Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Tüm hücre yama-kelepçe kayıtları için bir hedef olarak hipotalamik kisspeptin nöronları

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/64989
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Anatomy, Instituto de Ciencias Biomedicas, Universidade de Sao Paulo

Summary

Burada, gonadotropin salgılayan hormon (GnRH) hücrelerinin birincil modülatörü olan kisspeptin nöronlarını içeren beyin dilimleri üzerinde tüm hücre yama kelepçesini gerçekleştirmek için bir protokol sunuyoruz. Kisspeptin nöron aktivitesi hakkında bilgi ekleyerek, bu elektrofizyolojik araç son 20 yılda nöroendokrinoloji alanındaki önemli gelişmelerin temelini oluşturmuştur.

Abstract

Kisspeptinler, hipotalamik-hipofiz-gonadal (HPG) ekseninin olgunlaşması ve doğurganlık için gereklidir. Anteroventral periventriküler çekirdekte ve rostral periventriküler çekirdekte bulunan hipotalamik kisspeptin nöronlarının yanı sıra hipotalamusun kavisli çekirdeği, diğer hücrelerin yanı sıra gonadotrofin salgılayan hormon (GnRH) nöronlarına yansır. Önceki çalışmalar, kisspeptin sinyallemesinin Kiss1 reseptörü (Kiss1r) aracılığıyla gerçekleştiğini ve sonuçta heyecan verici GnRH nöron aktivitesini ortaya çıkardığını göstermiştir. İnsanlarda ve deneysel hayvan modellerinde, kisspeptinler GnRH sekresyonunu ve sonuç olarak luteinize edici hormon (LH) ve folikül uyarıcı hormon (FSH) salınımını indüklemek için yeterlidir. Kisspeptinler üreme fonksiyonlarında önemli bir rol oynadığından, araştırmacılar hipotalamik kisspeptin nöronlarının içsel aktivitesinin üreme ile ilgili eylemlere nasıl katkıda bulunduğunu değerlendirmek ve bu özellikleri değiştirebilen birincil nörotransmiterleri / nöromodülatörleri tanımlamak için çalışıyorlar. Tüm hücre yama-kelepçe tekniği, kemirgen hücrelerinde kisspeptin nöron aktivitesini araştırmak için değerli bir araç haline gelmiştir. Bu deneysel teknik, araştırmacıların spontan uyarıcı ve inhibitör iyonik akımları, dinlenme zarı potansiyelini, aksiyon potansiyeli ateşlemesini ve hücre zarlarının diğer elektrofizyolojik özelliklerini kaydetmelerini ve ölçmelerini sağlar. Bu çalışmada, hipotalamik kisspeptin nöronlarını tanımlayan elektrofizyolojik ölçümler olarak bilinen tüm hücre yama-kelepçe tekniğinin önemli yönleri ve teknikle ilgili konuların tartışılması gözden geçirilmiştir.

Introduction

Hodgkin ve Huxley, çeşitli bilimsel çalışmalarda tanımlanan bir aksiyon potansiyelinin ilk hücre içi kaydını yaptılar. Bu kayıt, aksonun içine bir mikroelektrodun yerleştirilmesine izin veren büyük bir çapa (~ 500 μm) sahip kalamar aksonu üzerinde gerçekleştirildi. Bu çalışma, bilimsel araştırmalar için büyük olanaklar sağladı ve daha sonra aksiyon potansiyeli üretimi 1,2,3,4,5,6,7,8'in iyonik temelini incelemek için kullanılan voltaj-kelepçe modunun oluşturulmasıyla sonuçlandı. Yıllar geçtikçe, teknik geliştirildi ve bilimsel araştırmalarda yaygın olarak uygulandı 6,9. 1970'lerin sonlarında Erwin Neher ve Bert Sakmann tarafından başlatılan çalışmalarla gerçekleşen yama-kelepçe tekniğinin icadı, araştırmacıların sadece tek bir elektrot kullanarak hemen hemen her hücre tipinde tek iyon kanallarını ve hücre içi zar potansiyellerini veya akımlarını kaydetmelerine izin verdi 9,10,11,12. Yama-kelepçe kayıtları, kültürlü hücreler veya doku dilimleri gibi çeşitli doku preparatları üzerinde, voltaj-kelepçe modunda (hücre zarını belirli bir voltajda tutarak, örneğin voltaja bağlı akımların ve sinaptik akımların kaydedilmesine izin veren) veya akım-kelepçe modunda (örneğin, iyon akımlarının neden olduğu dinlenme zarı potansiyelindeki değişikliklerin kaydedilmesine izin veren) yapılabilir. aksiyon potansiyelleri ve postsinaptik potansiyel frekans).

Yama-kelepçe tekniğinin kullanılması, birkaç önemli keşfi mümkün kıldı. Gerçekten de, üçüncü ventrikülün (RP3V) rostral periventriküler alanı olarak da bilinen anteroventral periventriküler ve rostral periventriküler çekirdeklerde (AVPV / PeN Kisspeptin) bulunan hipotalamik kisspeptin nöronlarının elektrofizyolojik özellikleri ve hipotalamusun (ARHkisspeptin) kavisli çekirdeği üzerine seminal bulgular13,14,15 özellikle ilgi çekicidir. 2010 yılında Ducret ve ark., başka bir elektrofizyolojik araç olan gevşek hücreli yama-kelepçe tekniğini kullanarak farelerde AVPV / PeNKisspeptinnöronlarının ilk kayıtlarını gerçekleştirdi. Bu çalışmalar, AVPV / PeNKisspeptin nöronlarının elektriksel bir tanımını sağladı ve ateşleme modellerinin östrus döngüsüne bağlı olduğunu gösterdi16. 2011 yılında, Qiu ve ark., ARHkisspeptin nöronlarının endojen kalp pili akımlarını eksprese ettiğini göstermek için tüm hücre yama-kelepçe tekniğini kullandılar17. Daha sonra, Gottsch ve ark., kisspeptin nöronlarının spontan aktivite sergilediğini ve hem h-tipi (kalp pili) hem de T-tipi kalsiyum akımlarını eksprese ettiğini gösterdi, bu da ARHkisspeptin nöronlarının elektrofizyolojik özellikleri diğer merkezi sinir sistemi kalp pili nöronlarıyla paylaştığını düşündürmektedir18. Ek olarak, ARH kisspeptin nöronlarının cinsel olarak dimorfik ateşleme hızları sergilediği ve AVPV / PeNKisspeptin nöronlarının ATP'ye duyarlı potasyum kanallarından (K ATP) etkilenen bimodal dinlenme zarı potansiyeli (RMP) sergilediği gösterilmiştir19,20. Ayrıca, gonadal steroidlerin farelerde kisspeptin nöronlarının spontan elektriksel aktivitesini olumlu yönde etkilediği tespit edilmiştir 19,20,21. Kisspeptin nöronlarının elektrofizyolojik özelliklerini inceleyen ilk çalışmalardan 16,17,18,19,20 bahsedilmektedir. O zamandan beri, birçok çalışma, kisspeptin nöronlarının elektriksel aktivitesini modüle etmek için hangi faktörlerin / nöromodülatörlerin yeterli olduğunu göstermek için tüm hücre yama-kelepçe tekniğini kullanmıştır (Şekil 1)17,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32.

Bu tekniğin, burada ele alınmayan diğer hücre tiplerinin yanı sıra, üreme için gerekli olan nöronların incelenmesi için önemi göz önüne alındığında, bu makalede, çözeltilerin hazırlanması, beynin diseksiyonu ve dilimlenmesi ve kayıtlar için hücre zarının mühürlenmesi gibi tüm hücre yama-kelepçe tekniğinin geliştirilmesi için temel adımlar açıklanmaktadır. Ayrıca, teknikle ilgili avantajları, teknik sınırlamaları ve optimum deneysel performans için kontrol edilmesi gereken önemli değişkenler gibi ilgili konular tartışılmaktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm hayvan prosedürleri, São Paulo Üniversitesi Biyomedikal Bilimler Enstitüsü Hayvanlar Etik Komitesi tarafından onaylandı ve Brezilya Hayvan Deneyleri Koleji tarafından kabul edilen etik kurallara göre gerçekleştirildi.

1. Çözümlerin hazırlanması

  1. İç çözümün hazırlanması
    NOT: Dahili çözelti yama kelepçeli mikropipeti doldurur ve hücrenin iç kısmına temas eder ( Şekil 2'deki bir örneğe bakın). Dahili çözümler, ölçülecek faaliyet türüne bağlı olarak değişebilir33.
    1. Deneysel amacını ve uygun kayıt türünü göz önünde bulundurarak dahili çözümü seçin. Akım kelepçesi modunda membran potansiyelini kaydetmek için, 120 mM K-glukonat, 1 mM NaCl, 5 mM EGTA, 10 mM HEPES, 1 mM MgCl 2, 1 mM CaCl2, 3 mM KOH, 10 mM KCl ve 4 mM (Mg)-ATP'den oluşan dahili çözeltiyi kullanın. Tüm tuzları Tablo 1'de verildiği gibi istenen son hacme göre tartın.
    2. Çözeltinin nihai hacminin% 90'ına ulaşmak için yeterli miktarda deiyonize su kullanın. Bu hacim, pH ve ozmolariteyi ayarlamak için yeterli alan sağlayacaktır.
    3. Tüm malzemeleri iyice ekleyip karıştırdıktan sonra, bir pH metre kullanarak pH'ı 5 M KOH ile 7.2-7.3'e ayarlayın. 275-280 mOsm civarında olması gereken ozmolariteyi kontrol etmek için bir ozmometre kullanın (gerekirse sadece aşağı doğru ayarlayın).
    4. Dahili çözeltiyi önceden hazırlayın ve 8 ° C'de saklayın. ATP'yi deneme gününe ekleyin. ATP içeren dahili çözeltiyi -20 ° C'de (1 mL aliquots) 3-4 ay boyunca saklayın.
  2. Dilimleme çözeltisinin hazırlanması
    1. 238 mM sakaroz, 2.5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1.0 mM NaH 2 PO4, 10 mM glikoz, 1.0 mM CaCl 2 ve 5.0 mM MgCl2 içeren dilimleme çözeltisi hazırlayın. Tüm tuzları Tablo 2'de gösterildiği gibi istenen son hacme göre tartın. Hazırlanacak bu çözeltinin tam hacmi, kesme odasının boyutuna bağlı olacaktır.
    2. Tüm tuzları deiyonize suda karıştırırken, sürekli olarak karbogen ile doyurun (% 95 O2 ve% 5CO2). Dilimleme çözeltisine karbojen sağlamak için polietilen boruyu (1,57 mm dış çap [OD] x 1,14 mm iç çap [ID]) bir karbogen silindirine takın. Tüpün açık ucunu dilimleme çözeltisini içeren kabın içinde tutun.
    3. Tüm malzemeleri iyice karıştırdıktan sonra, bir pH metre kullanarak pH'ı% 10 nitrik asit ile 7.3'e ayarlayın. 290-295 mOsm olması gereken ozmolariteyi kontrol etmek için bir ozmometre kullanın (gerekirse yalnızca aşağı doğru ayarlayın). Daha sonra, çözeltiyi 0-2 ° C'ye soğutun.
  3. Kayıtlar için aCSF çözümü hazırlama
    1. 124 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1,25 mM NaH 2 PO 4, 1,2 mM MgSO4, 5 mM glikoz ve 2,5 mM CaCl2 içerenkayıtlar için yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF) çözeltisi hazırlayın. Tüm tuzları Tablo 3'te verilen istenen son hacme göre tartın.
    2. Tüm tuzları deiyonize suda karıştırırken, adım 1.2.2'de açıklandığı gibi sürekli olarak karbogen (% 95O2 ve% 5 CO2) ile doyurun.
    3. Tüm bileşenleri ekleyip karıştırdıktan sonra, bir pH metre kullanarak pH'ı 7.3'e (% 10 nitrik asit kullanılabilir) ayarlayın. 290-300 mOsm olması gereken ozmolariteyi kontrol etmek için bir ozmometre kullanın. Daha sonra, aCSF'yi bir beher içine dökün ve 30 ° C'de bir su banyosunda tutun.

2. Beyin diseksiyonu ve dilimleme

NOT: Farklı beyin yapıları farklı düzlemlerde (koronal, sagital veya yatay dilimler) kesmeyi gerektirebileceğinden, dilimleri elde etmek için kesin yaklaşım ilgilenilen beyin bölgesine bağlıdır. Tipik olarak, AVPV / PeN ve ARH'deki Kiss1 eksprese eden hücreleri incelemek için (burada AVPV / PeN Kisspeptin nöronları ve ARHkisspeptin nöronları olarak adlandırılır; Şekil 2A,B), koronal beyin dilimleri (200-300 μm) genellikle 17,19,20,21,34 yapılır. AVPV / PeN Kisspeptin nöronları bregmadan yaklaşık 0.5 ila -0.22 mm uzaklıkta bulunurken, ARHkisspeptin nöronları -1.22 ila -2.70 mm'dir. Çekirdeklerin konumu, stereotaksik fare beyni atlası35 veya Allen Fare Beyni Referans Atlası (http://mouse.brain-map.org/) kullanılarak belirlenebilir. Bu çalışmada yetişkin Kiss1-Cre/GFP dişi (diestrus-evre) ve erkek fareler36 kullanılmıştır.

  1. Beyin çıkarılması
    1. Diseksiyon bölgesini ve beyni çıkarmak için gereken araçları hazırlayın: kafa kesme makası, iris makası, Castroviejo kavisli makas, osteotom, cımbız, spatula, filtre kağıdı, Petri kabı, tıraş bıçağı ve siyanoakrilat yapıştırıcı.
    2. Dilimleri yapmadan önce, sonraki tüm prosedürlerin hızlı bir şekilde yapılması gerektiğinden, diseksiyonun yapılacağı tezgahı hazırlayın. Vibratom gibi bir dilimleme cihazına erişebildiğinizden emin olun.
    3. Dokuyu dilimlemeden önce beyin dilimlerini korumak için bir kayıt odası hazırlayın. Ticari bir markadan (Malzeme Tablosu) 24 mm x 15 mm x 2 mm (U x G x Y) banyo boyutlarında bir kayıt odası edinin veya şirket içinde bir tane yapın.
      NOT: Şirket içi bir geri kazanım odası aşağıdaki gibi imal edilebilir: 24 delikli bir plakayı dokuz kuyu mevcut olacak şekilde kesin. Dokuz kuyucuğun tabanına naylon bir elek yapıştırın. Kuyu plakasının geri kalanıyla, naylonun alt kısmı serbest kalacak şekilde bir taban yapın. Bu uyarlanmış taban, aCSF içeren 500 mL'lik bir beherin içine yerleştirilebilir (Ek Şekil 1).
    4. Her şeyi hazırladıktan sonra,% 4 -% 5 izofluran kullanarak hayvanı inhale anestezi ile uyuşturun. Anestezi, etik kurul tarafından onaylanmış bir protokole uygun olmalıdır. Hayvan hareketsiz kaldıktan kısa bir süre sonra, hayvanın derinlemesine uyuşturulmasını sağlamak için kuyruk ve pençe çimdik testleri yapın.
    5. Hücre canlılığını arttırmak için kalp hala aktifken farelerin kafasını hızla kesin. Beyni dekapitasyondan sonra hızlı bir şekilde toplayın.
    6. Cerrahi makasla hayvanın kafatasının tepesindeki deride, kaudalden rostral'e kadar bir kesi yapın ve kafa derisini hayvanın kafasından çıkarın. Daha sonra, interparietal plakayı iris makası ile sagital sütür boyunca kesin ve oksipital kemiği çıkarın. Osteotomu parietal kemiğin altına kaydırın ve beyin açığa çıkana kadar yavaşça dışarı çekin.
    7. Beyni açığa çıkardıktan sonra, başını baş aşağı çevirin, her iki taraftaki trigeminal siniri görselleştirmek için beyni yavaşça indirin, ardından Castroviejo kavisli makas kullanarak trigeminal siniri kesin. Hipotalamusu görselleştirdikten sonra, optik siniri tanımlayın ve yavaşça kesin.
      NOT: Optik siniri keserken dikkatli olun, çünkü onu çekmek AVPV / PeN çekirdeğini içeren bitişik hipotalamik alanı yırtacaktır.
    8. Frontal lobun en ön kısmını kesin ve beyni tamamen çıkarın. Dilimleri elde edene kadar beyni hemen dilimleme çözeltisine daldırın.
  2. Beyin örneklerinin dilimlenmesi
    1. Fazla çözeltiyi kurutmak için beyni filtre kağıdına (Petri kabında desteklenen) yerleştirin. Daha sonra, keskin bir kesme tıraş bıçağı ile, beyin sapını beyincik ile dokunun geri kalanından ayıran bir koronal kesim gerçekleştirin.
    2. Daha sonra, beynin kaudal kısmını vibratomun tabanına yapıştırın ve dilimleme cihazının odasını 0-2 ° C'ye soğutulmuş dilimleme / aCSF çözeltisi ile doldurun. İşlem sırasında, dilimleme çözeltisini soğuk tutmak için vibratom odasının etrafına kuru buz paketleyin.
    3. Tıraş bıçağını vibratoma yerleştirin ve cihazın uygun kesme parametrelerini ayarlayın: hız = 3, frekans = 9 ve besleme = 250 μm. Doku dilimleme prosedürü sırasında dilimleri geri kazanım odasına (adım 2.1.3'te açıklanmıştır) aktarmak için bir akrilik transfer pipeti (silikon meme ucuna tutturulmuş ters Pasteur cam pipet) kullanın. Dilim alımından sonra doku iyileşmesi için 60 dakika bekleyin.

3. Kayıt için hücre sızdırmazlığı

  1. Kayda başlamadan önce tüm ekipman parçalarının (mikroskop, amplifikatör, sayısallaştırıcı, mikromanipülatör ve diğerleri) açık olduğundan emin olun.
  2. Mikroskopa bağlı ticari bir markadan (Malzeme Tablosu) kayıt odasını, kayıtlar için aCSF çözümü ile doldurun. aCSF'yi sürekli olarak 2 mL/dak hızında perfüze etmek için bir perfüzyon pompası kullanın.
  3. İlgilendiğiniz bir beyin dilimini (birer birer birer) kayıt odasına aktarın. Hipotalamik dilimleri odaya aktarmak için bir akrilik transfer pipeti (silikon meme ucuna tutturulmuş ters Pasteur cam pipet) kullanın. Dilimi aCSF perfüzyonu sırasında hareket etmeyecek şekilde tutmak için bir dilim ankrajı (Malzeme Tablosu) kullanın.
  4. Mikroskopa bağlı kayıt odasının ortasına bir dilim yerleştirin. Dilim konumu, mikroskop altında istenen bölgenin iyi bir şekilde görülebilmesi ve kayıt mikropipetine mükemmel bir şekilde ulaşılabilmesi için kritik öneme sahiptir.
  5. Dilimi konumlandırmaya ve ilgi alanını bulmaya yardımcı olmak için daldırma mikroskobunun düşük güçlü objektif lensini (10x veya 20x) kullanın.
  6. İlgilenilen bölgeyi bulduktan sonra, objektif lensi yüksek güçlü lense (63x) geçirin ve doku seviyesine odaklanın, endojen floresan proteinini ve hedef bölgedeki hücrelerin şekillerini gözlemleyerek kisspeptin hücrelerini beyin dilimi20'nin yüzeyinde konumlandırın.
  7. Olası bir hedef hücre bulunduğunda, bilgisayar ekranında fare imleciyle veya ilgi alanının üzerine kare gibi bir biçim çizerek işaretleyin. Bilgisayar ekran işareti, kayıt mikropipetinin konumunu hücreye yönlendirmeye yardımcı olur.
  8. Hedef hücrenin tam yerini belirledikten sonra, hedefi kaldırın ve dahili çözelti ile doldurulmuş kayıt mikropipetini tanıtın. Mikropipeti elektrot tutucuya yerleştirirken, dahili çözeltinin gümüş elektrot ile temas halinde olduğundan emin olun.
    NOT: Mikropipet hazırlama, elektrot tutucu üzerine yerleştirme ve konumlandırma için lütfen33'e bakın.
  9. Mikropipet tutucusuna bir polietilen boru (≈130 cm daha uzun) ile bağlanan 1-3 mL hava dolu bir şırınga kullanarak, döküntülerin mikropipete girmesini önlemek için mikropipeti aCSF çözeltisine batırmadan önce pozitif basınç uygulayın; yaklaşık 100-200 μL hava uygulayın.
  10. Mikromanipülatörü kullanarak, mikropipeti hedefin merkezinin altına yönlendirin. X-Y-Z eksenindeki mikropipeti ilgilenilen hücreye doğru yönlendirmek için mikromanipülatör üzerindeki düğmeleri hareket ettirin.
  11. Mikropipetin ucunu görmek için odağı ayarlayın ve odağı dilime yaklaştırın, ancak çok yakın değil. Mikromanipülatörün hızını azaltın ve mikropipeti yavaşça odak düzlemine indirin. Mikropipet ucunun dilime aniden nüfuz etmediğinden, hücrenin/hedef bölgenin yüzeyine dokunana kadar yavaşça alçaldığından emin olun.
  12. Yaklaşma yolundaki kalıntıları temizlemek için mikropipet tutucuya bağlı 1-3 mL hava dolu şırınga ile hafif pozitif basınç (≈100 μL) uygulayın.
  13. Hedef hücreye odaklanın ve mikropipeti hedef hücreye yaklaştırmak için mikromanipülatörü X-Y-Z ekseninde yavaşça hareket ettirin. Mikropipet hücreye dokunulduğunda, mikropipet ucundan uygulanan basıncın neden olduğu bir çukur gözlenecektir (Şekil 2C).
  14. Çukuru oluşturduktan sonra, mikropipetin hücreye yakınlığı nedeniyle, mikropipet ile hücre arasındaki sızdırmazlığı oluşturmak için mikropipet tutucuya bağlı tüpten ağızdan (1-2 s) zayıf, kısa süreli emme uygulayın (gigaohm conta veya gigaseal >1 GΩ; Şekil 2D). Contayı oluşturmak için, yazılım üzerindeki voltaj kelepçesi modunu kullanın. Mühür oluşumu detayları için lütfen33'e bakınız.
  15. Conta sabit kalırsa (gigaohm conta mekanik olarak kararlı olmalı ve yaklaşık 1 dakika boyunca gözlemle belirlenen gürültü paraziti olmamalıdır), tutma voltajını ilgili hücrenin en yakın fizyolojik dinlenme potansiyeline ayarlayın. Kisspeptin hipotalamik nöronlar için -50 mV önerilir.
  16. Plazma zarını kırmak için hücreye kapatılmış mikropipet ile ağızdan kısa süreli emme (negatif basınç) uygulayın (Şekil 2E). Emiş yeterli kuvvetle gerçekleştirildiğinde, yırtılmış membranın mikropipeti tıkamaması ve membranın büyük bir bölümünü veya hatta hücreyi çekmemesi için yeterli tam hücre konfigürasyonu elde edilir.
  17. Kullanılan sistem ayarları kılavuzunu kontrol edin. Seri direncini (SR) ve tüm hücre kapasitansını (wcc) dijital olarak kontrol etmek ve hesaplamak için yazılımı kullanın (bkz.
  18. Voltaj kelepçesi modunda, hücre zarını kırdıktan sonra, tüm hücre seçeneğini etkinleştirin ve tüm hücre sekmesine atıfta bulunan Otomatik komutuna tıklayın. Hücrenin SR ve wcc'si otomatik olarak hesaplanacak ve yazılım tarafından anında görüntülenecektir. Bu parametreler, Malzeme Tablosu33'te belirtilen yükselteç ile membran testi yapılarak da kontrol edilebilir.
  19. Hücre canlılığı parametrelerini kontrol ettiğinizden emin olun. Kisspeptin nöronları için, elektrofizyolojik ölçümlerin şunlar olduğunu kontrol edin: SR < 25 mΩ, giriş direnci 0.3 GΩ > ve mevcut mutlak değeri 30 pA< tutmak (kişisel gözlemler ve referans21). AVPV / PeN Kisspeptin veya ARHkisspeptin nöronlarının wcc'sinin ortalama değeri, gonad bozulmamış farelerde ≈ 10-12 pF'dir20.
  20. Deneyler sırasında SR ve hücre kararlı durum kapasitansını izleyin. Kayıt sırasında SR'nin %20'den fazla değişmediğinden ve membran kapasitansının sabit olduğundan emin olun.
  21. Yazılım ayarlarını kontrol edin. Deneme türüne göre kayıtlar için özel protokoller oluşturun. Akım kelepçesi modunda membran potansiyelini kaydetmek için, Malzeme Tablosunda belirtilen ekipmanla, alçak geçirgen elektrofizyolojik sinyalleri 2-4 kHz'de filtreler ve sonuçları bir yazılımda çevrimdışı olarak analiz eder (yazılım bilgileri için Malzeme Tablosuna bakın).
  22. Tüm hücre konfigürasyonu düzgün bir şekilde sağlandıktan sonra, voltaj-kelepçe modunda sinaptik akımları ölçün (Şekil 2G). Dinlenme membranı potansiyelindeki (RMP) değişiklikleri ve akım kelepçesi modunda indüklenen RMP varyasyonlarını kaydedin (Şekil 2H). Hücre zarının depolarizasyonu gibi RMP'deki değişiklikler, Şekil 1'de gösterildiği gibi, banyoya bilinen bir ilaç / nörotransmitter uygulanarak (adım 3.2'de açıklanmıştır) indüklenebilir.
    NOT: Akım-kelepçe modunda, membran voltajını istenen voltajda tutmak için pozitif veya negatif akım enjekte edilebilir. Kisspeptin nöronları için, membran potansiyelinin kendiliğinden varyasyonunu kaydetmek için genellikle sıfır akım enjeksiyonu (I = 0) ayarlarız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

İnsan rekombinant büyüme hormonunun (hGH) hipotalamik kisspeptin nöronlarının aktivitesi üzerindeki olası etkilerini incelemek için, beyin dilimlerinde tüm hücre yama-kelepçe kayıtları gerçekleştirdik ve bu hormonun AVPV / PeN Kisspeptin ve ARHkisspeptin nöronlarının aktivitesinde akut değişikliklere neden olup olmadığını değerlendirdik. Bu çalışmada yetişkin Kiss1-Cre/GFP dişi (diestrus-evre) ve erkek fareler36 kullanılmıştır. Deneyler için gonad-bozulmamış hayvanlar seçildi, çünkü hipotalamik kisspeptin nöronlarının özellikleri seks steroid seviyelerine bağlı olarak değişebilir19,20. Cinsiyetler arasındaki farklılıkları değerlendirmek bu çalışmanın kapsamı dışında olsa da, okuyucuyu daha fazla bilgi için Croft ve ark. ve Frazão ve ark.19,20'ye yönlendiriyoruz. Fareler ve sıçanlar gibi genetiği değiştirilmiş hayvanlar, bu tür deneyler için heyecan verici araçları temsil eder, çünkü belirli bir geni veya seçici indüklenmiş bir ablasyonu ifade eden hücreler, diğerlerinin yanı sıra GFP gibi bir floresan proteini ile tanımlanabilir23,26,36. Genetiği değiştirilmiş farelerin kullanımı, kisspeptin nöron aktivitesini anlamada bir atılımı temsil eder.

Kaydedilen nöronlar (12 hayvandan 26 hücre) nöroanatomik özelliklere göre belirlendi35 ve endojen GFP20 ekspresyonu. Akım kelepçesi modunda, nöronlar tüm hücre yama-kelepçe konfigürasyonunda I = 0 altında kaydedildi. AVPV / PeNKisspeptin nöronları (dokuz hayvandan 12 hücre), ortalama -59.0 mV ± 3.0 mV RMP (aralık: -75 mV ila -46 mV), 0.9 ± 0.1 GΩ giriş direnci, 12.3 pF ± 1.6 pF wcc ve 19.4 ± 1.9 mΩ SR sergiledi. Kaydedilen nöronlar arasında, 12 AVPV / PeNKisspeptin hücresinden üçü, istirahatte aksiyon potansiyellerinin (AP'ler) spontan deşarjlarını gösterdi (0.1 Hz ± 0.06 Hz; spontan olarak aktif hücrelerin ortalama RMP'si -50.7 mV ± 2.7 mV idi). ARHkisspeptin nöronlarının ortalama RMP'si (12 hayvandan 14 hücre) -50.0 mV ± 1.5 mV (aralık: -62 mV ila -39 mV), ortalama giriş direnci 1.7 ± 0.1 GΩ, wcc 9.2 pF ± 0.7 pF ve SR 16.9 ± 1.7 mΩ idi. ARHkisspeptin nöronlarının çoğu sessizken, 14 hücreden dördü istirahatte spontan AP'ler gösterdi (0.9 Hz ± 0.5 Hz; spontan olarak aktif hücrelerin ortalama RMP'si -52.7 mV ± 1.4 mV idi).

Banyoya hGH (20 μg / g) uygulanması, kaydedilen nöronların çoğunun, 12 AVPV / PeN Kisspeptin nöronundan beşinin (9 fareden gelen hücrelerin% ≈55'i) ve kaydedilen 14 ARH kisspeptin nöronundan dokuzunun (12 faredenhücrelerin% ≈65'i, p = 0.0006, Fisher'ın kesin testi; Şekil 3). AVPV/PeN Kisspeptin ve ARHkisspeptin hiperpolarize nöronları, yanıt vermeyen hücrelere kıyasla RMP'yi önemli ölçüde değiştirmiştir (Şekil 3B,E; Mann-Whitney testi). RMP üzerindeki etkileri (Şekil 3C, F; tekrarlanan ölçümler ANOVA ve Tukey'in son testi), hGH uygulaması sırasında AVPV / PeNKisspeptin (0.9 ± 0.1 GΩ ila 0.7 ± 0.1 GΩ üzerindeki tüm hücre giriş direncinin (IR) önemli ölçüde azalması izledi, p = 0.02; Şekil 3D) ve ARHkisspeptin (1.7 ± 0.1 GΩ ila 1.0 ± 0.1 GΩ hGH uygulaması sırasında, p < 0.0001; tekrarlanan ölçümler ANOVA ve Tukey'in son testi; Şekil 3G) Neurons. Ek olarak, hGH-hiperpolarize nöronların spontan AP'lerinin (fAP'ler) sıklığı her iki hücre popülasyonunda da azalmıştır (AVPV / PeNKisspeptin'de 0.1 Hz ± 0.0 Hz ila 0.0 Hz ± 0.0 Hz ve ARHkisspeptin nöronlarında 0.5 Hz ila 0.2 Hz ± 0.1 Hz ± 1.0 Hz). Bununla birlikte, bu azalmanın boyutu istatistiksel bir anlamlılık düzeyine ulaşamamıştır (p > 0.05, Mann-Whitney testi). hGH yıkamasından sonra, RMP ve IR taban çizgisine geri getirildi (Şekil 3A, C, D, F, G). Kalan kisspeptin nöronları hGH uygulamasına yanıt vermedi.

Daha önce pGH'nin hipotalamik kisspeptin nöron aktivitesi üzerinde hiçbir etkiye neden olmadığını göstermiştik (lütfen Silveira ve ark.25'e bakınız; Şekil 3H). Not olarak, hGH'nin GH reseptörlerine ek olarak prolaktin (PRL) reseptörlerini aktive edebildiği bilinmektedir37,38. Ayrıca, PRL, farelerde AVPV / PeNKisspeptin nöronlarının sadece% ≈20'sini dolaylı olarak depolarize eder24. Buna karşılık, PRL, ARHkisspeptin hücrelerinin hızlı sinaptik iletimini modüle etmez24. Bu nedenle, burada bildirilen hGH kaynaklı hiperpolarizasyon etkisi spesifik görünmemektedir. Gözlemlenen farklılıklar, daha önce bildirildiği gibi, ilaç konsantrasyonu, tür farkı (insan ve fare) veya hatta kullanılan ilaçların bileşimindeki tuzların varlığı gibi değişkenlere bağlı olabilir28.

Figure 1
Şekil 1: Tüm hücre yama-kelepçe tekniğinin kisspeptin nöronlarının aktivitesi bilgisine katkısını özetleyen şematik diyagram. Kisspeptin nöronları (yeşil renkle gösterilmiştir) anteroventral periventriküler ve rostral periventriküler çekirdeklerde (AVPV / PeN) ve hipotalamusun kavisli çekirdeğinde (ARH) bulunur. AVPV / PeN Kisspeptin ve ARHkisspeptin hücreleri, preoptik alanda (POA) bulunangonadotropin salgılayan hormon (GnRH) nöronlarının soma'sına ve medyan eminanstaki (ME) terminallerine doğrudan bağlantılar göndererek hipotalamus-hipofiz ekseninin (HPG) modülasyonuyla sonuçlanır. Hormonlar gibi farklı nöromodülatörlerin, AVPV / PeN Kisspeptin ve ARHkisspeptin nöronlarının aktivitesini farklı şekilde modüle ettiği gösterilmiştir. İstirahat membranı potansiyeli üzerindeki olası etkiler, tüm hücre yol-kelepçe tekniği ve akım-kelepçe kayıtları kullanılarak elde edilen temsili izlemelerle şematik olarak gösterilmiştir. Kırmızı renk, spesifik bir nörotransmitterin dinlenme zarı potansiyelinin (RMP) depolarizasyonunu indüklediğini gösterir 17,22,24,26,28,29,30,31,32; mavi renk RMP 24,25,26,27,30 üzerinde hiçbir etkisi olmadığını gösterir. Kesikli çizgi RMP'yi gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Tüm hücre yama-kelepçe tekniği ile ilgili hücrenin sızdırmazlığını elde etmek için temel adımlar. (A,B) Anteroventral periventriküler çekirdekte (AVPV) kisspeptin hücreleri ve hipotalamusun kavisli çekirdeğinde (ARH) kisspeptin hücreleri içeren beyin dilimlerinin (250 μm) temsili fotomikrografları. Kisspeptin nöronları yeşil floresan protein (GFP) ekspresyonu ile tanımlandı. (C) Sızdırmazlığı gerçekleştirmek için plazma zarında bir çukur oluşturacak kadar hücreye yakın bir mikropipet (elektrolit çözeltisi [dahili çözelti] içeren) gösteren fotomikrograf. (D,E) Hücre zarını mikropipete (D) kapatmak için hafif negatif basınç (baş sahneye ve mikropipete bağlı bir tüp üzerinde gerçekleştirilen ağız emmesi) gereklidir. Plazma zarı rüptürünü (E) indüklemek için ikinci bir negatif basınç uygulaması (hafif ve kısa) gereklidir. (F) Hücre aktivitesinin kaydı, yama-kelepçe deneyleri için kullanılan mekanik bir kurulum ile gerçekleştirilir. Plazma zarı kırıldıktan sonra, yamalı hücredeki iyonik kanallardan akan akımlar, oldukça hassas bir amplifikatöre bağlı bir elektrot tarafından kaydedilebilir. Bir geri besleme direnci, voltaj kelepçesi (G) veya akım kelepçesi (H) kayıtları için gereken akımı üretir. Kısaltmalar: 3V = üçüncü ventrikül; ME = medyan üstünlük. Ölçek çubukları: A = 130 μm, B = 145 μm, C = 20 μm, D = 15 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: İlaç özgüllüğünün test edilmesi. (A) İnsan rekombinant büyüme hormonunun (hGH), hipotalamusun (ARH kisspeptin) kavisli çekirdeğinde bulunankisspeptin nöronlarının dinlenme zarı potansiyelinin (RMP) hiperpolarizasyonuna neden olduğunu gösteren temsili akım kelepçesi kaydı. (B-G) Anteroventral periventriküler ve rostral periventriküler çekirdeklerde (AVPV/PeN Kisspeptin) (B-D) veya ARH'de (E-G) bulunan hGH'ye duyarlıkisspeptin nöronlarının dinlenme membranı potansiyelindeki (RMP) (B,C,E,F) ve ortalama giriş direncindeki (IR) (D,G) ortalama değişimi gösteren çubuk grafikler). Domuz büyüme hormonunun (pGH) daha önce bildirildiği gibi ARHkisspeptin nöronlarının RMP'si üzerinde hiçbir etkiye neden olmadığını gösteren temsili akım kelepçesi kaydı,25 (H). Kullanılan anlamlılık testleri, (B) ve (E) için Mann-Whitney testidir ve tekrarlanan ölçümler ANOVA ve Tukey'in (C, D, F, G) için son testidir. Kesikli çizgi RMP'yi gösterir. *p = 0,02; **p = 0,004,***p = 0,0003; p < 0.0001. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Dahili Çözüm (100 mL)
Tuz FW (g/mol) Konsantrasyon Ağırlık (g)
K-glukonat 234.2 120 mM 2.81
Arjantin 58.4 1,0 milyon 0.006
Kartal 74.5 10 mM 0.074
HEPES 238.3 10 mM 0.24
EGTA 380.3 5,0 milyon 0.19
CaCl2 147.0 1,0 milyon 0.015
MgCl2 203.0 1,0 milyon 0.02
KOH 56.11 3,0 milyon 0.017
ATP 507.18 4,0 milyon 0.20
pH = 7.3 / ozmolarite = 275 - 280 mOsm

Tablo 1: İç çözeltinin hazırlanması için reaktifler. Tablo, moleküler ağırlığı (FW), istenen konsantrasyonları ve 100 mL çözeltinin hazırlanması için tuzların hesaplanan ağırlığını içerir.

aCSF/Dilimleme Çözeltisi (250 mL)
Tuz FW Konsantrasyon Ağırlık (g)
Sakaroz 342.3 238 mM 18.5
KARTAL 74.5 2,5 milyon 0.046
NaHCO3 84.0 26 mM 0.546
NaH2PO4 120.0 1,0 milyon 0.03
MgCl2 203.0 5 mM 0.254
D-glikoz 180.2 10 mM 0.450
CaCl2 147.0 1,0 milyon 0.037
pH = 7.3 / ozmolarite = 290 - 295 mOsm

Tablo 2: Dilimleme çözeltisini hazırlamak için reaktifler. Tablo, moleküler ağırlığı (FW), istenen konsantrasyonları ve 250 mL çözeltinin hazırlanması için tuzların hesaplanan ağırlığını içerir. Beyin dilimlenmek üzere bu çözeltiye batırılır.

kayıt için aCSF (1 L)
Tuz FW Konsantrasyon Ağırlık (g)
Arjantin 58.4 135 mM 7.88
KARTAL 74.5 3,5 milyon 0.261
NaHCO3 84.0 26 mM 2,184
NaH2PO4 120.0 1,25 milyon 0.150
MgSO4 246.5 1,2 milyon 0.296
D-glikoz 180.2 10 mM 1,802
CaCl2 147.0 1,0 milyon 0.148
pH = 7.3 / ozmolarite = 290-300 mOsm

Tablo 3: Kayıtlar için aCSF hazırlamak için reaktifler. Tablo, moleküler ağırlığı (FW), istenen konsantrasyonları ve 1 L çözeltinin hazırlanması için tuzların hesaplanan ağırlığını içerir.

Ek Şekil 1: Şirket içi yapılmış bir kurtarma odası örneği. (A,B) Şirket içi bir geri kazanım odası aşağıdaki gibi imal edilebilir: dokuz kuyunun mevcut olması için 24 delikli bir plakayı kesin. Dokuz kuyucuğun tabanına naylon bir elek yapıştırın. Kuyu plakasının geri kalanıyla, naylonun alt kısmı serbest kalacak şekilde bir taban yapın. (C) Bu uyarlanmış baz, sürekli olarak karbogen (% 95 O2 ve% 5 CO2) ile doyurulmuş yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF) içeren 500 mL'lik bir beher içine yerleştirilebilir. (D) Geri kazanım odasını tutan beher, deney sırasında su banyosunda tutulur. (E,F) Beyin dilimlerini kurtarma odasına aktarmak için bir akrilik transfer pipeti kullanılır. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Tüm hücre yama-kelepçe tekniğinin geliştirilmesi, bilimsel araştırma geliştirmek ve çeşitli keşiflere olanak sağlamak için büyük önem taşıyan bilimsel topluluk üzerinde önemli bir etkiye sahipti. Bilim üzerindeki etkisi, 1991'de Nobel Tıp Ödülü ile sonuçlanmak için yeterliydi, çünkü bu keşif, iyon kanallarının fizyolojik ve patolojik koşullar altında nasıl işlediğinin daha iyi anlaşılmasına ve terapötik ajanlar için potansiyel hedeflerin belirlenmesine kapı açtı 11,39,40,41. Tıp alanında, bu teknik kullanılarak elde edilen göze çarpan bulgulardan biri, klinik olarak kullanılan çeşitli maddelerin iyon kanallarıyla (örneğin, lokal anestezikler, antiaritmikler, antidiyabetikler ve kas gevşeticiler) doğrudan etkileşime girmesiydi42. Bu nedenle, uygulanabilirliği klinik enstitülerde ve temel araştırma bölümlerinde belirgindir. Bu makalede, hipotalamik kisspeptin nöronları içeren beyin dilimleri üzerinde tüm hücre yama-kelepçe deneylerini gerçekleştirmek için temel hazırlık protokolü açıklanmaktadır. Temel adımları özetliyoruz ve doku elde etmek ve yama-kelepçe tekniği için çözümler hazırlamak için kontrol edilmesi gereken önemli parametreleri vurguluyoruz. Bununla birlikte, bu makale bu tekniğin karmaşıklığını ve her kayıt türünde, özellikle de analizde yer alan mekanizmaları tam olarak açıklayamaz. Daha ileri teorik öğrenme için, yama-kelepçe tekniği ile ilgili bazı kitaplar ve incelemeler önerilir 10,43,44,45,46.

Yama-kelepçe yönteminde kullanılan her çözeltinin belirli bir amacı vardır; Bu nedenle, spesifik bileşimleri ve kriterleri hazırlık sırasında titizlikle benimsenmelidir. Örneğin, iç çözeltinin bileşimi, ölçülecek akımın türüne bağlı olarak değiştiğinden, deneyin amacına göre belirlenmelidir. Burada bahsedilen klorür bazlı çözelti, Cl- (15 mM) hücre sitoplazması47'nin fizyolojik konsantrasyonunu taklit eder, aktif ve pasif nöronal özellikleri veya sinaptik girdiye verilen yanıtları incelemek için kullanılır. İç çözeltideki klorür içeriğinin, klorür denge potansiyelini hücre kaydı için en uygun seviyelerde tuttuğunu vurgulamak önemlidir (söz konusu çözelti E CL'de, yaklaşık -59mV'dir). Hücre içi klorür konsantrasyonu, GABA kaynaklı akım (E GABA) için tersine çevirme potansiyeli değerlendirilerek,GABA A reseptöründen geçen tüm akımın Cl-21,48 tarafından taşındığı varsayılarak tahmin edilebilir. Hipotalamik kisspeptin nöronlarının incelenmesi için, ARH kisspeptin için hücre içi Cl- konsantrasyonunun AVPV / PeNKisspeptin hücrelerinden21 daha yüksek olduğu düşünülmelidir. Bir deney planlarken bu özellik dikkate alınmalıdır. Olası şişme ve/veya hücre zayıflaması nedeniyle sızdırmazlık kaybını önlemek için kayıtlar için dahili çözeltinin ozmolaritesi aCSF'ninkinden en az %5 daha düşük olması önerilir33,47. Biyositin veya hücre içi boya (örneğin, Alexa Fluor 594) gibi dahili çözeltiye hücre belirteci olarak daha fazla kullanılabilecek bir hücre içi bileşik eklenmesi gerekiyorsa, ozmolaritenin sürekli olarak korunabilmesi için K + seviyeleri azaltılabilir 20,47,49,50.

Hızlı bir beyin diseksiyonu yapmak ve uygun bir dilimleme çözeltisi ile dilimleme sırasında düşük bir sıcaklığı (0-2 ° C) korumak çok önemlidir. Dilimleme solüsyonları, değerlendirilen hücre tipine ve/veya beyin bölgesine göre farklılık gösterebilir33,47. Beyin dilimlerini elde etmek için kullanılan aCSF çözeltisi (yani, dilimleme çözeltisi) genellikle kayıtlar için aCSF'den farklı bir bileşime sahiptir (karşılaştırma için Tablo 2 ve Tablo 3'e bakınız). Katyon (Ca 2 + ve Mg2 +) konsantrasyonları, nöronların uyarılabilirliğini değiştirmek için ayarlanabilir, bu da ateşleme eşiğini ve nörotransmitter salınımınıetkileyebilir 47. Düşük Ca2+ ve yüksekMg2+ ortamları, olası eksitotoksik süreçleri en aza indirmek için yaygın olarak kullanılmaktadır (daha fazla bilgi için bkz.51). Ek olarak, düşük Ca 2 + ve yüksek Mg2 + ortamları hipotalamik nöron aktivitesini uyarabilir52. Kayıtlar için aCSF ile ilgili olarak, bazı özellikler benzerdir. Tampon sistemi NaHCO3'e dayanır, yüksek NaCl konsantrasyonları (genellikle >100 mM) ve düşük KCl konsantrasyonları (genellikle <5 mM), göreceli Ca 2+ ve Mg2+ konsantrasyonları (2: 1 sıklıkla kullanılır) genellikle 2 mM civarındadır ve glikoz seviyeleri 1 ila 10 mM47 arasında değişebilir. Çözeltilerin ozmolarite, pH veya sıcaklık değişimlerinin (30-32 ° C arasında olacak şekilde dijital olarak kontrol edilen) varyasyonlarının yanı sıra, deneysel protokol sırasında deneye önemli ölçüde müdahale eden diğer sorunların ortaya çıkabileceğini vurgulamak önemlidir. Elektrofizyolojik ölçümler kayıtlar sırasında kararlı olmalı ve herhangi bir varyasyon eleştirel bir okumaya sahip olmalıdır. Örneğin, SR değişiklikleri tüm hücre modunda hücresel erişimi hesaba katar ve ölçülen akımlar ve potansiyeller üzerinde önemli sonuçlar doğurur. Ayrıca, yama-kelepçe metodolojisi ile ilgili dikkate alınması gereken ilgili bir sınırlamanın, morfolojik ve fonksiyonel değişikliklere neden olabilecek aşırı emme / basınç protokolleri ile hücrenin mekanik olarak aşırı uyarılması olduğunu vurgulamak önemlidir53. Bu önyargının, uygulanan emme yoğunluğunu tam olarak kontrol edebilen bir cihazdan ziyade emmenin ağız yoluyla yapıldığı protokollerde kontrol edilmesi genellikle zordur. Ek olarak, yüksek oranda hücre mortalitesi ile sonuçlanan doku ile ilgili sorunlar, yetersiz diseksiyon, hipoksi veya bir araştırmacının gözlemle tanımlayamadığı farenin sağlık durumu nedeniyle ortaya çıkabilir.

Tüm hücre yama-kelepçe tekniğinin temel avantajı, nöronları ilgilenilen belirli beyin bölgelerinde tam olarak kaydetme yeteneğidir. Bu teknik, genetiği değiştirilmiş hayvanların yaratılmasından büyük ölçüde yararlanmıştır. Grubumuz tipik olarak Kiss1 gen promotörü altında hrGFP'yi ifade eden bir fare modeli veya Kiss1 gen promotörü altında Cre-rekombinaz ve Cre-koşullu ifade altında GFP'yi ifade eden başka bir fare modeli ile çalışır. Bununla birlikte, günümüzde 23,26,36 sayılı birçok doğrulanmış hayvan modeli bulunmaktadır. Ek olarak, kan-beyin bariyerinin olmaması ve hücre dışı ve hücre içi ortamın kolayca kontrol edilebilmesi ve manipüle edilebilmesi bu yöntemin avantajlarını temsil eder; Bununla birlikte, mutlaka fizyolojik bir durumu temsil etmezler. Bu tekniğin in vivo preparatlara veya hücre içi veya delikli yama kayıtları gibi sitoplazmatik iyonik konsantrasyonu korumayı amaçlayan diğer kayıt tiplerine kıyasla sınırlamaları arasında, tüm hücre konfigürasyonunun invazivliğinin sitoplazma içeriğinin diyalizine neden olduğunu belirtmek önemlidir54. Diyaliz, bazı fenomenlerin gelişmesi veya ifade edilmesi için gerekli moleküler yönlerin kesilmesine neden olabilir. Dilimlerden kayıt yaparak, nöronların projeksiyonlarının çoğunun bölümlere ayrıldığı unutulmamalıdır. Bu nedenle, bu bozulmanın gözlemlenen etkileri veya fizyolojik bir durumu ne kadar etkilediğini değerlendirmek tekniğin kapsamı dışındadır. Belirtildiği gibi, 200-300 μm'lik koronal beyin dilimleri genellikle hipotalamik kisspeptin nöronlarının aktivitesini incelemek için yapılır 17,19,20,21,34. Kisspeptin hücrelerini ve belirli AVPV / PeN veya ARH bağlantısını koruyan farklı dilim açılarını incelemek için daha kalın bir beyin dilimi bölümü kullanmanın sınırlaması55 daha fazla araştırmaya ihtiyaç duymaktadır. Ek olarak, sentetik olsun ya da olmasın, bir hormonun / ilacın, bir nöronun RMP'si üzerindeki etkisini test ederek, EC50 ilacına (biliniyorsa) veya belirli bir konsantrasyonun ateşleme hızını aktive etmede veya [Ca2 +] i seviyelerini değiştirmede etkili olduğunu gösteren yayınlanmış verilere dayanan birkaç çalışma yapılmıştır. Bununla birlikte, deneylerde kullanılacak ilacın bileşiminin/özgüllüğünün farkında olunmalıdır, çünkü saflaştırılmış sentetik ilaçların, diğer benzer ilaçlarla karşılaştırıldığında, antagonistik etkilere sahip olması mümkündür28. Daha önce25'te gösterildiği gibi, saflaştırılmış pGH hipotalamik kisspeptin nöron aktivitesi üzerinde hiçbir etkiye neden olmazken, hGH tartışmalı veriler üretti (bkz. Şekil 3). ARH üzerindeki insülin etkileri değerlendirildiğinde benzer sonuçlar gösterilmiştir28. Bu nedenle, bir deney planlarken ve elde edilen sonuçları yorumlarken ilaca özgüllük göz önünde bulundurulmalıdır.

Yama-kelepçe tekniği, nöron elektriksel aktivitesi hakkında veri elde etmek için mükemmel bir araçtır ve kisspeptin nöronları gibi çeşitli nöronal popülasyonların bilgisine önemli ölçüde katkıda bulunmuştur. Burada verilen ayrıntıların çoğu, daha önce 25,50,56,57,58,59,60 bildirdiğimiz gibi, genellikle hipotalamik nöronların kayıtları için kullanılır. Önemli olarak, kisspeptin nöronlarının yanı sıra diğer nöronal popülasyonları kaydetmek için, hücre kapasitansı, SR, giriş direnci, hücre ateşleme paterni ve diğer parametreler gibi hücre tiplerini tanımlamaya yardımcı olabilecek elektrofizyolojik ölçümleri bilmek veya belirlemek gerekir. Bu özellikler, farklı beyin hücreleri, beyin çekirdekleri ve dolaşımdaki seks steroid seviyeleri 16,19,20,21,61 gibi fizyolojik veya indüklenmiş koşullar arasında değişir ve bu da sonuçların kritik analizine önemli ölçüde müdahale edebilir. Ek olarak, doku hazırlığında yer alan olası değişkenleri ve bunlarla ilişkili avantajları ve sınırlamaları bu teknikle çalışmak için anlamak gerekir. Burada açıklanan tüm adımlar makul bir şekilde gerçekleştirilmelidir, çünkü protokolde yer alan değişkenlerdeki herhangi bir değişiklik sonuçlara büyük ölçüde müdahale edebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan edilmemelidir.

Acknowledgments

Bu çalışma São Paulo Araştırma Vakfı [FAPESP hibe numaraları: 2021/11551-4 (JNS), 2015/20198-5 (TTZ), 2019/21707/1 (RF); ve Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) - Finans Kodu 001" (HRV) tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Compounds for aCSF, internal and slicing solutions
ATP Sigma Aldrich/various A9187
CaCl2 Sigma Aldrich/various C7902
D-(+)-Glucose Sigma Aldrich/various G7021
EGTA Sigma Aldrich/various O3777
HEPES Sigma Aldrich/various H3375
KCL Sigma Aldrich/various P5405
K-gluconate Sigma Aldrich/various G4500
KOH Sigma Aldrich/various P5958
MgCl2 Sigma Aldrich/various M9272
MgSO4 Sigma Aldrich/various 230391
NaCl Sigma Aldrich/various S5886
NaH2PO4  Sigma Aldrich/various S5011
NaHCO3 Sigma Aldrich/various S5761
nitric acid Sigma Aldrich/various 225711 CAUTION
Sucrose Sigma Aldrich/various S1888
Equipments
Air table TMC 63-534
Amplifier Molecular Devices Multiclamp 700B
Computer various -
DIGIDATA 1440 LOW-NOISE DATA ACQUISITION SYSTEM Molecular Devices DD1440
Digital peristaltic pump Ismatec ISM833C 
Faraday cage TMC 81-333-03
Imaging Camera Leica DFC 365 FX
Micromanipulator Sutter Instruments Roe-200
Micropipette Puller Narishige PC-10
Microscope Leica DM6000 FS
Osteotome Bonther equipamentos & Tecnologia/various 128
Recovery chamber Warner Instruments/Harvard apparatus - can be made in-house
Recording chamber Warner Instruments 640277
Spatula Fisher Scientific /various FISH-14-375-10; FISH-21-401-20
Vibratome  Leica VT1000 S
Water Bath  Fisher Scientific /various Isotemp
Software and systems
AxoScope 10 software Molecular Devices - Commander Software
LAS X wide field system Leica - Image acquisition and analysis
MultiClamp 700B Molecular Devices MULTICLAMP 700B Commander Software
PCLAMP 10 SOFTWARE FOR WINDOWS Molecular Devices Pclamp 10 Standard
Tools
Ag/AgCl electrode, pellet, 1.0 mm Warner Instruments 64-1309
Curved hemostatic forcep various -
cyanoacrylate glue LOCTITE/various -
Decapitation scissors various -
Filter paper various -
Glass capillaries (micropipette) World Precision Instruments, Inc TW150F-4
Iris scissors Bonther equipamentos & Tecnologia/various 65-66
Pasteur glass pipette  Sigma Aldrich/various CLS7095B9-1000EA
Petri dish various -
Polyethylene tubing  Warner Instruments 64-0756
Razor blade for brain dissection TED PELLA TEDP-121-1
Razor blade for the vibratome TED PELLA TEDP-121-9
Scissors Bonther equipamentos & Tecnologia/various 71-72, 48,49; 
silicone teat various -
Slice Anchor  Warner Instruments 64-0246
Syringe filters Merck Millipore Ltda SLGVR13SL Millex-GV 0.22 μm
Tweezers Bonther equipamentos & Tecnologia/various 131, 1518

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bezanilla, F. Single sodium channels from the squid giant axon. Biophysical Journal. 52 (6), 1087-1090 (1987).
  2. Clay, J. R. Potassium current in the squid giant axon. International Review of Neurobiology. 27, 363-384 (1985).
  3. Gandini, M. A., Sandoval, A., Felix, R. Patch-clamp recording of voltage-sensitive Ca2+ channels. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (4), 329-325 (2014).
  4. Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve. The Journal of Physiology. 117 (4), 500-544 (1952).
  5. Perkins, K. L. Cell-attached voltage-clamp and current-clamp recording and stimulation techniques in brain slices. Journal of Neuroscience Methods. 154 (1-2), 1-18 (2006).
  6. Suk, H. J., Boyden, E. S., van Welie, I. Advances in the automation of whole-cell patch clamp technology. Journal of Neuroscience Methods. 326, 108357 (2019).
  7. Cole, K. S., Curtis, H. J. Electric impedance of the squid giant axon during activity. The Journal of General Physiology. 22 (5), 649-670 (1939).
  8. Bernstein, J. Ueber den zeitlichen Verlauf der negativen Schwankung des Nervenstroms. Pflüger, Archiv für die Gesammte Physiologie des Menschen und der Thiere. 1 (1), 173-207 (1868).
  9. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Archiv. 391 (2), 85-100 (1981).
  10. Hill, C. L., Stephens, G. J. An introduction to patch clamp recording. Methods in Molecular Biology. 2188, 1-19 (2021).
  11. Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).
  12. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review of Physiology. 46, 455-472 (1984).
  13. Gottsch, M. L., et al. A role for kisspeptins in the regulation of gonadotropin secretion in the mouse. Endocrinology. 145 (9), 4073-4077 (2004).
  14. Smith, J. T., Cunningham, M. J., Rissman, E. F., Clifton, D. K., Steiner, R. A. Regulation of Kiss1 gene expression in the brain of the female mouse. Endocrinology. 146 (9), 3686-3692 (2005).
  15. Smith, J. T., et al. Differential regulation of KiSS-1 mRNA expression by sex steroids in the brain of the male mouse. Endocrinology. 146 (7), 2976-2984 (2005).
  16. Ducret, E., Gaidamaka, G., Herbison, A. E. Electrical and morphological characteristics of anteroventral periventricular nucleus kisspeptin and other neurons in the female mouse. Endocrinology. 151 (5), 2223-2232 (2010).
  17. Qiu, J., Fang, Y., Bosch, M. A., Rønnekleiv, O. K., Kelly, M. J. Guinea pig kisspeptin neurons are depolarized by leptin via activation of TRPC channels. Endocrinology. 152 (4), 1503-1514 (2011).
  18. Gottsch, M. L., et al. Molecular properties of Kiss1 neurons in the arcuate nucleus of the mouse. Endocrinology. 152 (11), 4298-4309 (2011).
  19. de Croft, S., et al. Spontaneous kisspeptin neuron firing in the adult mouse reveals marked sex and brain region differences but no support for a direct role in negative feedback. Endocrinology. 153 (11), 5384-5393 (2012).
  20. Frazão, R., et al. Shift in Kiss1 cell activity requires estrogen receptor alpha. The Journal of Neuroscience. 33 (7), 2807-2820 (2013).
  21. DeFazio, R. A., Elias, C. F., Moenter, S. M. GABAergic transmission to kisspeptin neurons is differentially regulated by time of day and estradiol in female mice. The Journal of Neuroscience. 34 (49), 16296-16308 (2014).
  22. Mansano, N. D. S., et al. Vasoactive intestinal peptide exerts an excitatory effect on hypothalamic kisspeptin neurons during estrogen negative feedback. Molecular and Cellular Endocrinology. 542, 111532 (2022).
  23. Jamieson, B. B., Piet, R. Kisspeptin neuron electrophysiology: Intrinsic properties, hormonal modulation, and regulation of homeostatic circuits. Frontiers in Neuroendocrinology. 66, 101006 (2022).
  24. Silveira, M. A., et al. STAT5 signaling in kisspeptin cells regulates the timing of puberty. Molecular and Cellular Endocrinology. 448, 55-65 (2017).
  25. Silveira, M. A., et al. Acute effects of somatomammotropin hormones on neuronal components of the hypothalamic-pituitary-gonadal axis. Brain Research. 1714, 210-217 (2019).
  26. Cravo, R. M., et al. Leptin signaling in Kiss1 neurons arises after pubertal development. PLoS One. 8 (3), e58698 (2013).
  27. Manfredi-Lozano, M., et al. Defining a novel leptin-melanocortin-kisspeptin pathway involved in the metabolic control of puberty. Molecular Metabolism. 5 (10), 844-857 (2016).
  28. Qiu, J., et al. Insulin excites anorexigenic proopiomelanocortin neurons via activation of canonical transient receptor potential channels. Cell Metabolism. 19 (4), 682-693 (2014).
  29. de Croft, S., Boehm, U., Herbison, A. E. Neurokinin B activates arcuate kisspeptin neurons through multiple tachykinin receptors in the male mouse. Endocrinology. 154 (8), 2750-2760 (2013).
  30. Frazao, R., et al. Estradiol modulates Kiss1 neuronal response to ghrelin. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 306 (6), E606-E614 (2014).
  31. True, C., Verma, S., Grove, K. L., Smith, M. S. Cocaine- and amphetamine-regulated transcript is a potent stimulator of GnRH and kisspeptin cells and may contribute to negative energy balance-induced reproductive inhibition in females. Endocrinology. 154 (8), 2821-2832 (2013).
  32. Navarro, V. M., et al. Regulation of NKB pathways and their roles in the control of Kiss1 neurons in the arcuate nucleus of the male mouse. Endocrinology. 152 (11), 4265-4275 (2011).
  33. Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell patch-clamp recordings in brain slices. Journal of Visualized Experiments. (112), e54024 (2016).
  34. Gibson, A. G., Jaime, J., Burger, L. L., Moenter, S. M. Prenatal androgen treatment does not alter the firing activity of hypothalamic arcuate kisspeptin neurons in female mice. eNeuro. 8 (5), (2021).
  35. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain. Stereotaxic Coordinates. 2nd edition. , Academic Press. (2001).
  36. Cravo, R. M., et al. Characterization of Kiss1 neurons using transgenic mouse models. Neuroscience. 173, 37-56 (2011).
  37. Emane, M. N., Delouis, C., Kelly, P. A., Djiane, J. Evolution of prolactin and placental lactogen receptors in ewes during pregnancy and lactation. Endocrinology. 118 (2), 695-700 (1986).
  38. Fuh, G., Colosi, P., Wood, W. I., Wells, J. A. Mechanism-based design of prolactin receptor antagonists. The Journal of Biological Chemistry. 268 (8), 5376-5381 (1993).
  39. Barinaga, M. Ion channel research wins physiology Nobel. Science. 254 (5030), 380 (1991).
  40. Colquhoun, D. Neher and Sakmann win Nobel Prize for patch-clamp work. Trends in Pharmacological Sciences. 12 (12), 449 (1991).
  41. Greger, R. Nobel Prize for Medicine and Physiology 1991. Analysis of the function of single ion channel. Deutsche Medizinische Wochenschrift. 116 (48), 1849-1851 (1991).
  42. Brau, M. E., Vogel, W., Hempelmann, G. Possible applications of the "patch-clamp" method in anesthesiologic research; comment. Anasthesiologie, Intensivmedizin, Notfallmedizin, Schmerztherapie. 31 (9), 537-542 (1996).
  43. Cahalan, M., Neher, E. Patch clamp techniques: an overview. Methods in Enzymology. 207, 3-14 (1992).
  44. Kornreich, B. G. The patch clamp technique: principles and technical considerations. Journal of Veterinary Cardiology. 9 (1), 25-37 (2007).
  45. Neher, E., Sakmann, B. The patch clamp technique. Scientific American. 266 (3), 44-51 (1992).
  46. Sachs, F., Auerbach, A. Single-channel electrophysiology: use of the patch clamp. Methods in Enzymology. 103, 147-176 (1983).
  47. Dallas, M., Bell, D. Patch Clamp Electrophysiology: Methods and Protocols. 1st edition. , (2021).
  48. Robinson, R. A., Stokes, R. H. Electrolyte Solutions. 2nd edition. , Butterworths Scientific. (1959).
  49. de Souza, G. O., et al. Gap junctions regulate the activity of AgRP neurons and diet-induced obesity in male mice. The Journal of Endocrinology. 255 (2), 75-90 (2022).
  50. Houades, V., Koulakoff, A., Ezan, P., Seif, I., Giaume, C. Gap junction-mediated astrocytic networks in the mouse barrel cortex. The Journal of Neuroscience. 28 (20), 5207-5217 (2008).
  51. Richerson, G. B., Messer, C. Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing. Experimental Neurology. 131 (1), 133-143 (1995).
  52. Pan, J. T., Li, C. S., Tang, K. C., Lin, J. Y. Low calcium/high magnesium medium increases activities of hypothalamic arcuate and suprachiasmatic neurons in brain tissue slices. Neuroscience Letters. 144 (1-2), 157-160 (1992).
  53. Hamill, O. P., McBride, D. W. Induced membrane hypo/hyper-mechanosensitivity: a limitation of patch-clamp recording. Annual Review of Physiology. 59, 621-631 (1997).
  54. Herbison, A. E., Moenter, S. M. Depolarising and hyperpolarising actions of GABA(A) receptor activation on gonadotrophin-releasing hormone neurones: towards an emerging consensus. Journal of Neuroendocrinology. 23 (7), 557-569 (2011).
  55. Qiu, J., et al. High-frequency stimulation-induced peptide release synchronizes arcuate kisspeptin neurons and excites GnRH neurons. eLife. 5, e16246 (2016).
  56. Chaves, F. M., Mansano, N. S., Frazão, R., Donato, J. Tumor necrosis factor α and interleukin-1β acutely inhibit AgRP neurons in the arcuate nucleus of the hypothalamus. International Journal of Molecular Sciences. 21 (23), 8928 (2020).
  57. Chaves, F. M., et al. Effects of the isolated and combined ablation of growth hormone and IGF-1 receptors in somatostatin neurons. Endocrinology. 163 (5), 045 (2022).
  58. Wasinski, F., et al. Growth hormone receptor in dopaminergic neurones regulates stress-induced prolactin release in male mice. Journal of Neuroendocrinology. 33 (3), e12957 (2021).
  59. Furigo, I. C., Ramos-Lobo, A. M., Frazao, R., Donato, J. Brain STAT5 signaling and behavioral control. Molecular and Cellular Endocrinology. 438, 70-76 (2016).
  60. Zampieri, T. T., et al. Postnatal overnutrition induces changes in synaptic transmission to leptin receptor-expressing neurons in the arcuate nucleus of female mice. Nutrients. 12 (8), 2425 (2020).
  61. Furigo, I. C., et al. Growth hormone regulates neuroendocrine responses to weight loss via AgRP neurons. Nature Communication. 10 (1), 662 (2019).

Tags

JoVE'de Bu Ay Sayı 193 beyin dilimi akım kelepçesi kayıtları Kiss1 hipotalamus
Tüm hücre yama-kelepçe kayıtları için bir hedef olarak hipotalamik kisspeptin nöronları
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Silva, J. d. N., Zampieri, T. T.,… More

Silva, J. d. N., Zampieri, T. T., Vieira, H. R., Frazao, R. Hypothalamic Kisspeptin Neurons as a Target for Whole-Cell Patch-Clamp Recordings. J. Vis. Exp. (193), e64989, doi:10.3791/64989 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter