Summary
このプロトコルは、ベージュ脂肪生物学を調査するためのアデノ随伴ウイルス(AAV)の代替戦略として、脂肪細胞(AdipoSPH)におけるCRISPR SunTag-p65-HSF1(SPH)の使用を示しています。内因性Prdm16遺伝子を標的とするAAV担持sgRNAの インビボ 注射は、ベージュ脂肪の発生を誘導し、熱発生遺伝子プログラムを増強するのに十分である。
Abstract
クラスター化された規則的に間隔を空けた短い回文反復(CRISPR)技術は生物学の革命を引き起こし、最近のツールは最初に記述された遺伝子編集をはるかに超えて適用されています。CRISPR活性化(CRISPRa)システムは、触媒的に不活性なCas9(dCas9)タンパク質と異なる転写モジュールを組み合わせて、内因性遺伝子発現を誘導します。SunTag-p65-HSF1(SPH)は、相乗的活性化メディエーター(SAM)の成分とSunTagアクチベーターを組み合わせた最近開発されたCRISPRa技術です。このシステムは、カスタマイズされたシングルガイドRNA(sgRNA)を設計することにより、単一または複数の遺伝子の過剰発現を可能にします。本研究では、以前に開発したSPHマウスを用いて、脂肪細胞(アディポネクチンCre系統)でSPHを発現するAdipoSPHという名前の条件付きマウスを作製しました。白からベージュの脂肪(褐変)表現型を誘導するために、内因性Prdm16遺伝子(褐色およびベージュ色の脂肪の発生に関連する確立された転写因子)を標的とするsgRNAを搭載したアデノ随伴ウイルス(AAV)を鼠径部白色脂肪組織(iWAT)に注入した。このマウスモデルは、内因性Prdm16の発現を誘導し、熱発生遺伝子プログラムを活性化しました。さらに、 インビトロ SPH誘導Prdm16過剰発現は、ベージュ脂肪細胞の酸素消費を増強し、以前のPrdm16トランスジェニックマウスモデルの結果を表現コピーした。したがって、このプロトコルは、脂肪組織生物学を調査するための、用途が広く、費用効果が高く、時間効率の高いマウスモデルを記述します。
Introduction
ベージュ(またはブライト)脂肪細胞は、白色脂肪組織(WAT)デポー内に存在する脱共役タンパク質1(UCP1)発現およびミトコンドリアに富む脂肪細胞です。ベージュ色の脂肪は、低温曝露および他の刺激に応答して脂肪細胞前駆細胞または成熟白色脂肪細胞のサブセットから出現する1,2。ベージュ色の脂肪細胞は、UCP1依存的または独立した方法でエネルギーを熱に変換することができます3。ベージュ色の脂肪は、その熱発生機能に関係なく、アディポカインの分泌や抗炎症および抗線維化活性などの他の手段によって代謝の健康を改善することもできます。マウスとヒトでの研究では、ベージュ脂肪の誘導が全身のグルコースと脂質の恒常性を改善することが示されています3。しかし、ベージュ脂肪生物学に関する私たちの知識は近年急速に進化していますが、その代謝の利点と関連するメカニズムのほとんどはまだ完全には理解されていません。
クラスター化された規則的に間隔を空けた短い回文反復(CRISPR)は、Cas9タンパク質4,5のヌクレアーゼ活性を介してゲノムの特定の部位に二本鎖切断(DSB)を生成できるツールとして真核細胞で最初に説明されました。Cas9は、合成シングルガイドRNA(sgRNA)によって誘導され、特定のゲノム領域を標的とし、DNA DSBにつながります。編集目的でヌクレアーゼCas9を使用することに加えて、CRISPR-Cas9技術は、配列特異的遺伝子調節ツール6として使用されるように進化した。触媒的に不活性なCas9タンパク質(dCas9)の開発と、遺伝子発現を増強することができる転写モジュールの会合により、CRISPR活性化(CRISPRa)ツールが生まれました。VP64 7,8、相乗的活性化メディエーター(SAM)9、SunTag10,11、VPR 12,13、SAMとSunTagアクチベーターのコンポーネントを組み合わせたSunTag-p65-HSF1(SPH)14など、いくつかのCRISPRaシステムが登場しました。最近、N2a神経芽細胞および初代星状細胞における神経原性遺伝子の誘導発現が、他のCRISPRaシステムと比較してSPHを使用して高いことが実証され14、SPHが有望なCRISPRaツールとして実証されています。
ここでは、先に開発したSPHマウス14 を利用して、アディポネクチンCre系統(AdipoSPH)を用いて脂肪細胞に特異的にSPHを発現する条件付きマウスモデルを作製した。内因性Prdm16遺伝子を標的とするgRNAを搭載したアデノ随伴ウイルス(AAV)を用いて、鼠径WAT(iWAT)の褐変(白からベージュへの変換)を誘導し、熱発生遺伝子プログラムの発現を増加させた。さらに、 インビトロ Prdm16過剰発現は酸素消費量を増加させた。したがって、このプロトコルは、脂肪組織内のベージュ脂肪発生のメカニズムを探索するための汎用性の高いSPHマウスモデルを提供します。
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Protocol
動物実験は、実験動物の世話と使用のためのカンピーナス大学ガイド(プロトコルCEUA #5810-1 / 2021)に従って実施されました。
1. 分子クローニング
- シングルガイドRNA(sgRNA)の設計
- CRISPR活性化用のsgRNAは、https://chopchop.cbu.uib.no/ で入手可能なCHOPCHOPまたはその他の適切なツールを使用して設計します。以下のパラメータを使用して、Prdm16遺伝子を標的とするsgRNAを設計します:ターゲット:Prdm16;で:ムスムスクルス;使用: クリスパー/キャス9;対象:アクティベーション。
注:200 bpの上流転写開始部位(TSS)領域に広がる各関心領域のsgRNAを設計します。例えば、この研究で使用されたPrdm16を標的とするsgRNAは、TSSの上流154 bpに結合します。 - ベクター骨格pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherryのSacI制限部位と一致するように、sgRNAにオーバーハングを追加します( 材料表を参照)。含まれるもの:5'-(N20)AGCT-3'(N =ヌクレオチド)。例えば、Prdm16遺伝子を標的とする配列は5'-CGAGCTGCGCTGAAAAGGGG-3'であり、オーバーハングを有する配列は5'-CGAGCTGCGCTGAAAAGGGCT-3'である。
- https://arep.med.harvard.edu/labgc/adnan/projects/Utilities/revcomp.html で入手可能なツールを使用して、3' sgRNA逆補体配列を取得します。例えば、Prdm16遺伝子を標的とする3'-sgRNA配列は、3'-TCGAGCTCGACGCGACTTTTCCCC-5'である。
- CRISPR活性化用のsgRNAは、https://chopchop.cbu.uib.no/ で入手可能なCHOPCHOPまたはその他の適切なツールを使用して設計します。以下のパラメータを使用して、Prdm16遺伝子を標的とするsgRNAを設計します:ターゲット:Prdm16;で:ムスムスクルス;使用: クリスパー/キャス9;対象:アクティベーション。
- 一本鎖相補的オリゴヌクレオチドのアニーリング
- 各5'および3'一本鎖オリゴヌクレオチド(ストック濃度:100 μM)1 μL、T4リガーゼバッファー1 μL、T4ポリヌクレオチドキナーゼ(PNK)0.5 μL(1 ×10 4 単位/mL)、および6.5 μLのH2Oを最終反応容量10 μLに加えます。 相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドを以下の条件下でサーモサイクラーを用いてアニールする: 37°Cで30分間、95°Cで5分間、その後5°C/分のランプダウン速度を実現します。
注:PNK酵素にはPNKバッファーが付属しており、リン酸化反応に必要な十分なATPが含まれていません( 材料の表を参照)。反応を単純化するために、(PNKバッファーの代わりに)T4リガーゼバッファーを使用してください。T4リガーゼバッファーは、リン酸化反応に適量(1 mM ATP)のリン酸を提供します。PNK酵素は、その後のライゲーション反応のためにオリゴヌクレオチドの5'末端リン酸化を提供します。
- 各5'および3'一本鎖オリゴヌクレオチド(ストック濃度:100 μM)1 μL、T4リガーゼバッファー1 μL、T4ポリヌクレオチドキナーゼ(PNK)0.5 μL(1 ×10 4 単位/mL)、および6.5 μLのH2Oを最終反応容量10 μLに加えます。 相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドを以下の条件下でサーモサイクラーを用いてアニールする: 37°Cで30分間、95°Cで5分間、その後5°C/分のランプダウン速度を実現します。
- アニーリングしたsgRNAオリゴヌクレオチドのライゲーション
- 25 ngのプラスミドpAAV-U6-gRNA-CBh-mCherryを2 μLのアニーリングsgRNAオリゴヌクレオチド、1 μLのSacI酵素、2 μLの10x T4 DNAリガーゼバッファー、1 μLのT4 DNAリガーゼ(1-3 u/μL)( 材料の表を参照)、およびH2Oを最終反応容量10 μLに加えます。
- 以下の条件でサーモサイクラーを用いて反応混合物をインキュベートしてライゲーションを行い、37°Cで5分間および25°Cで5分間の15サイクルを行い、続いて4°Cで保持した。
- 形質転換とそれに続くコロニーポリメラーゼ連鎖反応(PCR)
- ヒートショック(42°Cで45秒間)を使用して、有能な 大腸菌 DH10B細胞( 材料の表を参照)を4 μLのライゲーション製品で形質転換し、100 μg/mLのアンピシリンを含む寒天プレートに広げます。
- PCRマスターミックスを用いたコロニーPCRにより形質転換コロニーを確認します( 材料の表を参照)。コロニーを選び、5 μLのマスターミックス、0.1 μLのユニバーサルプライマー(ストック濃度:100 μM)、0.1 μLのsgRNAリバースプライマー(ストック濃度:100 μM)(表1)、および5 μLのH 2 Oと混合します。 以下の条件下でサーモサイクラーを使用してPCRを実行します。 初期変性(94°Cで2分間)、 その後、35サイクルの変性(94°Cで20秒間)、アニーリング(60°Cで30秒間)、伸長(72°Cで30秒間)、および最終伸長ステップ(72°Cで5分間)が続きます。アガロース(1.5%)ゲル電気泳動を0.5x TAEバッファー中、90 V、30分間で分離します。
注:正のクローンは~280 bpのバンドを与えます。 - ユニバーサルプライマーを使用したサンガーシーケンシングの陽性サンプルを提出します(表1、補足ファイル1)。
- プラスミド精製
- プラスミド精製キット( 材料表を参照)を使用して、製造元の指示に従って、ポジティブクローンからプラスミドを精製します。
注:陰イオン交換樹脂または細胞トランスフェクションでの使用に適した別のキットを使用してプラスミドを精製します。 - 100 μg/mLのアンピシリンを含む標準的な細菌増殖培地を使用して、ポジティブクローンをインキュベートします(200 rpmで振とうしながら37°Cで12時間)。
- 菌体を6,000 × g で4°Cで10分間遠心分離します。 製造元のキットの指示に従って、次の手順に従います。
- プラスミド精製キット( 材料表を参照)を使用して、製造元の指示に従って、ポジティブクローンからプラスミドを精製します。
2. AAVの包装
注:AAVパッケージングは、以前の出版物15,16に従って、わずかな変更を加えて実行されました。
- 10%ウシ胎児血清(FBS)および1%ペニシリン/ストレプトマイシン(P / S)を含む25mLのダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)を使用して、175cm2フラスコ(フラスコあたり5×106細胞を播種)に293T細胞(材料の表を参照)をプレートします。細胞が50%〜70%のコンフルエントに達するまで、37°C、5%CO2、および95%の湿度でインキュベートします。
- 14 μLのポリエチレンイミン(1 μg/μL)を1 mLの150 mM NaClと混合します。AAV産生に必要な3つのプラスミドを1:1:1のモル比で混合します(すなわち、17.7 μgのpAdDeltaF6、7.9 μgのAAV2/8( 材料の表を参照)、およびステップ1のクローニングされたsgRNAの5.9 μgを1 mLの150 mM NaClに混合します。ポリエチレンイミン:NaCl混合物をDNA(プラスミドの混合物)を含むチューブに一滴ずつ移し、25°Cで20分間インキュベートします。
注:pAdDeltaF6はヘルパープラスミドであり、pCapsid pAAV2/8は複製(Rep)およびカプシド(cap)遺伝子を発現するパッケージングプラスミドです。両方のプラスミドはAAVを産生するのに必要である。 - トランスフェクションの前に、細胞増殖培地を1%FBSおよびL-アラニル-L-グルタミン(0.5 g/L)を含む18 mLのDMEMと交換します。2 mLのポリエチレンイミン:DNA混合物を各培養フラスコに加え、CO2インキュベーター(37°C、5%CO2、湿度95%)で細胞をインキュベートします。
- 5時間後、10%FBSとL-アラニル-L-グルタミン(0.5g / L)を添加した5 mLのDMEMを追加します。
- 3日間のインキュベーション後、セルスクレーパーを使用して培養フラスコから細胞を剥離する。10(175 cm2)細胞培養フラスコから293T細胞を50 mLコニカルチューブに回収し、DMEM(材料表を参照)を最大30 mLまで加えます。
- 293T細胞を含む各50 mLコニカルチューブに3 mLのクロロホルムを加え、ボルテックスミキサーを使用して高速で5分間混合します。7.6 mLの5 M NaClとボルテックスを短時間加えて細胞を再懸濁します。3,000 × g 、4°Cで5分間遠心分離します。
- 水相を新しいコニカルチューブに移し、9.4 mLの50%(v / v)ポリエチレングリコール(PEG)8000を加えます。ボルテックスミキサーで高速で10秒間混合し、サンプルを氷上に1時間置きます。
- 3,000 × g 、4°Cで30分間遠心分離します。上清を取り除き、ペレットを10分間乾燥させます。
- 1.4 mLのHEPES(50 mM、pH 8)を加え、ボルテックスミキサーを使用して高速で5分間混合します。3.5 μLの1 M MgCl2、14 μLのDNase I(20ユニット/μL)、および1.4 μLのRNase A(10 μg/μL)を追加します。37°Cの水浴中で20分間インキュベートした後、サンプルを新しい1.5 mLチューブ(各チューブに700 μL)に移します。
- 各1.5 mLチューブに700 μLのクロロホルムを加え、ボルテックスミキサーを使用して高速で10秒間混合します。3,000 × g 、4°Cで5分間遠心分離し、水相を新しいチューブに移します。この手順を3回繰り返します。
- バイオセーフティキャビネットでクロロホルムを30分間蒸発させます。次に、300 μLの水相を0.5 mLの超遠心チューブに移します( 材料の表を参照)。フィルターを14,000 × g で25°Cで5分間回転させます。フロースルーを取り外し、ボリューム全体がフィルターを通過するまでフィルターを再度回転させます。
- 300 μLのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)を加えてフィルターを洗浄し、ピペッティングで溶液を混合します。フィルターを25°C、14,000 × g で5分間遠心分離します。 この洗浄ステップを4回繰り返します。
- フィルターを25°Cで14,000 × g で8分間遠心分離します。 フィルターを逆さまにして新しいチューブに入れ、25°Cで1,000 × g で2分間回転させます。
3. qPCRによるAAVの滴定
- AAV滴定の標準曲線を作成し、Fripontらによる元の研究に従ってAAV力価を決定します15。
4.鼠径部白色脂肪組織(iWAT)へのAAVの インビボ 注射
- 手術に必要な手術器具と消耗品を分離し、特定の材料ごとに推奨するように滅菌します。
- 腹腔内注射により、100 mg / kgのケタミンと10 mg / kgのキシラジンでマウスを麻酔します。.足と尾に強い圧力をかけ、反射をチェックして麻酔を確認します。手術中の目の乾燥を避けるために、マウスの目に軟膏を塗ります。
- 麻酔をかけたマウスを仰臥位に置き、iWAT注射のために股関節の近位にある脇腹の小さな領域をシェーバーで剃ります。脱毛クリームを5分間塗ります。皮膚のやけどを防ぐために、水で残留クリームを取り除きます。
- 清潔なガーゼと70%アルコールで消毒液(ポビドンヨード)を皮膚に塗布する3ラウンドを交互に使用して皮膚を消毒します。使用するたびにガーゼを捨ててください。
- 皮膚に消毒液を最終塗布します。次に、関節の近位領域で滅菌ハサミで1〜2 cmの切開を行い、鉗子を使用して皮膚を開いたままにして脂肪蓄積を露出させます。WATは両側の皮膚に付着しており、背中の最初から精巣に向かって下に伸びています。
注意: 手術や縫合手順中の汚染を避けるために、ドレープを使用してください。 - 鉗子を使用して、切開を通して脂肪デポをゆっくりと上に引き上げ、注射が正しい位置と深さにあることを確認します。
注意: ティッシュを元の場所から取り除かないように注意してください。 - マイクロリットルシリンジ(ゲージ:33、ポイントスタイル:4、角度:12、長さ:10)(材料の表を参照)に、AAV(内因性Prdm16遺伝子を標的とするsgRNAを含む)の2.5 μL(5.6 ×10 10 ウイルスゲノム[VG]/μL)を満たします。針を30°〜45°の角度でiWATに慎重に挿入します。組織のさまざまな場所に注射を5回繰り返して、iWAT脂肪パッド全体に均一に感染します。iWATに感染するには、総量15μLが推奨されます。
注意: シリンジの挿入の深さは、脂肪パッド沈着物の厚さによって異なります。ノータッチテクニックを使用して注射を作成します。 - 4/0モノフィラメント縫合糸を使用して剃毛した皮膚切開を閉じます。意識が回復するまでマウスをヒートパッドに置きます。完全に回復するまで10〜15分ごとに動物を監視します。動物が意識を取り戻した後、線形で苦痛や痛みの兆候がないはずの自発運動プロファイリングを観察します。
- 塩酸トラマドール(5 mg / kg)を腹腔内に3日間投与することにより、術後48時間以内に術後の痛みの管理を実行します(2x /日)。.
注意: 苦痛や不快感の兆候に注意し、水と食物の摂取量を監視します。鎮痛剤の有効用量を先制的に、好ましくは手術の前または開始時に投与する。 - 治癒期間中は、マウスをケージに入れて、食べ物や水に自由にアクセスできるようにしてください。治癒期間の後、マウスを安楽死させます。この研究では、安楽死は、誘発用量の3倍(300〜360 mg / kg塩酸ケタミン+ 30〜40 mg / kg塩酸キシラジン)からの注射可能な麻酔薬(腹腔内)の過剰投与とそれに続く断頭によって行われました。
注:麻酔から完全に回復するまで、動物を個々のケージに収容しておくことを強くお勧めします。
5. 間質血管細胞(SVF)のベージュ脂肪細胞への in vitro 分化
- Auneら17に従ってAdipoSPHマウスのiWATからの一次SVFの単離およびプレーティングを行う。AdipoSPHマウスiWAT由来のSVFを完全培地(3.1 g/Lグルコース、0.5 g/L L-アラニル-L-グルタミン、10%FBS、および2.5%P/Sを含むDMEM)を含む6ウェルプレートに1〜2時間播種します。
注:SVF画分には、異なる細胞タイプが混在しています。この段階では、脂肪細胞を生じさせる播種前駆細胞の数を定義することはできない。 - 培地を吸引し、リン酸緩衝生理食塩水(1x PBS)を使用してウェルを2回洗浄し、新鮮な完全培地と交換します。細胞が70%〜80%のコンフルエントに達するまで、37°C、5%CO2、95%の湿度で細胞をインキュベートします。
- 細胞を誘導培地で処理することにより分化を誘導する(0日目)。
注:誘導培地の薬物カクテルは、ベージュ脂肪細胞の分化を増強し、熱発生遺伝子プログラムの発現に必要である17。 - 2日後(2日目)、誘導培地を維持培地と交換します(表2)。
- 2日後(4日目)、維持培地を新しい維持培地(表2)と2〜3日間交換します。
- 前駆脂肪細胞が脂肪細胞に完全に分化するまで(通常、誘導培地の添加後6日)48時間ごとに維持培地を交換します。成熟脂肪細胞は、分化した細胞に脂肪滴がロードされているように見えるため、光学顕微鏡を使用して観察できます。
6. SVFの 体外 AAV感染
注:AdipoSPHマウスiWAT由来のSVFは、Wangら18 によって前述されたように、いくつかの変更を加えてAAVを保有するsgRNA-Prdm16に感染しました。
- ステップ5.1〜5.3で前述したように、細胞が70%〜80%のコンフルエントに達するまで、完全培地を含む6ウェル培養プレート上で細胞を増殖させます。
- 5.6 ×10 10 VG/μLのAAV担持sgRNA-Prdm16を2 mLの完全培地および臭化ヘキサジメトリン(8 μg/mL)と混合します(材料の表を参照)。完全な培地を交換し、AAVを含む完全な培地を添加することにより、細胞を形質導入します。形質導入した細胞を37°C、湿度95%、CO25%で12時間インキュベートします。
- 細胞増殖およびベージュ脂肪細胞への分化のためにステップ5に記載されるように細胞を分割および播種する。
注:酸素消費アッセイでは、24ウェル細胞培養プレートに誘導培地を使用して、ウェルあたり4.0×104 細胞(ステップ6.2から)をシードします。細胞増殖および分化の後続のステップは、ステップ5に記載されるように実行される。酸素消費アッセイは、細胞が80%〜100%のコンフルエントに達し、以前に報告されたように完全に分化したときに実行されます19。
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Representative Results
AdipoSPHマウスは、SPHおよびAdipoq-Creマウス系統を繁殖させることによって開発された。両方のマウス系統は、ハイブリッドC57BL6J-DBA/2Jバックグラウンドにあった(商業サプライヤーによる; 材料表を参照)。SPHマウス系統は、もともとZhouらによって記載された14。
AdipoSPHを介したPrdm16過剰発現によるインビボベージュ脂肪細胞発生
インビボでベージュ脂肪細胞を発達させるこの研究に記載されるモデルの能力を評価するために、Prdm16遺伝子を標的とするsgRNAを保有するAAVをAdipoSPHマウスのiWATに注射した。Prdm16は、ベージュ色の脂肪細胞の発生と機能を決定する確立された転写因子です20,21。ここでは、内因性のPrdm16遺伝子14を標的とする以前にテストおよび検証されたsgRNAを選択したことに言及することが重要です。空のsgRNAを担持したAAVをコントロールとして用いた。AAV注射の10日後に、組織学的および遺伝子発現解析のためにiWATを回収しました(図1A)。予想されたように、AdipoSPHマウス由来のiWATの免疫蛍光画像は、対照群およびPrdm16群の両方においてdCas9の発現を示した(図1B)。さらに、mCherry発現は、対照群およびPrdm16群の両方においてiWATのAAV感染の成功を確認した(図1B)。SPH誘導性Prdm16発現は、iWATへの多房ベージュ脂肪細胞の広範な蓄積を明らかに誘導した(図1B)。さらに、定量的PCR(qPCR)は、対照と比較して、Prdm16群におけるPrdm16および熱発生遺伝子プログラム(Ucp1、Cox8b、Ppargc1a、およびCidea)の発現の増加を明らかにしました(図1C)。
AdipoSPHを介したPrdm16過剰発現によるベージュ脂肪細胞発生の促進とin vitroでの酸素消費の増強
次に、ベージュ脂肪細胞生物学を in vitro で研究するためのこのモデルの適合性を調べた。この目的のために、AdipoSPHマウスのiWATに由来する前駆脂肪細胞を、Prdm16を標的とするsgRNA配列を保持するAAVで形質導入した。分化後7日目に、ベージュ色の脂肪細胞を遺伝子発現および酸素消費量の分析に使用した(図2A)。空のsgRNAをコントロールとして用いた。CREリコンビナーゼによるSTOPコドンの除去とSPH機構の活性化は、アディポネクチンプロモーター/エンハンサーの制御下にあり、成熟脂肪細胞における内因性Prdm16遺伝子の活性化をもたらしたことは注目に値します。遺伝子発現解析により、コントロールと比較してPrdm16過剰発現群における内因性Prdm16遺伝子および熱発生遺伝子の発現増加が確認された(図2B)。SPH誘導ベージュ脂肪細胞が機能的に熱発生性であることを確認するために、初代脂肪細胞に対して高分解能呼吸法アッセイを実施した。呼吸測定データの分析および解釈は、最近記載された22として実施した。SPHによって誘導されたPrdm16発現は、対照細胞よりも高い基礎および最大酸素消費量をもたらしました(図2C)。重要なことに、データは、対照群と比較して、Prdm16群の非共役呼吸(オリゴマイシン非感受性)の増強を示しました(図2C、 表3)。まとめると、これらの結果は、内因性Prdm16のSPH誘導発現が褐変表現型を再現し、従来のPrdm16 Tgマウスで観察された酸素消費率を高めることを明らかにしました。
図1:AdipoSPHマウスの鼠径部白色脂肪組織(iWAT)への内因性Prdm16遺伝子を標的としたアデノ随伴ウイルス(AAV)の注射によるベージュ脂肪の発生。 (A) in vivo ベージュ脂肪細胞実験デザインの概略図(Biorender.com を用いて作成)。(B)iWATの組織学的(ヘマトキシリンおよびエオジン[H&E]染色)画像。スケールバー = 50 μm. (C) Prdm16および熱発生遺伝子(Ucp1、Cox8b、Ppargc1α、およびCidea)の定量的PCR(qPCR;n = 3)。データはSEM±平均値として表されます。 *p < 0.05;対応のないスチューデントのt検定によるPrdm16対コントロール(CTR)のp< 0.01。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:Prdm16過剰発現によるSPH誘導 ベージュ脂肪細胞分化。 (A) in vitro ベージュ脂肪細胞実験デザインの概略図(Biorender.com を使用して作成)。(B)Prdm16および熱発生遺伝子(Ucp1、Cox8b、Ppargc1α、およびCidea;n=3)の相対遺伝子発現。(C)酸素消費率(OCR)、n = 6。データはSEM±平均値として表されます。 *p < 0.05;**p < 0.01;p <0.001で、(B)対応のないスチューデントのt検定と(C)二元配置反復測定ANOVAによるPrdm16対コントロール(CTR)と、それに続くテューキーの検定。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足図1:Prdm16 sgRNAのサンガーシーケンシング。 (A)一本鎖相補的なPrdm16オリゴヌクレオチドのアラインメントを示す模式図。(B)ユニバーサルプライマーを用いたPrdm16 sgRNAのサンガーシーケンシング。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
| 遺伝子 | 種 | フォワード | 逆 | |||||
| 遺伝子発現 | Prdm16 | 鼠 | CAGCACGGTGAAGCCATTC | GCGTGCATCCGCTTGTG | ||||
| Ucp1 | 鼠 | TCTCAGCCGGCTTAATGACTG | GGCTTGCATTCTGACCTTCAC | |||||
| Ppargc1a | 鼠 | AGCCGTGACCACTGACAACGAG | GCTGCATGGTTCTGAGTGCTAAG | |||||
| コックス8b | 鼠 | GAACCATGAAGCCAACGACT | GCGAAGTTCACAGTGGTTCC | |||||
| シデア | 鼠 | ATCACAACTGGCCTGGTTACG | TACTACCCGGTGTCCATTTCT | |||||
| 36B4 | 鼠 | TCCAGGCTTTGGGCATCA | CTTTATCAGCTGCACATCACTCAGA | |||||
| 分子クローニング | sgRNA Prdm16 配列 | 鼠 | CGAGCTGCGCTGAAAAGGGG | CCCCTTTTCAGCGCAGCTCG | ||||
| ユニバーサルプライマー | 鼠 | GAGGGCCTATTTCCC ATGATTCCTTCATAT |
||||||
表1:本試験で使用したプライマー配列。
| 中程度 | 組成 | |||
| 完全な媒体 | L-グルタミンを含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM) | |||
| ウシ胎児血清(FBS)の10% | ||||
| ペニシリン/ストレプトマイシンの2.5% | ||||
| 誘導媒体 | 完全な媒体 | |||
| インドメタシン、最終濃度125μM(エタノール中の0.125Mストック)。注:インドメタシンを溶解するには、90°Cに10秒間加熱する必要があります。 | ||||
| インスリン、最終濃度20 nM(1 mMストック、可溶化するためにHClを1 μL加えます(5.73 mg / mL)。在庫は-20°Cで保管してください。 | ||||
| デキサメタゾン、最終濃度2 μg/mL(エタノール溶液2 mg/mLストック) | ||||
| 3-イソブチル-1-メチルキサンチン(IBMX)、最終濃度500 μM(0.5 M KOH中の0.25 Mストック) | ||||
| 3,3',5-トリヨード-L-チロニン(T3)、最終濃度1 nM(10 μMストック、T3を1 M HClおよびEtOH 1:4に溶解してストック)。 | ||||
| ロシグリタゾン、最終濃度1 μg/mL(エタノール溶液1 mg/mLストック) | ||||
| メンテナンス媒体 | 完全な媒体 | |||
| インスリン、最終濃度20nM(1mMストック)。1 μLのHClを加えて可溶化します(5.73 mg/mL)。 | ||||
| ロシグリタゾン、最終濃度1 μg/mL(エタノール溶液1 mg/mLストック) | ||||
表2:研究に使用された培地の組成。
| パラメーター | クリック率 | PRDM16 | p値 | ||
| ミトコンドリア酸素消費量なし(pモル/分/μgタンパク質) | 8.19±1.40 | 10.80±1.83 | 0.01 | ||
| 基礎呼吸(pモル/分/μgタンパク質) | 28.82±5.20 | 52.58± 13.73 | 0.001 | ||
| 最大呼吸数(pモル/分/μgタンパク質) | 63.81±9.80 | 122.94 ± 22.31 | < 0.001 | ||
| 予備呼吸数(pモル/分/μgタンパク質) | 34.98 ± 11.09 | 70.36 ± 26.06 | 0.006 | ||
| オリゴ非感受性(pモル/分/μgタンパク質) | 8.27±2.29 | 15.85 ± 5.48 | 0.005 | ||
| オリゴ感受性(pモル/分/μgタンパク質) | 20.54 ± 5.68 | 36.72 ± 14.79 | 0.016 | ||
| カップリング効率 | 71.28 ± 1.51 | 69.84±3.05 | 0.163 | ||
| セルRCR | 7.70±1.46 | 7.75±2.43 | 0.485 | ||
表3:SPH誘発ベージュ脂肪細胞の呼吸パラメータ。
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Discussion
CRISPR技術の最も有用な非編集アプリケーションの1つは、CRISPRaシステムを使用した内因性遺伝子の活性化による遺伝子機能の調査です6。SPHは強力なCRISPRaであり、いくつかの神経原性遺伝子を標的とすることによって星状細胞の活性ニューロンへの変換を誘導することが最初に記載されていました14。この研究では、AdipoSPHは、脂肪細胞における内因性Prdm16の発現を活性化することにより、ベージュ脂肪生物学を調査するための適切なツールであることが実証されました。脂肪細胞におけるSPH誘導性Prdm16過剰発現は、熱発生遺伝子プログラムの活性化をもたらし、ブラウニング表現型を誘導し、以前のトランスジェニック(Tg)Prdm16マウスモデル23の表現をコピーする。Prdm16は、茶色とベージュの脂肪分化の調節におけるこの転写因子の中心的な役割、および分化した脂肪細胞における熱発生遺伝子プログラムの調節(例えば、Ucp1発現の増強)に基づいて、ベージュ脂肪細胞を誘導するための標的としてこの研究で選択されました。それにもかかわらず、現在のモデルは、研究者の裁量と研究の目的に応じて、内因性遺伝子の過剰発現を可能にします。
脂肪組織生物学を調査する従来のトランスジェニックモデルは、脂肪細胞に限定されたプロモーター/エンハンサー(Fabp4やアディポネクチンなど)の制御下で導入遺伝子を過剰発現する遺伝子組み換えげっ歯類の開発に依存しています24。現在の技術はこれらのモデルの開発のペースを加速させていますが、それらを開発するためのコストと時間は依然として科学界が経験する共通の問題です。対照的に、AdipoSPHは、従来のTgマウスよりも機能獲得アプローチのための安価で汎用性の高いモデルです。さらに、AdipoSPHは、Tgマウスモデルには特に適していない長いノンコーディングRNAおよび転写産物アイソフォームの研究に適しています。
AdipoSPHはまた、機能獲得実験のための現在の代替アプローチであるAAVの単純な投与と比較して、脂肪組織生物学の調査においていくつかの利点を提示します25。第1に、脂肪組織に送達されたAAVは、導入遺伝子のいくつかのコピーを導入することによって過剰発現を促進する。対照的に、内因性遺伝子のSPH活性化は、より自然な作用機序を表しています。第二に、AAVによって送達される導入遺伝子(構成的プロモーターを使用)は、通常、脂肪組織微小環境内の「あらゆる細胞型」においてそれらの過剰発現をもたらす。対照的に、AdipoSPH誘導性の内因性遺伝子の発現は脂肪細胞に限定される。第三に、パッケージングサイズ(~4.5kb)は、いくつかの導入遺伝子26に対するAAVの典型的な制限である。しかし、AAVを運ぶsgRNAには、カスタマイズされた20ヌクレオチドに対するシンプルで簡単なクローニング戦略が必要です。最後に、AAV投与は通常、体循環に達し、他の組織や臓器に感染します。一部のAAVには、肝臓や心臓などの特定の組織における導入遺伝子の発現を緩和するためのマイクロRNAが含まれていますが25、この戦略では他の組織や臓器でのAAV感染を防ぐことはできません。これに対し、AdipoSPHによる内因性遺伝子の発現は脂肪細胞に限定され、AAVの体循環への漏出を考慮しても同様である。したがって、AdipoSPHは、AAVを運ぶsgRNAの全身投与や、全身エネルギー恒常性の脂肪組織調節の調査にも適したモデルです。
AdipoSPHモデルにはいくつかの利点がありますが、考慮すべき重要な制限があります。AAVは現在、sgRNAのin vivo送達のための最も一般的なプラットフォームです。しかし、AAV製造および免疫学的問題におけるいくつかの課題は未解決のままです26,27。さらに、脂肪組織全体に注入されたAAVの量と分布が異なると、遺伝子発現の組織内および組織間のばらつきが生じます。sgRNAベクタークローニング、AAV産生、およびiWATへのAAVの均質投与は、このプロトコルの成功のための重要なステップであると考えています。最後に、異なるsgRNAは、SPH系14における内因性遺伝子の発現を独特に活性化する。主な推奨事項は、目的の遺伝子の転写開始部位(TSS)の上流200 bp以内に3〜5個のsgRNA配列を設計してテストすることです。したがって、標的遺伝子に最適なsgRNA配列を定義するには、通常、in vivo実験の前に手間のかかるインビトロアッセイが必要です。
AdipoSPHは、脂肪組織生物学の他の側面を調査するための魅力的なモデルでもあります。例えば、脂肪細胞は多数のアディポカインの分泌を促進します28,29;しかし、これらの分子のほとんどの全身への影響はよくわかっていません。AdipoSPHは、成熟脂肪細胞において単一または複数の内因性遺伝子を過剰発現させ、それらの局所的または全身的影響を調べることによって、この問題に対処するのに適したモデルです。したがって、AdipoSPHは脂肪組織の生物学と生理学を研究するためのユニークなツールです。
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Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
著者らは、AdipoSPHマウスの作製、免疫代謝および細胞シグナル伝達研究所、および細胞生物学に適用されるフォトニクスに関する国立科学技術研究所(INFABIC)のすべての実験的支援に対して、Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência em Animais de Laboratório(Cemib)、Unicampから受けた支援に感謝する。サンパウロ研究財団(FAPESP)からの財政的支援に感謝します:2019 / 15025-5;2020/09308-1;2020/14725-0;2021/11841-2.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3,3',5-Triiodo-L-thyronine | Sigma-Aldrich | T2877 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| AAVpro 293T Cell Line | Takarabio | 632273 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filter | Merckmillipore | UFC510008 | 100 KDa |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| Dulbecco's Modification of Eagles Medium (DMEM) | Corning | 10-017-CV | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) F-12, GlutaMAX™ supplement | Gibco | 10565-018 | high concentrations of glucose, amino acids, and vitamins |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| Excelta Self-Opening Micro Scissors | Fisher Scientific | 17-467-496 | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Fisherbrand Cell Scrapers (100 pk) | Fisher Scientific | 08-100-241 | |
| Fisherbrand High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| Fisherbrand Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-940 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-25G | |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| LigaFast Rapid DNA Ligation System | Promega | M8225 | |
| Maxiprep purification kit | Qiagen | 12162 | |
| Microliter syringe | Hamilton | 80308 | Model 701 |
| NEB 10-beta/Stable | New England Biolabs | C3019H | E. coli competent cells |
| pAAV2/8 | Addgene | 112864 | |
| pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry | Addgene | 91947 | |
| pAdDeltaF6 | Addgene | 112867 | |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Polyethylenimine | Sigma-Aldrich | 23966 | Linear, MW 25000 |
| Povidone-iodine | Rioquímica | 510101303 | Antiseptic |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| SacI enzyme | New England Biolabs | R0156 | |
| Surgical Design Premier Adson Forceps | Fisher Scientific | 22-079-741 | |
| Syringe | Hamilton | 475-40417 | |
| T4 DNA Ligase | Promega | M180B | |
| T4 DNA ligase buffer | New England Biolabs | B0202S | |
| T4 PNK enzyme kit | New England Biolabs | M0201S | |
| Tramadol Hydrochloride | SEM | 43930 | |
| Vidisic Gel | Bausch + Lomb | 99620 |
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