Summary
Dans cette étude, un modèle de rat d’induction de la parodontite est présenté via une combinaison de ligature rétentive et d’injections répétitives de lipopolysaccharide dérivé de Porphyromonas gingivalis, sur 14 jours autour des premières molaires maxillaires. Les techniques de ligature et d’injection de LPS se sont avérées efficaces pour induire une péridontitis, entraînant une perte osseuse alvéolaire et une inflammation.
Abstract
La parodontite (MP) est une maladie immuno-inflammatoire chronique très répandue du parodonte, qui entraîne une perte des tissus mous gingivaux, du ligament parodontal, du cément et de l’os alvéolaire. Dans cette étude, une méthode simple d’induction de la MP chez le rat est décrite. Nous fournissons des instructions détaillées pour le placement du modèle de ligature autour des premières molaires maxillaires (M1) et une combinaison d’injections de lipopolysaccharide (LPS), dérivées de Porphyromonas gingivalis à la face mésio-palatine du M1. L’induction de la parodontite a été maintenue pendant 14 jours, favorisant l’accumulation de biofilm bactérien et l’inflammation. Pour valider le modèle animal, l’IL-1β, un médiateur inflammatoire clé, a été déterminée par un dosage immunologique dans le liquide gingival creviculaire (GCF), et la perte osseuse alvéolaire a été calculée à l’aide de la tomodensitométrie à faisceau conique (CBCT). Cette technique s’est avérée efficace pour favoriser la récession gingivale, la perte osseuse alvéolaire et une augmentation des niveaux d’IL-1β dans le FCGC à la fin de la procédure expérimentale après 14 jours. Cette méthode s’est avérée efficace pour induire la MP, pouvant ainsi être utilisée dans des études sur les mécanismes de progression de la maladie et les futurs traitements possibles.
Introduction
La parodontite (MP) est le sixième problème de santé publique le plus répandu dans le monde, touchant environ 11% de la population totale, étant une forme avancée, irréversible et destructrice de maladie parodontale 1,2. La MP est un processus inflammatoire qui affecte les tissus gingivaux et parodontaux, ce qui entraîne une récession gingivale, une migration apicale de l’épithélium jonctionnel avec le développement de la poche et la perte de l’os alvéolaire3. De plus, la MP est associée à plusieurs maladies systémiques, notamment les maladies cardiovasculaires, l’obésité, le diabète et la polyarthrite rhumatoïde, pour lesquelles des facteurs environnementaux et spécifiques à l’hôte jouent un rôle important 4,5.
Par conséquent, la MP est une maladie multifactorielle principalement initiée par l’accumulation de plaque microbienne - résultant de la dysbiose des communautés microbiennes - et par une réponse immunitaire exagérée de l’hôte aux agents pathogènes parodontaux, ce qui conduit à la dégradation du tissu parodontal 4,6. Parmi plusieurs bactéries parodontales, la bactérie anaérobie à Gram négatif Porphyromonas gingivalis est l’un des principaux agents pathogènes de4. P. gingivalis contient un lipopolysaccharide complexe (LPS) dans ses parois, une molécule connue pour induire l’infiltration de leucocytes polymorphonucléaires et la dilatation vasculaire dans les tissus parodontaux enflammés7. Il en résulte la production de médiateurs inflammatoires, tels que l’interleukine 1 (IL-1), l’IL-6 et l’IL-8, le facteur de nécrose tumorale (TNF) ou les prostaglandines, avec une activation ultérieure des ostéoclastes et une résorption osseuse, entraînant la destruction des tissus et la perte ultimedes dents 3.
Parmi les différents avantages des modèles animaux, citons la capacité d’imiter les complexités cellulaires comme chez l’homme, ou d’être plus précis que les études in vitro , qui sont réalisées sur des surfaces plastiques avec des types cellulaires limités8. Pour modéliser expérimentalement la MP in vivo, différentes espèces animales ont été utilisées, comme les primates non humains, les chiens, les porcs, les furets, les lapins, les souris et les rats9. Cependant, les rats sont le modèle animal le plus étudié pour la pathogenèse de la MP parce qu’ils sont peu coûteux et faciles à manipuler10. Leur tissu gingival dentaire a des caractéristiques structurelles similaires au tissu gingival humain, avec un sillon gingival peu profond et un épithélium jonctionnel attaché à la surface de la dent. De plus, comme chez l’homme, l’épithélium jonctionnel facilite le passage des matières bactériennes, étrangères et des exsudats des cellules inflammatoires 9.
L’un des modèles expérimentaux les plus rapportés d’induction de la MP chez le rat est le placement de ligatures autour des dents, ce qui est techniquement difficile mais fiable10. La mise en place de la ligature facilite l’accumulation de plaque dentaire et de bactéries, générant une dysbiose dans les sillons gingivaux, qui provoque une inflammation et une destruction du tissu parodontal11. La perte de l’attachement parodontal et la résorption de l’os alvéolaire pourraient survenir en 7 jours dans ce modèle8 de rat.
Un autre modèle animal pour la MP consiste en l’injection de LPS dans le tissu gingival. En conséquence, l’ostéoclastogenèse et la perte osseuse sont stimulées. Les caractéristiques histopathologiques de ce modèle sont similaires à la MP établie par l’homme, caractérisées par des niveaux plus élevés de cytokines pro-inflammatoires, de dégradation du collagène et de résorption osseuse alvéolaire 6,8.
Ainsi, le but de cette étude était de décrire un modèle simple de DP expérimentale chez le rat basé sur les techniques d’injections de P. gingivalis-LPS (Pg-LPS), combinées à la mise en place de ligatures autour des premières molaires maxillaires (M1). Il s’agit d’un modèle ayant des caractéristiques similaires à celles observées dans la maladie MP humaine, qui pourrait être utilisé dans l’étude des mécanismes de progression de la maladie et des futurs traitements possibles.
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Protocol
NOTE: Le protocole expérimental de l’étude a été approuvé par le Comité d’éthique de l’expérimentation animale de l’Institut de recherche en santé des îles Baléares (CEEA-UIB; numéro de référence 163/03/21).
1. Anesthésie animale et préparation de la procédure
- Stériliser tous les instruments chirurgicaux (bâillons buccaux en aluminium, explorateur dentaire, lance diamantée, ciseaux chirurgicaux, pinces microchirurgicales, porte-aiguilles, sculpteur hollenback, ascenseur microchirurgical périosté et ciseaux microchirurgicaux) (5 min à 135 °C) avant la chirurgie.
- Préparez toutes les solutions nécessaires à la procédure dans des conditions stériles, comme décrit:
- Préparer un mélange de kétamine (60 mg/mL) et de xylazine (8 mg/mL) en mélangeant 1,6 mL de kétamine avec 1 mL de xylazine diluée dans une solution tampon de phosphate (PBS)/solution saline. Conserver le bouillon à 4 °C.
- Diluer l’atipamézole à une concentration finale de 0,25 mg/mL dans du PBS/solution saline. Conserver le bouillon à 4 °C.
- Diluer la buprénorphine à une concentration finale de 0,03 mg/mL dans du PBS/solution saline. Conserver le bouillon à 4 °C.
- Préparer 1 mL de Pg-LPS (1 mg/mL) dans une solution saline stérile. Conserver le bouillon à -20 °C.
- Pour l’expérience, utilisez des rats Wistar femelles et mâles, âgés de 12 semaines et pesant entre 210 et 350 g au moment de la chirurgie. Gardez les animaux logés en groupes dans un environnement approprié et dans des conditions constantes (20-24 °C, 12 h par jour de cycles lumière-obscurité), avec de la nourriture et de l’eau standard, offertes ad libitum.
- Pour induire l’anesthésie, peser le rat et administrer le mélange de kétamine/xylazine à une concentration de 80/10 mg/kg par voie intrapéritonéale (IP), à l’aide d’une aiguille hypodermique stérile de 25 G et d’une seringue de 1 mL.
- Une fois le rat anesthésié, placez l’animal sur le dos sur une plate-forme chirurgicale chauffée; Pendant la procédure, couvrez le corps de l’animal pour éviter la perte de chaleur.
REMARQUE: La profondeur de l’anesthésie est évaluée par la perte du réflexe de pédale pendant la procédure et par la surveillance des signes vitaux. Si nécessaire, utilisez un petit cône nasal pour maintenir l’anesthésie avec 2% d’isoflurane dans 100% d’oxygène. Appliquez une pommade ophtalmique stérile sur les deux yeux après l’induction de l’anesthésie pour protéger les cornées et prévenir le dessèchement. - Pendant les procédures, administrer 100% d’oxygène à l’aide d’un petit cône nasal et surveiller le pouls et la saturation en oxygène par oxymétrie de pouls.
NOTE: Si la saturation en oxygène et le pouls tombent en dessous de 95% et 190 bpm, respectivement, arrêter la procédure et placer l’animal en position de décubitus latéral jusqu’à ce qu’il atteigne les valeurs normales. - Ouvrez la bouche du rat à l’aide d’un bâillon buccal en aluminium autour des incisives (supérieure et inférieure), en rétractant la langue avec elle et en stabilisant le maxillaire et la mandibule dans une position de travail ouverte et confortable, permettant l’accès aux molaires mandibulaires.
NOTE: Si l’animal doit être placé en décubitus latéral, retirez le bâillon buccal avant de changer de position pour favoriser la récupération. Une fois l’animal anesthésié, prélever le liquide creviculaire gingival (FCG) avant la chirurgie (échantillon dans des conditions basales) (jour 0). - Collectez GCF comme décrit par les étapes suivantes :
- Placez l’animal sur le dos sur une plate-forme chirurgicale et stabilisez le maxillaire et la mandibule en position ouverte avec des bâillons buccaux en aluminium.
- Recueillir le FCG en utilisant un total de quatre (deux pour chaque M1) papier absorbant point nº 30 (0,03 cm de diamètre x 3 cm de longueur), en l’insérant dans la crevasse gingivale (espace entre l’épithélium gingival et l’émail adjacent) autour du mésio-palatal du M1 jusqu’à légère résistance. Conserver la pointe papier dans la même position pendant 30 s au total avant de la retirer immédiatement.
- Après la collecte, transférer immédiatement la pointe de papier dans un flacon en plastique et conserver à -80 °C jusqu’à l’efficacité du dosage.
2. Technique de ligature rétentive et injection intragingivale de Pg-LPS
REMARQUE: Le modèle de ligature a été créé (jour 0) en plaçant une ligature de soie tressée stérile (5/0) autour du M1 bilatéralement dans le sillon gingival à l’aide d’instruments microchirurgicaux et en le fixant avec les nœuds du chirurgien sur la surface palatine. Les instruments microchirurgicaux utilisés étaient des pinces microchirurgicales, un porte-aiguille, un sculpteur hollenback, un ascenseur microchirurgical périosté et des ciseaux microchirurgicaux. Des télescopes chirurgicaux avec une source lumineuse LED ont également été utilisés (grossissement de 3,6x).
- Placez la queue distale de la suture sur la face palatine de la dentition et insérez le segment proximal entre le contact de M1 et de la deuxième molaire maxillaire (M2).
- Utilisez l’ascenseur microchirurgical périosté pour insérer la suture dans le sulcus. Enroulez la ligature autour de la surface buccale du M1 très soigneusement, car les tissus à ce niveau présentent une zone étroite de gencive attachée. Sur l’aspect palatin, assurez-vous que la suture est serrée aux deux extrémités pour s’assurer qu’elle est enfoncée dans le sillon gingival.
NOTE: Si une résistance est observée lors de l’insertion de la suture entre le M1 et le M2, le contact peut être légèrement ouvert à l’aide d’un explorateur dentaire et d’une fraise en forme de lance en diamant. - Attachez les extrémités de la suture avec un nœud de chirurgien et coupez les queues aussi courtes que possible. Insérez le nœud dans le sulcus.
REMARQUE: Les pointes des instruments chirurgicaux peuvent causer des traumatismes buccaux et des saignements. Préparez de petits segments de gaze ou un coton-tige pour enlever le sang de la cavité buccale et appliquez une pression pour arrêter toute hémorragie. Une gestion prudente des tissus mous avec une approche microchirurgicale minimise les complications chirurgicales et conduit à moins de traumatismes tissulaires. - Après le positionnement de la ligature, injecter 40 μL de Pg-LPS dans une solution saline stérile avec une aiguille hypodermique stérile de 25 G et une seringue de 1 mL au tissu sous-gingival (entre la racine ou le col d’une dent et la marge gingivale) du côté mésio-palatal du M1 bilatéralement (jour 0).
3. Fin de la procédure
- Après le positionnement de la ligature et l’application de Pg-LPS, libérez le rat de l’état chirurgical et placez-le dans une cage individuelle propre sous une lampe chauffante.
- Injecter l’antagoniste atipamezole (0,5 mg/kg par voie sous-cutanée (SC)) avec une aiguille hypodermique stérile de 25 G et une seringue de 1 mL.
- Pour soulager la douleur, injecter 0,03 mg / kg Buprénorphine, SC.
- Surveillez le rétablissement de l’animal jusqu’à ce que les effets de l’opération soient complètement inversés. Hébergez individuellement chaque rat dans l’environnement approprié dans des conditions constantes (20-24 °C, 12 h par jour de cycles lumière-obscurité). Offrez de la nourriture et de l’eau désionisée ad libitum.
- Au cours des 2 premiers jours après la procédure, pesez les animaux et injectez Buprénorphine SC deux fois par jour pour soulager la douleur.
REMARQUE: La buprénorphine peut être administrée avant le début de la procédure pour éliminer l’effet de liquidation. - Pendant la durée de l’expérience, surveillez les animaux en fonction du poids et de l’évaluation générale du comportement une ou deux fois par semaine.
4. Suivi post-procédure
NOTE: L’induction de la MP a été maintenue pendant 14 jours pour favoriser l’accumulation de biofilm bactérien et l’inflammation qui en résulte. Les ligatures doivent être examinées et ajustées, et Pg-LPS est injecté trois fois par semaine (jour 2, jour 4, jour 6, jour 8, jour 10 et jour 12).
- Examinez et ajustez la ligature (jour 2, jour 4, jour 6, jour 8, jour 10 et jour 12) comme suit :
- Anesthésier avec 2% d’isoflurane dans 100% d’oxygène à l’aide d’une chambre d’induction d’anesthésie.
- Une fois le rat anesthésié, placez l’animal sur le dos et utilisez un petit cône nasal pendant la procédure avec 1% d’isoflurane dans 100% d’oxygène pour le maintien de l’anesthésie de l’animal.
- Ouvrez la bouche du rat à l’aide du bâillon buccal en aluminium autour des incisives (supérieure et inférieure), en rétractant la langue avec elle et en stabilisant le maxillaire et la mandibule dans une position de travail ouverte et confortable, permettant l’accès aux ligatures.
- Serrez les ligatures contre la gencive à l’aide d’un ascenseur microchirurgical périosté et assurez-vous que la suture des ligatures est insérée, créant une inflammation autour de la gencive.
REMARQUE: Il est possible que 7-10 jours après la chirurgie, les ligatures soient perdues. Si cela se produit, suivez le protocole expliqué pour l’injection de Pg-LPS (étape 2.4).
- Après l’ajustement de la ligature, injecter bilatéralement 40 μL de Pg-LPS avec une aiguille hypodermique stérile de 25 G et une seringue de 1 mL au tissu sous-gingival du côté mésio-palatal du M1 (jour 2, jour 4, jour 6, jour 8, jour 10 et jour 12).
- Retirez le cône nasal pour l’anesthésie et placez le rat dans sa cage. Surveillez le rétablissement de l’animal jusqu’à ce que les effets de l’anesthésie soient complètement inversés.
5. Sacrifice et analyse d’animaux
REMARQUE : Il existe différentes options pour évaluer la progression de la MP. Ici, l’analyse décrite consiste en une évaluation des cytokines pro-inflammatoires au niveau du liquide gingival créviculaire (FCGC) et une évaluation de la perte d’os alvéolaire.
- Le jour 14 de l’étude (jour 14), sacrifiez les animaux avec du CO2 dans une chambre de dioxyde de carbone. Un taux de déplacement de 30 % à 70 % du volume de la chambre/min est recommandé pour les rongeurs.
REMARQUE : L’absence de réponse animale au réflexe de pédale et l’absence de signes vitaux doivent être vérifiées pour confirmer l’euthanasie. - Collectez GCF comme décrit par les étapes suivantes :
REMARQUE : Le FCG est prélevé avant l’induction de la MP (avant la chirurgie) (jour 0) et après l’induction de la MP (après le sacrifice) (jour 14).- Placez l’animal sur le dos sur une plate-forme chirurgicale et stabilisez le maxillaire et la mandibule en position ouverte avec des bâillons buccaux en aluminium.
- Recueillir le FCC à l’aide du point de papier adsorbant nº 30 (0,03 cm de diamètre x 3 cm de longueur) en l’insérant dans la crevasse gingivale autour du mésio-palatal du M1 jusqu’à légère résistance. Conserver la pointe papier dans la même position pendant 30 s au total avant de la retirer immédiatement.
- Après le prélèvement, transférer immédiatement la pointe de papier dans un flacon en plastique et conserver à -80 °C jusqu’à l’efficacité du dosage.
- Pour évaluer les protéines dans le GCF, préparez les solutions suivantes et suivez les étapes de la méthode d’élution comme décrit:
NOTE: IL-1β est évalué sur le GCF (jour 14) à l’aide d’un immunoessai, selon le protocole du fabricant.- Préparez le tampon d’élution frais et gardez-le sur la glace tout au long du processus d’extraction pour inhiber l’activité de la protéase.
- Préparer toutes les solutions nécessaires pour le tampon d’élution comme décrit:
- Préparer 1 mL d’aprotinine (1 mg/mL) dans de l’eau ultrapure.
- Préparer 10 mL de fluorure de phénylméthylsulfonyl (PMSF) (200 mM) dans du méthanol.
- Ajouter 125 μL de PMSF et 250 μL d’aprotinine à 24,5 mL de solution de PBS (pH = 7,4) pour préparer le tampon d’élution.
- Dissoudre un comprimé commercial d’inhibiteur de phosphatase avec 10 mL de tampon d’élution fraîchement préparé pendant 10 min sous agitation à 4 °C.
NOTA: La durée de l’élution du FVC est limitée; Utiliser immédiatement pour les centrifugations après l’ajout d’un comprimé inhibiteur de phosphatase dans les 30 premières minutes. - Après avoir ajouté l’inhibiteur de phosphatase, ajouter 11 μL de tampon d’élution complet directement sur le tube avec les points de papier.
- Centrifuger le tube à 452 x g pendant 5 min à 4 °C.
- Transférer le contenu élué dans un nouveau flacon en plastique. Répétez ce processus quatre fois de plus pour obtenir un volume total de 50 μL.
- Après la dernière centrifugation, ajouter un volume total de 60 μL directement sur la pointe papier et centrifuger une dernière fois à 452 x g pendant 5 min à 4 °C.
- Utilisez le volume requis élué pour l’évaluation des protéines.
- Après l’euthanasie et la collecte du GCF, à l’aide de ciseaux chirurgicaux, découpez la mâchoire supérieure des rats. Essayez de décoller le masque du rat et de laisser le moins de tissus mous possible.
- Placez la mâchoire dans l’étage du microscope pour la visualisation et prenez une photo au grossissement souhaité.
- Placer la mâchoire directement dans du paraformaldéhyde (PFA) à 4% dilué dans du PBS. Rafraîchir deux fois par semaine avec du nouveau PFA pendant 12 jours pour une fixation complète.
ATTENTION : Les étapes impliquant le PFA doivent être effectuées dans une hotte en suivant les recommandations de la fiche de données de sécurité. - Après une fixation complète de la mâchoire, évaluer la perte osseuse à l’aide d’un tomodensitomètre à faisceau conique (CBCT), comme suit:
- Ouvrez le PC.
- Ouvrez le programme d’analyse CBCT.
- Sélectionnez Protocole d’analyse > Mode d’analyse des prothèses dentaires.
- Sélectionnez le champ de vision (FOV) > ( 11x8) HIRes ( 90 kV de tension et 3 mA de courant).
- Placez le maxillaire supérieur fixe des rats dans le portique.
- Cliquez sur Suivant.
- Cliquez sur le bouton de déclenchement des rayons X (appuyez sur la télécommande à rayons X pour effectuer l’émission et maintenez-la enfoncée pendant toute la durée de l’analyse).
- Si nécessaire, déplacez le maxillaire supérieur au centre du plan frontal en appuyant sur le bouton de commande, puis cliquez sur le bouton de tir à rayons X (appuyez sur la télécommande à rayons X pour effectuer l’émission et maintenez-la enfoncée pendant toute la durée de l’analyse).
- Cliquez sur Suivant.
- Cliquez sur le bouton de déclenchement des rayons X (appuyez sur la télécommande à rayons X pour effectuer l’émission et maintenez-la enfoncée pendant toute la durée de l’analyse).
- Si nécessaire, déplacez la prothèse au centre du plan sagittal en appuyant sur le bouton de commande, puis cliquez sur le bouton de déclenchement des rayons X (appuyez sur la télécommande à rayons X pour effectuer l’émission et maintenez-la enfoncée pendant toute la durée de l’analyse).
- Cliquez sur Suivant.
- Cliquez sur le bouton Démarrer (appuyez sur la télécommande à rayons X pour effectuer l’émission et maintenez-la enfoncée pendant toute la durée de l’examen). Attendez de recevoir un message de traitement, puis suivez les instructions affichées.
- Une vue de fenêtre s’affiche. Réglez le gris à 65% et cliquez sur Appliquer.
- Pour enregistrer l’analyse, cliquez sur Fichier et enregistrez-le au format DICOM. Ensuite, cliquez sur Toutes les images et dans la fenêtre de sélection de l’exportation DICOM, sélectionnez tous les paramètres affichés (image initiale, axiale d’origine, axiale reformatée, multiplanaire) et sélectionnez le type prédéfini.
- Traiter les images représentatives bidimensionnelles et sagittales des molaires maxillaires à l’aide d’un programme d’analyse, comme suit :
- Ouvrez le logiciel.
- Cliquez sur Fichier et ouvrir, puis sélectionnez le dossier contenant les images au format DICOM et cliquez sur Ouvrir.
- Attendez que la fenêtre « Convertir en 8 bits » apparaisse, sélectionnez la plage de 0 à 6 000, puis cliquez sur OK.
- Cliquez sur Images brutes.
- Définissez le haut et le bas de la sélection pour limiter la région d’intérêt. Recherchez la première et la dernière image où l’os alvéolaire apparaît et sélectionnez-le avec le haut de la sélection et le bas des commandes de sélection.
REMARQUE : Des images bidimensionnelles représentatives de l’os alvéolaire des molaires pourraient être exportées, comme le montre la figure 3A, B. - Pour les images représentatives sagittales, cliquez sur Basculer la barre de profil.
- Tracez une ligne sagittale au milieu du palais et cliquez sur Reslice model. Déterminez les paramètres de délimitation de la région d’intérêt (espacement des tranches : 1 ; nombre de tranches : 100) et cliquez sur OK. Attendez la fin du modèle de retranchement. Enfin, cliquez sur Enregistrer les images découpées.
NOTE: Des images sagittales représentatives de l’os alvéolaire des molaires pourraient être exportées, comme dans la figure 3C,D.
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Representative Results
Une chronologie des étapes expérimentales est présentée à la figure 1. La figure 2A montre une image de la mandibule après intervention chirurgicale, avec le placement de la ligature autour du sillon du M1 au temps 0 de l’expérience. La figure 2B montre comment, après 14 jours d’intervention, la ligature autour du M1 pénètre dans le sillon gingival, provoquant une inflammation de la gencive et une accumulation d’infiltration.
Figure 1 : Représentation schématique de la chronologie de la procédure expérimentale d’induction de la parodontite (MP) chez le rat. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Des images bidimensionnelles représentatives (Figure 3; carré rouge) montrent des différences de perte osseuse alvéolaire dans le mandibule entre le témoin basal, montrant plus de volume osseux (Figure 3A), et après l’établissement de la MP, montrant une perte osseuse alvéolaire plus élevée (Figure 3B). De plus, l’analyse des images sagittales met en évidence la plus grande perte osseuse alvéolaire dans la zone osseuse interradiculaire de M1 (Figure 3D; flèche rouge) et M2 (Figure 3D; flèche verte) après l’établissement de la MP, par rapport au groupe témoin basal (Figure 3C). De plus, la résorption osseuse alvéolaire a été caractérisée par une augmentation de l’espace entre la jonction de l’émail du ciment (CEJ) et la crête osseuse alvéolaire (ABC). La distance entre le CEJ et ABC dans les deux groupes de rats est représentée à la figure 3C,D avec des flèches bleues. La DP établie a développé de grands espaces entre le CEJ et l’ABC (Figure 3D), par rapport au témoin basal (Figure 3C).
Au moment du sacrifice, les images du palais présentaient des différences de récession gingivale dans le M1 dans les différents groupes (figures 4A, B). Le groupe MP (figure 4B) montre une plus grande migration gingivale apicale en raison de la perte de soutien osseux et de l’exposition des racines, par rapport au groupe témoin basal (figure 4A). De plus, le groupe MP (figure 4B) présentait une plus grande inflammation de la gencive autour des molaires maxillaires, comparativement au groupe témoin basal (figure 4A). La figure 4C montre les résultats de l’analyse de la cytokine pro-inflammatoire IL-1β du GCF, montrant une libération significativement plus élevée d’IL-1β dans le groupe par rapport au groupe témoin. Selon la littérature, l’IL-1β participe à l’inflammation, à la régulation immunitaire et à la résorption osseuse dans la parodontite, et est un puissant stimulateur de la destruction des tissus parodontaux12.
Figure 2 : Images de la ligature insérée dans le sillon du M1 à différents moments. (A) Palais de rat avec mise en place de la ligature autour du M1, 0 jours après l’insertion de la ligature. (B) Palais du rat avec mise en place de la ligature autour du M1, 14 jours après l’insertion de la ligature. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Images bidimensionnelles représentatives de l’os alvéolaire et des molaires maxillaires. Photos bidimensionnelles représentatives obtenues par CBCT de l’os alvéolaire des molaires maxillaires (carré rouge) de (A) le témoin basal, et (B) la parodontite établie () pendant 14 jours avec insertion de ligature et injection de Pg-LPS. Vues bidimensionnelles sagittales représentatives des molaires maxillaires de (C) le contrôle basal et (D) le. Les flèches rouges indiquent la zone osseuse alvéolaire interradiculaire du M1, les flèches bleues indiquent la distance entre le CEJ et ABC, et les flèches vertes indiquent la zone osseuse alvéolaire interradiculaire du M2. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Images représentatives du palais. Images représentatives du palais après sacrifice du groupe témoin (A) basal et (B) du groupe parodontite (), traitées pendant 14 jours avec insertion de ligature et injection de Pg-LPS. (C) Détermination des concentrations d’IL-1β dans le FCGC du groupe témoin basal et du groupe (n = 9). Les données représentent la moyenne ± SEM. Les résultats ont été comparés statistiquement par Kruskal-Wallis: * p < 0,05 groupe versus groupe témoin basal. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Cette méthode décrit l’induction de la MP chez le rat à la suite d’une technique combinée d’injections de Pg-LPS et de placement de ligatures autour du M1, révélant que des changements significatifs dans les tissus parodontaux et l’os alvéolaire pourraient être induits dans les 14 jours suivant cette méthode.
Au cours de cette procédure, une attention particulière doit être accordée aux différentes étapes critiques. Pendant l’anesthésie animale et la préparation de la procédure, l’évaluation de l’anesthésie appropriée pendant le processus chirurgical est essentielle à son succès, tout comme le positionnement correct de l’animal, la stabilisation de la bouche ouverte du rat avec le bâillon buccal en aluminium autour des incisives et éviter que les animaux ne soient blessés avec le bâillon et les instruments chirurgicaux. Si la saturation en oxygène et le pouls diminuent, la procédure doit être arrêtée et l’animal placé en position de décubitus latéral jusqu’à ce qu’il atteigne les valeurs normales. Pendant la position de la ligature, il est essentiel que la suture et le nœud soient insérés correctement dans le sillon, étant donné que les lésions des tissus mous doivent être minimisées pour prévenir la douleur et l’inflammation dans d’autres zones. Compte tenu des questions éthiques concernant le bien-être des animaux, il est essentiel de surveiller la récupération de l’animal jusqu’à ce que les effets de l’anesthésie soient complètement inversés. Des analgésiques pendant les 2 premiers jours suivant l’intervention sont indispensables. La surveillance du poids et du comportement des animaux est également importante pour évaluer dans quelle mesure le rat tolère la procédure et s’assurer qu’il ne présente pas de détresse extrême. Pendant le protocole post-procédure d’injection de Pg-LPS et d’ajustement de la ligature au tissu sous-gingival autour du M1, il est tout d’abord important de resserrer et de déplacer la ligature en position apicale pour créer l’inflammation. Deuxièmement, il est important d’injecter bilatéralement le Pg-LPS avec soin, pour ne pas causer de traumatisme buccal. En outre, des précautions doivent être prises lors de l’anesthésie de l’animal, et il doit être surveillé jusqu’à la récupération. Pendant la collecte du FCG, le papier calibré doit être maintenu à la même position pendant la même durée totale et il est important de l’insérer dans la même crevasse gingivale autour du M1 mésio-palatin. Pendant les étapes d’élution du FMC, il est important d’utiliser le tampon d’élution immédiatement après l’ajout du comprimé commercial inhibiteur de phosphatase. Une dernière étape critique du protocole est pendant les analyses CBCT; Un alignement correct des échantillons et du protocole d’analyse est essentiel pour obtenir des résultats interprétables.
La variation de l’exposition spécifique de chaque animal à l’injection de Pg-LPS et la ligature rétentive autour du M1 pourraient être incluses comme raisons de ne pas obtenir l’inflammation correcte et la résorption osseuse qui en résulte. Bien que de bons résultats soient obtenus dans l’induction de la MP en utilisant cette procédure, il est important de réduire étroitement la variation entre les animaux en suivant attentivement le protocole. L’une des modifications les plus significatives de la méthode est le placement de la ligature rétentive autour du M1, et non autour du M2, le modèle de ligature le plus traditionnel dans la littérature13,14,15. La procédure opératoire pour la mise en place de la ligature chez la souris ou le rat présente une difficulté technique et représente un défi potentiel pour de nombreux chercheurs en raison de la petite taille de la cavité buccale murine et des dents11,16. L’utilisation de rats et le placement de la ligature autour du M1 ont facilité la manipulation et l’accès à la zone, ce qui a également réduit le stress de l’animal pendant la procédure. Aucune souffrance animale n’a été observée pendant le protocole, mais si un rat montre des signes de détresse, envisagez de le retirer de l’expérience pour éviter la souffrance. Enfin, l’étape la plus limitante de la procédure est d’éviter la perte de la ligature, qui pourrait survenir 7 à 10 jours après la chirurgie. Pour augmenter et maintenir l’intensité de la maladie avec le temps, il est important d’ajuster les ligatures pour maintenir un contact intime avec les tissus gingivaux, en atténuant la variabilité des intensités sur l’induction de la parodontite entre les animaux15. En général, si la procédure est effectuée correctement, aucune modification ne devrait être nécessaire et des résultats cohérents seront obtenus.
Il est important de noter que ce modèle présente plusieurs limites. Tout d’abord, une technique a été développée pour l’étude de la MP causée par une lésion traumatique (position de ligature), qui faciliterait l’accumulation locale de bactéries et améliorerait ainsi l’inflammation médiée par les bactéries et la perte osseuse13,10, avec la combinaison de l’injection de Pg-LPS. Mais, en fait, la méthode n’imite pas les facteurs étiologiques naturels responsables de la dysbiose du microbiote dans la parodontite humaine et n’imite pas plusieurs autres mécanismes possibles par lesquels la parodontite peut survenir. De plus, les structures dentaires murines ne sont pas identiques à celles de l’homme15. De plus, bien que la méthode présentée soit efficace pour étudier la MP aiguë, elle peut ne pas refléter les caractéristiques de perte osseuse et d’infiltration inflammatoire à long terme dans la MP16 chronique. En détail avec la méthodologie proposée pour l’évaluation de la perte osseuse alvéolaire, la méthode la plus couramment utilisée d’évaluation multidimensionnelle de l’os est la micro-CT, qui permet l’évaluation des facteurs externes et fournit des images tridimensionnelles de l’os. De plus, les paramètres osseux trabéculaires, le volume osseux et la densité minérale osseuse peuvent être analysés sans casser les os14,17. Cependant, l’utilisation de CBCT pour l’évaluation de la perte osseuse alvéolaire a été proposée ici (figure 3) comme alternative à la micro-TDM; Bien que des images à plus faible résolution soient obtenues, il fournit également une analyse qualitative et quantitative utile de la progression de la parodontite18,19,20. Ainsi, les examens CBCT fournissent une méthode précise d’imagerie, plus disponible et accessible que la micro-TDM, ce qui faciliterait les études sur l’induction de la parodontite chez le rat.
Parmi les divers modèles animaux qui ont été utilisés pour imiter la MP in vivo16 afin d’évaluer les tissus de soutien dentaire (gencive et os) dans des conditions bien contrôlées, le modèle de MP induite par ligature a été largement utilisé chez les rats, les chiens et les primates non humains13. La littérature indique également que, bien qu’elle soit utilisée dans certains protocoles, l’utilisation de souris – qui représente un modèle pratique, peu coûteux et polyvalent – entraîne un défi plus technique en raison de la taille relativement petite de la cavité buccale de la souris par rapport aux rats13. Comparativement à d’autres modèles, le modèle de rat induit par ligature offre plusieurs avantages, dont l’induction rapide de la maladie, qui peut commencer à un moment prévisible et aboutir à une perte osseuse alvéolaire en quelques jours (souris et rats)13. Cette méthode présente d’autres avantages, tels que la possibilité d’étudier le tissu parodontal et la régénération osseuse alvéolaire, ainsi que la capacité de localiser et de disséquer le tissu gingival enflammé afin d’évaluer le niveau d’inflammation15. La méthode consistant à combiner le modèle de MP induite par la ligature avec l’injection de LPS ajoute une réponse inflammatoire destructrice locale dans le parodonte qui améliore la perte d’attachement du tissu conjonctif et la résorption osseuse alvéolaire générée par la ligature. Cet effet additif est conseillé d’augmenter avec la concentration et la fréquence des injections de LPS10. La méthode rapportée ici présente un protocole optimisé d’une combinaison de ligature avec injection de Pg-LPS, avec les avantages et la signification des deux méthodes.
L’optimisation et le développement de modèles in vivo sûrs et économiques de la MP sont essentiels pour faciliter la compréhension de la pathogenèse de la maladie parodontale et tester de nouvelles approches thérapeutiques. Le modèle de la technique combinée d’injections de Pg-LPS et de placement de ligature autour du M1 présenté ici est évalué comme un modèle d’étude attrayant, pour étudier les interactions hôte-microbe, l’inflammation dans la parodontite et la résorption osseuse alvéolaire. Ce modèle identifie les ensembles les plus critiques du protocole, les décrit en détail technique basé sur l’image, et normalise et optimise l’utilisation de ces techniques combinées. L’utilisation de techniques supplémentaires pour l’évaluation de la progression de la parodontite pourrait être possible, y compris des analyses histologiques de l’os alvéolaire et de la gencive attachée environnante, la détermination d’autres cytokines impliquées dans l’inflammation et la caractérisation du microbiote oral. Bien que le modèle ne puisse pas refléter tous les aspects des mécanismes ou des causes de la MP chez l’homme, cette étude révèle que des changements dégénératifs et inflammatoires importants dans les tissus parodontaux et l’os alvéolaire pourraient être induits 14 jours après l’intervention, fournissant la base de futures études précliniques préventives ou de traitement de la maladie parodontale.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la Fundació Universitat-Empresa de les Illes Balears (appel de preuve de concept 2020), par l’Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competividad, cofinancé par le FSE Fonds social européen et le Fonds européen de développement régional FEDER (contrat avec M.M.B; FI18/00104) et par la Direcció General d’Investigació, Conselleria d’Investigació, Govern Balear (contrat avec M.M.F.C; FPI/040/2020). Les auteurs remercient le Dr Anna Tomás et Maria Tortosa pour leur aide à la chirurgie expérimentale et à la plateforme d’IdISBa. Enfin, merci à l’École de médecine dentaire ADEMA pour l’accès au scanner CBCT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adsorbent paper point nº30 | Proclinc | 8187 | |
| Aprotinin | Sigma-Aldrich | A1153 | |
| Atipamezole | Dechra | 573751.5 | Revanzol 5 mg/mL |
| Braided silk ligature (5/0) | Laboratorio Arago Sl | 613112 | |
| Buprenorphine | Richter pharma | 578816.6 | Bupaq 0.3 mg/mL |
| Cone-beam computed tomography (CBCT) Scanner | MyRay | hyperion X9 | Model Hyperion X9 |
| CTAn software | SkyScan | Version 1.13.4.0 | |
| Dental explorer | Proclinc | 99743 | |
| Diamond lance-shaped bur | Dentaltix | IT21517 | |
| Food maintenance diet | Sodispain research | ROD14 | |
| Heated surgical platform | PetSavers | ||
| Hollenback carver | Hu-FRIEDY | HF45234 | |
| Hypodermic needle | BD | 300600 | 25G X 5/8” - 0,5 X 16 MM |
| Isoflurane | Karizoo | Isoflutek 1000mg/g | |
| Ketamine | Dechra | 581140.6 | Anesketin 100 mg/mL |
| Lipopolysaccharide derived from P.Gingivalis | InvivoGen | TLRL-PGLPS | |
| Methanol | Fisher Scientific | M/4000/PB08 | |
| Micro needle holter | Fehling Surgical Instruments | KOT-6 | |
| Microsurgical pliers | KLS Martin | 12-384-06-07 | |
| microsurgical scissors | S&T microsurgical instruments | SDC-15 RV | |
| Monitor iMEC 8 Vet | Mindray | ||
| Multiplex bead immunoassay | Procartaplex, Thermo fisher Scientific | PPX-05 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 8187151000 | |
| Periosteal microsurgical elevator | Dentaltix | CU19112468 | |
| Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) | Roche | 10837091001 | |
| Phosphate Buffer Solution (PBS) | Capricorn Scientific | PBS-1A | |
| PhosSTOP | Roche | 4906845001 | Commercial phosphatase inhibitor tablet |
| Plastic vial | SPL Lifesciencies | 60015 | 1.5mL |
| Saline | Cinfa | 204024.3 | |
| Stereo Microscope | Zeiss | Model SteREO Discovery.V12 | |
| Surgical loupes led light | Zeiss | ||
| Surgical scissors | Zepf Surgical | 08-1701-17 | |
| Syringe | BD plastipak | 303172 | 1mL |
| Veterinary dental micromotor | Eickemeyer | 174028 | |
| Xylazine | Calier | 20102-003 | Xilagesic 20 mg/mL |
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