Summary
ここでは、ゴナドトロピン放出ホルモン(GnRH)細胞の主要なモジュレーターであるキスペプチンニューロンを含む脳スライスに対して全細胞パッチクランプを実行するためのプロトコルを提示します。キスペプチンニューロンの活動に関する知識を加えることにより、この電気生理学的ツールは、過去20年間に神経内分泌学分野の重要な進歩の基礎として機能してきました。
Abstract
キスペプチンは、視床下部-下垂体-性腺(HPG)軸の成熟と生殖能力に不可欠です。視床下部のキスペプチンニューロンは、視床下部の弓状核と同様に、前腹側脳室周囲核および吻側脳室周囲核に位置し、他の細胞の中でもとりわけゴナドトロピン放出ホルモン(GnRH)ニューロンに投射する。以前の研究では、キスペプチンシグナル伝達がKiss1受容体(Kiss1r)を介して発生し、最終的にGnRHニューロン活性を刺激することが示されています。ヒトおよび実験動物モデルでは、キスペプチンはGnRH分泌を誘導するのに十分であり、その結果、黄体形成ホルモン(LH)および卵胞刺激ホルモン(FSH)の放出を誘導するのに十分である。キスペプチンは生殖機能に不可欠な役割を果たすため、視床下部キスペプチンニューロンの固有の活動が生殖関連の行動にどのように寄与するかを評価し、これらの特性を変化させることができる主要な神経伝達物質/神経調節物質を特定するために取り組んでいます。全細胞パッチクランプ技術は、げっ歯類細胞におけるキスペプチンニューロン活性を調査するための貴重なツールとなっています。この実験技術により、研究者は自発的な興奮性および抑制性のイオン電流、静止膜電位、活動電位の発火、および細胞膜の他の電気生理学的特性を記録および測定できます。本研究では、視床下部キスペプチンニューロンを定義する電気生理学的測定として知られる全細胞パッチクランプ法の重要な側面と、その技術に関する関連する問題の議論をレビューします。
Introduction
ホジキンとハクスリーは、いくつかの科学的研究で説明されている活動電位の最初の細胞内記録を作成しました。この記録は、大きな直径(~500μm)を持つイカ軸索で行われ、軸索の内側に微小電極を配置することができました。この研究は科学研究に大きな可能性を提供し、後に活動電位発生1,2,3,4,5,6,7,8のイオン基盤を研究するために使用された電圧クランプモードの作成に至りました。何年にもわたって、技術は改善され、科学研究に広く適用されるようになりました6,9。Erwin NeherとBert Sakmannによって開始された研究を通じて1970年代後半に行われたパッチクランプ技術の発明により、研究者は単一の電極のみを使用して、ほぼすべてのタイプの細胞における単一のイオンチャネルと細胞内膜電位または電流を記録することができました9,10,11,12.パッチクランプ記録は、培養細胞または組織スライスなどの様々な組織調製物に対して、電圧クランプモード(例えば、電圧依存性電流およびシナプス電流の記録を可能にする)または電流クランプモード(例えば、イオン電流によって誘発される休止膜電位の変化の記録を可能にする)のいずれかで行うことができる。 活動電位、およびシナプス後電位頻度)。
パッチクランプ技術の使用は、いくつかの注目すべき発見を可能にしました。実際、視床下部のキスペプチンニューロンは、第3脳室の吻側脳室周囲領域(RP3V)としても知られる前腹側脳室周囲および吻側脳室周囲核(AVPV/PeNKisspeptin)および視床下部の弓状核(ARHキスペプチン)に位置する視床下部キスペプチンニューロンの電気生理学的特性に関する独創的な発見13,14,15特に興味深いものです。2010年、Ducretらは、別の電気生理学的ツールであるルーズセルパッチクランプ技術を使用して、マウスのAVPV / PeNキスペプチンニューロンの最初の記録を行いました。これらの研究は、AVPV/PeNキスペプチンニューロンの電気的記述を提供し、それらの発火パターンが発情周期依存性であることを示しました16。2011年、Qiuらは全細胞パッチクランプ技術を用いて、ARHキスペプチンニューロンが内因性ペースメーカー電流を発現することを実証した17。続いて、Gottschらは、キスペプチンニューロンが自発的な活動を示し、h型(ペースメーカー)およびT型カルシウム電流の両方を発現することを示し、ARHキスペプチンニューロンが他の中枢神経系ペースメーカーニューロンと電気生理学的特性を共有することを示唆している18。さらに、ARHキスペプチンニューロンは性的に二形性の発火率を示し、AVPV / PeNキスペプチンニューロンはATP感受性カリウムチャネル(KATP)の影響を受ける二峰性の静止膜電位(RMP)を示すことが実証されています19,20。さらに、性腺ステロイドがマウスのキスペプチンニューロンの自発的な電気的活動にプラスの影響を与えることが確立された19,20,21。キスペプチンニューロンの電気生理学的特性を研究した最初の作品は、16,17,18,19,20に言及されています。それ以来、多くの研究が全細胞パッチクランプ技術を使用して、キスペプチンニューロンの電気的活動を調節するのにどの因子/神経調節物質が十分であるかを実証してきました(図1)17、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31,32。
本稿では、再生に必要な神経細胞の研究におけるこの技術の重要性を踏まえ、本稿では、溶液の調製、脳の解剖とスライス、記録のための細胞膜の封印など、全細胞パッチクランプ技術の開発のための基本的な手順について説明します。さらに、その利点、技術的な限界、最適な実験性能のために制御しなければならない重要な変数など、この技術に関する関連する問題が議論されています。
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Protocol
すべての動物の手順は、サンパウロ大学の生物医科学研究所の動物倫理委員会によって承認され、ブラジル動物実験大学によって採用された倫理ガイドラインに従って実施されました。
1.溶液の調製
- 内部溶液の調製
注意: 内部溶液はパッチクランプマイクロピペットを満たし、細胞の内部に接触します( 図2の例を参照)。内部溶液は、測定される活性のタイプに応じて変化し得る33。- 実験目的と適切なレコードタイプを考慮して内部ソリューションを選択します。電流クランプモードで膜電位を記録するには、120 mM K-グルコン酸塩、1 mM NaCl、5 mM EGTA、10 mM HEPES、1 mM MgCl 2、1 mM CaCl2、3 mM KOH、10 mM KCl、および4 mM(Mg)-ATPで構成される内部溶液を使用します。表1に示すように、所望の最終容量に従ってすべての塩を秤量する。
- 溶液の最終体積の90%に達するのに十分な脱イオン水を使用してください。この容量は、pHと浸透圧を調整するのに十分なスペースを確保します。
- すべての成分を完全に添加して混合した後、pHメーターを使用して5 M KOHでpHを7.2〜7.3に調整します。浸透圧計を使用して、約275〜280 mOsmの浸透圧を確認します(必要に応じて、ダウンのみを調整します)。
- 内部溶液を事前に調製し、8°Cで保存してください。 実験当日にATPを追加します。ATP含有内部溶液を-20°C(1 mLアリコート)で3〜4か月間保存します。.
- スライス液の調製
- 238 mM スクロース、2.5 mM KCl、26 mM NaHCO3、1.0 mM NaH 2 PO4、10 mM グルコース、1.0 mM CaCl 2、および5.0 mM MgCl2を含むスライス溶液を調製します。表2に示すように、所望の最終容量に従ってすべての塩を秤量する。調製するこの溶液の正確な量は、切断チャンバのサイズによって異なります。
- 脱イオン水中ですべての塩を混合しながら、常にカルボゲン(95%O 2および5%CO2)で飽和させる。ポリエチレンチューブ(外径1.57 mm[OD] x 内径1.14 mm[ID])をカルボゲンシリンダーに取り付けて、スライス溶液にカルボゲンを供給します。スライス液を含むビーカーの内側にチューブの開放端を保持します。
- すべての成分をよく混ぜた後、pHメーターを使用して10%硝酸でpHを7.3に調整します。浸透圧計を使用して、290〜295 mOsmの浸透圧を確認します(必要に応じて、下方向にのみ調整します)。その後、溶液を0〜2°Cに冷却する。
- 録画用の CSF ソリューションを準備する
- 124 mM NaCl、2.8 mM KCl、26 mM NaHCO3、1.25 mM NaH 2 PO 4、1.2 mM MgSO4、5 mM グルコース、および2.5 mM CaCl2を含む記録用の人工脳脊髄液(aCSF)溶液を調製します。表3に示す所望の最終容量に従って全ての塩を秤量する。
- 脱イオン水中で全ての塩を混合しながら、ステップ1.2.2で説明したように、カルボゲン(95%O2および5%CO2)で絶えず飽和させる。
- すべての成分を加えて混合した後、pHメーターを使用してpHを7.3に調整します(10%硝酸を使用できます)。浸透圧計を使用して、290〜300 mOsmの浸透圧を確認します。その後、aCSFをビーカーに注ぎ、30°Cの水浴中に維持する。
2.脳の解剖とスライス
注:異なる脳構造は異なる平面(冠状、矢状、または水平スライス)での切断を必要とする場合があるため、スライスを取得するための正確なアプローチは、関心のある脳領域によって異なります。典型的には、AVPV/PeNおよびARH(ここではAVPV/PeNキスペプチンニューロンおよびARHキスペプチンニューロンと呼ばれる)におけるKiss1発現細胞を研究する。図2A、B)、冠状脳スライス(200〜300μm)は、通常、17、19、20、21、34で作られる。AVPV / PeNキスペプチンニューロンはブレグマから約0.5〜-0.22 mmに位置し、ARHキスペプチンニューロンは-1.22〜-2.70 mmに位置しています。核位置は、定位固定装置マウス脳アトラス35またはアレンマウス脳参照アトラス(http://mouse.brain-map.org/)を用いて決定することができる。この研究では、成体のKiss1-Cre / GFP雌(発情期)および雄マウス36を使用しました。
- 脳の除去
- 解剖部位と脳の抽出に必要なツールを準備します:断頭ハサミ、アイリスハサミ、カストロビエホ湾曲ハサミ、骨切り、ピンセット、ヘラ、ろ紙、ペトリ皿、かみそりの刃、シアノアクリレート接着剤。
- スライスを作成する前に、その後のすべての手順を迅速に実行する必要があるため、解剖が実行されるベンチを準備します。ビブラトームなどのスライス装置にアクセスできることを確認してください。
- 組織をスライスする前に、脳スライスを維持するための記録チャンバーを準備します。市販ブランド(材料表)から、浴寸法24 mm x 15 mm x 2 mm(長さ x 幅 x 高さ)の記録室を入手するか、社内で作成します。
注:社内回収チャンバーは次のように製造できます:9つのウェルが利用可能になるように24ウェルプレートをカットします。ナイロンスクリーンを9つのウェルのベースに接着します。ウェルプレートの残りの部分で、ナイロンの下部が自由になるようにベースを作ります。この適合ベースは、aCSFを含む500mLビーカーの中に入れることができます(補足図1)。 - すべてを準備した後、4%〜5%イソフルランを使用して吸入麻酔薬で動物を麻酔します。麻酔は、倫理委員会によって承認されたプロトコルに従っていなければなりません。動物が動かなくなった直後に、尾と足のピンチテストを実行して、動物が深く麻酔をかけられていることを確認します。
- 心臓がまだ活動している間にマウスをすばやく斬首して、細胞の生存率を高めます。斬首後すぐに脳を収穫します。
- 外科用ハサミで、動物の頭蓋骨の上部、尾側から吻側まで皮膚を切開し、動物の頭から頭皮を取り除きます。次に、虹彩ハサミで矢状縫合糸に沿って頭頂間板を切り、後頭骨を取り除きます。骨切りを頭頂骨の下にスライドさせ、脳が露出するまでそっと引き出します。
- 脳を露出させた後、頭を逆さまにし、脳をそっと下げて両側の三叉神経を視覚化し、カストロビエホ湾曲ハサミを使用して三叉神経を切ります。視床下部を視覚化した後、視神経を特定し、穏やかに切断します。
注:視神経を切断するときは、視神経を引っ張るとAVPV / PeN核を含む隣接する視床下部領域が裂けるため、注意してください。 - 前頭葉の最も前部を切断し、脳を完全に切除します。スライスを取得するまで、すぐに脳をスライス溶液に浸します。
- 脳サンプルのスライス
- 脳をろ紙(ペトリ皿で支えられている)の上に置き、余分な溶液を乾燥させます。次に、鋭い切断かみそりの刃で、脳幹と小脳を残りの組織から分離する冠状切断を実行します。
- 次に、脳の尾部をビブラトームの基部に接着し、スライス装置のチャンバーに0〜2°Cに冷却したスライス/ aCSF溶液を満たします。 手順の間、ビブラトームチャンバーの周りにドライアイスを詰めて、スライス液を冷たく保ちます。
- かみそりの刃をビブラトームに挿入し、デバイスの適切な切断パラメータを設定します:速度= 3、周波数= 9、および送り= 250μm。アクリルトランスファーピペット(シリコン乳首に取り付けられた逆パスツールガラスピペット)を使用して、組織スライス手順中にスライスを回収チャンバーに移します(ステップ2.1.3で説明)。スライス取得後の組織回復を60分待ちます。
3.記録のためのセルシーリング
- 記録を開始する前に、すべての機器(顕微鏡、アンプ、デジタイザー、マイクロマニピュレーターなど)がオンになっていることを確認してください。
- 顕微鏡に取り付けられた市販ブランド(材料表)の記録室に、記録用のaCSF溶液を充填します。灌流ポンプを使用して、aCSFを2 mL / minの速度で常に灌流します。
- 目的の脳スライスを(一度に1つずつ)記録チャンバーに移します。アクリルトランスファーピペット(シリコン乳首に取り付けられた逆パスツールガラスピペット)を使用して、視床下部スライスをチャンバーに移します。スライスアンカー(材料表)を使用してスライスを保持し、aCSF灌流中にスライスが動かないようにします。
- 顕微鏡に取り付けられた記録室の中央にスライスを置きます。スライス位置は、顕微鏡下で目的の領域をよく観察し、記録マイクロピペットに完全に到達させるために重要です。
- 液浸顕微鏡の低倍率対物レンズ(10倍または20倍)を使用して、スライスの位置決めと関心領域の位置決めを支援します。
- 関心領域を特定した後、対物レンズを高倍率レンズ(63倍)に切り替えて組織レベルに焦点を合わせ、内因性蛍光タンパク質および標的領域内の細胞の形状を観察して、脳スライス20の表面上のキスペプチン細胞を見つける。
- 可能なターゲットセルが見つかったら、マウスカーソルを使用するか、関心のある領域に正方形などのフォーマットを描画して、コンピューター画面上でマークします。コンピューターのスクリーンマークは、記録マイクロピペットの位置をセルに導くのに役立ちます。
- ターゲットセルの正確な位置を決定したら、対物レンズを持ち上げ、内部溶液で満たされた記録マイクロピペットを導入します。マイクロピペットを電極ホルダーに入れるときは、内部溶液が銀電極に接触していることを確認してください。
注意: マイクロピペットの準備、配置、および電極ホルダーへの位置決めについては、33を参照してください。 - マイクロピペットをaCSF溶液に浸す前に陽圧をかけ、破片がマイクロピペットに入るのを防ぐために、ポリエチレンチューブ(≈130 cm長い)を介してマイクロピペットホルダーに接続された1〜3 mLの空気充填シリンジを使用します。約100〜200μLの空気を塗布します。
- マイクロマニピュレーターを使用して、マイクロピペットを対物レンズの中央の下にガイドします。マイクロマニピュレーターのボタンを動かして、X-Y-Z軸上のマイクロピペットを目的のセルに向かってガイドします。
- マイクロピペットの先端が見えるようにフォーカスを調整し、フォーカスをスライスに近づけすぎないようにします。マイクロマニピュレーターの速度を落とし、マイクロピペットを焦点面までゆっくりと下げます。マイクロピペットチップがスライスに突然浸透するのではなく、細胞/標的領域の表面に触れるまでゆっくりと下降することを確認してください。
- マイクロピペットホルダーに取り付けられた1〜3 mLの空気充填シリンジを使用して、軽い陽圧(≈100 μL)を適用して、アプローチパスから破片を取り除きます。
- ターゲットセルに焦点を合わせ、マイクロマニピュレーターをX-Y-Z軸上でゆっくりと動かして、マイクロピペットをターゲットセルに近づけます。マイクロピペットを細胞に触れると、マイクロピペットチップに加えられる圧力によって引き起こされるディンプルが観察されます(図2C)。
- ディンプルを形成した後、マイクロピペットが細胞に近接しているため、マイクロピペットホルダーに接続されたチューブを介して口から弱く短時間吸引し(1〜2秒)、マイクロピペットとセルの間にシールを生成します(ギガオームシールまたはギガシール>1GΩ; 図2D)。シールを形成するには、ソフトウェアの電圧クランプモードを使用します。シール形成の詳細については、33を参照してください。
- シールが安定している場合(ギガオームシールは機械的に安定しており、ノイズ干渉がなく、約1分間の観察によって決定される)、保持電圧を目的のセルの最も近い生理学的静止電位に設定します。キスペプチン視床下部ニューロンの場合、-50mVが推奨されます。
- 細胞に密封されたマイクロピペットで口から短時間吸引(陰圧)を加え、原形質膜を破壊します(図2E)。破裂したメンブレンがマイクロピペットを詰まらせず、メンブレンのかなりの部分またはセルを引き付けないように、十分な力で吸引が行われると、適切な全セル構成が達成されます。
- 使用しているシステム設定マニュアルを確認してください。ソフトウェア( 材料表を参照)を使用して、直列抵抗(SR)とセル全体の容量(wcc)をデジタルで確認および計算します。
- 電圧クランプモードでは、細胞膜を破壊した後、セル全体オプションを有効にし、セルタブ全体を参照して自動コマンドをクリックします。セルのSRとwccは自動的に計算され、ソフトウェアによって即座に表示されます。これらのパラメータは、 材料表33に記載されている増幅器で膜試験を行うことによっても確認することができる。
- 細胞生存率パラメータを必ず確認してください。キスペプチンニューロンの場合、電気生理学的測定値がSR < 25 mΩ、入力抵抗>0.3 GΩ、および保持電流絶対値が30 pA<であることを確認します(個人的な観察および参考文献21)。AVPV/PeNキスペ プチンまたはARHキスペプチン ニューロンのwccの平均値は、生殖腺インタクトマウスでは10-12pF≈20である。
- 実験中にSRとセルの定常静電容量を監視します。記録中にSRが20%を超えて変化せず、膜静電容量が安定していることを確認してください。
- ソフトウェアの設定を確認してください。実験の種類に応じて、録音用の特定のプロトコルを作成します。 材料表に記載されている機器を使用して、電流クランプモードで膜電位を記録するには、2〜4 kHzで電気生理学的信号をローパスフィルタリングし、ソフトウェアでオフラインで結果を分析します(ソフトウェア情報については、 材料の表 を参照してください)。
- セル全体の構成が適切に達成されたら、電圧クランプモードでシナプス電流を測定します(図2G)。静止膜電位(RMP)の変化と電流クランプモードでの誘導RMP変動を記録します(図2H)。細胞膜の脱分極などのRMPの変化は、 図1に示すように、既知の薬物/神経伝達物質を浴に投与することによって誘発できます(ステップ3.2に記載)。
注意: 電流クランプモードでは、正または負の電流を注入して、膜電圧を目的の電圧に保持できます。キスペプチンニューロンの場合、通常、膜電位の自発的な変化を記録するためにゼロ電流注入(I = 0)を設定します。
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Representative Results
視床下部キスペプチンニューロンの活動に対するヒト組換え成長ホルモン(hGH)の可能な影響を研究するために、脳スライスで全細胞パッチクランプ記録を行い、このホルモンがAVPV / PeNキスペプチンおよびARHキスペプチンニューロンの活性に急性変化を引き起こすかどうかを評価しました。この研究では、成体のKiss1-Cre / GFP雌(発情期)および雄マウス36を使用しました。視床下部キスペプチンニューロンの特性は性ステロイドレベル19,20によって異なる可能性があるため、生殖腺無傷の動物を実験用に選択しました。男女間の違いを評価することは本研究の範囲を超えていましたが、詳細についてはCroftらおよびFrazãoら19,20を参照してください。マウスやラットなどの遺伝子改変動物は、特定の遺伝子または選択的誘導アブレーションを発現する細胞がGFPなどの蛍光タンパク質によって同定できるため、このタイプの実験のためのエキサイティングなツールを表しています23、26、36。遺伝子改変マウスの使用は、キスペプチンニューロン活性の理解におけるブレークスルーを表しています。
記録されたニューロン(12匹中26個の細胞)を、神経解剖学的特徴35 および内因性GFP20の発現に従って決定した。電流クランプモードでは、ニューロンは全細胞パッチクランプ構成でI = 0の下で記録されました。AVPV/PeNキスペプチン ニューロン(9匹の動物から12個の細胞)は、平均RMPが-59.0 mV±3.0 mV(範囲:-75 mV〜-46 mV)、入力抵抗が0.9 ± 0.1 GΩ、wccが12.3 pF ± 1.6 pF、SRが19.4 ± 1.9 mΩを示しました。記録されたニューロンのうち、12個のAVPV/PeNキスペプチン 細胞のうち3個が安静時に活動電位(AP)の自発放電を示した(0.1 Hz±0.06 Hz;自発的に活動する細胞の平均RMPは-50.7 mV±2.7 mV)。ARHキスペプチン ニューロン(12匹の動物から14細胞)の平均RMPは-50.0 mV±1.5 mV(範囲:-62 mVから-39 mV)であり、平均入力抵抗は1.7 ± 0.1 GΩ、wccは9.2 pF±0.7 pF、SRは16.9 ± 1.7 mΩでした。ほとんどのARHキスペプチン ニューロンは静止していたが、14細胞中4細胞は静止時に自発的APを示した(0.9Hz±0.5Hz;自発的に活性な細胞の平均RMPは-52.7mV±1.4mVであった)。
hGH(20μg/g)を浴に投与すると、記録されたニューロンの多く、12個のAVPV / PeNキスペプチンニューロンのうち5個(9匹のマウスの細胞の≈55%)、および記録された14個のARH キスペプチンニューロンのうち9個(12匹のマウスの細胞の≈65%、p = 0.0006、フィッシャーの正確確率検定;図3)。AVPV/PeNキスペプチンおよびARHキスペプチン過分極ニューロンは、非応答細胞と比較してRMPを有意に変化させた(図3B、E;マン・ホイットニー検定)。RMPに対する効果(図3C、F;反復測定ANOVAおよびテューキーの事後試験)に続いて、AVPV/PeNキスペプチンに対する全細胞入力抵抗(IR)の有意な低下(0.9 ± 0.1 GΩから0.7 ± 0.1 GΩ、p = 0.02;図3D)、およびhGH適用中のARHキスペプチン(1.7 ± 0.1GΩから1.0 ± 0.1GΩ、p < 0.0001;反復測定ANOVAおよびテューキーの事後試験;図3G)ニューロン。さらに、hGH過分極ニューロンの自発的AP(fAP)の頻度は、両方の細胞集団で減少しました(AVPV / PeNキスペプチンでは0.1 Hz±0.06 Hz〜0.0 Hz±ARHキスペプチンニューロンでは0.1 Hz±0.5 Hz〜0.2 Hz±0.1 Hz)。しかし、この減少の程度は統計的有意性のレベルに達しなかった(p > 0.05、マン・ホイットニー検定)。hGHウォッシュアウト後、RMPおよびIRはベースラインに回復した(図3A、C、D、F、G)。残りのキスペプチンニューロンはhGH投与に応答しなかった。
我々は以前、pGHが視床下部キスペプチンニューロン活性に影響を及ぼさないことを実証した(Silveira et al.25;図3H)。注目すべきことに、hGHはGH受容体に加えてプロラクチン(PRL)受容体を活性化できることが知られている37,38。さらに、PRLはマウスのAVPV / PeNキスペプチンニューロンのわずか≈20%のみを間接的に脱分極します24。対照的に、PRLは、ARHキスペプチン細胞24の高速シナプス伝達を調節しない。したがって、ここで報告されているhGH誘発過分極効果は非特異的であるように思われる。観察された違いは、以前に報告されているように、薬物濃度、種差(ヒト対マウス)、または使用された薬物の組成中の塩の存在などの変数に依存する可能性があります28。
図1:キスペプチンニューロンの活動に関する知識に対する全細胞パッチクランプ技術の貢献を要約した概略図。キスペプチンニューロン(緑色で表示)は、視床下部の前腹側脳室周囲および吻側脳室周囲核(AVPV / PeN)および弓状核(ARH)に位置しています。AVPV/PeNキスペプチンおよびARHキスペプチン細胞は、視索前野(POA)に位置する性腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)ニューロンの体細胞およびそれらの末端が中央隆起(ME)に直接接続し、視床下部-下垂体軸(HPG)の調節で最高潮に達します。ホルモンなどのさまざまな神経調節物質が、AVPV / PeNキスペプチンおよびARHキスペプチンニューロンの活性を差動的に調節することが示されています。静止膜電位に対する可能な影響は、全細胞パスクランプ技術および電流クランプ記録を使用して得られた代表的なトレースによって概略的に実証されています。赤色は、特定の神経伝達物質が休止膜電位(RMP)の脱分極を誘発することを示しています17,22,24,26,28,29,30,31,32;青色はRMP24、25、26、27、30に影響がないことを示します。破線は RMP を示します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:全細胞パッチクランプ技術によって目的の細胞のシーリングを得るための基本的なステップ。 (A,B)前腹側脳室周囲核(AVPV)および視床下部の弓状核(ARH)にキスペプチン細胞を含む脳スライス(250μm)の代表的な顕微鏡写真。キスペプチンニューロンは、緑色蛍光タンパク質(GFP)発現によって同定された。(c)細胞に十分近いマイクロピペット(電解質溶液[内部溶液]を含む)が細胞に十分接近して、細胞膜にディンプルを作成してシールを行うことを示す顕微鏡写真。(D,E)細胞膜をマイクロピペット(D)に密封するには、穏やかな陰圧(ヘッドステージとマイクロピペットに取り付けられたチューブで行われる口の吸引)が必要です。原形質膜破裂を誘発するには、陰圧(軽度および短時間)の2回目の適用が必要です(E)。(F)細胞活性の登録は、パッチクランプ実験に使用される機械的セットアップによって実行されます。原形質膜を破壊した後、パッチされたセル内のイオンチャネルを流れる電流は、高感度アンプに接続された電極によって記録することができる。帰還抵抗は、電圧クランプ(G)または電流クランプ(H)の記録に必要な電流を生成します。略語:3V =第三脳室;ME =中央値の卓越性。スケールバー:A = 130 μm、B = 145 μm、C = 20 μm、D = 15 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:薬物特異性の試験。 (A)ヒト組換え成長ホルモン(hGH)が視床下部の弓状核に位置するキスペプチンニューロン(ARHキスペプチン)の休止膜電位(RMP)の過分極を誘導したことを示す代表的な電流クランプ記録。(B-G)前腹側脳室周囲および吻側脳室周囲核(AVPV / PeNキスペプチン)(B-D)またはARH(E-G)に位置するhGH応答性キスペプチンニューロンの静止膜電位(RMP)(B,C,E,F)および平均入力抵抗(IR)(D,G)の平均変化を示す棒グラフ).ブタ成長ホルモン(pGH)がARHキスペプチンニューロンのRMPに影響を及ぼさないことを実証する代表的な電流クランプ記録は、以前に報告された25(H)である。使用される有意性検定は、(B)と(E)のマンホイットニー検定、および(C、D、F、G)の反復測定ANOVAとテューキーの事後検定です。破線は RMP を示します。*p = 0.02;**p = 0.004,****p = 0.0003;p < 0.0001この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 内部溶液 (100 mL) | |||
| 塩 | FW (グラム/モル) | 濃度 | 重量(g) |
| K-グルコン酸塩 | 234.2 | 120ミリメートル | 2.81 |
| ナトリウム | 58.4 | 1.0ミリメートル | 0.006 |
| KCl | 74.5 | 10ミリメートル | 0.074 |
| ヘペス | 238.3 | 10ミリメートル | 0.24 |
| エグタ | 380.3 | 5.0 ミリメートル | 0.19 |
| 塩化カルシウム2 | 147.0 | 1.0ミリメートル | 0.015 |
| マグネシウムCl2 | 203.0 | 1.0ミリメートル | 0.02 |
| 島 | 56.11 | 3.0 ミリメートル | 0.017 |
| アメリカ総代理店 | 507.18 | 4.0 ミリリットル | 0.20 |
| pH = 7.3 / 浸透圧 = 275 - 280 mOsm | |||
表1:内部溶液を調製するための試薬。 この表には、分子量(FW)、所望の濃度、および100mLの溶液を調製するための塩の計算重量が含まれています。
| aCSF/スライシング溶液 (250 mL) | |||
| 塩 | ティッカー | 濃度 | 重量(g) |
| 蔗糖 | 342.3 | 238ミリメートル | 18.5 |
| ティッカー | 74.5 | 2.5 ミリリットル | 0.046 |
| ナトリウム3 | 84.0 | 26ミリメートル | 0.546 |
| NaH2PO4 | 120.0 | 1.0ミリメートル | 0.03 |
| マグネシウム2 | 203.0 | 5ミリメートル | 0.254 |
| D-グルコース | 180.2 | 10ミリメートル | 0.450 |
| 塩化カルシウム2 | 147.0 | 1.0ミリメートル | 0.037 |
| pH = 7.3 / 浸透圧 = 290 - 295 mOsm | |||
表2:スライス液を調製するための試薬。 この表には、分子量(FW)、所望の濃度、および250mLの溶液を調製するための塩の計算重量が含まれています。脳はスライスされるためにこの溶液に沈められます。
| 記録用aCSF (1 L) | |||
| 塩 | ティッカー | 濃度 | 重量(g) |
| ナトリウム | 58.4 | 135ミリメートル | 7.88 |
| ティッカー | 74.5 | 3.5ミリメートル | 0.261 |
| ナトリウム3 | 84.0 | 26ミリメートル | 2,184 |
| NaH2PO4 | 120.0 | 1.25 ミリメートル | 0.150 |
| マグネシウム4 | 246.5 | 1.2ミリメートル | 0.296 |
| D-グルコース | 180.2 | 10ミリメートル | 1,802 |
| 塩化カルシウム2 | 147.0 | 1.0ミリメートル | 0.148 |
| pH = 7.3 /浸透圧= 290-300 mOsm | |||
表3:記録用のCSFを調製するための試薬。 この表には、分子量(FW)、所望の濃度、および1Lの溶液を調製するための塩の計算重量が含まれています。
補足図1:自社製の回収室の例。 (A,B)社内回収チャンバーは次のように製造できます:9つのウェルが利用可能になるように24ウェルプレートをカットします。ナイロンスクリーンを9つのウェルのベースに接着します。ウェルプレートの残りの部分で、ナイロンの下部が自由になるようにベースを作ります。(C)この適合ベースは、カルボゲン(95%O2および5%CO2)で常に飽和した人工脳脊髄液(aCSF)を含む500mLビーカーの中に入れることができます。(D)回収チャンバーを保持するビーカーは、実験中は水浴中に保持される。(E,F)アクリルトランスファーピペットを使用して、脳スライスを回収チャンバーに移します。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
全細胞パッチクランプ技術の開発は科学界に大きな影響を与え、科学研究を発展させ、いくつかの発見を可能にするために最も重要であると考えられていました。科学への影響は、1991年にノーベル医学賞を受賞するのに十分であり、この発見は、生理学的および病理学的条件下でイオンチャネルがどのように機能するかについてのより良い理解と、治療薬の潜在的な標的の特定への扉を開いた11,39,40,41。.医学の分野では、この技術を使用して行われた優れた発見の1つは、臨床的に使用されるいくつかの物質(局所麻酔薬、抗不整脈薬、抗糖尿病薬、筋弛緩薬など)がイオンチャネルと直接相互作用することでした42。したがって、その適用可能性は臨床研究所や基礎研究部門で明らかです。この記事では、視床下部キスペプチンニューロンを含む脳スライスで全細胞パッチクランプ実験を実行するための基本的な準備のプロトコルについて説明します。基本的な手順を概説し、組織を入手し、パッチクランプ技術の溶液を調製するために制御しなければならない注目すべきパラメータを強調します。ただし、この記事では、この手法の複雑さと、各タイプの記録、特に分析に関連するメカニズムを完全に説明することはできません。さらなる理論的学習のために、パッチクランプ技術に関するいくつかの本とレビューが推奨されます10,43,44,45,46。
パッチクランプ法で使用される各ソリューションには特定の目的があります。したがって、その特定の組成と基準は、準備中に厳密に採用する必要があります。たとえば、内部溶液の組成は、測定する電流の種類によって異なるため、実験の目的に応じて決定する必要があります。ここで言及した塩化物ベースの溶液は、Cl−(15mM)が細胞質47の生理学的濃度を模倣し、能動的および受動的ニューロン特性またはシナプス入力に対する応答を研究するために利用される。内部溶液中の塩化物含有量が塩化物平衡電位を細胞記録に最適なレベルに保つことを強調することが重要である(言及された溶液ECLでは、約-59mVである)。細胞内塩化物濃度は、GABAA受容体を通る全ての電流がCl−21,48によって運ばれると仮定して、GABA誘発電流(EGABA)の反転電位を評価することによって推定することができる。視床下部キスペプチンニューロンの研究のためには、ARHキスペプチンの細胞内Cl-濃度がAVPV / PeNキスペプチン細胞よりも高いことを考慮する必要があります21。実験を計画するときは、この特性を考慮する必要があります。内部溶液の浸透圧は、腫脹および/または細胞の弱体化の可能性によるシールの喪失を避けるために、記録用のaCSFの浸透圧よりも少なくとも5%低いことが推奨される33,47。ビオシチンや細胞内色素(例えば、Alexa Fluor 594)などの細胞マーカーとしてさらに使用できる細胞内化合物を内部溶液に添加する必要がある場合、浸透圧を常に維持できるようにK+レベルを低下させてもよい20、47、49、50。
迅速な脳解剖を行い、適切なスライス溶液でスライス中に低温(0〜2°C)を維持することが重要です。スライスソリューションは、評価される細胞および/または脳領域の種類によって異なる場合があります33,47。脳スライスを得るために用いられるaCSF溶液(すなわち、スライス溶液)は、通常、記録用のaCSFとは異なる組成を有する(比較のために、表2および表3を参照されたい)。陽イオン(Ca2+およびMg2+)濃度は、ニューロンの興奮性を改変するために調整することができ、これはまた、発火閾値および神経伝達物質の放出47にも影響を及ぼし得る。低Ca2+および高Mg2+培地は、起こりうる興奮毒性プロセスを最小化するために広く利用されている(詳細については、51を参照されたい)。加えて、低Ca2+および高Mg2+媒体は、視床下部ニューロン活動を刺激することができる52。録音用のaCSFに関しては、いくつかの特性が似ています。緩衝系はNaHCO3に基づいており、高NaCl濃度(一般に>100mM)および低KCl濃度(一般に<5mM)、Ca2+およびMg2+(2:1がよく使用される)の相対濃度は通常約2mMであり、グルコースレベルは1〜10mM47の範囲であり得る。溶液の浸透圧、pH、または温度変化(30〜32°Cになるようにデジタル制御)の変動に加えて、実験プロトコル中に実験を実質的に妨害する他の問題が発生する可能性があることを強調することが重要です。電気生理学的測定は、記録中に安定している必要があり、変動には重要な読み取り値が必要です。たとえば、SRの変更は、全セルモードでのセルラーアクセスを考慮し、測定された電流と電位に大きな影響を与えます。さらに、考慮しなければならないパッチクランプ方法論に関連する関連する制限は、形態学的および機能的変化を誘発する可能性のある過度の吸引/圧力プロトコルによる細胞の機械的過剰刺激であることを強調することが重要です53。このバイアスは、適用される吸引強度を正確に制御できるデバイスではなく、吸引が口から行われるプロトコルでは制御が難しいことがよくあります。さらに、細胞死亡率の高い割合で最高潮に達する組織関連の問題は、研究者が観察によって特定できない不十分な解剖、低酸素症、またはマウスの健康状態が原因で発生する可能性があります。
全細胞パッチクランプ技術の主な利点は、関心のある特定の脳領域のニューロンを正確に記録できることです。この技術は、遺伝子組み換え動物の作成から多大な恩恵を受けています。私たちのグループは通常、Kiss1遺伝子プロモーターの下でhrGFPを発現するマウスモデル、またはKiss1遺伝子プロモーターの下でCre-リコンビナーゼを発現し、Cre条件発現下でGFPを発現するマウスモデルで研究しています。しかし、今日では多くの検証済みの動物モデルがあります23,26,36。さらに、血液脳関門の欠如、および細胞外および細胞内環境を容易に制御および操作できるという事実は、この方法の利点を表す。ただし、必ずしも生理学的状態を表すわけではありません。インビボ調製物、または細胞質イオン濃度を維持することを目的とした他の記録タイプ、例えばオンセルまたは穿孔パッチ記録と比較したこの技術の限界の中で、全細胞構成の侵襲性が細胞質内容物の透析を引き起こすことに言及することが重要である54。透析は、いくつかの現象が発達または発現されるのに必要な分子的側面の中断を引き起こす可能性がある。スライスから記録することにより、ニューロンの投影のほとんどがセクション化されていることを覚えておく必要があります。したがって、この混乱が観察された影響または生理学的状態にどの程度影響するかを評価することは、技術の範囲外です。前述のように、視床下部キスペプチンニューロン17,19,20,21,34の活動を研究するために、通常、200〜300μmの冠状脳スライスが行われる。より厚い脳スライスセクションを使用してキスペプチン細胞を研究し、特定のAVPV / PeNまたはARH接続を維持する異なるスライス角度を使用することの制限55は、さらなる調査が必要です。さらに、ニューロンのRMPに対するホルモン/薬物(合成かどうかにかかわらず)の効果をテストすることにより、いくつかの研究は、薬物EC50(既知の場合)または特定の濃度が発火速度の活性化または変化に有効であることを実証する公開データに基づいています[Ca 2+]iレベル。ただし、精製された合成薬物は、他の同様の薬物と比較して、拮抗作用を有する可能性があるため、実験に使用する薬物の組成/特異性に注意する必要があります28。以前に実証されたように25、精製されたpGHは視床下部のキスペプチンニューロン活動に影響を及ぼさないが、hGHは物議を醸すデータを生成した(図3を参照)。ARHに対するインスリン効果を評価した場合にも同様の結果が実証された28。したがって、実験を計画し、得られた結果を解釈する際には、薬物特異性を考慮する必要があります。
パッチクランプ技術は、ニューロンの電気的活動に関するデータを取得するための優れたツールであり、キスペプチンニューロンなどのいくつかのニューロン集団の知識に大きく貢献しています。ここで提供される詳細のほとんどは、以前に報告したように、視床下部ニューロンの記録に一般的に使用されます25,50,56,57,58,59,60。重要なことに、キスペプチンニューロン以外の他のニューロン集団を記録するには、細胞容量、SR、入力抵抗、細胞発火パターン、およびその他のパラメータなど、細胞タイプの識別に役立つ電気生理学的測定値を知っているか、決定する必要があります。これらの特性は、異なる脳細胞、脳核、および循環性ステロイドレベル16、19、20、21、61などの生理学的または誘発された条件の間で異なり、結果の批判的分析を実質的に妨げる可能性があります。さらに、この技術を使用するには、組織調製に関与する可能性のある変数と、それに関連する利点と制限を理解する必要があります。プロトコルに含まれる変数の変更は結果を大幅に妨げる可能性があるため、ここで説明するすべての手順は慎重に実行する必要があります。
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Disclosures
宣言される利益相反はありません。
Acknowledgments
本研究は、サンパウロ研究財団[FAPESP助成金番号:2021/11551-4(JNS)、2015/20198-5(TTZ)、2019/21707/1(RF)、およびCoordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) - Finance Code 001" (HRV)の支援を受けた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Compounds for aCSF, internal and slicing solutions | |||
| ATP | Sigma Aldrich/various | A9187 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich/various | C7902 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich/various | G7021 | |
| EGTA | Sigma Aldrich/various | O3777 | |
| HEPES | Sigma Aldrich/various | H3375 | |
| KCL | Sigma Aldrich/various | P5405 | |
| K-gluconate | Sigma Aldrich/various | G4500 | |
| KOH | Sigma Aldrich/various | P5958 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich/various | M9272 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich/various | 230391 | |
| NaCl | Sigma Aldrich/various | S5886 | |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich/various | S5011 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich/various | S5761 | |
| nitric acid | Sigma Aldrich/various | 225711 | CAUTION |
| Sucrose | Sigma Aldrich/various | S1888 | |
| Equipments | |||
| Air table | TMC | 63-534 | |
| Amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | |
| Computer | various | - | |
| DIGIDATA 1440 LOW-NOISE DATA ACQUISITION SYSTEM | Molecular Devices | DD1440 | |
| Digital peristaltic pump | Ismatec | ISM833C | |
| Faraday cage | TMC | 81-333-03 | |
| Imaging Camera | Leica | DFC 365 FX | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | Roe-200 | |
| Micropipette Puller | Narishige | PC-10 | |
| Microscope | Leica | DM6000 FS | |
| Osteotome | Bonther equipamentos & Tecnologia/various | 128 | |
| Recovery chamber | Warner Instruments/Harvard apparatus | - | can be made in-house |
| Recording chamber | Warner Instruments | 640277 | |
| Spatula | Fisher Scientific /various | FISH-14-375-10; FISH-21-401-20 | |
| Vibratome | Leica | VT1000 S | |
| Water Bath | Fisher Scientific /various | Isotemp | |
| Software and systems | |||
| AxoScope 10 software | Molecular Devices | - | Commander Software |
| LAS X wide field system | Leica | - | Image acquisition and analysis |
| MultiClamp 700B | Molecular Devices | MULTICLAMP 700B | Commander Software |
| PCLAMP 10 SOFTWARE FOR WINDOWS | Molecular Devices | Pclamp 10 Standard | |
| Tools | |||
| Ag/AgCl electrode, pellet, 1.0 mm | Warner Instruments | 64-1309 | |
| Curved hemostatic forcep | various | - | |
| cyanoacrylate glue | LOCTITE/various | - | |
| Decapitation scissors | various | - | |
| Filter paper | various | - | |
| Glass capillaries (micropipette) | World Precision Instruments, Inc | TW150F-4 | |
| Iris scissors | Bonther equipamentos & Tecnologia/various | 65-66 | |
| Pasteur glass pipette | Sigma Aldrich/various | CLS7095B9-1000EA | |
| Petri dish | various | - | |
| Polyethylene tubing | Warner Instruments | 64-0756 | |
| Razor blade for brain dissection | TED PELLA | TEDP-121-1 | |
| Razor blade for the vibratome | TED PELLA | TEDP-121-9 | |
| Scissors | Bonther equipamentos & Tecnologia/various | 71-72, 48,49; | |
| silicone teat | various | - | |
| Slice Anchor | Warner Instruments | 64-0246 | |
| Syringe filters | Merck Millipore Ltda | SLGVR13SL | Millex-GV 0.22 μm |
| Tweezers | Bonther equipamentos & Tecnologia/various | 131, 1518 |
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