Summary
In questo studio, un modello di ratto di induzione della parodontite è presentato attraverso una combinazione di legatura ritentiva e iniezioni ripetitive di lipopolisaccaride derivato da Porphyromonas gingivalis, per 14 giorni intorno ai primi molari mascellari. Le tecniche di legatura e iniezione di LPS sono state efficaci nell'indurre la peridontite, con conseguente perdita ossea alveolare e infiammazione.
Abstract
La parodontite (PD) è una malattia immuno-infiammatoria cronica altamente prevalente del parodonto, che provoca una perdita dei tessuti molli gengivali, del legamento parodontale, del cemento e dell'osso alveolare. In questo studio, viene descritto un semplice metodo di induzione del PD nei ratti. Forniamo istruzioni dettagliate per il posizionamento del modello di legatura attorno ai primi molari mascellari (M1) e una combinazione di iniezioni di lipopolisaccaride (LPS), derivato da Porphyromonas gingivalis sul lato mesio-palatale della M1. L'induzione della parodontite è stata mantenuta per 14 giorni, promuovendo l'accumulo di biofilm batterico e l'infiammazione. Per convalidare il modello animale, IL-1β, un mediatore infiammatorio chiave, è stato determinato mediante un saggio immunologico nel liquido crevicolare gengivale (GCF) e la perdita ossea alveolare è stata calcolata utilizzando la tomografia computerizzata a fascio conico (CBCT). Questa tecnica è stata efficace nel promuovere la recessione gengivale, la perdita ossea alveolare e un aumento dei livelli di IL-1β nel GCF alla fine della procedura sperimentale dopo 14 giorni. Questo metodo è stato efficace nell'indurre la malattia di Parkinson, potendo così essere utilizzato in studi sui meccanismi di progressione della malattia e sui futuri possibili trattamenti.
Introduction
La parodontite (PD) è la sesta condizione di salute pubblica più diffusa in tutto il mondo, che colpisce circa l'11% della popolazione totale, essendo una forma avanzata, irreversibile e distruttiva di malattia parodontale 1,2. Il PD è un processo infiammatorio che colpisce i tessuti gengivali e parodontali, che provoca la recessione gengivale, la migrazione apicale dell'epitelio giunzionale con sviluppo della tasca e la perdita dell'osso alveolare3. Inoltre, la malattia di Parkinson è associata a diverse malattie sistemiche, tra cui malattie cardiovascolari, obesità, diabete e artrite reumatoide, per le quali i fattori ambientali e specifici dell'ospite svolgono un ruolo significativo 4,5.
Quindi, la malattia di Parkinson è una malattia multifattoriale iniziata principalmente dall'accumulo di placca microbica - derivante dalla disbiosi delle comunità microbiche - e da una risposta immunitaria esagerata dell'ospite ai patogeni parodontali, che porta alla rottura del tessuto parodontale 4,6. Tra i diversi batteri parodontali, il batterio anaerobico gram-negativo Porphyromonas gingivalis è uno dei patogeni chiave nel PD4. P. gingivalis contiene un complesso lipopolisaccaride (LPS) nelle sue pareti, una molecola nota per indurre infiltrazione leucocitaria polimorfonucleata e dilatazione vascolare nei tessuti parodontali infiammati7. Ciò si traduce nella produzione di mediatori infiammatori, come l'interleuchina 1 (IL-1), IL-6 e IL-8, fattore di necrosi tumorale (TNF) o prostaglandine, con una successiva attivazione degli osteoclasti e riassorbimento osseo, che porta alla distruzione dei tessuti e alla perdita finale dei denti3.
Tra i diversi vantaggi dei modelli animali c'è la capacità di imitare le complessità cellulari come negli esseri umani, o di essere più accurati rispetto agli studi in vitro , che vengono effettuati su superfici plastiche con tipi cellulari limitati8. Per modellare sperimentalmente il PD in vivo, sono state utilizzate diverse specie animali, come primati non umani, cani, maiali, furetti, conigli, topi e ratti9. Tuttavia, i ratti sono il modello animale più ampiamente studiato per la patogenesi del PD perché sono economici e facili da maneggiare10. Il loro tessuto gengivale dentale ha caratteristiche strutturali simili al tessuto gengivale umano, con un solco gengivale poco profondo e un epitelio giunzionale attaccato alla superficie del dente. Inoltre, come nell'uomo, l'epitelio giunzionale facilita il passaggio di batteri, materiali estranei ed essudati dalle cellule infiammatorie 9.
Uno dei modelli sperimentali più riportati di induzione del PD nei ratti è il posizionamento delle legature intorno ai denti, che è tecnicamente impegnativo ma affidabile10. Il posizionamento della legatura facilita la placca dentale e l'accumulo batterico, generando una disbiosi nei solchi gengivali, che causa infiammazione e distruzione del tessuto parodontale11. La perdita dell'attaccamento parodontale e il riassorbimento dell'osso alveolare potrebbero verificarsi in 7 giorni in questo ratto modello8.
Un altro modello animale per il PD consiste nell'iniezione di LPS nel tessuto gengivale. Di conseguenza, vengono stimolati l'osteoclastogenesi e la perdita ossea. Le caratteristiche istopatologiche di questo modello sono simili alla PD stabilita dall'uomo, caratterizzata da livelli più elevati di citochine proinfiammatorie, degradazione del collagene e riassorbimento osseo alveolare 6,8.
Pertanto, lo scopo di questo studio è stato quello di descrivere un semplice modello di ratto di PD sperimentale basato sulle tecniche di iniezioni di P. gingivalis-LPS (Pg-LPS), combinato con il posizionamento della legatura attorno ai primi molari mascellari (M1). Si tratta di un modello con caratteristiche simili a quelle osservate nella malattia PD umana, che potrebbe essere utilizzato nello studio dei meccanismi di progressione della malattia e dei futuri possibili trattamenti.
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Protocol
NOTA: Il protocollo sperimentale dello studio è stato approvato dal Comitato Etico di Sperimentazione Animale dell'Istituto di Ricerca Sanitaria delle Isole Baleari (CEEA-UIB; numero di riferimento 163/03/21).
1. Anestesia animale e preparazione della procedura
- Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici (bavagli in alluminio, esploratore dentale, lancia diamantata, forbici chirurgiche, pinze microchirurgiche, un micro portaaghi, un intagliatore hollenback, un elevatore microchirurgico periostale e forbici microchirurgiche) (5 min a 135 °C) prima dell'intervento.
- Preparare tutte le soluzioni necessarie per la procedura in condizioni sterili, come descritto:
- Preparare una miscela di ketamina (60 mg/ml) e xilazina (8 mg/ml) mescolando 1,6 mL di ketamina con 1 mL di xilazina diluita in soluzione tampone fosfato (PBS)/soluzione salina. Conservare il brodo a 4 °C.
- Diluire Atipamezolo ad una concentrazione finale di 0,25 mg/mL in PBS/soluzione salina. Conservare il brodo a 4 °C.
- Diluire la buprenorfina ad una concentrazione finale di 0,03 mg/ml in PBS/soluzione salina. Conservare il brodo a 4 °C.
- Preparare 1 mL di Pg-LPS (1 mg/ml) in soluzione salina sterile. Conservare il brodo a -20 °C.
- Per l'esperimento, utilizzare ratti Wistar femmina e maschio, di età compresa tra 12 settimane e del peso di 210-350 g al momento dell'intervento. Tenere gli animali alloggiati in gruppi nell'ambiente appropriato e in condizioni costanti (20-24 °C, cicli luce-buio 12 ore al giorno), con cibo e acqua standard, offerti ad libitum.
- Per indurre l'anestesia, pesare il ratto e somministrare la miscela di ketamina/xilazina ad una concentrazione di 80/10 mg/kg per via intraperitoneale (IP), utilizzando un ago ipodermico sterile da 25 G e una siringa da 1 ml.
- Dopo che il ratto è stato anestetizzato, posizionare l'animale sulla schiena su una piattaforma chirurgica riscaldata; Durante la procedura, coprire il corpo dell'animale per prevenire la perdita di calore.
NOTA: La profondità dell'anestesia viene valutata dalla perdita del riflesso del pedale durante la procedura e dal monitoraggio dei segni vitali. Se necessario, utilizzare un piccolo cono nasale per mantenere l'anestesia con isoflurano al 2% in ossigeno al 100%. Applicare un unguento oftalmico sterile su entrambi gli occhi dopo l'induzione dell'anestesia per proteggere le cornee e prevenire l'essiccazione. - Durante le procedure, somministrare ossigeno al 100% utilizzando un piccolo cono nasale e monitorare la frequenza cardiaca e la saturazione di ossigeno mediante pulsossimetria.
NOTA: Se la saturazione di ossigeno e la frequenza cardiaca scendono al di sotto del 95% e 190 bpm, rispettivamente, interrompere la procedura e posizionare l'animale nella posizione di decubito laterale fino a raggiungere i valori normali. - Aprire la bocca del ratto usando un bavaglio in alluminio intorno agli incisivi (superiore e inferiore), ritraendo la lingua con esso e stabilizzando la mascella e la mandibola in una posizione di lavoro aperta e confortevole, consentendo l'accesso ai molari mandibolari.
NOTA: Se l'animale deve essere posto in decubito laterale, rimuovere il bavaglio della bocca prima di cambiare la sua posizione per favorire il recupero. Una volta che l'animale è anestetizzato, raccogliere il liquido crevicolare gengivale (GCF) prima dell'intervento chirurgico (campione in condizioni basali) (giorno 0). - Raccogli GCF come descritto dai seguenti passaggi:
- Posizionare l'animale sulla schiena su una piattaforma chirurgica e stabilizzare la mascella e la mandibola in posizione aperta con bavagli in alluminio.
- Raccogliere GCF utilizzando un totale di quattro (due per ogni M1) punto di carta assorbente nº 30 (0,03 cm di diametro x 3 cm di lunghezza), inserendolo nella fessura gengivale (spazio tra epitelio gengivale e smalto adiacente) attorno al mesio-palatale della M1 fino a una leggera resistenza. Mantenere il punto carta nella stessa posizione per un totale di 30 secondi prima della rimozione immediata.
- Dopo la raccolta, trasferire immediatamente il punto di carta in un flaconcino di plastica e conservare a -80 °C fino all'esecuzione del dosaggio.
2. Tecnica di legatura ritentiva e iniezione intragengivale Pg-LPS
NOTA: Il modello di legatura è stato creato (giorno 0) posizionando una legatura di seta intrecciata sterile (5/0) attorno alla M1 bilateralmente all'interno del solco gengivale utilizzando strumenti microchirurgici e fissandola con i nodi del chirurgo sulla superficie palatale. Gli strumenti microchirurgici utilizzati erano pinze microchirurgiche, un micro portaaghi, un intagliatore hollenback, un elevatore microchirurgico periostale e forbici microchirurgiche. Sono state utilizzate anche lenti chirurgiche con sorgente luminosa a LED (ingrandimento 3,6x).
- Posizionare la coda distale della sutura sul lato palatale della dentatura e inserire il segmento prossimale tra il contatto di M1 e dei secondi molari mascellari (M2).
- Utilizzare l'elevatore microchirurgico periostale per inserire la sutura all'interno del solco. Avvolgere la legatura attorno alla superficie buccale della M1 con molta attenzione, poiché i tessuti a questo livello presentano una stretta zona di gengiva attaccata. Sull'aspetto palatale, assicurarsi che la sutura sia stretta su entrambe le estremità per assicurarsi che sia spinta nel solco gengivale.
NOTA: Se si osserva resistenza durante l'inserimento della sutura tra M1 e M2, il contatto può essere aperto leggermente utilizzando un esploratore dentale e una fresa a forma di lancia diamantata. - Legare le estremità della sutura con un nodo da chirurgo e tagliare le code il più corte possibile. Inserire il nodo nel solco.
NOTA: Le punte degli strumenti chirurgici possono causare traumi orali e sanguinamento. Preparare piccoli segmenti di garza o un batuffolo di cotone per rimuovere il sangue dalla cavità orale e applicare pressione per fermare qualsiasi emorragia. Un'attenta gestione dei tessuti molli con un approccio microchirurgico riduce al minimo le complicanze chirurgiche e porta a meno traumi tissutali. - Dopo il posizionamento della legatura, iniettare 40 μL di Pg-LPS in soluzione salina sterile con un ago ipodermico sterile da 25 G e una siringa da 1 mL sul tessuto sottogengivale (tra la radice o il collo di un dente e il margine gengivale) sul lato mesio-palatale della M1 bilateralmente (giorno 0).
3. Fine della procedura
- Dopo il posizionamento della legatura e l'applicazione di Pg-LPS, rilasciare il ratto dallo stato chirurgico e metterlo in una gabbia individuale pulita sotto una lampada di calore.
- Iniettare l'antagonista Atipamezolo (0,5 mg/kg per via sottocutanea (SC)) con un ago ipodermico sterile da 25 G e una siringa da 1 ml.
- Per alleviare il dolore, iniettare 0,03 mg/kg di buprenorfina, SC.
- Monitorare il recupero dell'animale fino a quando gli effetti dell'operazione non sono completamente invertiti. Ospitare individualmente ogni ratto nell'ambiente appropriato in condizioni costanti (20-24 °C, 12 ore al giorno cicli luce-buio). Offrire cibo e acqua deionizzata ad libitum.
- Durante i primi 2 giorni dopo la procedura, pesare gli animali e iniettare Buprenorfina SC due volte al giorno per alleviare il dolore.
NOTA: La buprenorfina può essere somministrata prima di iniziare la procedura per eliminare l'effetto windup. - Durante il periodo dell'esperimento, monitorare gli animali in base al peso e alla valutazione generale del comportamento una o due volte alla settimana.
4. Follow-up post-procedura
NOTA: L'induzione del PD è stata mantenuta per 14 giorni per favorire l'accumulo di biofilm batterico e conseguente infiammazione. Le legature devono essere esaminate e regolate e Pg-LPS viene iniettato tre volte alla settimana (giorno 2, giorno 4, giorno 6, giorno 8, giorno 10 e giorno 12).
- Esamina e regola la legatura (giorno 2, giorno 4, giorno 6, giorno 8, giorno 10 e giorno 12) come segue:
- Anestetizzare con isoflurano al 2% in ossigeno al 100% utilizzando una camera di induzione per anestesia.
- Dopo che il ratto è stato anestetizzato, posizionare l'animale sulla schiena e utilizzare un piccolo cono nasale durante la procedura con isoflurano all'1% in ossigeno al 100% per il mantenimento dell'anestesia animale.
- Aprire la bocca del ratto usando il bavaglio in alluminio intorno agli incisivi (superiore e inferiore), ritraendo la lingua con essa e stabilizzando la mascella e la mandibola in una posizione di lavoro aperta e confortevole, consentendo l'accesso alle legature.
- Stringere le legature contro la gengiva con l'aiuto di un elevatore microchirurgico periostale e assicurarsi che la sutura delle legature sia inserita, creando infiammazione intorno alla gengiva.
NOTA: È possibile che 7-10 giorni dopo l'intervento chirurgico, le legature siano perse. Se ciò accade, seguire il protocollo come spiegato per l'iniezione di Pg-LPS (passo 2.4).
- Dopo l'aggiustamento della legatura, iniettare bilateralmente 40 μL di Pg-LPS con un ago ipodermico sterile da 25 G e una siringa da 1 mL sul tessuto sottogengivale sul lato mesio-palatale della M1 (giorno 2, giorno 4, giorno 6, giorno 8, giorno 10 e giorno 12).
- Rimuovere il cono del naso per l'anestesia e posizionare il topo nella sua gabbia. Monitorare il recupero dell'animale fino a quando gli effetti dell'anestesia non sono completamente invertiti.
5. Sacrificio animale e analisi
NOTA: Ci sono diverse opzioni per valutare la progressione del PD. Qui, l'analisi descritta consiste in una valutazione delle citochine pro-infiammatorie nel liquido crevicolare gengivale (GCF) e una valutazione della perdita di osso alveolare.
- Il giorno 14 dello studio (giorno 14), sacrificare gli animali con CO2 in una camera di anidride carbonica. Per i roditori si raccomanda un tasso di spostamento compreso tra il 30% e il 70% del volume/min della camera.
NOTA: La mancanza di risposta animale al riflesso del pedale e l'assenza di segni vitali devono essere verificate per confermare l'eutanasia. - Raccogli GCF come descritto dai seguenti passaggi:
NOTA: GCF viene raccolto prima dell'induzione del PD (prima dell'intervento chirurgico) (giorno 0) e dopo l'induzione del PD (dopo il sacrificio) (giorno 14).- Posizionare l'animale sulla schiena su una piattaforma chirurgica e stabilizzare la mascella e la mandibola in posizione aperta con bavagli in alluminio.
- Raccogliere il GCF utilizzando carta adsorbente punto nº 30 (0,03 cm di diametro x 3 cm di lunghezza) inserendolo nella fessura gengivale attorno al mesio-palatale della M1 fino a una leggera resistenza. Mantenere il punto carta nella stessa posizione per un totale di 30 secondi prima della rimozione immediata.
- Dopo la raccolta, trasferire immediatamente il punto di carta in un flaconcino di plastica e conservare a -80 °C fino all'esecuzione del dosaggio.
- Per valutare le proteine all'interno del GCF, preparare le seguenti soluzioni e seguire le fasi del metodo di eluizione come descritto:
NOTA: IL-1β viene valutato sul GCF (giorno 14) utilizzando un test immunologico, secondo il protocollo del produttore.- Preparare il tampone di eluizione fresco e tenerlo in ghiaccio durante l'intero processo di estrazione per inibire l'attività della proteasi.
- Preparare tutte le soluzioni necessarie per il tampone di eluizione come descritto:
- Preparare 1 mL di Aprotinina (1 mg/ml) in acqua ultrapura.
- Preparare 10 mL di fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) (200 mM) in metanolo.
- Aggiungere 125 μL di PMSF e 250 μL di Aprotinina a 24,5 mL di soluzione di PBS (pH = 7,4) per preparare il tampone di eluizione.
- Sciogliere una compressa di inibitore della fosfatasi commerciale con 10 mL di tampone di eluizione appena preparato per 10 minuti sotto agitazione a 4 °C.
NOTA: La durata dell'eluizione GCF è limitata; Utilizzare immediatamente per centrifugazioni dopo l'aggiunta di compresse di inibitore della fosfatasi entro i primi 30 minuti. - Dopo aver aggiunto l'inibitore della fosfatasi, aggiungere 11 μL di tampone di eluizione completo direttamente sul tubo con i punti di carta.
- Centrifugare il tubo a 452 x g per 5 minuti a 4 °C.
- Trasferire il contenuto eluito in un nuovo flaconcino di plastica. Ripetere questo processo altre quattro volte per ottenere un volume totale di 50 μL.
- Dopo l'ultima centrifugazione, aggiungere un volume totale di 60 μL direttamente sul punto carta e centrifugare un'ultima volta a 452 x g per 5 minuti a 4 °C.
- Utilizzare il volume richiesto eluito per la valutazione delle proteine.
- Dopo l'eutanasia e la raccolta GCF, con l'aiuto di forbici chirurgiche, tagliare la mascella superiore dei ratti. Cerca di staccare la maschera del topo e lasciare il minor tessuto molle possibile.
- Posizionare la mascella nello stadio del microscopio per la visualizzazione e scattare una foto all'ingrandimento desiderato.
- Posizionare la mascella direttamente in paraformaldeide (PFA) al 4% diluita in PBS. Aggiornare due volte a settimana con nuovo PFA per 12 giorni per una fissazione completa.
ATTENZIONE: Le fasi che coinvolgono PFA devono essere eseguite in una cappa aspirante seguendo le raccomandazioni della scheda di dati di sicurezza. - Dopo la completa fissazione della mascella, valutare la perdita ossea utilizzando uno scanner di tomografia computerizzata a fascio conico (CBCT), come segue:
- Apri il PC.
- Aprire il programma di analisi CBCT.
- Selezionare Protocollo di scansione > modalità di scansione della protesi.
- Selezionare Campo visivo (FOV) > ( 11x8) HIRes ( 90 kV di tensione e 3 mA di corrente).
- Posizionare la mascella superiore fissa dei ratti nel portale.
- Fare clic su Avanti.
- Fare clic sul pulsante di accensione a raggi X (premere il telecomando a raggi X per effettuare l'emissione e tenerla premuta per l'intera durata della scansione).
- Se necessario, riposizionare la mascella superiore al centro del piano frontale premendo il pulsante di controllo, quindi fare clic sul pulsante di accensione a raggi X (premere il telecomando a raggi X per effettuare l'emissione e tenerlo premuto per l'intera durata della scansione).
- Fare clic su Avanti.
- Fare clic sul pulsante di accensione a raggi X (premere il telecomando a raggi X per effettuare l'emissione e tenerla premuta per l'intera durata della scansione).
- Se necessario, spostare la protesi al centro del piano sagittale premendo il pulsante di controllo, quindi fare clic sul pulsante di accensione a raggi X (premere il telecomando a raggi X per effettuare l'emissione e tenerlo premuto per l'intera durata della scansione).
- Fare clic su Avanti.
- Fare clic sul pulsante Start (premere il telecomando a raggi X per effettuare l'emissione e tenerla premuta per tutta la durata dell'esame). Attendere la ricezione di un messaggio di elaborazione, quindi seguire le istruzioni visualizzate.
- Viene visualizzata una vista finestra. Regolare il grigio al 65% e fare clic su Applica.
- Per salvare la scansione, fare clic su File e salvarla in formato DICOM. Quindi, fare clic su Tutte le immagini e nella finestra di selezione dell'esportazione DICOM, selezionare tutti i parametri visualizzati (immagine iniziale, assiale originale, assiale riformattato, multiplanare) e selezionare il tipo predefinito.
- Elaborare le immagini rappresentative bidimensionali e sagittali dei molari mascellari utilizzando un programma di analisi, come segue:
- Aprire il software.
- Fare clic su File e Apri, quindi selezionare la cartella con le immagini in formato DICOM e fare clic su Apri.
- Attendere che venga visualizzata la finestra "Converti in 8 bit", selezionare l'intervallo da 0 a 6.000 e fare clic su OK.
- Fai clic su Immagini raw.
- Definire la parte superiore e inferiore della selezione per limitare l'area di interesse. Cerca la prima e l'ultima immagine in cui appare l'osso alveolare e selezionalo con la parte superiore dei comandi di selezione e inferiore della selezione .
NOTA: È possibile esportare immagini bidimensionali rappresentative dell'osso alveolare dei molari, come nella figura 3A,B. - Per le immagini rappresentative sagittali, fare clic su Toggle profile bar.
- Disegnate una linea sagittale al centro del palato e fate clic su Modello Reslice. Determinare i parametri per la delimitazione dell'area di interesse (spaziatura delle sezioni: 1; numero di sezioni: 100) e fare clic su OK. Attendete il termine del modello di relicing. Infine, fai clic su Salva immagini affettate.
NOTA: Le immagini sagittali rappresentative dell'osso alveolare dei molari potrebbero essere esportate, come nella Figura 3C,D.
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Representative Results
Una sequenza temporale delle fasi sperimentali è presentata nella Figura 1. La figura 2A mostra un'immagine della mandibula dopo l'intervento chirurgico, con il posizionamento della legatura attorno al solco di M1 al tempo 0 dell'esperimento. La figura 2B mostra come, dopo 14 giorni dalla procedura, la legatura intorno alla M1 entra nel solco gengivale, causando infiammazione della gengiva e accumulo infiltrante.
Figura 1: Rappresentazione schematica della cronologia della procedura sperimentale di induzione della parodontite (PD) nei ratti. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Le immagini bidimensionali rappresentative (Figura 3; quadrato rosso) mostrano differenze di perdita ossea alveolare nella mandibolla tra il controllo basale, mostrando più volume osseo (Figura 3A), e dopo l'istituzione di PD, mostrando una maggiore perdita ossea alveolare (Figura 3B). Inoltre, l'analisi delle immagini sagittali evidenzia la maggiore perdita ossea alveolare nell'area ossea interradicolare di M1 (Figura 3D; freccia rossa) e M2 (Figura 3D; freccia verde) dopo l'insediamento della PD, rispetto al gruppo di controllo basale (Figura 3C). Inoltre, il riassorbimento osseo alveolare è stato caratterizzato da un aumento dello spazio tra la giunzione dello smalto cementizio (CEJ) e la cresta ossea alveolare (ABC). La distanza tra CEJ e ABC in entrambi i gruppi di ratti è mostrata nella Figura 3C,D con frecce blu. Il PD stabilito ha sviluppato ampi spazi tra la CEJ e l'ABC (Figura 3D), rispetto al controllo basale (Figura 3C).
Al momento del sacrificio, le immagini del palato presentavano differenze nella recessione gengivale nella M1 nei diversi gruppi (Figure 4A,B). Il gruppo PD (Figura 4B) mostra una maggiore migrazione gengivale apicale dovuta alla perdita di supporto osseo e all'esposizione radicolare, rispetto al gruppo di controllo basale (Figura 4A). Inoltre, il gruppo PD (Figura 4B) presentava una maggiore infiammazione della gengiva intorno ai molari mascellari, rispetto al gruppo di controllo basale (Figura 4A). La Figura 4C mostra i risultati dell'analisi della citochina pro-infiammatoria IL-1β da GCF, mostrando un rilascio significativamente più elevato di IL-1β visualizzato nel gruppo PD rispetto al gruppo di controllo. Secondo la letteratura, IL-1β partecipa all'infiammazione, alla regolazione immunitaria e al riassorbimento osseo nella parodontite ed è un forte stimolatore della distruzione del tessuto parodontale12.
Figura 2: Immagini della legatura inserita nel solco della M1 in tempi diversi. (A) Palato del ratto con posizionamento della legatura intorno alla M1, 0 giorni dopo l'inserimento della legatura. (B) Palato del ratto con posizionamento della legatura intorno alla M1, 14 giorni dopo l'inserimento della legatura. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Immagini bidimensionali rappresentative dell'osso alveolare e dei molari mascellari. Foto bidimensionali rappresentative ottenute dalla CBCT dell'osso alveolare dei molari mascellari (quadrato rosso) di (A) il controllo basale e (B) parodontite stabilita (PD) per 14 giorni con inserimento di legatura e iniezione di Pg-LPS. Viste bidimensionali sagittali rappresentative dei molari mascellari di (C) il controllo basale e (D) il PD. Le frecce rosse indicano l'area dell'osso alveolare interradicolare della M1, le frecce blu indicano la distanza tra CEJ e ABC e le frecce verdi indicano l'area dell'osso alveolare interradicolare della M2. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Immagini rappresentative del palato. Immagini rappresentative del palato dopo sacrificio del gruppo di controllo basale (A) e del gruppo parodontite (B) (PD), trattati per 14 giorni con inserimento di legature e iniezione di Pg-LPS. (C) Determinazione delle concentrazioni di IL-1β nel GCF del gruppo di controllo basale e del gruppo PD (n = 9). I dati rappresentano la media ± SEM. I risultati sono stati confrontati statisticamente da Kruskal-Wallis: * p < gruppo 0,05 PD rispetto al gruppo di controllo basale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Questo metodo descrive l'induzione del PD nei ratti seguendo una tecnica combinata di iniezioni di Pg-LPS e posizionamento della legatura intorno alla M1, rivelando che cambiamenti significativi nei tessuti parodontali e nell'osso alveolare potrebbero essere indotti in 14 giorni dopo questo metodo.
Durante questa procedura, deve essere fornita attenzione a diversi passaggi critici. Durante l'anestesia animale e la preparazione della procedura, valutare la corretta anestesia durante il processo chirurgico è fondamentale per il suo successo, così come garantire il corretto posizionamento dell'animale, stabilizzare la bocca aperta del ratto con il bavaglio della bocca di alluminio intorno agli incisivi ed evitare che gli animali vengano feriti con il bavaglio e gli strumenti chirurgici. Se la saturazione di ossigeno e la frequenza cardiaca diminuiscono, la procedura deve essere interrotta e l'animale posto nella posizione di decubito laterale fino al raggiungimento di valori normali. Durante la posizione della legatura, è essenziale che la sutura e il nodo siano inseriti correttamente nel solco, considerando che la lesione dei tessuti molli dovrebbe essere ridotta al minimo per prevenire dolore e infiammazione in altre aree. Tenendo conto delle questioni etiche riguardanti il benessere degli animali, è essenziale monitorare il recupero dell'animale fino a quando gli effetti dell'anestesia non sono completamente invertiti. I farmaci antidolorifici durante i primi 2 giorni dopo la procedura sono indispensabili. Anche il monitoraggio del peso e del comportamento degli animali è importante, per valutare quanto bene il ratto tollera la procedura e assicurarsi che non mostri alcun disagio estremo. Durante il protocollo post-procedura di iniezione di Pg-LPS e regolazione della legatura al tessuto sottogengivale intorno alla M1, prima di tutto, è importante stringere e riposizionare la legatura in posizione apicale per creare l'infiammazione. In secondo luogo, è importante iniettare bilateralmente il Pg-LPS con cura, per non causare traumi orali. Inoltre, è necessario prestare attenzione durante l'anestetizzazione dell'animale e deve essere monitorato fino al recupero. Durante la raccolta del GCF, la carta calibrata deve essere mantenuta nella stessa posizione per lo stesso tempo totale, ed è importante inserirla nella stessa fessura gengivale attorno alla M1 mesio-palatale. Durante le fasi di eluizione del GCF, è importante utilizzare il tampone di eluizione immediatamente dopo aver aggiunto la compressa dell'inibitore della fosfatasi commerciale. Un ultimo passaggio critico del protocollo è durante le scansioni CBCT; Un corretto allineamento dei campioni e del protocollo di analisi è fondamentale per ottenere risultati interpretabili.
La variazione dell'esposizione specifica di ciascun animale all'iniezione di Pg-LPS e la legatura ritentiva intorno alla M1 potrebbero essere incluse come ragioni per non raggiungere la corretta infiammazione e il conseguente riassorbimento osseo. Mentre si ottengono buoni risultati nell'induzione della malattia di Parkinson utilizzando questa procedura, è importante ridurre attentamente le variazioni tra gli animali seguendo attentamente il protocollo. Una delle modifiche più significative del metodo è la collocazione della legatura ritentiva attorno alla M1, e non intorno alla M2, il modello di legatura più tradizionale in letteratura13,14,15. La procedura operativa per il posizionamento della legatura nei topi o nei ratti presenta difficoltà tecniche e rappresenta una potenziale sfida per molti ricercatori a causa delle piccole dimensioni della cavità orale murina e dei denti11,16. L'uso di ratti e il posizionamento della legatura attorno alla M1 hanno facilitato la manipolazione e l'accesso all'area, riducendo anche lo stress dell'animale durante la procedura. Non è stata osservata sofferenza animale durante il protocollo, ma se qualche ratto mostra segni di angoscia, prendere in considerazione la possibilità di rimuoverlo dall'esperimento per prevenire la sofferenza. Infine, il passo più limitante della procedura è evitare la perdita della legatura, che potrebbe verificarsi 7-10 giorni dopo l'intervento. Per aumentare e mantenere l'intensità della malattia nel tempo, è importante regolare le legature per mantenere un contatto intimo con i tessuti gengivali, mitigando la variabilità delle intensità sull'induzione della parodontite tra gli animali15. In generale, se la procedura viene eseguita correttamente, non dovrebbero essere necessarie modifiche e si otterranno risultati coerenti.
È importante notare che questo modello presenta diverse limitazioni. Prima di tutto, è stata sviluppata una tecnica per lo studio del PD causato da una lesione traumatica (posizione della legatura), che si pensa faciliti l'accumulo locale di batteri e quindi aumenti l'infiammazione mediata dai batteri e la perdita ossea13,10, con la combinazione di iniezione di Pg-LPS. Ma, in realtà, il metodo non imita i fattori eziologici naturali responsabili della disbiosi microbiota nella parodontite umana e non imita molti altri possibili meccanismi attraverso i quali la parodontite può insorgere. Inoltre, le strutture dentali murine non sono identiche all'uomo15. Inoltre, mentre il metodo presentato è efficace per lo studio del PD acuto, potrebbe non riflettere la perdita ossea a lungo termine e le caratteristiche di infiltrazione infiammatoria nel PD16 cronico. Nel dettaglio con la metodologia proposta per la valutazione della perdita ossea alveolare, il metodo più comunemente utilizzato di valutazione multidimensionale dell'osso è la micro-CT, che consente la valutazione di fattori esterni e fornisce immagini tridimensionali dell'osso. Inoltre, i parametri ossei trabecolari, il volume osseo e la densità minerale ossea possono essere analizzati senza rompere le ossa14,17. Tuttavia, l'uso della CBCT per la valutazione della perdita ossea alveolare è stato proposto qui (Figura 3) come alternativa alla micro-CT; Sebbene si ottengano immagini a bassa risoluzione, fornisce anche un'utile analisi qualitativa e quantitativa della progressione della parodontite18,19,20. Quindi, gli esami CBCT forniscono un metodo accurato per l'imaging, più disponibile e accessibile rispetto alla micro-CT, che faciliterebbe gli studi sull'induzione della parodontite nei ratti.
Tra i vari modelli animali che sono stati utilizzati per imitare il PD in vivo16 per valutare i tessuti di supporto dei denti (gengiva e osso) in condizioni ben controllate, il modello PD indotto dalla legatura è stato ampiamente utilizzato in ratti, cani e primati non umani13. La letteratura indica anche che, nonostante sia utilizzato in alcuni protocolli, l'uso di topi - che rappresenta un modello conveniente, economico e versatile - si traduce in una sfida più tecnica a causa delle dimensioni relativamente piccole della cavità orale del topo rispetto ai ratti13. Rispetto ad altri modelli, il modello di ratto PD indotto da legature offre diversi vantaggi, tra cui la rapida induzione della malattia, che può iniziare in un momento prevedibile e culminare nella perdita ossea alveolare entro pochi giorni (topi e ratti)13. Ci sono altri vantaggi di questo metodo, come il potenziale per studiare il tessuto parodontale e la rigenerazione ossea alveolare, nonché la capacità di localizzare e sezionare il tessuto gengivale infiammato al fine di valutare il livello di infiammazione15. Il metodo di combinazione del modello PD indotto dalla legatura con l'iniezione di LPS aggiunge una risposta infiammatoria distruttiva locale nel parodonto che aumenta la perdita di attaccamento del tessuto connettivo e il riassorbimento osseo alveolare generato dalla legatura. Questo effetto additivo è consigliabile aumentare con la concentrazione e la frequenza delle iniezioni di LPS10. Il metodo qui riportato presenta un protocollo ottimizzato di una combinazione di legatura con iniezione di Pg-LPS, con i vantaggi e il significato di entrambi i metodi.
L'ottimizzazione e lo sviluppo di modelli in vivo sicuri ed economici di PD sono fondamentali per facilitare la comprensione della patogenesi della malattia parodontale e la sperimentazione di nuovi approcci terapeutici. Il modello PD della tecnica combinata di iniezioni di Pg-LPS e posizionamento della legatura intorno alla M1 qui presentata è valutato come un modello di studio attraente, per studiare le interazioni ospite-microbo, l'infiammazione nella parodontite e il riassorbimento osseo alveolare. Questo modello identifica i set più critici del protocollo, li descrive in dettaglio tecnico basato su immagini e standardizza e ottimizza l'uso di queste tecniche combinate. Potrebbe essere possibile l'uso di tecniche aggiuntive per la valutazione della progressione della parodontite, comprese le analisi istologiche sia dell'osso alveolare che della gengiva circostante, la determinazione di altre citochine coinvolte nell'infiammazione e la caratterizzazione del microbiota orale. Sebbene il modello non possa riflettere tutti gli aspetti dei meccanismi o delle cause del PD nell'uomo, questo studio rivela che significativi cambiamenti degenerativi e infiammatori nei tessuti parodontali e nell'osso alveolare potrebbero essere indotti a 14 giorni dopo l'intervento, fornendo la base per futuri studi preclinici preventivi o terapeutici per la malattia parodontale.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fundació Universitat-Empresa de les Illes Balears (Proof of concept call 2020), dall'Instituto de Salud Carlos III, dal Ministerio de Economía y Competividad, cofinanziato dal Fondo sociale europeo FSE e dal Fondo europeo di sviluppo regionale del FESR (contratto con M.M.B; FI18/00104) e dalla Direcció General d'Investigació, Conselleria d'Investigació, Govern Balear (contratto con M.M.F.C; FPI/040/2020). Gli autori ringraziano la dottoressa Anna Tomás e Maria Tortosa per il loro aiuto alla chirurgia sperimentale e alla piattaforma di IdISBa. Infine, grazie ad ADEMA School of Dentistry per l'accesso allo scanner CBCT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adsorbent paper point nº30 | Proclinc | 8187 | |
| Aprotinin | Sigma-Aldrich | A1153 | |
| Atipamezole | Dechra | 573751.5 | Revanzol 5 mg/mL |
| Braided silk ligature (5/0) | Laboratorio Arago Sl | 613112 | |
| Buprenorphine | Richter pharma | 578816.6 | Bupaq 0.3 mg/mL |
| Cone-beam computed tomography (CBCT) Scanner | MyRay | hyperion X9 | Model Hyperion X9 |
| CTAn software | SkyScan | Version 1.13.4.0 | |
| Dental explorer | Proclinc | 99743 | |
| Diamond lance-shaped bur | Dentaltix | IT21517 | |
| Food maintenance diet | Sodispain research | ROD14 | |
| Heated surgical platform | PetSavers | ||
| Hollenback carver | Hu-FRIEDY | HF45234 | |
| Hypodermic needle | BD | 300600 | 25G X 5/8” - 0,5 X 16 MM |
| Isoflurane | Karizoo | Isoflutek 1000mg/g | |
| Ketamine | Dechra | 581140.6 | Anesketin 100 mg/mL |
| Lipopolysaccharide derived from P.Gingivalis | InvivoGen | TLRL-PGLPS | |
| Methanol | Fisher Scientific | M/4000/PB08 | |
| Micro needle holter | Fehling Surgical Instruments | KOT-6 | |
| Microsurgical pliers | KLS Martin | 12-384-06-07 | |
| microsurgical scissors | S&T microsurgical instruments | SDC-15 RV | |
| Monitor iMEC 8 Vet | Mindray | ||
| Multiplex bead immunoassay | Procartaplex, Thermo fisher Scientific | PPX-05 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 8187151000 | |
| Periosteal microsurgical elevator | Dentaltix | CU19112468 | |
| Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) | Roche | 10837091001 | |
| Phosphate Buffer Solution (PBS) | Capricorn Scientific | PBS-1A | |
| PhosSTOP | Roche | 4906845001 | Commercial phosphatase inhibitor tablet |
| Plastic vial | SPL Lifesciencies | 60015 | 1.5mL |
| Saline | Cinfa | 204024.3 | |
| Stereo Microscope | Zeiss | Model SteREO Discovery.V12 | |
| Surgical loupes led light | Zeiss | ||
| Surgical scissors | Zepf Surgical | 08-1701-17 | |
| Syringe | BD plastipak | 303172 | 1mL |
| Veterinary dental micromotor | Eickemeyer | 174028 | |
| Xylazine | Calier | 20102-003 | Xilagesic 20 mg/mL |
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