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Neuroscience

Les neurones hypothalamiques de kisspeptine comme cible pour les enregistrements de patch-clamp à cellules entières

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/64989
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Anatomy, Instituto de Ciencias Biomedicas, Universidade de Sao Paulo

Summary

Ici, nous présentons un protocole pour effectuer une pince de patch à cellules entières sur des tranches de cerveau contenant des neurones kisspeptine, le principal modulateur des cellules de l’hormone de libération des gonadotrophines (GnRH). En ajoutant des connaissances sur l’activité des neurones kisspeptine, cet outil électrophysiologique a servi de base à des progrès significatifs dans le domaine de la neuroendocrinologie au cours des 20 dernières années.

Abstract

Les kisspeptines sont essentielles à la maturation de l’axe hypothalamo-hypophyso-gonadique (HPG) et à la fertilité. Les neurones hypothalamiques kisspeptine situés dans le noyau périventriculaire antéroventral et le noyau périventriculaire rostral, ainsi que le noyau arqué de l’hypothalamus, projettent les neurones de l’hormone de libération des gonadotrophines (GnRH), entre autres cellules. Des études antérieures ont démontré que la signalisation de la kisspeptine se produit par le récepteur Kiss1 (Kiss1r), ce qui stimule finalement l’activité neuronale de la GnRH. Chez l’homme et les modèles animaux expérimentaux, les kisspeptines sont suffisantes pour induire la sécrétion de GnRH et, par conséquent, la libération d’hormone lutéinisante (LH) et d’hormone folliculostimulante (FSH). Puisque les kisspeptines jouent un rôle essentiel dans les fonctions de reproduction, les chercheurs travaillent à évaluer comment l’activité intrinsèque des neurones hypothalamiques kisspeptine contribue aux actions liées à la reproduction et à identifier les neurotransmetteurs/neuromodulateurs primaires capables de modifier ces propriétés. La technique de patch-clamp à cellules entières est devenue un outil précieux pour étudier l’activité des neurones kisspeptine dans les cellules de rongeurs. Cette technique expérimentale permet aux chercheurs d’enregistrer et de mesurer les courants ioniques excitateurs et inhibiteurs spontanés, le potentiel de membrane au repos, le potentiel d’action et d’autres propriétés électrophysiologiques des membranes cellulaires. Dans la présente étude, des aspects cruciaux de la technique de patch-clamp à cellules entières, connus sous le nom de mesures électrophysiologiques qui définissent les neurones hypothalamiques de la kisspeptine, et une discussion des questions pertinentes concernant la technique, sont examinés.

Introduction

Hodgkin et Huxley ont fait le premier enregistrement intracellulaire d’un potentiel d’action décrit dans plusieurs études scientifiques. Cet enregistrement a été réalisé sur l’axone du calmar, qui a un grand diamètre (~500 μm), permettant de placer une microélectrode à l’intérieur de l’axone. Ce travail a fourni de grandes possibilités pour la recherche scientifique, aboutissant plus tard à la création du mode tension-pince, qui a été utilisé pour étudier la base ionique de la génération de potentiel d’action 1,2,3,4,5,6,7,8. Au fil des ans, la technique a été améliorée et elle est devenue largement appliquée dans la recherche scientifique 6,9. L’invention de la technique du patch-clamp, qui a eu lieu à la fin des années 1970 grâce à des études initiées par Erwin Neher et Bert Sakmann, a permis aux chercheurs d’enregistrer des canaux ioniques uniques et des potentiels ou courants de membrane intracellulaire dans pratiquement tous les types de cellules en utilisant une seule électrode 9,10,11,12 . Les enregistrements patch-clamp peuvent être effectués sur une variété de préparations tissulaires, telles que des cellules cultivées ou des tranches de tissus, soit en mode de serrage de tension (maintien de la membrane cellulaire à une tension définie permettant l’enregistrement, par exemple, de courants dépendants de la tension et de courants synaptiques) ou en mode de pince de courant (permettant l’enregistrement, par exemple, des changements dans le potentiel de membrane au repos induits par les courants ioniques, les potentiels d’action et la fréquence du potentiel postsynaptique).

L’utilisation de la technique patch-clamp a rendu possible plusieurs découvertes notables. En effet, les résultats fondamentaux sur les propriétés électrophysiologiques des neurones hypothalamiques kisspeptine situés au niveau des noyaux périventriculaire antéroventrulaire et périventriculaire rostral (AVPV/PeNKisspeptin), également connu sous le nom de zone périventriculaire rostrale du troisième ventricule (RP3V), et le noyau arqué de l’hypothalamus (ARHkisspeptine)13,14,15 présentent un intérêt particulier. En 2010, Ducret et al. ont effectué les premiers enregistrements de neurones AVPV / PeNKisspeptinchez la souris en utilisant un autre outil électrophysiologique, la technique de patch-clamp à cellules lâches. Ces études ont fourni une description électrique des neurones AVPV/PeNKisspeptin et ont démontré que leurs schémas de déclenchement dépendent du cycle œstral16. En 2011, Qiu et al. ont utilisé la technique du patch-clamp à cellules entières pour démontrer que les neurones ARHkisspeptin expriment les courants endogènes du stimulateur cardiaque17. Par la suite, Gottsch et al. ont montré que les neurones kisspeptine présentent une activité spontanée et expriment à la fois des courants calciques de type h (stimulateur cardiaque) et de type T, suggérant que les neurones ARHkisspeptine partagent des propriétés électrophysiologiques avec d’autres neurones cardiaques du système nerveux central18. De plus, il a été démontré que les neurones de lakisspeptine ARH présentent des taux de déclenchement sexuellement dimorphes et que les neurones AVPV/PeNKisspeptin présentent un potentiel de membrane au repos bimodal (RMP) influencé par les canaux potassiques sensibles à l’ATP (KATP)19,20. En outre, il a été établi que les stéroïdes gonadiques affectent positivement l’activité électrique spontanée des neurones kisspeptine chez la souris 19,20,21. Les premiers travaux qui étudient les propriétés électrophysiologiques des neurones kisspeptine sont mentionnés 16,17,18,19,20. Depuis lors, de nombreuses études ont utilisé la technique de patch-clamp à cellules entières pour démontrer quels facteurs/neuromodulateurs sont suffisants pour moduler l’activité électrique des neurones kisspeptine (Figure 1)17,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32.

Compte tenu de l’importance de cette technique pour l’étude des neurones nécessaires à la reproduction, parmi d’autres types de cellules non abordés ici, cet article décrit les étapes de base pour le développement de la technique de patch-clamp à cellules entières, telles que la préparation des solutions, la dissection et le découpage du cerveau, et l’exécution du sceau de la membrane cellulaire pour les enregistrements. De plus, des questions pertinentes sur la technique sont discutées, telles que ses avantages, ses limites techniques et ses variables importantes qui doivent être contrôlées pour une performance expérimentale optimale.

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Protocol

Toutes les procédures animales ont été approuvées par le Comité d’éthique animale de l’Institut des sciences biomédicales de l’Université de São Paulo et ont été effectuées conformément aux directives éthiques adoptées par le Collège brésilien d’expérimentation animale.

1. Préparation des solutions

  1. Préparation de la solution interne
    REMARQUE : La solution interne remplit la micropipette patch-clamp et entrera en contact avec l’intérieur de la cellule (voir un exemple dans la Figure 2). Les solutions internes peuvent varier selon le type d’activité à mesurer33.
    1. Choisissez la solution interne en tenant compte de son objectif expérimental et du type d’enregistrement approprié. Pour enregistrer le potentiel membranaire en mode pince de courant, utilisez la solution interne composée de 120 mM de K-gluconate, 1 mM de NaCl, 5 mM d’EGTA, 10 mM HEPES, 1 mM de MgCl 2, 1 mM de CaCl2, 3 mM de KOH, 10 mM de KCl et 4 mM (Mg)-ATP. Peser tous les sels en fonction du volume final souhaité, comme indiqué au tableau 1.
    2. Utilisez suffisamment d’eau désionisée pour atteindre 90% du volume final de la solution. Ce volume assurera suffisamment d’espace pour ajuster le pH et l’osmolarité.
    3. Après avoir bien ajouté et bien mélangé tous les ingrédients, ajustez le pH à 7,2-7,3 avec 5 M KOH à l’aide d’un pH-mètre. Utilisez un osmomètre pour vérifier l’osmolarité, qui devrait être d’environ 275-280 mOsm (ajustez, si nécessaire, vers le bas seulement).
    4. Préparer la solution interne à l’avance et la conserver à 8 °C. Ajoutez l’ATP le jour de l’expérience. Conserver la solution interne contenant de l’ATP à -20 °C (aliquotes de 1 mL) pendant 3 à 4 mois.
  2. Préparation de la solution de tranchage
    1. Préparer la solution de tranchage contenant 238 mM de saccharose, 2,5 mM de KCl, 26 mM de NaHCO3, 1,0 mM deNaH2PO4, 10 mM de glucose, 1,0 mM de CaCl2et 5,0 mM de MgCl2. Peser tous les sels selon le volume final souhaité, comme indiqué dans le tableau 2. Le volume exact de cette solution à préparer dépendra de la taille de la chambre de coupe.
    2. En mélangeant tous les sels dans de l’eau désionisée, saturer constamment en carbogène (95%O2 et 5% CO2). Fixer un tube en polyéthylène (diamètre extérieur [OD] 1,57 mm x 1,14 mm diamètre intérieur [ID]) à un cylindre de carbogène pour fournir du carbogène à la solution de tranchage. Tenez l’extrémité ouverte du tube à l’intérieur du bécher contenant la solution de tranchage.
    3. Après avoir bien mélangé tous les ingrédients, ajustez le pH à 7,3 avec 10% d’acide nitrique à l’aide d’un pH-mètre. Utilisez un osmomètre pour vérifier l’osmolarité, qui doit être de 290-295 mOsm (ajustez, si nécessaire, vers le bas seulement). Ensuite, refroidissez la solution à 0-2 °C.
  3. Préparer une solution aCSF pour les enregistrements
    1. Préparer une solution de liquide céphalorachidien artificiel (aLCR) pour les enregistrements contenant 124 mM de NaCl, 2,8 mM de KCl, 26 mM de NaHCO3, 1,25 mM deNaH2PO4, 1,2 mM de MgSO4, 5 mM de glucose et 2,5 mM de CaCl2. Peser tous les sels selon le volume final souhaité, indiqué au tableau 3.
    2. En mélangeant tous les sels dans de l’eau désionisée, saturer constamment de carbogène (95%O2 et 5% CO 2), comme décrit à l’étape 1.2.2.
    3. Après avoir ajouté et mélangé tous les ingrédients, réglez le pH à 7,3 (10% d’acide nitrique peut être utilisé) à l’aide d’un pH-mètre. Utilisez un osmomètre pour vérifier l’osmolarité, qui devrait être de 290 à 300 mOsm. Ensuite, versez l’aCSF dans un bécher et maintenez-le au bain-marie à 30 °C.

2. Dissection et découpage du cerveau

REMARQUE: Étant donné que différentes structures cérébrales peuvent nécessiter une coupe dans différents plans (tranches coronales, sagittales ou horizontales), l’approche exacte pour obtenir les tranches dépend de la région cérébrale d’intérêt. Typiquement, étudier les cellules exprimant Kiss1 dans les neurones AVPV/PeN et ARH (ici appelés neurones AVPV/PeNKisspeptin et ARHkisspeptine; Figure 2A,B), les tranches de cerveau coronale (200-300 μm) sont généralement faites 17,19,20,21,34. Les neurones AVPV/PeN Kisspeptin sont situés à environ 0,5 à -0,22 mm du bregma, tandis que les neurones ARHkisspeptin sont à -1,22 à -2,70 mm. L’emplacement des noyaux peut être déterminé à l’aide d’un atlas stéréotaxique du cerveau de souris35 ou de l’Atlas de référence du cerveau de souris Allen (http://mouse.brain-map.org/). Des souris adultes Kiss1-Cre/GFP femelles (stade diestrus) et mâles36 ont été utilisées dans cette étude.

  1. Ablation du cerveau
    1. Préparez le site de dissection et les outils nécessaires pour extraire le cerveau : ciseaux de décapitation, ciseaux d’iris, ciseaux courbes Castroviejo, ostéotome, pince à épiler, spatule, papier filtre, boîte de Pétri, lame de rasoir et colle cyanoacrylate.
    2. Avant de faire les tranches, préparez le banc sur lequel la dissection sera effectuée, car toutes les procédures ultérieures doivent être effectuées rapidement. Assurez-vous d’avoir accès à un dispositif de tranchage tel qu’un vibratome.
    3. Préparez une chambre d’enregistrement pour maintenir les tranches de cerveau avant de trancher le tissu. Acquérir une chambre d’enregistrement, dimensions de bain de 24 mm x 15 mm x 2 mm (L x l x H), auprès d’une marque commerciale (Table of Materials) ou en fabriquer une à l’interne.
      REMARQUE: Une chambre de récupération interne peut être fabriquée comme suit: couper une plaque de 24 puits afin que neuf puits soient disponibles. Collez un écran en nylon à la base des neuf puits. Avec le reste de la plaque de puits, faites une base de sorte que la partie inférieure du nylon soit libre. Cette base adaptée peut être placée à l’intérieur d’un bécher de 500 mL contenant le LCRa (Figure supplémentaire 1).
    4. Après avoir tout préparé, anesthésiez l’animal avec un anesthésique inhalé en utilisant 4% à 5% d’isoflurane. L’anesthésie doit être conforme à un protocole approuvé par le comité d’éthique. Peu de temps après l’immobilité de l’animal, effectuez des tests de pincement de la queue et des pattes pour vous assurer que l’animal est anesthésié en profondeur.
    5. Décapitant rapidement les souris pendant que le cœur est encore actif pour augmenter la viabilité cellulaire. Récoltez le cerveau rapidement après la décapitation.
    6. Avec des ciseaux chirurgicaux, faites une incision dans la peau au sommet du crâne de l’animal, de la caudale à la rostrale, et retirez le cuir chevelu de la tête de l’animal. Ensuite, coupez la plaque interpariétale le long de la suture sagittale avec les ciseaux d’iris et retirez l’os occipital. Glissez l’ostéotome sous l’os pariétal et retirez-le doucement jusqu’à ce que le cerveau soit exposé.
    7. Après avoir exposé le cerveau, tournez la tête à l’envers, abaissez doucement le cerveau pour visualiser le nerf trijumeau de chaque côté, puis coupez le nerf trijumeau à l’aide de ciseaux courbés Castroviejo. Après avoir visualisé l’hypothalamus, identifiez le nerf optique et coupez-le doucement.
      REMARQUE: Soyez prudent lorsque vous coupez le nerf optique, car le tirer déchirera la zone hypothalamique adjacente contenant le noyau AVPV / PeN.
    8. Coupez la partie la plus antérieure du lobe frontal et retirez complètement le cerveau. Immergez immédiatement le cerveau dans la solution de tranchage jusqu’à l’acquisition des tranches.
  2. Découpage d’échantillons de cerveau
    1. Placez la cervelle sur du papier filtre (soutenu sur une boîte de Pétri) pour sécher l’excès de solution. Ensuite, avec une lame de rasoir tranchante, effectuez une coupe coronale séparant le tronc cérébral avec le cervelet du reste du tissu.
    2. Ensuite, collez la partie caudale du cerveau à la base du vibratome et remplissez la chambre du dispositif de tranchage avec la solution de tranchage/aCSF refroidie à 0-2 °C. Pendant la procédure, placez de la glace sèche autour de la chambre du vibratome pour garder la solution de tranchage froide.
    3. Insérez la lame de rasoir dans le vibratome et réglez les paramètres de coupe appropriés de l’appareil : vitesse = 3, fréquence = 9 et alimentation = 250 μm. Utiliser une pipette de transfert en acrylique (pipette en verre Pasteur inversé fixée à une tétine en silicone) pour transférer les tranches dans la chambre de récupération (décrite à l’étape 2.1.3) pendant la procédure de tranchage des tissus. Attendez 60 minutes pour la récupération des tissus après l’acquisition de la tranche.

3. Étanchéité cellulaire pour l’enregistrement

  1. Assurez-vous que toutes les pièces d’équipement (microscope, amplificateur, numériseur, micromanipulateur et autres) sont allumées avant de commencer l’enregistrement.
  2. Remplissez la chambre d’enregistrement, d’une marque commerciale (Table of Materials), fixée au microscope avec la solution aCSF pour les enregistrements. Utilisez une pompe à perfusion pour perfuser constamment l’aCSF à un débit de 2 mL/min.
  3. Transférez une tranche de cerveau d’intérêt (une à la fois) dans la chambre d’enregistrement. Utilisez une pipette de transfert en acrylique (pipette en verre Pasteur inversé fixée à une tétine de silicone) pour transférer les tranches hypothalamiques dans la chambre. Utilisez une ancre de tranche (table des matériaux) pour maintenir la tranche afin qu’elle ne bouge pas pendant la perfusion aCSF.
  4. Placez une tranche au centre de la chambre d’enregistrement fixée au microscope. La position de la tranche est essentielle pour permettre une bonne vue de la région souhaitée au microscope et pour une portée parfaite de la micropipette d’enregistrement.
  5. Utilisez la lentille d’objectif basse consommation d’un microscope à immersion (10x ou 20x) pour aider à positionner la tranche et à localiser la région d’intérêt.
  6. Après avoir localisé la région d’intérêt, passez la lentille de l’objectif à la lentille haute puissance (63x) et concentrez-vous sur le niveau tissulaire, en observant la protéine fluorescente endogène et les formes des cellules dans la région cible pour localiser les cellules kisspeptine à la surface de la tranche de cerveau20.
  7. Lorsqu’une cellule cible possible est localisée, marquez-la sur l’écran de l’ordinateur avec le curseur de la souris ou en dessinant un format, comme un carré, sur la zone d’intérêt. La marque d’écran d’ordinateur aide à guider la position de la micropipette d’enregistrement vers la cellule.
  8. Après avoir déterminé l’emplacement exact de la cellule cible, soulevez l’objectif et introduisez la micropipette d’enregistrement remplie de la solution interne. Lorsque vous placez la micropipette dans le porte-électrode, assurez-vous que la solution interne est en contact avec l’électrode en argent.
    REMARQUE: Pour la préparation, le placement et le positionnement de la micropipette sur le porte-électrode, veuillez vous référer àla section 33.
  9. Appliquer une pression positive avant d’immerger la micropipette dans la solution aCSF, pour empêcher les débris de pénétrer dans la micropipette, à l’aide d’une seringue remplie d’air de 1 à 3 mL reliée au porte-micropipette par un tube en polyéthylène (≈130 cm de plus); appliquer près de 100-200 μL d’air.
  10. À l’aide du micromanipulateur, guidez la micropipette sous le centre de l’objectif. Déplacez les boutons du micromanipulateur pour guider la micropipette sur l’axe X-Y-Z vers la cellule d’intérêt.
  11. Ajustez la mise au point pour voir l’extrémité de la micropipette et rapprochez-la de la tranche, mais pas trop. Réduisez la vitesse du micromanipulateur et abaissez lentement la micropipette sur le plan de mise au point. Assurez-vous que l’embout de la micropipette ne pénètre pas brusquement dans la tranche, mais descend lentement jusqu’à ce qu’il touche la surface de la cellule/région cible.
  12. Appliquez une légère pression positive (≈100 μL) avec la seringue remplie d’air de 1 à 3 mL fixée au porte-micropipette pour éliminer tout débris de la trajectoire d’approche.
  13. Concentrez-vous sur la cellule cible et déplacez lentement le micromanipulateur sur l’axe X-Y-Z pour rapprocher la micropipette de la cellule cible. En touchant la micropipette à la cellule, on observe une fossette causée par la pression appliquée à travers l’extrémité de la micropipette (Figure 2C).
  14. Après avoir formé la fossette, en raison de la proximité de la micropipette avec la cellule, appliquer une aspiration faible et brève par la bouche (1-2 s) à travers le tube connecté au support de micropipette pour générer l’étanchéité entre la micropipette et la cellule (joint gigaohm ou gigaseal >1 GΩ; Figure 2D). Pour former le joint, utilisez le mode tension-pince du logiciel. Pour plus de détails sur la formation des phoques, veuillez vous référer àla section 33.
  15. Si le joint reste stable (le joint gigaohm doit être mécaniquement stable et sans interférence sonore, déterminée par observation pendant environ 1 min), réglez la tension de maintien au potentiel de repos physiologique le plus proche de la cellule d’intérêt. Pour les neurones hypothalamiques kisspeptine, -50 mV est recommandé.
  16. Appliquer une brève aspiration par la bouche (pression négative) avec la micropipette scellée à la cellule pour briser la membrane plasmique (figure 2E). Une configuration adéquate de la cellule entière est obtenue lorsque l’aspiration est effectuée avec une force suffisante pour que la membrane rompue n’obstrue pas la micropipette et n’attire pas une partie importante de la membrane ou même de la cellule.
  17. Vérifiez le manuel des paramètres système utilisé. Utilisez le logiciel (voir le tableau des matériaux) pour vérifier et calculer numériquement la résistance série (SR) et la capacité de la cellule entière (wcc).
  18. En mode tension-clampe, après avoir cassé la membrane cellulaire, activez l’option cellule entière et cliquez sur la commande Auto faisant référence à l’onglet de la cellule entière. La SR et le wcc de la cellule seront automatiquement calculés et affichés instantanément par le logiciel. Ces paramètres peuvent également être vérifiés en effectuant le test membranaire avec l’amplificateur mentionné dans le Tableau des matériaux33.
  19. Assurez-vous de vérifier les paramètres de viabilité des cellules. Pour les neurones kisspeptine, vérifier que les mesures électrophysiologiques sont : SR < 25 mΩ, résistance d’entrée > 0,3 GΩ et maintien de la valeur absolue actuelle < 30 pA (observations personnelles et référence21). La valeur moyenne du WCC des neurones AVPV/PeNKisspeptin ou ARHkisspeptin est ≈ 10-12 pF chez les souris gonadesintactes 20.
  20. Surveillez le SR et la capacité stationnaire de la cellule pendant les expériences. Assurez-vous que le SR ne change pas de plus de 20 % pendant un enregistrement et que la capacité de la membrane est stable.
  21. Vérifiez les paramètres du logiciel. Créez des protocoles spécifiques pour les enregistrements en fonction du type d’expérience. Pour enregistrer le potentiel de membrane en mode de pince de courant, avec l’équipement mentionné dans le tableau des matériaux, filtrer passe-bas les signaux électrophysiologiques à 2-4 kHz et analyser les résultats hors ligne dans un logiciel (voir le tableau des matériaux pour obtenir des informations sur le logiciel).
  22. Une fois la configuration de la cellule entière correctement réalisée, mesurer les courants synaptiques en mode pince de tension (Figure 2G). Enregistrer les changements dans le potentiel de membrane au repos (RMP) et les variations RMP induites dans le mode de serrage de courant (Figure 2H). Les changements dans la RMP, tels que la dépolarisation de la membrane cellulaire, peuvent être induits par l’administration d’un médicament/neurotransmetteur connu dans le bain (décrit à l’étape 3.2), comme illustré à la figure 1.
    REMARQUE: En mode de pince de courant, un courant positif ou négatif peut être injecté pour maintenir la tension de la membrane à une tension souhaitée. Pour les neurones kisspeptine, nous définissons généralement une injection de courant nul (I = 0) pour enregistrer la variation spontanée du potentiel membranaire.

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Representative Results

Pour étudier les effets possibles de l’hormone de croissance recombinante humaine (hGH) sur l’activité des neurones hypothalamiques kisspeptine, nous avons effectué des enregistrements de patch-clamp à cellules entières dans des tranches de cerveau et évalué si cette hormone provoque des changements aigus dans l’activité des neurones AVPV / PeNKisspeptin et ARHkisspeptin. Des souris adultes Kiss1-Cre/GFP femelles (stade diestrus) et mâles36 ont été utilisées dans cette étude. Des animaux intacts de gonades ont été sélectionnés pour les expériences, car les propriétés de leurs neurones hypothalamiques kisspeptine peuvent varier en fonction des niveaux de stéroïdes sexuels19,20. Bien qu’il n’entre pas dans le cadre de la présente étude d’évaluer les différences entre les sexes, nous renvoyons le lecteur à Croft et al. et Frazão et al.19,20 pour plus d’informations. Les animaux génétiquement modifiés, tels que les souris et les rats, représentent des outils intéressants pour ce type d’expérience, puisque les cellules exprimant un gène spécifique ou une ablation sélective induite peuvent être identifiées par une protéine fluorescente telle que la GFP, entre autres23,26,36. L’utilisation de souris génétiquement modifiées représente une percée dans la compréhension de l’activité des neurones kisspeptine.

Les neurones enregistrés (26 cellules sur 12 animaux) ont été déterminés en fonction des caractéristiques neuroanatomiques35 et de l’expression de la GFP endogène20. En mode pince de courant, les neurones ont été enregistrés sous I = 0 dans une configuration patch-clamp à cellules entières. Les neurones AVPV/PeNKisspeptin (12 cellules de neuf animaux) présentaient une RMP moyenne de -59,0 mV ± 3,0 mV (plage : -75 mV à -46 mV), une résistance d’entrée de 0,9 ± 0,1 GΩ, un wcc de 12,3 pF ± 1,6 pF et un SR de 19,4 ± 1,9 mΩ. Parmi les neurones enregistrés, trois des 12 cellules AVPV/PeN Kisspeptin ont montré des décharges spontanées de potentiels d’action (PA) au repos (0,1 Hz ± 0,06 Hz ; la RMP moyenne des cellules spontanément actives était de -50,7 mV ± 2,7 mV). La RMP moyenne des neurones de lakisspeptine ARH (14 cellules de 12 animaux) était de -50,0 mV ± 1,5 mV (plage : -62 mV à -39 mV), la résistance moyenne d’entrée était de 1,7 ± 0,1 GΩ, le wcc était de 9,2 pF ± 0,7 pF et le SR de 16,9 ± 1,7 mΩ. La plupart des neurones de lakisspeptine ARH étaient au repos, tandis que quatre cellules sur 14 présentaient des PA spontanés au repos (0,9 Hz ± 0,5 Hz; la RMP moyenne des cellules spontanément actives était de -52,7 mV ± 1,4 mV).

L’administration de hGH (20 μg/g) au bain a induit une hyperpolarisation significative du RMP de nombreux neurones enregistrés, de cinq des 12 neurones AVPV/PeN Kisspeptin (≈55% des cellules de 9 souris) et de neuf des 14 neurones ARHkisspeptin enregistrés (≈65% des cellules de 12 souris, p = 0,0006, test exact de Fisher; Graphique 3). Les neurones hyperpolarisés AVPV/PeN Kisspeptin et ARHkisspeptin ont significativement modifié le RMP par rapport aux cellules qui ne répondent pas (Figure 3B,E; Test de Mann-Whitney). Les effets sur RMP (Figure 3C,F; mesures répétées ANOVA et post-test de Tukey) ont été suivis d’une réduction significative de la résistance à l’entrée (IR) de la cellule entière sur AVPV/PeNKisspeptin (0,9 ± 0,1 GΩ à 0,7 ± 0,1 GΩ pendant l’application de hGH, p = 0,02; Figure 3D) et sur lakisspeptine ARH (1,7 ± 0,1 GΩ à 1,0 ± 0,1 GΩ pendant l’application de hGH, p < 0,0001; mesures répétées ANOVA et post-test de Tukey; Figure 3G) Neurones. De plus, la fréquence des PA spontanés (fAP) des neurones hyperpolarisés par hGH a diminué dans les deux populations de cellules (0,1 Hz ± 0,06 Hz à 0,0 Hz ± 0,0 Hz dans AVPV /PeN Kisspeptin et 1,0 Hz ± 0,5 Hz à 0,2 Hz ± 0,1 Hz dans les neurones ARHkisspeptine). Cependant, l’ampleur de cette diminution n’a pas atteint un niveau de signification statistique (p > 0,05, test de Mann-Whitney). Après le lavage de l’hGH, le RMP et l’IR ont été rétablis à la ligne de base (Figure 3A, C, D, F, G). Les neurones kisspeptine restants ne répondaient pas à l’administration de hGH.

Nous avons déjà démontré que la pGH n’induit aucun effet sur l’activité des neurones hypothalamiques de la kisspeptine (veuillez vous référer à Silveira et al.25; Figure 3H). Il est à noter que l’hGH peut activer les récepteurs de la prolactine (PRL) en plus des récepteurs GH37,38. En outre, la PRL ne dépolarise indirectement que ≈20% des neurones AVPV / PeNKisspeptin chez la souris24. En revanche, la PRL ne module pas la transmission synaptique rapide des cellules dekisspeptine ARH24. Par conséquent, l’effet d’hyperpolarisation induit par l’hGH rapporté ici semble être non spécifique. Les différences observées peuvent dépendre de variables telles que la concentration de médicaments, la différence entre les espèces (humain ou souris) ou même la présence de sels dans la composition des drogues utilisées, comme indiqué précédemment28.

Figure 1
Figure 1 : Diagramme schématique résumant la contribution de la technique de patch-clamp à cellules entières à la connaissance de l’activité des neurones kisspeptine. Les neurones kisspeptine (en vert) sont situés dans les noyaux périventriculaires antéroventrulaires et rostrals (AVPV/PeN) et arqués de l’hypothalamus (ARH). Les cellules AVPV/PeN Kisspeptin et ARHkisspeptin envoient des connexions directes au soma des neurones de l’hormone de libération des gonadotrophines (GnRH) situés dans la zone préoptique (POA) et leurs terminaux à l’éminence médiane (EM), aboutissant à la modulation de l’axe hypothalamus-hypophysaire (HPG). Il a été démontré que différents neuromodulateurs, tels que les hormones, modulent différentiellement l’activité des neurones AVPV / PeNKisspeptin et ARHkisspeptin. Les effets possibles sur le potentiel de la membrane au repos sont schématiquement démontrés par des tracés représentatifs obtenus à l’aide de la technique de pincement de trajectoire de la cellule entière et des enregistrements de pince de courant. La couleur rouge indique qu’un neurotransmetteur spécifique induit la dépolarisation du potentiel membranaire au repos (RMP)17,22,24,26,28,29,30,31,32; la couleur bleue n’indique aucun effet sur RMP 24,25,26,27,30. La ligne pointillée indique le PGR. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Étapes de base pour obtenir l’étanchéité de la cellule d’intérêt par la technique du patch-clamp à cellules entières. (A,B) Photomicrographies représentatives de tranches de cerveau (250 μm) contenant des cellules de kisspeptine au niveau du noyau périventriculaire antéroventral (AVPV) et du noyau arqué de l’hypothalamus (ARH). Les neurones kisspeptine ont été identifiés par expression de protéine fluorescente verte (GFP). (C) Photomicrographie montrant une micropipette (contenant une solution d’électrolyte [solution interne]) suffisamment proche de la cellule pour créer une fossette dans la membrane plasmique pour effectuer l’étanchéité. (D, E) Une légère pression négative (aspiration buccale effectuée sur un tube fixé à la tête et micropipette) est nécessaire pour sceller la membrane cellulaire à la micropipette (D). Une seconde application de pression négative (légère et brève) est nécessaire pour induire la rupture de la membrane plasmique (E). (F) L’enregistrement de l’activité de la cellule est effectué par une installation mécanique utilisée pour les expériences de pince patch-clamp. Après avoir brisé la membrane plasmique, les courants circulant à travers les canaux ioniques dans la cellule rapiécée peuvent être enregistrés par une électrode connectée à un amplificateur très sensible. Une résistance de rétroaction génère le courant nécessaire pour les enregistrements de pince de tension (G) ou de pince de courant (H). Abréviations : 3V = troisième ventricule; ME = éminence médiane. Barres d’échelle: A = 130 μm, B = 145 μm, C = 20 μm, D = 15 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Mise à l’essai de la spécificité du médicament. (A) Enregistrement représentatif de la pince de courant démontrant que l’hormone de croissance recombinante humaine (hGH) induisait une hyperpolarisation du potentiel membranaire au repos (RMP) des neurones kisspeptine situés au niveau du noyau arqué de l’hypothalamus (ARHkisspeptin). (B-G) Graphiques à barres montrant le changement moyen du potentiel membranaire au repos (RMP) (B, C, E, F) et de la résistance moyenne à l’entrée (IR) (D, G) des neurones kisspeptine sensibles à l’hGH situés au niveau des noyaux périventriculaire antéroventrulaire et périventriculaire rostral (AVPV/PeNKisspeptin) (B-D) ou ARH (E-G). Enregistrement représentatif de la pince de courant démontrant que l’hormone de croissance porcine (pGH) n’induisait aucun effet sur le RMP des neurones dela kisspeptine ARH, comme indiqué précédemment25 (H). Les tests de signification utilisés sont le test de Mann-Whitney pour (B) et (E), et les mesures répétées ANOVA et le post-test de Tukey pour (C, D, F, G). La ligne pointillée indique le PGR. *p = 0,02; **p = 0,004,***p = 0,0003; p < 0,0001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Solution interne (100 mL)
Sel FW (g/mol) Concentration Poids (g)
K-gluconate 234.2 120 mM 2.81
NaCl 58.4 1,0 mM 0.006
Kcl 74.5 10 mM 0.074
HEPES 238.3 10 mM 0.24
L’EGTA 380.3 5,0 mM 0.19
CaCl2 147.0 1,0 mM 0.015
MgCl2 203.0 1,0 mM 0.02
KOH 56.11 3,0 mM 0.017
ATP 507.18 4,0 mM 0.20
pH = 7,3 / osmolarité = 275 - 280 mOsm

Tableau 1 : Réactifs pour la préparation de la solution interne. Le tableau contient le poids moléculaire (FW), les concentrations souhaitées et le poids calculé des sels pour la préparation de 100 mL de solution.

aCSF/Solution de tranchage (250 mL)
Sel FW Concentration Poids (g)
Saccharose 342.3 238 mM 18.5
KCL 74.5 2,5 mM 0.046
NaHCO3 84.0 26 mM 0.546
NaH2PO4 120.0 1,0 mM 0.03
MgCl2 203.0 5 mM 0.254
D-glucose 180.2 10 mM 0.450
CaCl2 147.0 1,0 mM 0.037
pH = 7,3 / osmolarité = 290 - 295 mOsm

Tableau 2 : Réactifs pour préparer la solution de tranchage. Le tableau contient le poids moléculaire (FW), les concentrations souhaitées et le poids calculé des sels pour la préparation de 250 mL de solution. Le cerveau est immergé dans cette solution pour être tranché.

aCSF pour l’enregistrement (1 L)
Sel FW Concentration Poids (g)
NaCl 58.4 135 mM 7.88
KCL 74.5 3,5 mM 0.261
NaHCO3 84.0 26 mM 2,184
NaH2PO4 120.0 1,25 mM 0.150
MgSO4 246.5 1,2 mM 0.296
D-glucose 180.2 10 mM 1,802
CaCl2 147.0 1,0 mM 0.148
pH = 7,3 / osmolarité = 290-300 mOsm

Tableau 3 : Réactifs pour préparer le LCR en vue des enregistrements. Le tableau contient le poids moléculaire (FW), les concentrations souhaitées et le poids calculé des sels pour la préparation de 1 L de solution.

Figure supplémentaire 1 : Exemple d’une chambre de récupération fabriquée en interne. (A,B) Une chambre de récupération interne peut être fabriquée comme suit: couper une plaque de 24 puits afin que neuf puits soient disponibles. Collez un écran en nylon à la base des neuf puits. Avec le reste de la plaque de puits, faites une base de sorte que la partie inférieure du nylon soit libre. (C) Cette base adaptée peut être placée à l’intérieur d’un bécher de 500 mL contenant du liquide céphalorachidien artificiel (aCSF) constamment saturé de carbogène (95% O2 et 5% CO2). D) Le bécher contenant la chambre de récupération est maintenu au bain-marie pendant l’expérimentation. (E,F) Une pipette de transfert en acrylique est utilisée pour transférer les tranches de cerveau vers la chambre de récupération. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

Le développement de la technique de patch-clamp à cellules entières a eu un impact significatif sur la communauté scientifique, étant considéré comme d’une importance primordiale pour le développement de la recherche scientifique et permettant plusieurs découvertes. Son impact sur la science a été suffisant pour aboutir au prix Nobel de médecine en 1991, car cette découverte a ouvert la porte à une meilleure compréhension du fonctionnement des canaux ioniques dans des conditions physiologiques et pathologiques, ainsi qu’à l’identification de cibles potentielles pour les agents thérapeutiques 11,39,40,41 . Dans le domaine de la médecine, l’une des découvertes remarquables faites à l’aide de cette technique est que plusieurs substances utilisées cliniquement interagissent directement avec les canaux ioniques (p. ex. anesthésiques locaux, antiarythmiques, antidiabétiques et relaxants musculaires)42. Par conséquent, son applicabilité est évidente dans les instituts cliniques et les départements de recherche fondamentale. Cet article décrit le protocole de la préparation de base pour effectuer des expériences de patch-clamp à cellules entières sur des tranches de cerveau contenant des neurones hypothalamiques kisspeptine. Nous décrivons les étapes de base et soulignons les paramètres notables qui doivent être contrôlés pour obtenir du tissu et préparer des solutions pour la technique patch-clamp. Cependant, cet article ne peut pas décrire complètement la complexité de cette technique et les mécanismes impliqués dans chaque type d’enregistrement, en particulier l’analyse. Pour un apprentissage théorique plus approfondi, certains livres et critiques sur la technique patch-clamp sont recommandés 10,43,44,45,46.

Chaque solution utilisée dans la méthode patch-clamp a un but spécifique; Par conséquent, ses compositions et critères spécifiques doivent être rigoureusement adoptés lors de la préparation. Par exemple, la composition de la solution interne doit être déterminée en fonction de l’objectif de l’expérience, car elle varie en fonction du type de courant à mesurer. La solution à base de chlorure mentionnée ici, dans laquelle Cl- (15 mM) imite la concentration physiologique du cytoplasme cellulaire47, est utilisée pour étudier les propriétés neuronales actives et passives ou les réponses à l’entrée synaptique. Il est important de souligner que la teneur en chlorure dans la solution interne maintient le potentiel d’équilibre du chlorure à des niveaux optimaux pour l’enregistrement cellulaire (dans la solution mentionnée ECL, elle est d’environ -59 mV). La concentration intracellulaire de chlorure peut être estimée en évaluant le potentiel d’inversion du courant induit par le GABA (E GABA), en supposant que tout le courant traversant le récepteurGABA A est transporté par Cl-21,48. Pour l’étude des neurones hypothalamiques kisspeptine, il faut considérer que la concentration intracellulaire de Cl- pour lakisspeptine ARH est plus élevée que pour les cellules AVPV/PeNKisspeptin 21. Cette caractéristique doit être prise en compte lors de la planification d’une expérience. Il est recommandé que l’osmolarité de la solution interne soit inférieure d’au moins 5 % à celle de l’aCSF pour les enregistrements afin d’éviter la perte d’étanchéité due à un éventuel gonflement et/ou affaiblissement cellulaire33,47. S’il est nécessaire d’ajouter un composé intracellulaire qui peut être utilisé comme marqueur cellulaire à la solution interne, tel que la biocytine ou un colorant intracellulaire (par exemple, Alexa Fluor 594), les niveaux de K + peuvent être réduits afin que l’osmolarité puisse être constamment maintenue 20,47,49,50.

Il est crucial d’effectuer une dissection cérébrale rapide et de maintenir une température basse (0-2 °C) pendant le tranchage avec une solution de tranchage appropriée. Les solutions de tranchage peuvent différer selon le type de cellule et/ou la région cérébrale évaluée33,47. La solution aLCR utilisée pour obtenir les tranches de cerveau (c.-à-d. la solution de tranchage) a habituellement une composition différente de celle du LCRa pour les enregistrements (à titre de comparaison, voir les tableaux 2 et 3). Les concentrations de cations (Ca 2+ et Mg2+) peuvent être ajustées pour modifier l’excitabilité des neurones, ce qui peut également affecter le seuil de déclenchement et la libération de neurotransmetteurs47. Les milieux à faible teneur en Ca 2+ et à forte teneur en Mg2+ sont largement utilisés pour minimiser les processus excitotoxiques possibles (pour plus d’informations, voir51). De plus, un faible milieu en Ca 2+ et en Mg2+ élevé peut stimuler l’activité des neurones hypothalamiques52. En ce qui concerne l’aCSF pour les enregistrements, certaines caractéristiques sont similaires. Le système tampon est basé sur le NaHCO3, les concentrations élevées de NaCl (généralement >100 mM) et les faibles concentrations de KCl (généralement <5 mM), les concentrations relatives de Ca 2+ et Mg2+ (2: 1 est souvent utilisé) sont généralement autour de 2 mM, et les niveaux de glucose peuvent varier de 1 à 10 mM47. Outre les variations de l’osmolarité, du pH ou des changements de température des solutions (contrôlés numériquement entre 30 et 32 °C), il est important de souligner que d’autres problèmes peuvent survenir au cours du protocole expérimental qui interfèrent considérablement avec l’expérimentation. Les mesures électrophysiologiques doivent être stables pendant les enregistrements et toute variation doit avoir une lecture critique. Par exemple, les changements de SR tiennent compte de l’accès cellulaire en mode cellule entière et ont des conséquences considérables sur les courants et les potentiels mesurés. En outre, il est important de souligner qu’une limitation pertinente liée à la méthodologie patch-clamp qui doit être prise en compte est la surstimulation mécanique de la cellule par des protocoles d’aspiration / pression excessifs qui peuvent induire des changements morphologiques et fonctionnels53. Ce biais est souvent difficile à contrôler dans les protocoles où l’aspiration est effectuée par la bouche plutôt que par un appareil capable de contrôler avec précision l’intensité d’aspiration appliquée. De plus, des problèmes tissulaires, qui culminent avec un pourcentage élevé de mortalité cellulaire, peuvent survenir en raison d’une dissection inadéquate, d’une hypoxie ou de l’état de santé de la souris qu’un chercheur ne peut pas identifier par observation.

Le principal avantage de la technique de patch-clamp à cellules entières est la capacité d’enregistrer avec précision les neurones dans des régions cérébrales spécifiques d’intérêt. Cette technique a énormément bénéficié de la création d’animaux génétiquement modifiés. Notre groupe travaille généralement avec un modèle murin qui exprime le hrGFP sous le promoteur du gène Kiss1 ou un autre qui exprime la Cre-recombinase sous le promoteur du gène Kiss1 et la GFP sous l’expression Cre-conditionnelle. Cependant, il existe de nombreux modèles animaux validés aujourd’hui23,26,36. De plus, l’absence de barrière hémato-encéphalique et le fait que l’environnement extracellulaire et intracellulaire peut être facilement contrôlé et manipulé représentent des avantages de cette méthode; Cependant, ils ne représentent pas nécessairement un état physiologique. Parmi les limites de cette technique par rapport aux préparations in vivo, ou à d’autres types d’enregistrements visant à préserver la concentration ionique cytoplasmique, tels que les enregistrements sur cellule ou sur patch perforé, il est important de mentionner que le caractère invasif de la configuration cellulaire entière provoque une dialyse du contenu du cytoplasme54. La dialyse peut provoquer l’interruption des aspects moléculaires nécessaires au développement ou à l’expression de certains phénomènes. En enregistrant à partir de tranches, il faut se rappeler que la plupart des projections des neurones sont sectionnées. Ainsi, il n’entre pas dans le cadre de la technique d’évaluer dans quelle mesure cette perturbation impacte les effets observés ou une condition physiologique. Comme mentionné, des tranches de cerveau coronal de 200 à 300 μm sont généralement effectuées pour étudier l’activité des neurones hypothalamiques kisspeptine 17,19,20,21,34. La limitation de l’utilisation d’une section de tranche cérébrale plus épaisse pour étudier les cellules de kisspeptine et différents angles de tranche maintenant une connectivité spécifique AVPV/PeN ou ARH55 doit faire l’objet d’une étude plus approfondie. De plus, en testant l’effet d’une hormone/médicament, synthétique ou non, sur la RMP d’un neurone, plusieurs études sont basées sur le médicament EC50 (s’il est connu) ou sur des données publiées qui démontrent qu’une concentration spécifique est efficace pour activer la cadence de tir ou modifier les niveaux de [Ca2+]i. Cependant, il faut être conscient de la composition / spécificité du médicament à utiliser dans les expériences, car il est possible que les drogues synthétiques purifiées, par rapport à d’autres drogues similaires, puissent avoir des effets antagonistes28. Comme démontré précédemment25, alors que la pGH purifiée n’induit aucun effet sur l’activité des neurones hypothalamiques kisspeptine, la hGH a produit des données controversées (voir Figure 3). Des résultats similaires ont été démontrés lorsque les effets de l’insuline sur l’ARH ont été évalués28. Par conséquent, la spécificité du médicament doit être prise en compte lors de la planification d’une expérience et de l’interprétation des résultats obtenus.

La technique patch-clamp est un excellent outil pour obtenir des données sur l’activité électrique des neurones et a contribué de manière significative à la connaissance de plusieurs populations neuronales, telles que les neurones kisspeptine. La plupart des détails fournis ici sont généralement utilisés pour les enregistrements de neurones hypothalamiques, comme nous l’avons signalé précédemment 25,50,56,57,58,59,60. Il est important de noter que pour enregistrer d’autres populations neuronales que les neurones kisspeptine, il faut connaître ou déterminer les mesures électrophysiologiques qui peuvent aider à identifier les types de cellules, telles que la capacité cellulaire, la RS, la résistance d’entrée, le modèle de tir des cellules et d’autres paramètres. Ces propriétés varient entre les différentes cellules du cerveau, les noyaux cérébraux et les conditions physiologiques ou induites, telles que les niveaux de stéroïdes sexuels circulants 16,19,20,21,61, qui peuvent interférer considérablement avec l’analyse critique des résultats. En outre, il est nécessaire de comprendre les variables possibles impliquées dans la préparation des tissus et leurs avantages et limites associés pour travailler avec cette technique. Toutes les étapes décrites ici doivent être menées judicieusement, car tout changement dans les variables impliquées dans le protocole peut interférer considérablement avec les résultats.

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Disclosures

Aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Acknowledgments

Cette étude a été soutenue par la Fondation de recherche de São Paulo [numéros de subvention FAPESP: 2021/11551-4 (JNS), 2015/20198-5 (TTZ), 2019/21707/1 (RF); et par le Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) - Finance Code 001 » (HRV).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Compounds for aCSF, internal and slicing solutions
ATP Sigma Aldrich/various A9187
CaCl2 Sigma Aldrich/various C7902
D-(+)-Glucose Sigma Aldrich/various G7021
EGTA Sigma Aldrich/various O3777
HEPES Sigma Aldrich/various H3375
KCL Sigma Aldrich/various P5405
K-gluconate Sigma Aldrich/various G4500
KOH Sigma Aldrich/various P5958
MgCl2 Sigma Aldrich/various M9272
MgSO4 Sigma Aldrich/various 230391
NaCl Sigma Aldrich/various S5886
NaH2PO4  Sigma Aldrich/various S5011
NaHCO3 Sigma Aldrich/various S5761
nitric acid Sigma Aldrich/various 225711 CAUTION
Sucrose Sigma Aldrich/various S1888
Equipments
Air table TMC 63-534
Amplifier Molecular Devices Multiclamp 700B
Computer various -
DIGIDATA 1440 LOW-NOISE DATA ACQUISITION SYSTEM Molecular Devices DD1440
Digital peristaltic pump Ismatec ISM833C 
Faraday cage TMC 81-333-03
Imaging Camera Leica DFC 365 FX
Micromanipulator Sutter Instruments Roe-200
Micropipette Puller Narishige PC-10
Microscope Leica DM6000 FS
Osteotome Bonther equipamentos & Tecnologia/various 128
Recovery chamber Warner Instruments/Harvard apparatus - can be made in-house
Recording chamber Warner Instruments 640277
Spatula Fisher Scientific /various FISH-14-375-10; FISH-21-401-20
Vibratome  Leica VT1000 S
Water Bath  Fisher Scientific /various Isotemp
Software and systems
AxoScope 10 software Molecular Devices - Commander Software
LAS X wide field system Leica - Image acquisition and analysis
MultiClamp 700B Molecular Devices MULTICLAMP 700B Commander Software
PCLAMP 10 SOFTWARE FOR WINDOWS Molecular Devices Pclamp 10 Standard
Tools
Ag/AgCl electrode, pellet, 1.0 mm Warner Instruments 64-1309
Curved hemostatic forcep various -
cyanoacrylate glue LOCTITE/various -
Decapitation scissors various -
Filter paper various -
Glass capillaries (micropipette) World Precision Instruments, Inc TW150F-4
Iris scissors Bonther equipamentos & Tecnologia/various 65-66
Pasteur glass pipette  Sigma Aldrich/various CLS7095B9-1000EA
Petri dish various -
Polyethylene tubing  Warner Instruments 64-0756
Razor blade for brain dissection TED PELLA TEDP-121-1
Razor blade for the vibratome TED PELLA TEDP-121-9
Scissors Bonther equipamentos & Tecnologia/various 71-72, 48,49; 
silicone teat various -
Slice Anchor  Warner Instruments 64-0246
Syringe filters Merck Millipore Ltda SLGVR13SL Millex-GV 0.22 μm
Tweezers Bonther equipamentos & Tecnologia/various 131, 1518

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Ce mois-ci dans JoVE numéro 193 tranche de cerveau enregistrements de pince de courant Kiss1 hypothalamus
Les neurones hypothalamiques de kisspeptine comme cible pour les enregistrements de patch-clamp à cellules entières
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Silva, J. d. N., Zampieri, T. T.,… More

Silva, J. d. N., Zampieri, T. T., Vieira, H. R., Frazao, R. Hypothalamic Kisspeptin Neurons as a Target for Whole-Cell Patch-Clamp Recordings. J. Vis. Exp. (193), e64989, doi:10.3791/64989 (2023).

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