ağız tıkaçlarını çıkarın. Hayvan uyuşturulduktan sonra, ameliyattan önce dişeti oluk sıvısı (GCF) toplayın (bazal koşullarda örnek) (gün 0). - GCF'yi aşağıdaki adımlarda açıklandığı şekilde toplayın:
- Hayvanı cerrahi bir platforma sırt üstü yerleştirin ve maksilla ve mandibulayı alüminyum ağız tıkaçlarıyla açık bir konumda stabilize edin.
- GCF'yi, M1'in mesio-palatalının etrafındaki dişeti yarığına (dişeti epiteli ile bitişik emaye arasındaki boşluk) hafif bir direnç gösterene kadar yerleştirerek toplam 30 (0,03 cm çap x 3 cm uzunluk) numaralı toplam dört (her M1 için iki) emici kağıt noktası kullanarak toplayın. Hemen çıkarmadan önce kağıt noktasını toplam 30 saniye boyunca aynı konumda tutun.
- Toplandıktan sonra, kağıt noktasını hemen plastik bir şişeye aktarın ve tahlil performansına kadar -80 ° C'de saklayın.
2. Geciktirici ligatür tekniği ve intragingival Pg -LPS enjeksiyonu
NOT: Ligatür modeli, mikrocerrahi aletler kullanılarak dişeti sulkus içine çift taraflı olarak M1 etrafına steril örgülü ipek bir ligatür (5/0) yerleştirilerek ve damak yüzeyinde cerrahın düğümleri ile sabitlenerek oluşturuldu (gün 0). Kullanılan mikrocerrahi aletler mikrocerrahi pense, mikro iğne tutucu, hollenback oymacı, periosteal mikrocerrahi asansör ve mikrocerrahi makastı. LED ışık kaynağına sahip cerrahi büyüteçler de kullanıldı (3.6x büyütme).
- Dikişin distal kuyruğunu dişlenmenin damak tarafına yerleştirin ve proksimal segmenti M1 ve ikinci maksiller azı dişlerinin (M2) teması arasına yerleştirin.
- Sütürü sulkus içine yerleştirmek için periosteal mikrocerrahi asansörü kullanın. Ligatürü M1'in bukkal yüzeyinin etrafına çok dikkatli bir şekilde sarın, çünkü bu seviyedeki dokular dar bir bağlı dişeti bölgesi sunar. Damak yönünde, dişeti sulkusuna sürüldüğünden emin olmak için dikişin her iki ucunda sıkıldığından emin olun.
NOT: M1 ve M2 arasına dikiş yerleştirilirken direnç gözlenirse, temas bir diş kaşifi ve elmas mızrak şeklindeki bur kullanılarak hafifçe açılabilir. - Dikişin uçlarını bir cerrahın düğümü ile bağlayın ve kuyrukları mümkün olduğunca kısa kesin. Düğümü sulkusa yerleştirin.
NOT: Cerrahi aletlerin uçları oral travmaya ve kanamaya neden olabilir. Ağız boşluğundan kanı çıkarmak için küçük gazlı bez parçaları veya pamuklu çubuk hazırlayın ve herhangi bir kanamayı durdurmak için basınç uygulayın. Mikrocerrahi yaklaşımla dikkatli yumuşak doku yönetimi, cerrahi komplikasyonları en aza indirir ve daha az doku travmasına yol açar. - Ligatür konumlandırmadan sonra, M1'in mezio-palatal tarafındaki subgingival dokuya (bir dişin kökü veya boynu ile diş eti marjı arasında) 25 G steril hipodermik iğne ve 1 mL şırınga ile steril salin içinde 40 μL Pg-LPS enjekte edin (gün 0).
3. Prosedürün sonu
- Ligasyon konumlandırma ve Pg-LPS uygulamasından sonra, sıçanı cerrahi durumdan serbest bırakın ve bir ısı lambasının altındaki temiz bir bireysel kafese yerleştirin.
- Antagonist Atipamezole'ye (deri altından 0.5 mg / kg (SC)) 25 G steril hipodermik iğne ve 1 mL şırınga ile enjekte edin.
- Ağrıyı gidermek için, 0.03 mg / kg Buprenorfin, SC enjekte edin.
- Operasyonun etkileri tamamen tersine dönene kadar hayvanın iyileşmesini izleyin. Her sıçanı ayrı ayrı sabit koşullar altında uygun ortamda barındırın (20-24 ° C, günde 12 saat aydınlık-karanlık döngüleri). Yiyecek ve deiyonize su ad libitum sunun.
- İşlemden sonraki ilk 2 gün boyunca, hayvanları tartın ve ağrıyı gidermek için günde iki kez Buprenorfin SC enjekte edin.
NOT: Buprenorfin, sarma etkisini ortadan kaldırmak için prosedüre başlamadan önce uygulanabilir. - Deney sırasında, hayvanları haftada bir veya iki kez ağırlık ve genel davranış değerlendirmesine göre izleyin.
4. İşlem sonrası takip
NOT: PD indüksiyonu, bakteri biyofilm birikimini ve bunun sonucunda inflamasyonu teşvik etmek için 14 gün boyunca korunmuştur. Ligatürler incelenmeli ve ayarlanmalıdır ve Pg-LPS haftada üç kez enjekte edilir (gün 2, gün 4, gün 6, gün 8, gün 10 ve gün 12).
- Ligatürü (2. gün, 4. gün, 6. gün, 8. gün, 10. gün ve 12. gün) aşağıdaki gibi inceleyin ve ayarlayın:
- Bir anestezi indüksiyon odası kullanarak% 100 oksijende% 2 izofluran ile anestezi yapın.
- Sıçan uyuşturulduktan sonra, hayvanı sırtına yerleştirin ve hayvan anestezisinin sürdürülmesi için% 100 oksijende% 1 izofluran ile prosedür sırasında küçük bir burun konisi kullanın.
- Kesici dişlerin etrafındaki (üst ve alt) alüminyum ağız tıkaçlarını kullanarak sıçan ağzını açın, dili onunla geri çekin ve maksilla ve mandibulayı açık, rahat bir çalışma pozisyonunda stabilize ederek ligatürlere erişim sağlayın.
- Periosteal mikrocerrahi asansör yardımıyla bağları dişetine karşı sıkın ve bağların dikişinin yerleştirildiğinden emin olun, bu da dişeti çevresinde iltihap oluşturur.
NOT: Ameliyattan 7-10 gün sonra bağların kaybolması mümkündür. Bu durumda, Pg-LPS enjeksiyonu için açıklanan protokolü izleyin (adım 2.4).
- Ligatür ayarlamasından sonra, M1'in mesio-palatal tarafındaki subgingival dokuya 25 G steril hipodermik iğne ve 1 mL şırınga ile iki taraflı olarak 40 μL Pg-LPS enjekte edin (gün 2, gün 4, gün 6, gün 8, gün 10 ve gün 12).
- Anestezi için burun konisini çıkarın ve sıçanı kafesine yerleştirin. Anestezinin etkileri tamamen tersine dönene kadar hayvanın iyileşmesini izleyin.
5. Hayvan kurban etme ve analiz
NOT: PD'nin ilerlemesini değerlendirmek için farklı seçenekler vardır. Burada tarif edilen analiz, dişeti oluk sıvısındaki (GCF) pro-inflamatuar sitokinlerin değerlendirilmesi ve alveoler kemik kaybının değerlendirilmesinden oluşmaktadır.
- Çalışmanın 14. gününde (14. gün), CO2'li hayvanları bir karbondioksit odasında kurban edin. Kemirgenler için oda hacminin/dak'nın %30 ila %70'lik bir yer değiştirme oranı önerilir.
NOT: Ötanazi doğrulamak için pedal refleksine hayvan tepkisi eksikliği ve hayati belirtilerin yokluğu doğrulanmalıdır. - GCF'yi aşağıdaki adımlarda açıklandığı şekilde toplayın:
NOT: GCF, PD indüksiyonundan önce (ameliyattan önce) (gün 0) ve PD indüksiyonundan sonra (kurbandan sonra) (gün 14) toplanır.- Hayvanı cerrahi bir platforma sırt üstü yerleştirin ve maksilla ve mandibulayı alüminyum ağız tıkaçlarıyla açık bir konumda stabilize edin.
- GCF'yi 30 numaralı adsorban kağıt noktasını (0,03 cm çap x 3 cm uzunluk) kullanarak, hafif bir direnç gösterene kadar M1'in mesio-palatal etrafındaki dişeti yarığına yerleştirerek toplayın. Hemen çıkarmadan önce kağıt noktasını toplam 30 saniye boyunca aynı konumda tutun.
- Toplandıktan sonra, kağıt noktasını hemen plastik bir şişeye aktarın ve tahlil performansına kadar -80 ° C'de saklayın.
- GCF içindeki proteinleri değerlendirmek için, aşağıdaki çözeltileri hazırlayın ve açıklandığı gibi elüsyon yönteminin adımlarını izleyin:
NOT: IL-1β, üreticinin protokolüne göre bir immünoassay kullanılarak GCF'de (14. gün) değerlendirilir.- Elüsyon tamponunu taze hazırlayın ve proteaz aktivitesini inhibe etmek için tüm ekstraksiyon işlemi boyunca buz üzerinde tutun.
- Elüsyon tamponu için gereken tüm çözümleri açıklandığı gibi hazırlayın:
- Ultra saf suda 1 mL Aprotinin (1 mg / mL) hazırlayın.
- Metanol içinde 10 mL fenilmetilsülfonilflorür (PMSF) (200 mM) hazırlayın.
- Elüsyon tamponunu hazırlamak için 24.5 mL PBS çözeltisine (pH = 7.4) 125 μL PMSF ve 250 μL Aprotinin ekleyin.
- Bir ticari fosfataz inhibitörü tableti, 10 mL taze hazırlanmış elüsyon tamponu ile 4 ° C'de ajitasyon altında 10 dakika boyunca çözün.
NOT: GCF elüsyonunun süresi sınırlıdır; İlk 30 dakika içinde fosfataz inhibitörü tabletinin eklenmesinden sonra santrifüjler için hemen kullanın. - Fosfataz inhibitörünü ekledikten sonra, kağıt noktalarıyla doğrudan tüpün üzerine 11 μL tam elüsyon tamponu ekleyin.
- Tüpü 452 x g'de 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin.
- Salınan içeriği yeni bir plastik şişeye aktarın. 50 μL toplam hacim elde etmek için bu işlemi dört kez daha tekrarlayın.
- Son santrifüjlemeden sonra, doğrudan kağıt noktasına toplam 60 μL hacim ekleyin ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 452 x g'de son bir kez santrifüj yapın.
- Protein değerlendirmesi için salınan gerekli hacmi kullanın.
- Ötanazi ve GCF toplanmasından sonra, cerrahi makas yardımıyla, sıçanların üstün çenesini kesin. Sıçanın maskesini soymaya çalışın ve mümkün olduğunca az yumuşak doku bırakın.
- Görselleştirme için çeneyi mikroskop aşamasında konumlandırın ve istenen büyütmede bir resim çekin.
- Çeneyi doğrudan PBS'de seyreltilmiş %4 paraformaldehit (PFA) içine yerleştirin. Tam bir sabitleme için haftada iki kez yeni PFA ile 12 gün boyunca yenileyin.
DİKKAT: PFA içeren adımlar, Güvenlik Bilgi Formu tavsiyelerine uygun olarak bir duman davlumbazında gerçekleştirilmelidir. - Tam çene fiksasyonundan sonra, bir koni ışınlı bilgisayarlı tomografi (CBCT) tarayıcısı kullanarak kemik kaybını aşağıdaki gibi değerlendirin:
- Bilgisayarı açın.
- CBCT analiz programını açın.
- Scan Protocol (Tarama Protokolü) > Protez Tarama Modu (Protez Tarama Modu) seçeneğini belirleyin.
- Görüş Alanı (FOV) > (11x8) HIRes (90 kV voltaj ve 3 mA akım) öğesini seçin.
- Sıçanların sabit üst maksillasını portal içine yerleştirin.
- İleri'ye tıklayın.
- X-ışını ateşleme düğmesine tıklayın (emisyonu yapmak için X-ışını uzaktan kumandasına basın ve tarama süresi boyunca basılı tutun).
- Gerekirse, kontrol düğmesine basarak üst maksillayı ön düzlemin ortasına yerleştirin, ardından X-ışını ateşleme düğmesine tıklayın (emisyonu yapmak ve tarama süresi boyunca basılı tutmak için X-ışını uzaktan kumandasına basın).
- İleri'ye tıklayın.
- X-ışını ateşleme düğmesine tıklayın (emisyonu yapmak için X-ışını uzaktan kumandasına basın ve tarama süresi boyunca basılı tutun).
- Gerekirse, kontrol düğmesine basarak protezi sagital düzlemin ortasına yerleştirin, ardından X-ışını ateşleme düğmesine tıklayın (emisyonu yapmak ve tarama süresi boyunca basılı tutmak için X-ışını uzaktan kumandasına basın).
- İleri'ye tıklayın.
- Başlat düğmesine tıklayın (emisyonu yapmak için X-ışını uzaktan kumandasına basın ve sınav süresi boyunca basılı tutun). Bir işleme iletisi alana kadar bekleyin ve ardından gösterilen yönergeleri izleyin.
- Bir pencere görünümü görüntülenir. Griyi %65'te düzenleyin ve Uygula'yı tıklayın.
- Taramayı kaydetmek için Dosya'ya tıklayın ve DICOM formatında kaydedin. Ardından, Tüm Görüntüler'i tıklatın ve DICOM dışa aktarma seçimi penceresinde, gösterilen tüm parametreleri seçin (ilk görüntü, orijinal eksenel, yeniden biçimlendirilmiş eksenel, çok düzlemli) ve önceden tanımlanmış türü seçin.
- Maksiller azı dişlerinin iki boyutlu ve sagital temsili görüntülerini bir analiz programı kullanarak aşağıdaki gibi işleyin:
- Yazılımı açın.
- Dosya ve Aç'ı tıklatın, ardından DICOM biçiminde görüntülerin bulunduğu klasörü seçip Aç'ı tıklatın.
- "8 bit'e dönüştür" penceresi görünene kadar bekleyin, 0 ile 6.000 arasındaki aralığı seçin ve Tamam'ı tıklayın.
- Raw görüntüler'i tıklayın.
- İlgilenilen bölgeyi sınırlamak için seçimin üst ve alt kısımlarını tanımlayın. Alveolar kemiğin göründüğü ilk ve son görüntüleri arayın ve seçimin üst ve alt kısım komutlarıyla seçin.
NOT: Azı dişlerinin alveolar kemiğinin temsili iki boyutlu görüntüleri, Şekil 3A, B'de olduğu gibi dışa aktarılabilir. - Sagital temsili görüntüler için, Profil çubuğunu değiştir'e tıklayın.
- Damak ortasına bir sagital çizgi çizin ve Modeli yeniden düzenle'yi tıklayın. İlgilenilen bölgeyi sınırlamak için parametreleri belirleyin (dilim aralığı: 1; dilim sayısı: 100) ve Tamam'ı tıklatın. Yeniden dilimleme modeli sona erene kadar bekleyin. Son olarak, Yeniden Dilimlenmiş görüntüleri kaydet'i tıklatın.
NOT: Azı dişlerinin alveolar kemiğinin temsili sagital hayalleri, Şekil 3C, D'de olduğu gibi ihraç edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deneysel adımların zaman çizelgesi Şekil 1'de sunulmuştur. Şekil 2A , cerrahi müdahaleden sonra mandibulanın bir görüntüsünü, deneyin 0 zamanında M1'in sulkusunun etrafına bağ yerleştirilmesiyle göstermektedir. Şekil 2B , işlemden 14 gün sonra, M1 etrafındaki bağın dişeti sulkusuna nasıl girdiğini, dişetinin iltihaplanmasına ve birikime sızmasına neden olduğunu göstermektedir.
Şekil 1: Sıçanlarda deneysel periodontitis (PD) indüksiyon prosedürünün zaman çizelgesinin şematik gösterimi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Temsili iki boyutlu görüntüler (Şekil 3; kırmızı kare), bazal kontrol arasındaki mandibulada alveoler kemik kaybı farklılıklarını göstererek daha fazla kemik hacmi (Şekil 3A) ve PD kuruluşundan sonra daha yüksek alveoler kemik kaybı (Şekil 3B) göstermektedir. Ayrıca, sagital görüntülerin analizi, PD kuruluşundan sonra M1 (Şekil 3D; kırmızı ok) ve M2'nin (Şekil 3D; yeşil ok) interradiküler kemik alanında, bazal kontrol grubuna (Şekil 3C) kıyasla daha büyük alveoler kemik kaybını vurgulamaktadır. Ayrıca, alveoler kemik rezorpsiyonu, çimento mine bileşkesi (CEJ) ve alveoler kemik krest (ABC) arasındaki boşlukta bir artış ile karakterize edildi. Her iki sıçan grubunda CEJ ve ABC arasındaki mesafe Şekil 3C,D'de mavi oklarla gösterilmiştir. Kurulan PD, CEJ ve ABC arasında bazal kontrole kıyasla (Şekil 3D) geniş boşluklar geliştirmiştir (Şekil 3C).
Kurban anında damak görüntüleri, farklı gruplarda M1'deki dişeti çekilmesinde farklılıklar göstermiştir (Şekil 4A, B). PD grubu (Şekil 4B), bazal kontrol grubuna kıyasla kemik desteği kaybı ve kök maruziyeti nedeniyle daha büyük bir apikal dişeti migrasyonu göstermektedir (Şekil 4A). Ayrıca, PD grubu (Şekil 4B), bazal kontrol grubuna (Şekil 4A) kıyasla, maksiller azı dişleri çevresinde dişetinin daha fazla iltihaplanmasını sağlamıştır. Şekil 4C , GCF'den pro-inflamatuar sitokin IL-1β analizinin sonuçlarını göstermekte ve PD grubunda kontrol grubuna kıyasla anlamlı derecede daha yüksek IL-1β salınımı göstermektedir. Literatüre göre, IL-1β periodontitiste inflamasyon, immün regülasyon ve kemik rezorpsiyonuna katılır ve periodontal doku yıkımının güçlü bir uyarıcısıdır12.
Şekil 2: M1'in sulcusuna farklı zamanlarda yerleştirilen bağların görüntüleri. (A) Ligatürün yerleştirilmesinden 0 gün sonra, M1 civarında bağ yerleşimi olan sıçan damakları. (B) Ligatürün yerleştirilmesinden 14 gün sonra, M1 çevresinde bağ yerleşimi olan sıçan damakları. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Alveoler kemik ve maksiller azı dişlerinin temsili iki boyutlu görüntüleri. (A) bazal kontrolün maksiller azı dişlerinin (kırmızı kare) alveolar kemiğinin CBCT'si ile elde edilen temsili iki boyutlu fotoğraflar ve (B) ligatür yerleştirme ve Pg-LPS enjeksiyonu ile 14 gün boyunca periodontitis (PD) oluşturdu. (C) bazal kontrol ve (D) PD'nin maksiller azı dişlerinin temsili sagital iki boyutlu görünümleri. Kırmızı oklar M1'in interradiküler alveoler kemik alanını, mavi oklar CEJ ve ABC arasındaki mesafeyi ve yeşil oklar M2'nin interradiküler alveoler kemik alanını gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Damak temsili görüntüleri. (A) bazal kontrol grubunun ve (B) periodontitis (PD) grubunun kurban edilmesinden sonra damağın temsili görüntüleri, ligatür yerleştirme ve Pg-LPS enjeksiyonu ile 14 gün boyunca tedavi edilir. (C) Bazal kontrol grubunun ve PD grubunun GCF'sinde IL-1β konsantrasyonlarının belirlenmesi (n = 9). Sonuçlar Kruskal±-Wallis tarafından istatistiksel olarak karşılaştırıldı: * p < 0.05 PD grubu ile bazal kontrol grubu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yöntem, Pg-LPS enjeksiyonlarının kombine tekniğini ve M1 etrafındaki ligatür yerleşimini takiben sıçanlarda PD'nin indüksiyonunu açıklamakta ve periodontal dokularda ve alveoler kemikte önemli değişikliklerin bu yöntemi takip eden 14 gün içinde indüklenebileceğini ortaya koymaktadır.
Bu prosedür sırasında, farklı kritik adımlara dikkat edilmelidir. Hayvan anestezisi ve prosedür hazırlığı sırasında, cerrahi işlem sırasında uygun anestezinin değerlendirilmesi, hayvanın doğru konumlandırılmasını sağlamak, açık sıçan ağzını kesici dişlerin etrafındaki alüminyum ağız tıkaçları ile stabilize etmek ve hayvanların tıkaç ve cerrahi aletlerle zarar görmesini önlemek gibi başarısı için kritik öneme sahiptir. Oksijen doygunluğu ve nabız hızı düşerse, prosedür durdurulmalı ve hayvan normal değerlere ulaşana kadar lateral dekübit pozisyonuna yerleştirilmelidir. Ligatür pozisyonu sırasında, diğer bölgelerde ağrı ve iltihabı önlemek için yumuşak doku hasarının en aza indirilmesi gerektiği göz önüne alındığında, sütür ve düğümün sulkusa doğru bir şekilde yerleştirilmesi esastır. Hayvanların refahı ile ilgili etik sorunları göz önünde bulundurarak, anestezinin etkileri tamamen tersine dönene kadar hayvanın iyileşmesini izlemek önemlidir. İşlemi takip eden ilk 2 gün boyunca ağrı kesici ilaçlar vazgeçilmezdir. Hayvanların ağırlığını ve davranışlarını izlemek, sıçanın prosedürü ne kadar iyi tolere ettiğini değerlendirmek ve aşırı bir sıkıntı göstermemesini sağlamak için de önemlidir. Pg-LPS enjeksiyonunun prosedür sonrası protokolü ve ligatürün M1 çevresindeki subgingival dokuya ayarlanması sırasında, her şeyden önce, iltihabı oluşturmak için bağın apikal bir pozisyonda sıkılması ve yer değiştirmesi önemlidir. İkincisi, Pg-LPS'yi iki taraflı olarak dikkatli bir şekilde enjekte etmek, oral travmaya neden olmamak önemlidir. Ayrıca, hayvanı uyuştururken dikkatli olunmalı ve iyileşene kadar izlenmelidir. GCF'nin toplanması sırasında, kalibre edilen kağıt aynı toplam süre boyunca aynı konumda tutulmalıdır ve mesio-palatal M1 etrafındaki aynı dişeti yarığına yerleştirilmesi önemlidir. GCF elüsyon adımları sırasında, ticari fosfataz inhibitörü tableti ekledikten hemen sonra elüsyon tamponunun kullanılması önemlidir. Protokolün son bir kritik adımı CBCT taramaları sırasındadır; Numunelerin ve analiz protokolünün uygun şekilde hizalanması, yorumlanabilir sonuçlar elde etmek için kritik öneme sahiptir.
Her hayvanın Pg-LPS enjeksiyonuna spesifik maruziyetinin ve M1 etrafındaki geciktirici ligatürün varyasyonu, doğru inflamasyona ve bunun sonucunda ortaya çıkan kemik rezorpsiyonuna ulaşılamamasının nedenleri olarak dahil edilebilir. Bu prosedür kullanılarak PD indüksiyonunda iyi sonuçlar elde edilirken, protokolü yakından takip ederek hayvanlar arasındaki varyasyonu yakından azaltmak önemlidir. Yöntemin en önemli modifikasyonlarından biri, geciktirici ligatürün literatürdeki en geleneksel ligatür modeli olan M2'nin etrafına değil, M1'in etrafına yerleştirilmesidir13,14,15. Farelerde veya sıçanlarda bağ yerleştirme için çalışma prosedürü teknik zorluk teşkil eder ve murin ağız boşluğunun ve dişlerin küçük boyutu nedeniyle birçok araştırmacı için potansiyel bir zorluk teşkil eder11,16. Sıçanların kullanımı ve bağın M1'in etrafına yerleştirilmesi, manipülasyonu ve bölgeye erişimi kolaylaştırdı, bu da prosedür sırasında hayvanın stresini azalttı. Protokol sırasında hiçbir hayvanın acı çekmediği gözlendi, ancak herhangi bir sıçan sıkıntı belirtileri gösteriyorsa, acı çekmeyi önlemek için onları deneyden çıkarmayı düşünün. Son olarak, prosedürün en sınırlayıcı adımı, ameliyattan 7-10 gün sonra meydana gelebilecek ligatür kaybını önlemektir. Hastalık yoğunluğunu zamanla arttırmak ve korumak için, ligatürlerin dişeti dokularıyla yakın teması koruyacak şekilde ayarlanması, hayvanlar arasındaki periodontitis indüksiyonundaki yoğunlukların değişkenliğinin azaltılması önemlidir15. Genel olarak, prosedür doğru bir şekilde gerçekleştirilirse, herhangi bir değişikliğe gerek duyulmamalıdır ve tutarlı sonuçlar elde edilecektir.
Bu modelin birkaç sınırlama sunduğuna dikkat etmek önemlidir. Her şeyden önce, Pg-LPS enjeksiyonunun kombinasyonu ile bakterilerin lokal birikimini kolaylaştırdığı ve böylece bakteri aracılı inflamasyonu ve kemik kaybını arttırdığı düşünülen travmatik bir yaralanmanın (ligatür pozisyonu) neden olduğu PD'nin incelenmesi için bir teknik geliştirilmiştir13,10. Ancak, aslında, yöntem, insan periodontitisinde mikrobiyota dysbiosis'ten sorumlu olan doğal etiyolojik faktörleri taklit etmez ve periodontitisin ortaya çıkabileceği diğer birçok olası mekanizmayı taklit etmez. Ek olarak, murin diş yapıları insan15 ile aynı değildir. Ayrıca, sunulan yöntem akut PH'yi incelemek için etkili olsa da, kronik PD16'daki uzun süreli kemik kaybını ve inflamatuar infiltrasyon özelliklerini yansıtmayabilir. Alveoler kemik kaybının değerlendirilmesi için önerilen metodoloji ile detaylı olarak, kemiğin çok boyutlu değerlendirilmesinde en sık kullanılan yöntem, dış etkenlerin değerlendirilmesine olanak sağlayan ve kemiğin üç boyutlu görüntülerini sağlayan mikro-BT'dir. Ek olarak, trabeküler kemik parametreleri, kemik hacmi ve kemik mineral yoğunluğu kemikleri kırmadan analiz edilebilir14,17. Bununla birlikte, alveoler kemik kaybının değerlendirilmesinde CBCT'nin kullanımı burada mikro-BT'ye alternatif olarak önerilmiştir (Şekil 3); Daha düşük çözünürlüklü görüntüler elde edilmesine rağmen, periodontitis progresyonunun 18,19,20 yararlı bir nitel ve kantitatif analizini de sağlar. Bu nedenle, CBCT muayeneleri, sıçanlarda periodontitis indüksiyonu çalışmalarını kolaylaştıracak mikro-BT'den daha erişilebilir ve erişilebilir görüntüleme için doğru bir yöntem sağlar.
İyi kontrol edilen koşullar altında diş destekleyici dokuları (dişeti ve kemik) değerlendirmek için in vivo16'da PD'yi taklit etmek için kullanılan çeşitli hayvan modelleri arasında, ligatür kaynaklı PD modeli sıçanlarda, köpeklerde ve insan olmayan primatlarda yaygın olarak kullanılmıştır13. Literatür ayrıca, bazı protokollerde kullanılmasına rağmen, uygun, ucuz ve çok yönlü bir modeli temsil eden farelerin kullanımının, fare ağız boşluğununsıçanlara kıyasla nispeten küçük boyutu nedeniyle daha teknik bir zorlukla sonuçlandığını göstermektedir. Diğer modellerle karşılaştırıldığında, ligatür kaynaklı PD sıçan modeli, öngörülebilir bir zamanda başlayabilen ve birkaç gün içinde alveoler kemik kaybıyla sonuçlanabilen hızlı hastalık indüksiyonu da dahil olmak üzere çeşitli avantajlar sunar (fareler ve sıçanlar)13. Bu yöntemin, periodontal doku ve alveoler kemik rejenerasyonunu inceleme potansiyelinin yanı sıra, iltihaplanma seviyesini değerlendirmek için iltihaplı dişeti dokusunu bulma ve diseksiyon yeteneği gibi başka avantajları da vardır15. Ligatüre bağlı PD modelini LPS enjeksiyonu ile birleştirme yöntemi, periodonsiyumda bağ dokusu bağlanması kaybını ve ligatür tarafından üretilen alveoler kemik rezorpsiyonunu artıran lokal yıkıcı bir enflamatuar yanıt ekler. Bu katkı etkisinin, LPS enjeksiyonlarının konsantrasyonu ve sıklığı ile artması tavsiye edilir10. Burada bildirilen yöntem, her iki yöntemin avantajları ve önemi ile birlikte Pg-LPS enjeksiyonu ile ligatür kombinasyonunun optimize edilmiş bir protokolünü sunmaktadır.
PH'nin güvenli ve ekonomik in vivo modellerinin optimizasyonu ve geliştirilmesi, periodontal hastalığın patogenezinin anlaşılmasını ve yeni terapötik yaklaşımların test edilmesini kolaylaştırmak için kritik öneme sahiptir. Burada sunulan Pg-LPS enjeksiyonları ve M1 etrafındaki ligatür yerleştirme kombine tekniğinin PD modeli, konakçı-mikrop etkileşimlerini, periodontitiste inflamasyonu ve alveoler kemik rezorpsiyonunu araştırmak için çekici bir çalışma modeli olarak değerlendirilmiştir. Bu model, protokolün en kritik kümelerini tanımlar, bunları görüntü tabanlı teknik ayrıntılarla açıklar ve bu kombine tekniklerin kullanımını standartlaştırır ve optimize eder. Periodontitis progresyonunun değerlendirilmesi için hem alveoler kemiğin hem de çevresindeki bağlı dişetinin histolojik analizleri, inflamasyonda rol oynayan diğer sitokinlerin belirlenmesi ve oral mikrobiyotanın karakterizasyonu dahil olmak üzere ek tekniklerin kullanılması mümkün olabilir. Model, insanlarda PD'nin mekanizmalarının veya nedenlerinin tüm yönlerini yansıtamasa da, bu çalışma, periodontal dokularda ve alveoler kemikte önemli dejeneratif ve enflamatuar değişikliklerin, müdahaleyi takip eden 14 gün içinde indüklenebileceğini ve periodontal hastalık için gelecekteki klinik öncesi önleyici veya tedavi çalışmaları için temel oluşturduğunu ortaya koymaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu çalışma, Fundació Universitat-Empresa de les Illes Balears (Kavram kanıtı çağrısı 2020), ESF Avrupa Sosyal Fonu ve ERDF Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu (M.M.B. sözleşmesi; FI18/00104) ve Direcció General d'Investigació, Conselleria d'Investigació, Govern Balear tarafından (M.M.F.C. sözleşmesi; FPI/040/2020). Yazarlar, deneysel cerrahi ve IdISBa platformundaki yardımları için Dr. Anna Tomás ve Maria Tortosa'ya teşekkür eder. Son olarak, CBCT tarayıcısına erişim için ADEMA Diş Hekimliği Fakültesi'ne teşekkürler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adsorbent paper point nº30 | Proclinc | 8187 | |
| Aprotinin | Sigma-Aldrich | A1153 | |
| Atipamezole | Dechra | 573751.5 | Revanzol 5 mg/mL |
| Braided silk ligature (5/0) | Laboratorio Arago Sl | 613112 | |
| Buprenorphine | Richter pharma | 578816.6 | Bupaq 0.3 mg/mL |
| Cone-beam computed tomography (CBCT) Scanner | MyRay | hyperion X9 | Model Hyperion X9 |
| CTAn software | SkyScan | Version 1.13.4.0 | |
| Dental explorer | Proclinc | 99743 | |
| Diamond lance-shaped bur | Dentaltix | IT21517 | |
| Food maintenance diet | Sodispain research | ROD14 | |
| Heated surgical platform | PetSavers | ||
| Hollenback carver | Hu-FRIEDY | HF45234 | |
| Hypodermic needle | BD | 300600 | 25G X 5/8” - 0,5 X 16 MM |
| Isoflurane | Karizoo | Isoflutek 1000mg/g | |
| Ketamine | Dechra | 581140.6 | Anesketin 100 mg/mL |
| Lipopolysaccharide derived from P.Gingivalis | InvivoGen | TLRL-PGLPS | |
| Methanol | Fisher Scientific | M/4000/PB08 | |
| Micro needle holter | Fehling Surgical Instruments | KOT-6 | |
| Microsurgical pliers | KLS Martin | 12-384-06-07 | |
| microsurgical scissors | S&T microsurgical instruments | SDC-15 RV | |
| Monitor iMEC 8 Vet | Mindray | ||
| Multiplex bead immunoassay | Procartaplex, Thermo fisher Scientific | PPX-05 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 8187151000 | |
| Periosteal microsurgical elevator | Dentaltix | CU19112468 | |
| Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) | Roche | 10837091001 | |
| Phosphate Buffer Solution (PBS) | Capricorn Scientific | PBS-1A | |
| PhosSTOP | Roche | 4906845001 | Commercial phosphatase inhibitor tablet |
| Plastic vial | SPL Lifesciencies | 60015 | 1.5mL |
| Saline | Cinfa | 204024.3 | |
| Stereo Microscope | Zeiss | Model SteREO Discovery.V12 | |
| Surgical loupes led light | Zeiss | ||
| Surgical scissors | Zepf Surgical | 08-1701-17 | |
| Syringe | BD plastipak | 303172 | 1mL |
| Veterinary dental micromotor | Eickemeyer | 174028 | |
| Xylazine | Calier | 20102-003 | Xilagesic 20 mg/mL |
References
- Carvalho, J. D. S., et al. Impact of citrus flavonoid supplementation on inflammation in lipopolysaccharide-induced periodontal disease in mice. Food and Function. 12 (11), 5007-5017 (2021).
- Nazir, M. A. Prevalence of periodontal disease, its association with systemic diseases and prevention. International Journal of Health Sciences. 1 (2), 72-80 (2017).
- Dumitrescu, A. L., El-Aleem, S. A., Morales-Aza, B., Donaldson, L. F. A model of periodontitis in the rat: Effect of lipopolysaccharide on bone resorption, osteoclast activity, and local peptidergic innervation. Journal of Clinical Periodontology. 31 (8), 596-603 (2004).
- Wang, H. Y., et al. Preventive effects of the novel antimicrobial peptide Nal-P-113 in a rat Periodontitis model by limiting the growth of Porphyromonas gingivalis and modulating IL-1β and TNF-α production. BMC Complementary and Alternative Medicine. 17 (1), 1-10 (2017).
- Guan, J., Zhang, D., Wang, C. Identifying periodontitis risk factors through a retrospective analysis of 80 cases. Pakistan Journal of Medical Sciences. 38 (1), 293-296 (2021).
- Khajuria, D. K., Patil, O. N., Karasik, D., Razdan, R. Development and evaluation of novel biodegradable chitosan based metformin intrapocket dental film for the management of periodontitis and alveolar bone loss in a rat model. Archives of Oral Biology. 85, 120-129 (2018).
- Nishida, E., et al. Bone resorption and local interleukin-1alpha and interleukin-1beta synthesis induced by Actinobacillus actinomycetemcomitans and Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide. Journal of Periodontal Research. 36 (1), 1-8 (2001).
- Graves, D. T., Kang, J., Andriankaja, O., Wada, K., Rossa, C. Animal models to study host-bacteria interactions involved in periodontitis. Bone. 23 (1), 1-7 (2008).
- Struillou, X., Boutigny, H., Soueidan, A., Layrolle, P. Experimental animal models in periodontology: a review. The Open Dentistry Journal. 4 (1), 37-47 (2010).
- Mustafa, H., et al. Induction of periodontal disease via retentive ligature, lipopolysaccharide injection, and their combination in a rat model. Polish Journal of Veterinary Sciences. 24 (3), 365-373 (2021).
- Chadwick, J. W., Glogauer, M. Robust ligature-induced model of murine periodontitis for the evaluation of oral neutrophils. Journal of Visualized Experiments. 2020 (155), 6-13 (2019).
- Cheng, R., Wu, Z., Li, M., Shao, M., Hu, T. Interleukin-1β is a potential therapeutic target for periodontitis: a narrative review. International Journal of Oral Science. 12 (1), 1-9 (2020).
- Abe, T., Hajishengallis, G. Optimization of the ligature-induced periodontitis model in mice. Journal of Immunological Methods. 394 (1-2), 49-54 (2013).
- Jeong-Hyon, K., Bon-Hyuk, G., Sang-Soo, N., Yeon-Cheol, P. A review of rat models of periodontitis treated with natural extracts. Journal of Traditional Chinese Medical Sciences. 7 (2), 95-103 (2020).
- Marchesan, J., et al. An experimental murine model to study periodontitis. Nature Protocols. 13 (10), 2247-2267 (2018).
- Lin, P., et al. Application of ligature-induced periodontitis in mice to explore the molecular mechanism of periodontal disease. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 8900 (2021).
- Irie, M. S., et al. Use of micro-computed tomography for bone evaluation in dentistry. Brazilian Dental Journal. 29 (3), 227-238 (2018).
- Haas, L. F., Zimmermann, G. S., De Luca Canto, G., Flores-Mir, C., Corrêa, M. Precision of cone beam CT to assess periodontal bone defects: a systematic review and meta-analysis. Dentomaxillofacial Radiology. 47 (2), 20170084 (2018).
- Kamburoğlu, K., Ereş, G., Akgün, C. Qualitative and quantitative assessment of alveolar bone destruction in adult rats using CBCT. Journal of Veterinary Dentistry. 36 (4), 245-250 (2019).
- Sousa Melo, S. L., Rovaris, K., Javaheri, A. M., de Rezen de Barbosa, G. L. Cone-beam computed tomography (CBCT) imaging for the assessment of periodontal disease. Current Oral Health Reports. 7 (4), 376-380 (2020).
