Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

الخلايا العصبية تحت المهاد كيسبيبتين كهدف لتسجيلات المشبك التصحيحي للخلية الكاملة

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/64989
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Anatomy, Instituto de Ciencias Biomedicas, Universidade de Sao Paulo

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا لإجراء مشبك رقعة خلية كاملة على شرائح الدماغ التي تحتوي على خلايا كيسبيبتين العصبية ، المغير الأساسي لخلايا الهرمون المطلق للغدد التناسلية (GnRH). من خلال إضافة المعرفة حول نشاط الخلايا العصبية kisspeptin ، كانت هذه الأداة الكهربية بمثابة الأساس لتطورات كبيرة في مجال الغدد الصماء العصبية على مدى السنوات ال 20 الماضية.

Abstract

Kisspeptins ضرورية لنضوج محور الغدة النخامية والغدد التناسلية (HPG) والخصوبة. الخلايا العصبية تحت المهاد kisspeptin الموجودة في النواة الأمامية البطنية المحيطة بالبطين والنواة حول البطين المنقارية ، وكذلك النواة المقوسة في منطقة ما تحت المهاد ، تسقط على الخلايا العصبية لهرمون إفراز الغدد التناسلية (GnRH) ، من بين خلايا أخرى. أظهرت الدراسات السابقة أن إشارات كيسبيبتين تحدث من خلال مستقبل Kiss1 (Kiss1r) ، مما يؤدي في النهاية إلى إثارة نشاط الخلايا العصبية GnRH. في البشر والنماذج الحيوانية التجريبية ، تكون القبلات كافية للحث على إفراز GnRH ، وبالتالي إطلاق الهرمون اللوتيني (LH) والهرمون المنشط للجريب (FSH). نظرا لأن kisspeptins تلعب دورا أساسيا في الوظائف الإنجابية ، يعمل الباحثون على تقييم كيفية مساهمة النشاط الجوهري للخلايا العصبية تحت المهاد في الإجراءات المتعلقة بالتكاثر وتحديد الناقلات العصبية / المعدلات العصبية الأولية القادرة على تغيير هذه الخصائص. أصبحت تقنية مشبك التصحيح للخلية الكاملة أداة قيمة للتحقيق في نشاط الخلايا العصبية كيسبيبتين في خلايا القوارض. تسمح هذه التقنية التجريبية للباحثين بتسجيل وقياس التيارات الأيونية المثيرة والمثبطة التلقائية ، وإمكانات غشاء الراحة ، وإطلاق جهد الفعل ، وغيرها من الخصائص الكهربية لأغشية الخلايا. في هذه الدراسة ، تتم مراجعة الجوانب الحاسمة لتقنية مشبك التصحيح للخلية بأكملها ، والمعروفة باسم القياسات الكهربية الفسيولوجية التي تحدد الخلايا العصبية تحت المهاد كيسبيبتين ، ومناقشة القضايا ذات الصلة حول هذه التقنية.

Introduction

قام هودجكين وهكسلي بأول سجل داخل الخلايا لجهد الفعل الموصوف في العديد من الدراسات العلمية. تم إجراء هذا التسجيل على محور الحبار ، الذي يبلغ قطره الكبير (~ 500 ميكرومتر) ، مما يسمح بوضع قطب كهربائي دقيق داخل المحور. قدم هذا العمل إمكانيات كبيرة للبحث العلمي ، وبلغت ذروتها لاحقا في إنشاء وضع مشبك الجهد ، والذي تم استخدامه لدراسة الأساس الأيوني لتوليد جهد العمل1،2،3،4،5،6،7،8. على مر السنين ، تم تحسين هذه التقنية ، وأصبحت مطبقة على نطاق واسع في البحث العلمي 6,9. اختراع تقنية التصحيح المشبك، الذي حدث في أواخر سبعينيات القرن العشرين من خلال الدراسات التي بدأها إروين نيهر وبيرت ساكمان، سمح للباحثين لتسجيل القنوات أيون واحد وإمكانات الغشاء داخل الخلايا أو التيارات في كل نوع من الخلايا تقريبا باستخدام قطب كهربائي واحد فقط9،10،11،12. يمكن إجراء تسجيلات المشبك الرقعي على مجموعة متنوعة من مستحضرات الأنسجة ، مثل الخلايا المستزرعة أو شرائح الأنسجة ، إما في وضع مشبك الجهد (تثبيت غشاء الخلية عند جهد محدد يسمح بتسجيل ، على سبيل المثال ، التيارات المعتمدة على الجهد والتيارات المشبكية) أو وضع المشبك الحالي (مما يسمح بتسجيل ، على سبيل المثال ، التغيرات في جهد غشاء الراحة الناجم عن التيارات الأيونية ، إمكانات الفعل ، وتردد جهد ما بعد المشبكي).

جعل استخدام تقنية التصحيح المشبك العديد من الاكتشافات البارزة ممكنة. في الواقع ، فإن النتائج المنوية حول الخصائص الفيزيولوجية الكهربية للخلايا العصبية تحت المهاد kisspeptin الموجودة في النواة المحيطة بالبطين الأمامي البطني والمنقار حول البطين (AVPV / PeN Kisspeptin) ، والمعروفة أيضا باسم المنطقة المحيطة بالبطين المنقاري للبطين الثالث (RP3V) ، والنواة المقوسة لما تحت المهاد (ARH kisspeptin)13،14،15 ذات أهمية خاصة. في عام 2010 ، أجرى Ducret et al. التسجيلات الأولى للخلايا العصبية AVPV /PeN Kisspeptinفي الفئران باستخدام أداة فيزيولوجية كهربية أخرى ، وهي تقنية مشبك التصحيح للخلايا السائبة. قدمت هذه الدراسات وصفا كهربائيا للخلايا العصبية AVPV / PeNKisspeptin وأظهرت أن أنماط إطلاقها تعتمد على الدورة16. في عام 2011 ، استخدم Qiu et al. تقنية مشبك تصحيح الخلية بالكامل لإثبات أن الخلايا العصبية ARHkisspeptin تعبر عن تيارات جهاز تنظيم ضربات القلب الداخلي17. في وقت لاحق ، أظهر Gottsch et al. أن الخلايا العصبية kisspeptin تظهر نشاطا عفويا وتعبر عن كل من تيارات الكالسيوم من النوع h (جهاز تنظيم ضربات القلب) وتيارات الكالسيوم من النوع T ، مما يشير إلى أن الخلايا العصبيةARH kisspeptin تشترك في الخصائص الفيزيولوجية الكهربية مع الخلايا العصبية الأخرى لجهاز تنظيم ضربات القلب في الجهاز العصبي المركزي18. بالإضافة إلى ذلك ، فقد ثبت أن الخلايا العصبية ARH kisspeptin تظهر معدلات إطلاق ثنائية الشكل جنسيا وأن الخلايا العصبية AVPV /PeN Kisspeptin تظهر إمكانات غشاء استراحة ثنائية النمط (RMP) تتأثر بقنوات البوتاسيوم الحساسة ل ATP (KATP) 19,20. علاوة على ذلك ، ثبت أن المنشطات التناسلية تؤثر بشكل إيجابي على النشاط الكهربائي التلقائي للخلايا العصبية kisspeptin في الفئران19،20،21. تم ذكر الأعمال الأولى التي تدرس الخصائص الكهربية للخلايا العصبية كيسبيبتين16،17،18،19،20. منذ ذلك الحين ، استخدمت العديد من الدراسات تقنية مشبك التصحيح للخلية بأكملها لإثبات العوامل / المعدلات العصبية الكافية لتعديل النشاط الكهربائي للخلايا العصبية كيسبيبتين (الشكل 1)17،21،22،23،24،25،26،27،28،29،30، 31,32.

نظرا لأهمية هذه التقنية لدراسة الخلايا العصبية المطلوبة للتكاثر ، من بين أنواع الخلايا الأخرى التي لا يتم تناولها هنا ، تصف هذه المقالة الخطوات الأساسية لتطوير تقنية مشبك التصحيح للخلية بأكملها ، مثل تحضير المحاليل ، وتشريح الدماغ وتقطيعه ، وإجراء ختم غشاء الخلية للتسجيلات. علاوة على ذلك ، تتم مناقشة القضايا ذات الصلة حول التقنية ، مثل مزاياها والقيود الفنية والمتغيرات المهمة التي يجب التحكم فيها للحصول على الأداء التجريبي الأمثل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل لجنة أخلاقيات الحيوانات التابعة لمعهد العلوم الطبية الحيوية في جامعة ساو باولو وتم تنفيذها وفقا للمبادئ التوجيهية الأخلاقية التي اعتمدتها الكلية البرازيلية للتجارب على الحيوانات.

1. إعداد الحلول

  1. إعداد الحل الداخلي
    ملاحظة: يملأ المحلول الداخلي الماصة الدقيقة ذات المشبك التصحيحي وسوف يتصل بداخل الخلية (انظر المثال في الشكل 2). قد تختلف الحلول الداخلية حسب نوع النشاط المراد قياسه33.
    1. اختيار الحل الداخلي مع مراعاة الغرض التجريبي منه ونوع السجل المناسب. لتسجيل جهد الغشاء في وضع المشبك الحالي ، استخدم المحلول الداخلي المكون من 120 mM K-gluconate ، 1 mM NaCl ، 5 mM EGTA ، 10 mM HEPES ، 1 mM MgCl 2 ، 1 mM CaCl2 ، 3 mM KOH ، 10 mM KCl ، و 4 mM (Mg) -ATP. قم بوزن جميع الأملاح وفقا للحجم النهائي المطلوب ، كما هو موضح في الجدول 1.
    2. استخدم كمية كافية من الماء منزوع الأيونات للوصول إلى 90٪ من الحجم النهائي للمحلول. سيضمن هذا الحجم مساحة كافية لضبط الأس الهيدروجيني والأسمولية.
    3. بعد إضافة وخلط جميع المكونات جيدا ، اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.2-7.3 مع 5 M KOH باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني. استخدم مقياس الأسموزية للتحقق من الأسمولية ، والتي يجب أن تكون حوالي 275-280 mOsm (اضبط ، إذا لزم الأمر ، لأسفل فقط).
    4. تحضير المحلول الداخلي مسبقا وتخزينه في درجة حرارة 8 درجات مئوية. أضف الأدينوسين الثلاثي الفوسفات (ATP) في يوم التجربة. قم بتخزين المحلول الداخلي المحتوي على ATP عند -20 درجة مئوية (1 مل من القسامة) لمدة 3-4 أشهر.
  2. تحضير محلول التقطيع
    1. تحضير محلول تقطيع يحتوي على 238 mM سكروز ، 2.5 mM KCl ، 26 mM NaHCO3 ، 1.0 mM NaH 2 PO4 ، 10 mM Glucose ، 1.0 mM CaCl 2، و 5.0 mM MgCl2. قم بوزن جميع الأملاح وفقا للحجم النهائي المطلوب ، كما هو موضح في الجدول 2. يعتمد الحجم الدقيق لهذا المحلول المراد تحضيره على حجم غرفة القطع.
    2. أثناء خلط جميع الأملاح في الماء منزوع الأيونات ، تشبع باستمرار مع الكاربوجين (95 ٪ O 2 و 5 ٪ CO2). قم بتوصيل أنابيب البولي إيثيلين (القطر الخارجي 1.57 مم [OD] × القطر الداخلي 1.14 مم [ID]) بأسطوانة كاربوجين لتزويد محلول التقطيع بالكاربوجين. أمسك الطرف المفتوح للأنبوب داخل الكأس الزجاجية التي تحتوي على محلول التقطيع.
    3. بعد خلط جميع المكونات جيدا ، اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.3 مع حمض النيتريك بنسبة 10٪ باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني. استخدم مقياس الأسموزية للتحقق من الأسمولية ، والتي يجب أن تكون 290-295 mOsm (اضبط ، إذا لزم الأمر ، لأسفل فقط). بعد ذلك ، قم بتبريد المحلول إلى 0-2 درجة مئوية.
  3. إعداد حل aCSF للتسجيلات
    1. تحضير محلول السائل النخاعي النخاعي الاصطناعي (aCSF) للتسجيلات التي تحتوي على 124 مللي مول كلوريد الصوديوم ، 2.8 مللي مول KCl ، 26 مللي متر NaHCO3 ، 1.25 mMNaH2 PO 4 ، 1.2 mM MgSO4 ، 5 mM الجلوكوز ، و 2.5 mM CaCl2. قم بوزن جميع الأملاح وفقا للحجم النهائي المطلوب ، الوارد في الجدول 3.
    2. أثناء خلط جميع الأملاح في الماء منزوع الأيونات ، تشبع باستمرار بالكربوجين (95٪ O 2 و 5٪ CO 2) ، كما هو موضح في الخطوة 1.2.2.
    3. بعد إضافة وخلط جميع المكونات ، اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.3 (يمكن استخدام حمض النيتريك بنسبة 10٪) باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني. استخدم مقياس الأسمومتر للتحقق من الأسمولية ، والتي يجب أن تكون 290-300 mOsm. بعد ذلك ، صب السائل الدماغي الشوكي في دورق واحتفظ به في حمام مائي عند 30 درجة مئوية.

2. تشريح الدماغ وتقطيعه

ملاحظة: نظرا لأن هياكل الدماغ المختلفة قد تتطلب قطعا في مستويات مختلفة (شرائح إكليلية أو سهمية أو أفقية) ، فإن النهج الدقيق للحصول على الشرائح يعتمد على منطقة الدماغ محل الاهتمام. عادة ، لدراسة الخلايا المعبرة عن Kiss1 في AVPV / PeN و ARH (المقومة هنا باسم الخلايا العصبية AVPV / PeN Kisspeptin والخلايا العصبية ARHkisspeptin ؛ الشكل 2 أ ، ب) ، عادة ما تصنع شرائح الدماغ الإكليلي (200-300 ميكرومتر)17،19،20،21،34. تقع الخلايا العصبية AVPV / PeN Kisspeptin على بعد حوالي 0.5 إلى -0.22 مم من bregma ، في حين أن الخلايا العصبيةARH kisspeptin هي في -1.22 إلى -2.70 ملم. يمكن تحديد موقع النوى باستخدام أطلس دماغ الفأرالتجسيمي 35 أو أطلس ألين المرجعي لدماغ الفأر (http://mouse.brain-map.org/). تم استخدام إناث Kiss1-Cre / GFP البالغة (مرحلة diestrus) والفئرانالذكور 36 في هذه الدراسة.

  1. إزالة الدماغ
    1. قم بإعداد موقع التشريح والأدوات اللازمة لاستخراج الدماغ: مقص قطع الرأس ، مقص القزحية ، مقص Castroviejo المنحني ، العظم العظمي ، الملقط ، الملعقة ، ورق الترشيح ، طبق بتري ، شفرة الحلاقة ، وغراء cyanoacrylate.
    2. قبل عمل الشرائح ، قم بإعداد المقعد الذي سيتم إجراء التشريح عليه ، حيث يجب تنفيذ جميع الإجراءات اللاحقة بسرعة. تأكد من الوصول إلى جهاز تقطيع مثل الاهتزاز.
    3. قم بإعداد غرفة تسجيل للحفاظ على شرائح الدماغ قبل تقطيع الأنسجة. احصل على غرفة تسجيل ، أبعاد حمام 24 مم × 15 مم × 2 مم (الطول × العرض × الارتفاع) ، من علامة تجارية (جدول المواد) أو اصنع واحدة داخليا.
      ملاحظة: يمكن تصنيع غرفة الاسترداد الداخلية على النحو التالي: قطع لوحة من 24 بئرا بحيث تتوفر تسعة آبار. قم بلصق شاشة من النايلون على قاعدة الآبار التسعة. مع ما تبقى من لوحة البئر ، قم بعمل قاعدة بحيث يكون الجزء السفلي من النايلون مجانيا. يمكن وضع هذه القاعدة المكيفة داخل كأس زجاجية سعة 500 mL تحتوي على aCSF (الشكل التكميلي 1).
    4. بعد تحضير كل شيء ، قم بتخدير الحيوان بمخدر مستنشق باستخدام 4٪ -5٪ إيزوفلوران. يجب أن يكون التخدير وفقا لبروتوكول معتمد من لجنة الأخلاقيات. بعد فترة وجيزة من عدم قدرة الحيوان على الحركة ، قم بإجراء اختبارات قرصة الذيل والمخلب للتأكد من تخدير الحيوان بعمق.
    5. قطع رأس الفئران بسرعة بينما لا يزال القلب نشطا لزيادة صلاحية الخلية. حصاد الدماغ بسرعة بعد قطع الرأس.
    6. باستخدام المقص الجراحي ، قم بعمل شق في الجلد في الجزء العلوي من جمجمة الحيوان ، من الذيلية إلى المنضدة ، وقم بإزالة فروة الرأس من رأس الحيوان. بعد ذلك ، قم بقطع الصفيحة بين الجداريات على طول الخيط السهمي بمقص القزحية وإزالة العظم القذالي. حرك العظم العظمي أسفل العظم الجداري واسحبه برفق للخارج حتى ينكشف الدماغ.
    7. بعد تعريض الدماغ ، اقلب الرأس رأسا على عقب ، واخفض الدماغ برفق لتصور العصب الثلاثي التوائم على كل جانب ، ثم اقطع العصب الثلاثي التوائم باستخدام مقص Castroviejo المنحني. بعد تصور منطقة ما تحت المهاد ، حدد العصب البصري واقطعه برفق.
      ملاحظة: كن حذرا عند قطع العصب البصري ، لأن سحبه سوف يمزق منطقة ما تحت المهاد المجاورة التي تحتوي على نواة AVPV / PeN.
    8. قطع الجزء الأمامي من الفص الجبهي وإزالة الدماغ تماما. اغمر الدماغ على الفور في محلول التقطيع حتى الحصول على الشرائح.
  2. تشريح عينات الدماغ
    1. ضع الدماغ على ورق ترشيح (مدعوم على طبق بتري) لتجفيف المحلول الزائد. ثم ، باستخدام شفرة حلاقة حادة ، قم بإجراء قطع إكليلي يفصل جذع الدماغ مع المخيخ عن بقية الأنسجة.
    2. بعد ذلك ، قم بلصق الجزء الذيلي من الدماغ بقاعدة الاهتزاز واملأ حجرة جهاز التقطيع بمحلول التقطيع / aCSF المبرد إلى 0-2 درجة مئوية. أثناء الإجراء ، قم بتعبئة الثلج الجاف حول حجرة الاهتزاز للحفاظ على محلول التقطيع باردا.
    3. أدخل شفرة الحلاقة في الاهتزاز واضبط معلمات القطع المناسبة للجهاز: السرعة = 3 ، التردد = 9 ، والتغذية = 250 ميكرومتر. استخدم ماصة نقل الأكريليك (ماصة زجاج باستور المقلوبة المرفقة بحلمة سيليكون) لنقل الشرائح إلى غرفة الاسترداد (الموضحة في الخطوة 2.1.3) أثناء إجراء تقطيع الأنسجة. انتظر 60 دقيقة لاستعادة الأنسجة بعد الحصول على شريحة.

3. ختم الخلية للتسجيل

  1. تأكد من تشغيل جميع قطع المعدات (المجهر ، مكبر الصوت ، التحويل الرقمي ، المعالج الدقيق ، وغيرها) قبل بدء التسجيل.
  2. املأ غرفة التسجيل ، من علامة تجارية (جدول المواد) ، متصلة بالمجهر بمحلول aCSF للتسجيلات. استخدم مضخة التروية لتغذية السائل الدماغي النخاعي باستمرار بمعدل 2 مل / دقيقة.
  3. انقل شريحة دماغية مثيرة للاهتمام (واحدة تلو الأخرى) إلى غرفة التسجيل. استخدم ماصة نقل الأكريليك (ماصة زجاج باستور المقلوبة المرفقة بحلمة سيليكون) لنقل شرائح ما تحت المهاد إلى الغرفة. استخدم مرساة شريحة (جدول المواد) لتثبيت الشريحة حتى لا تتحرك أثناء نضح السائل الدماغي النخاعي.
  4. ضع شريحة في وسط غرفة التسجيل متصلة بالمجهر. يعد موضع الشريحة أمرا بالغ الأهمية للسماح برؤية جيدة للمنطقة المرغوبة تحت المجهر وللوصول المثالي إلى ماصة التسجيل الدقيقة.
  5. استخدم عدسة الهدف منخفضة الطاقة لمجهر الغمر (10x أو 20x) للمساعدة في تحديد موضع الشريحة وتحديد منطقة الاهتمام.
  6. بعد تحديد المنطقة محل الاهتمام ، قم بتبديل العدسة الموضوعية إلى العدسة عالية الطاقة (63x) والتركيز على مستوى الأنسجة ، ومراقبة البروتين الفلوري الداخلي وأشكال الخلايا في المنطقة المستهدفة لتحديد موقع خلايا kisspeptin على سطح شريحة الدماغ20.
  7. عند تحديد موقع خلية هدف محتملة ، قم بتمييزها على شاشة الكمبيوتر بمؤشر الماوس أو عن طريق رسم تنسيق ، مثل مربع ، فوق منطقة الاهتمام. تساعد علامة شاشة الكمبيوتر في توجيه موضع ماصة التسجيل الدقيقة إلى الخلية.
  8. بعد تحديد الموقع الدقيق للخلية المستهدفة ، ارفع الهدف وأدخل ماصة التسجيل المملوءة بالمحلول الداخلي. عند وضع الماصة الدقيقة في حامل القطب ، تأكد من أن المحلول الداخلي ملامس للقطب الفضي.
    ملاحظة: لإعداد الماصة الدقيقة ووضعها ووضعها على حامل القطب ، يرجى الرجوع إلى33.
  9. تطبيق ضغط إيجابي قبل غمر الماصة الدقيقة في محلول aCSF ، لمنع الحطام من دخول الماصة الدقيقة ، باستخدام حقنة مملوءة بالهواء سعة 1-3 مل متصلة بحامل الماصة الدقيقة من خلال أنبوب بولي إيثيلين (أطول ≈130 سم) ؛ تطبيق ما يقرب من 100-200 ميكرولتر من الهواء.
  10. باستخدام المناور الدقيق ، قم بتوجيه الماصة الدقيقة أسفل مركز الهدف. حرك الأزرار الموجودة على المناور الدقيق لتوجيه الماصة الدقيقة على محور X-Y-Z نحو الخلية محل الاهتمام.
  11. اضبط التركيز البؤري لرؤية طرف الماصة الدقيقة واجعل التركيز البؤري أقرب ، ولكن ليس قريبا جدا ، من الشريحة. قلل من سرعة المعالج الدقيق وقم بخفض الماصة الدقيقة ببطء إلى مستوى التركيز. تأكد من أن طرف الماصة الدقيقة لا يخترق الشريحة فجأة ، بل ينزل ببطء حتى يلامس سطح الخلية / المنطقة المستهدفة.
  12. استخدم ضغطا إيجابيا خفيفا (≈100 ميكرولتر) باستخدام حقنة مملوءة بالهواء سعة 1-3 مل متصلة بحامل الماصة الدقيقة لإزالة أي حطام من مسار الاقتراب.
  13. ركز على الخلية المستهدفة وحرك المعالج الدقيق ببطء على المحور X-Y-Z لتقريب الماصة الدقيقة من الخلية المستهدفة. عند لمس الماصة الدقيقة بالخلية ، سيتم ملاحظة غمازة ناتجة عن الضغط المطبق من خلال طرف الماصة الدقيقة (الشكل 2C).
  14. بعد تشكيل الدمل ، نظرا لقرب الماصة الدقيقة من الخلية ، ضع شفطا ضعيفا وقصيرا عن طريق الفم (1-2 ثانية) من خلال الأنبوب المتصل بحامل الماصة الدقيقة لتوليد الختم بين الماصة الدقيقة إلى الخلية (ختم جيجاأوم أو جيجاسيل >1 GΩ ؛ الشكل 2 د). لتشكيل الختم ، استخدم وضع مشبك الجهد على البرنامج. للحصول على تفاصيل تشكيل الختم ، يرجى الرجوع إلى33.
  15. إذا ظل الختم مستقرا (يجب أن يكون ختم gigaohm مستقرا ميكانيكيا وبدون تدخل ضوضاء ، يتم تحديده عن طريق الملاحظة لمدة 1 دقيقة تقريبا) ، اضبط جهد التثبيت عند أقرب إمكانات الراحة الفسيولوجية للخلية المعنية. بالنسبة للخلايا العصبية تحت المهاد كيسبيبتين ، يوصى باستخدام -50 مللي فولت.
  16. تطبيق شفط قصير عن طريق الفم (الضغط السلبي) مع إغلاق الماصة الدقيقة على الخلية لكسر غشاء البلازما (الشكل 2E). يتم تحقيق التكوين المناسب للخلية الكاملة عند إجراء الشفط بقوة كافية بحيث لا يسد الغشاء الممزق الماصة الدقيقة ولا يجذب جزءا كبيرا من الغشاء أو حتى الخلية.
  17. تحقق من دليل إعدادات النظام المستخدم. استخدم البرنامج (انظر جدول المواد) للتحقق رقميا وحساب مقاومة السلسلة (SR) وسعة الخلية الكاملة (wcc).
  18. في وضع مشبك الجهد ، بعد كسر غشاء الخلية ، قم بتمكين خيار الخلية بأكملها ، وانقر فوق الأمر "تلقائي" الذي يشير إلى علامة تبويب الخلية بأكملها. سيتم حساب SR و wcc للخلية تلقائيا وعرضها على الفور بواسطة البرنامج. يمكن أيضا التحقق من هذه المعلمات عن طريق إجراء اختبار الغشاء باستخدام مكبر الصوت المذكور في جدول المواد33.
  19. تأكد من التحقق من معلمات صلاحية الخلية. بالنسبة للخلايا العصبية كيسبيبتين ، تحقق من أن القياسات الفيزيولوجية الكهربية هي: SR < 25 mΩ ، ومقاومة المدخلات > 0.3 GΩ ، والاحتفاظ بالقيمة المطلقة الحالية < 30 pA (الملاحظات الشخصية والمرجع21). القيمة المتوسطة ل WCC للخلايا العصبية AVPV / PeNKisspeptin أو ARHkisspeptin هي ≈ 10-12 pF في الفئران السليمةللغدد التناسلية 20.
  20. راقب SR وسعة الحالة المستقرة للخلية أثناء التجارب. تأكد من أن SR لا يتغير أكثر من 20٪ أثناء التسجيل وأن سعة الغشاء مستقرة.
  21. تحقق من إعدادات البرنامج. إنشاء بروتوكولات محددة للتسجيلات وفقا لنوع التجربة. لتسجيل جهد الغشاء في وضع المشبك الحالي ، باستخدام المعدات المذكورة في جدول المواد ، يقوم تمرير منخفض بتصفية الإشارات الكهربية عند 2-4 كيلو هرتز وتحليل النتائج في وضع عدم الاتصال في برنامج (انظر جدول المواد للحصول على معلومات البرنامج).
  22. بمجرد تحقيق تكوين الخلية بأكملها بشكل صحيح ، قم بقياس التيارات المشبكية في وضع مشبك الجهد (الشكل 2G). سجل التغيرات في إمكانات غشاء الراحة (RMP) وتغيرات RMP المستحثة في وضع المشبك الحالي (الشكل 2H). يمكن إحداث تغييرات في RMP ، مثل إزالة استقطاب غشاء الخلية ، عن طريق إعطاء دواء / ناقل عصبي معروف للحمام (كما هو موضح في الخطوة 3.2) ، كما هو موضح في الشكل 1.
    ملاحظة: في وضع المشبك الحالي ، يمكن حقن التيار الموجب أو السالب للحفاظ على جهد الغشاء عند الجهد المطلوب. بالنسبة للخلايا العصبية kisspeptin ، عادة ما نضع حقنة تيار صفرية (I = 0) لتسجيل التباين التلقائي لجهد الغشاء.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

لدراسة الآثار المحتملة لهرمون النمو البشري المؤتلف (hGH) على نشاط الخلايا العصبية تحت المهاد ، أجرينا تسجيلات مشبك رقعة للخلية الكاملة في شرائح الدماغ وقيمنا ما إذا كان هذا الهرمون يسبب تغيرات حادة في نشاط الخلايا العصبية AVPV / PeNKisspeptin و ARHkisspeptin. تم استخدام إناث Kiss1-Cre / GFP البالغة (مرحلة diestrus) والفئرانالذكور 36 في هذه الدراسة. تم اختيار الحيوانات السليمة للغدد التناسلية للتجارب ، لأن خصائص الخلايا العصبية kisspeptin تحت المهاد قد تختلف اعتمادا على مستويات الستيرويد الجنسي19,20. في حين أن تقييم الاختلافات بين الجنسين كان خارج نطاق الدراسة الحالية ، فإننا نحيل القارئ إلى Croft et al. و Frazão et al.19,20 لمزيد من المعلومات. تمثل الحيوانات المعدلة وراثيا ، مثل الفئران والجرذان ، أدوات مثيرة لهذا النوع من التجارب ، حيث يمكن التعرف على الخلايا التي تعبر عن جين معين أو الاجتثاث الناجم عن الانتقائية بواسطة بروتين فلوري مثل GFP ، من بين أمور أخرى23،26،36. يمثل استخدام الفئران المعدلة وراثيا طفرة في فهم نشاط الخلايا العصبية كيسبيبتين.

تم تحديد الخلايا العصبية المسجلة (26 خلية من أصل 12 حيوانا) وفقا للسمات التشريحية العصبية35 والتعبير عن GFP20 الداخلي. في وضع المشبك الحالي ، تم تسجيل الخلايا العصبية تحت I = 0 في تكوين المشبك التصحيح الخلية بأكملها. أظهرت الخلايا العصبية AVPV /PeN Kisspeptin (12 خلية من تسعة) متوسط RMP من -59.0 مللي فولت ± 3.0 مللي فولت (النطاق: -75 مللي فولت إلى -46 مللي فولت) ، ومقاومة المدخلات 0.9 ± 0.1 GΩ ، و WCC من 12.3 pF ± 1.6 pF ، و SR من 19.4 ± 1.9 mΩ. من بين الخلايا العصبية المسجلة ، أظهرت ثلاثة من أصل 12 خلية AVPV /PeN Kisspeptin تصريفات تلقائية لجهود الفعل (APs) أثناء الراحة (0.1 هرتز ± 0.06 هرتز ؛ كان متوسط RMP للخلايا النشطة تلقائيا -50.7 مللي فولت ± 2.7 مللي فولت). كان متوسط RMP للخلايا العصبيةARH kisspeptin (14 خلية من 12 حيوانا) -50.0 مللي فولت ± 1.5 مللي فولت (المدى: -62 مللي فولت إلى -39 مللي فولت) ، وكان متوسط مقاومة المدخلات 1.7 ± 0.1 GΩ ، وكان WCC 9.2 pF ± 0.7 pF ، و SR من 16.9 ± 1.7 mΩ. كانت معظم الخلايا العصبية ل ARHkisspeptin هادئة ، في حين أظهرت أربع خلايا من أصل 14 نقطة وصول عفوية أثناء الراحة (0.9 هرتز ± 0.5 هرتز ؛ كان متوسط RMP للخلايا النشطة تلقائيا -52.7 مللي فولت ± 1.4 مللي فولت).

أدى إعطاء هرمون النمو (20 ميكروغرام / جم) إلى الحمام إلى فرط استقطاب كبير في RMP للعديد من الخلايا العصبية المسجلة ، وخمسة من أصل 12 خلية عصبية AVPV / PeN Kisspeptin (≈55٪ من الخلايا من 9 فئران) ، وتسعة من أصل 14 خلية عصبية مسجلةARH kisspeptin (≈65٪ من الخلايا من 12 فأرا ، p = 0.0006 ، اختبار فيشر الدقيق. الشكل 3). غيرت الخلايا العصبية شديدة الاستقطاب AVPV / PeNKisspeptin و ARHkisspeptin بشكل كبير RMP مقارنة بالخلايا غير المستجيبة (الشكل 3B ، E ؛ الشكل 3B ، E ؛ الشكل 3B ، E ؛ الشكل 3B ، E ؛ الشكل 3B ، E ، الشكل 3B ، الشكل 3B ، E ، الشكل 3B ، الشكل 3B ، الشكل E ، الشكل 3B ، الشكل 3B ، الشكل E ، الشكل 3B ، الشكل 3B ، الشكل 3B ، الشكل E ، الشكل 3B ، الشكل 3B ، الشكل 3B ، الشكل 3B ، الشكل 3B ، الشكل 3 اختبار مان ويتني). أعقب التأثيرات على RMP (الشكل 3C ، F ؛ المقاييس المتكررة ANOVA و Tukey بعد الاختبار) انخفاض كبير في مقاومة مدخلات الخلية الكاملة (IR) على AVPV /PeN Kisspeptin (0.9 ± 0.1 GΩ إلى 0.7 ± 0.1 GΩ أثناء تطبيق hGH ، p = 0.02 ؛ الشكل 3D) ، وعلىARH kisspeptin (1.7 ± 0.1 GΩ إلى 1.0 ± 0.1 GΩ أثناء تطبيق هرمون النمو ، p < 0.0001 ؛ التدابير المتكررة ANOVA و Tukey بعد الاختبار ؛ الشكل 3G) الخلايا العصبيه. بالإضافة إلى ذلك ، انخفض تواتر APs العفوية (fAPs) للخلايا العصبية شديدة الاستقطاب hGH في كلتا مجموعتي الخلايا (0.1 هرتز ± 0.06 هرتز إلى 0.0 هرتز ± 0.0 هرتز في AVPV / PeN Kisspeptin و 1.0 هرتز ± 0.5 هرتز إلى 0.2 هرتز ± 0.1 هرتز في الخلايا العصبيةARH kisspeptin). ومع ذلك ، فشل مدى هذا الانخفاض في الوصول إلى مستوى ذي دلالة إحصائية (p > 0.05 ، اختبار مان ويتني). بعد غسل هرمون النمو ، تمت استعادة RMP و IR إلى خط الأساس (الشكل 3A ، C ، D ، F ، G). كانت الخلايا العصبية المتبقية كيسبيبتين لا تستجيب لإدارة هرمون النمو.

لقد أثبتنا سابقا أن pGH لا يؤدي إلى أي تأثيرات على نشاط الخلايا العصبية تحت المهاد (يرجى الرجوع إلى Silveira et al.25; الشكل 3H). من الجدير بالذكر أنه من المعروف أن هرمون النمو يمكنه تنشيط مستقبلات البرولاكتين (PRL) بالإضافة إلى مستقبلات هرمون النمو37,38. إلى جانب ذلك ، يزيل PRL بشكل غير مباشر ≈20٪ فقط من الخلايا العصبية AVPV /PeN Kisspeptin في الفئران24. في المقابل ، لا يعدل PRL الانتقال المشبكي السريع لخلاياARH kisspeptin 24. لذلك ، يبدو أن تأثير فرط الاستقطاب الناجم عن هرمون النمو المبلغ عنه هنا غير محدد. قد تعتمد الاختلافات الملحوظة على متغيرات مثل تركيز الدواء ، واختلاف الأنواع (الإنسان مقابل الفأر) ، أو حتى وجود الأملاح في تكوين الأدوية المستخدمة ، كما ورد سابقا28.

Figure 1
الشكل 1: رسم تخطيطي يلخص مساهمة تقنية المشبك الرقعي للخلية بأكملها في معرفة نشاط الخلايا العصبية كيسبيبتين. توجد الخلايا العصبية Kisspeptin (الموضحة باللون الأخضر) في نوى البطين حول البطين الأمامي البطني والنواة حول البطين (AVPV / PeN) والنواة المقوسة لمنطقة ما تحت المهاد (ARH). ترسل خلايا AVPV / PeN Kisspeptin و ARHkisspeptin اتصالات مباشرة إلى سوما الخلايا العصبية للهرمون المطلق للغدد التناسلية (GnRH) الموجودة في منطقة ما قبل البصري (POA) ونهايتها عند متوسط البروز (ME) ، وبلغت ذروتها في تعديل محور ما تحت المهاد والغدة النخامية (HPG). وقد تبين أن المعدلات العصبية المختلفة ، مثل الهرمونات ، تعدل بشكل تفاضلي نشاط الخلايا العصبية AVPV /PeN Kisspeptin و ARHkisspeptin. يتم توضيح التأثيرات المحتملة على إمكانات غشاء الراحة بشكل تخطيطي من خلال التتبع التمثيلي الذي تم الحصول عليه باستخدام تقنية مشبك مسار الخلية بأكملها وتسجيلات المشبك الحالي. يشير اللون الأحمر إلى أن ناقلا عصبيا معينا يحفز إزالة استقطاب إمكانات غشاء الراحة (RMP) 17،22،24،26،28،29،30،31،32 ؛ يشير اللون الأزرق إلى عدم وجود تأثير على RMP24،25،26،27،30. يشير الخط المتقطع إلى RMP. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: الخطوات الأساسية للحصول على ختم الخلية محل الاهتمام بواسطة تقنية مشبك التصحيح للخلية بأكملها. (أ، ب) صور مجهرية تمثيلية لشرائح الدماغ (250 ميكرومتر) التي تحتوي على خلايا كيسبيبتين في النواة الأمامية البطينية (AVPV) والنواة المقوسة لمنطقة ما تحت المهاد (ARH). تم تحديد الخلايا العصبية Kisspeptin بواسطة تعبير البروتين الفلوري الأخضر (GFP). (ج) صورة مجهرية ضوئية توضح ماصة مجهرية (تحتوي على محلول إلكتروليت [محلول داخلي]) قريبة بدرجة كافية من الخلية لتكوين غمازة في غشاء البلازما لإجراء الختم. (د، ه) مطلوب ضغط سلبي خفيف (شفط الفم الذي يتم إجراؤه على أنبوب متصل بالرأس والماصة الدقيقة) لإغلاق غشاء الخلية بالماصة الدقيقة (D). التطبيق الثاني للضغط السلبي (خفيف وقصير) ضروري للحث على تمزق غشاء البلازما (E). (F) يتم تسجيل نشاط الخلية بواسطة إعداد ميكانيكي يستخدم في تجارب المشبك الرقعي. بعد كسر غشاء البلازما ، يمكن تسجيل التيارات المتدفقة عبر القنوات الأيونية في الخلية المرقعة بواسطة قطب كهربائي متصل بمكبر صوت شديد الحساسية. يولد المقاوم المرتد التيار اللازم لتسجيلات مشبك الجهد (G) أو المشبك الحالي (H). الاختصارات: 3V = البطين الثالث. ME = متوسط السماحة. أشرطة المقياس: أ = 130 ميكرومتر ، ب = 145 ميكرومتر ، ج = 20 ميكرومتر ، د = 15 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: اختبار خصوصية الدواء. (أ) تسجيل المشبك الحالي التمثيلي يوضح أن هرمون النمو البشري المؤتلف (hGH) تسبب في فرط استقطاب جهد غشاء الراحة (RMP) للخلايا العصبية كيسبيبتين الموجودة في النواة المقوسة لمنطقة ما تحت المهاد (ARHkisspeptin). (ب-ز) الرسوم البيانية الشريطية التي توضح متوسط التغير في جهد غشاء الراحة (RMP) (B ، C ، E ، F) ومتوسط مقاومة الإدخال (IR) (D ، G) للخلايا العصبية كيسبيبتين المستجيبة لهرمون النمو الموجودة في نوى البطين حول البطين الأمامي البطني والمنقار (AVPV / PeNKisspeptin) (B-D) أو ARH (E-G). تسجيل المشبك الحالي التمثيلي يوضح أن هرمون نمو الخنازير (pGH) لم يحدث أي تأثير على RMP للخلايا العصبيةARH kisspeptin ، كما ورد سابقا25 (H). اختبارات الدلالة المستخدمة هي اختبار مان ويتني ل (B) و (E) ، والمقاييس المتكررة ANOVA واختبار Tukey البعدي ل (C ، D ، F ، G). يشير الخط المتقطع إلى RMP. * ع = 0.02 ؛ ** ع = 0.004 ، *** ع = 0.0003 ؛ ص < 0.0001. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

محلول داخلي (100 مل)
ملح مهاجم (جم / مول) تركيز الوزن (جم)
ك-غلوكونات 234.2 120 مللي متر 2.81
كلوريد الصوديوم 58.4 1.0 مللي متر 0.006
ككل 74.5 10 مللي متر 0.074
هيبس 238.3 10 مللي متر 0.24
إي جي تي ايه 380.3 5.0 مللي متر 0.19
كلوريد متعدد الكلور2 147.0 1.0 مللي متر 0.015
إم جي سي إل2 203.0 1.0 مللي متر 0.02
كوه 56.11 3.0 مللي متر 0.017
ATP 507.18 4.0 مللي متر 0.20
الرقم الهيدروجيني = 7.3 / الأسمولية = 275 - 280 mOsm

الجدول 1: الكواشف لإعداد الحل الداخلي. يحتوي الجدول على الوزن الجزيئي (FW) والتركيزات المطلوبة والوزن المحسوب للأملاح لتحضير 100 مل من المحلول.

aCSF / محلول تقطيع (250 مل)
ملح مهاجم تركيز الوزن (جم)
سكروز 342.3 238 مللي متر 18.5
كي سي إل 74.5 2.5 مللي متر 0.046
ناهكو3 84.0 26 مللي متر 0.546
NaH2PO4 120.0 1.0 مللي متر 0.03
مغ سي سي ال2 203.0 5 مللي متر 0.254
د-الجلوكوز 180.2 10 مللي متر 0.450
كلوريد متعدد الكلور2 147.0 1.0 مللي متر 0.037
الرقم الهيدروجيني = 7.3 / الأسمولية = 290 - 295 mOsm

الجدول 2: الكواشف لتحضير محلول التقطيع. يحتوي الجدول على الوزن الجزيئي (FW) والتركيزات المطلوبة والوزن المحسوب للأملاح لتحضير 250 مل من المحلول. يتم غمر الدماغ في هذا الحل ليتم تقطيعه.

aCSF للتسجيل (1 لتر)
ملح مهاجم تركيز الوزن (جم)
كلوريد الصوديوم 58.4 135 مللي متر 7.88
كي سي إل 74.5 3.5 مللي متر 0.261
ناهكو3 84.0 26 مللي متر 2,184
NaH2PO4 120.0 1.25 مللي متر 0.150
مغسو4 246.5 1.2 مللي متر 0.296
د-الجلوكوز 180.2 10 مللي متر 1,802
كلوريد متعدد الكلور2 147.0 1.0 مللي متر 0.148
الرقم الهيدروجيني = 7.3 / الأسمولية = 290-300 mOsm

الجدول 3: الكواشف لإعداد aCSF للتسجيلات. يحتوي الجدول على الوزن الجزيئي (FW) والتركيزات المطلوبة والوزن المحسوب للأملاح لإعداد 1 لتر من المحلول.

الشكل التكميلي 1: مثال على غرفة إنعاش داخلية. (أ، ب) يمكن تصنيع غرفة الاسترداد الداخلية على النحو التالي: قطع لوحة من 24 بئرا بحيث تتوفر تسعة آبار. قم بلصق شاشة من النايلون على قاعدة الآبار التسعة. مع ما تبقى من لوحة البئر ، قم بعمل قاعدة بحيث يكون الجزء السفلي من النايلون مجانيا. (ج) يمكن وضع هذه القاعدة المكيفة داخل كأس زجاجية سعة 500 mL تحتوي على السائل النخاعي النخاعي الاصطناعي (aCSF) المشبع باستمرار بالكربوجين (95٪ O2 و 5٪ CO2). (د) تحفظ الكأس الزجاجية التي تحمل حجرة الاسترداد في حمام مائي أثناء التجربة. (ه، و) يتم استخدام ماصة نقل الأكريليك لنقل شرائح الدماغ إلى غرفة الإنعاش. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

كان لتطوير تقنية المشبك التصحيحي للخلية الكاملة تأثير كبير على المجتمع العلمي ، حيث تعتبر ذات أهمية قصوى لتطوير البحث العلمي وتمكين العديد من الاكتشافات. كان تأثيره على العلم كافيا ليتوج بجائزة نوبل في الطب في عام 1991 ، حيث فتح هذا الاكتشاف الباب أمام فهم أفضل لكيفية عمل القنوات الأيونية في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية ، وكذلك تحديد الأهداف المحتملة للعوامل العلاجية11،39،40،41. في مجال الطب ، كان أحد النتائج البارزة التي تم التوصل إليها باستخدام هذه التقنية هو أن العديد من المواد المستخدمة سريريا تتفاعل مباشرة مع القنوات الأيونية (على سبيل المثال ، التخدير الموضعي ، ومضادات اضطراب النظم ، ومضادات السكر ، ومرخيات العضلات)42. لذلك ، فإن تطبيقه واضح في المعاهد السريرية وأقسام البحوث الأساسية. توضح هذه المقالة بروتوكول التحضير الأساسي لإجراء تجارب مشبك التصحيح للخلية الكاملة على شرائح الدماغ التي تحتوي على خلايا عصبية تحت المهاد kisspeptin. نحدد الخطوات الأساسية ونسلط الضوء على المعلمات البارزة التي يجب التحكم فيها للحصول على الأنسجة وإعداد حلول لتقنية التصحيح المشبك. ومع ذلك ، لا يمكن لهذه المقالة أن تصف بشكل كامل تعقيد هذه التقنية والآليات التي ينطوي عليها كل نوع من أنواع التسجيل ، وخاصة التحليل. لمزيد من التعلم النظري ، يوصى ببعض الكتب والمراجعات حول تقنية مشبك التصحيح10،43،44،45،46.

كل حل يستخدم في طريقة التصحيح المشبك له غرض محدد ؛ لذلك ، يجب اعتماد تركيباته ومعاييره المحددة بدقة أثناء الإعداد. على سبيل المثال ، يجب تحديد تكوين المحلول الداخلي وفقا لهدف التجربة ، لأنه يختلف باختلاف نوع التيار المراد قياسه. يستخدم المحلول القائم على الكلوريد المذكور هنا ، والذي يحاكي فيه Cl- (15 mM) التركيز الفسيولوجي لسيتوبلازم الخلية47 ، لدراسة الخصائص العصبية النشطة والسلبية أو الاستجابات للمدخلات المشبكية. من المهم التأكيد على أن محتوى الكلوريد في المحلول الداخلي يحافظ على إمكانات توازن الكلوريد عند المستويات المثلى لتسجيل الخلية (في المحلول المذكور ECL ، يكون حوالي -59 مللي فولت). يمكن تقدير تركيز الكلوريد داخل الخلايا من خلال تقييم إمكانات الانعكاس للتيار المستحث ب GABA (EGABA) ، بافتراض أن كل التيار عبر مستقبل GABAA يحمله Cl-21,48. لدراسة الخلايا العصبية تحت المهاد كيسبيبتين ، يجب على المرء أن يأخذ في الاعتبار أن تركيز Cl- داخل الخلايا ل ARHkisspeptin أعلى من خلايا AVPV /PeN Kisspeptin 21. يجب مراعاة هذه الخاصية عند التخطيط للتجربة. يوصى بأن تكون أسمولية المحلول الداخلي أقل بنسبة 5٪ على الأقل من أسمولية aCSF للتسجيلات لتجنب فقدان الختم بسبب التورم المحتمل و / أو إضعاف الخلية33,47. إذا كانت هناك حاجة لإضافة مركب داخل الخلايا يمكن استخدامه بشكل أكبر كعلامة خلية إلى المحلول الداخلي ، مثل biocytin أو صبغة داخل الخلايا (على سبيل المثال ، Alexa Fluor 594) ، فقد يتم تقليل مستويات K + بحيث يمكن الحفاظ على الأسمولية باستمرار20،47،49،50.

يعد إجراء تشريح سريع للدماغ والحفاظ على درجة حرارة منخفضة (0-2 درجة مئوية) أثناء التقطيع بمحلول تقطيع مناسب أمرا بالغ الأهمية. قد تختلف محاليل التقطيع وفقا لنوع الخلية و / أو منطقة الدماغ التي يتم تقييمها33,47. عادة ما يكون لمحلول aCSF المستخدم للحصول على شرائح الدماغ (أي محلول التقطيع) تركيبة مختلفة عن aCSF للتسجيلات (للمقارنة ، انظر الجدول 2 والجدول 3). يمكن تعديل تركيزات الكاتيون (Ca 2+ و Mg2+) لتعديل استثارة الخلايا العصبية ، والتي يمكن أن تؤثر أيضا على عتبة إطلاق النار وإطلاق الناقل العصبي47. تستخدم وسائط Low Ca 2+ و Mg2+ العالية على نطاق واسع لتقليل العمليات السامة المحتملة (لمزيد من المعلومات ، انظر51). بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تحفز وسائط الكالسيومالمنخفضة 2+ والوسائط العالية Mg2+ نشاط الخلايا العصبية تحت المهاد52. فيما يتعلق ب aCSF للتسجيلات ، فإن بعض الخصائص متشابهة. يعتمد النظام العازل على NaHCO3 ، وتركيزات عالية من كلوريد الصوديوم (بشكل عام >100 mM) وتركيزات KCl منخفضة (بشكل عام <5 mM) ، والتركيزات النسبية ل Ca 2+ و Mg2+ (غالبا ما يستخدم 2: 1) عادة ما تكون حوالي 2 mM ، ويمكن أن تتراوح مستويات الجلوكوز من 1 إلى 10 mM47. إلى جانب الاختلافات في الأسمولية أو الأس الهيدروجيني أو تغيرات درجة الحرارة (التي يتم التحكم فيها رقميا لتكون بين 30-32 درجة مئوية) ، من المهم تسليط الضوء على أن مشكلات أخرى قد تحدث أثناء البروتوكول التجريبي تتداخل بشكل كبير مع التجربة. يجب أن تكون القياسات الفيزيولوجية الكهربية مستقرة أثناء التسجيلات ، ويجب أن يكون لأي اختلافات قراءة نقدية. على سبيل المثال ، تمثل تغييرات SR الوصول الخلوي في وضع الخلية بأكملها ولها عواقب وخيمة على التيارات والإمكانات المقاسة. علاوة على ذلك ، من المهم التأكيد على أن أحد القيود ذات الصلة المتعلقة بمنهجية مشبك التصحيح التي يجب مراعاتها هو الإفراط في التحفيز الميكانيكي للخلية عن طريق بروتوكولات الشفط / الضغط المفرطة التي يمكن أن تحدث تغييرات مورفولوجية ووظيفية53. غالبا ما يصعب التحكم في هذا التحيز في البروتوكولات التي يتم فيها إجراء الشفط عن طريق الفم بدلا من جهاز يمكنه التحكم بدقة في شدة الشفط المطبقة. بالإضافة إلى ذلك ، قد تحدث المشكلات المتعلقة بالأنسجة ، والتي تبلغ ذروتها بنسبة عالية من وفيات الخلايا ، بسبب عدم كفاية التشريح أو نقص الأكسجة أو الحالة الصحية للفأر التي لا يستطيع الباحث تحديدها عن طريق الملاحظة.

الميزة الرئيسية لتقنية المشبك التصحيح للخلية بأكملها هي القدرة على تسجيل الخلايا العصبية في مناطق معينة من الدماغ ذات الأهمية بدقة. استفادت هذه التقنية بشكل كبير من إنشاء معدلة وراثيا. تعمل مجموعتنا عادة مع نموذج فأر يعبر عن hrGFP تحت مروج جين Kiss1 أو آخر يعبر عن Cre-recombinase تحت مروج جين Kiss1 و GFP تحت تعبير Cre-condition. ومع ذلك ، هناك العديد من النماذج الحيوانية التي تم التحقق من صحتها في الوقت الحاضر23،26،36. بالإضافة إلى ذلك ، فإن غياب الحاجز الدموي الدماغي وحقيقة أن البيئة خارج الخلية وداخل الخلايا يمكن التحكم فيها والتلاعب بها بسهولة يمثل مزايا هذه الطريقة ؛ ومع ذلك ، فإنها لا تمثل بالضرورة حالة فسيولوجية. من بين قيود هذه التقنية مقارنة بالمستحضرات في الجسم الحي ، أو أنواع التسجيل الأخرى التي تهدف إلى الحفاظ على التركيز الأيوني السيتوبلازمي ، مثل التسجيلات على الخلية أو التصحيح المثقوب ، من المهم الإشارة إلى أن غزو تكوين الخلية بأكملها يسبب غسيل الكلى لمحتوى السيتوبلازم54. قد يتسبب غسيل الكلى في انقطاع الجوانب الجزيئية اللازمة لبعض الظواهر لتتطور أو يتم التعبير عنها. من خلال التسجيل من الشرائح، يجب أن نتذكر أن معظم إسقاطات الخلايا العصبية مقسمة. وبالتالي ، فإنه خارج نطاق التقنية لتقييم مدى تأثير هذا الاضطراب على التأثيرات الملحوظة أو الحالة الفسيولوجية. كما ذكرنا ، عادة ما يتم إجراء شرائح الدماغ الإكليلي من 200-300 ميكرومتر لدراسة نشاط الخلايا العصبية تحت المهاد17،19،20،21،34. إن الحد من استخدام قسم شريحة دماغية أكثر سمكا لدراسة خلايا كيسبيبتين وزوايا شرائح مختلفة تحافظ على اتصال AVPV / PeN أو ARHمحدد 55 يحتاج إلى مزيد من التحقيق. بالإضافة إلى ذلك ، من خلال اختبار تأثير هرمون / دواء ، اصطناعي أم لا ، على RMP للخلية العصبية ، تستند العديد من الدراسات إلى عقار EC50 (إذا كان معروفا) أو على البيانات المنشورة التي تثبت أن تركيزا معينا فعال في تنشيط معدل إطلاق النار أو تغيير مستويات [Ca2+] i. ومع ذلك ، يجب أن يكون المرء على دراية بتكوين / خصوصية الدواء الذي سيتم استخدامه في التجارب ، حيث من الممكن أن يكون للعقاقير الاصطناعية المنقاة ، مقارنة بالعقاقير المماثلة الأخرى ، تأثيرات عدائية28. كما هو موضح سابقا25 ، في حين أن pGH المنقى لا يسبب أي تأثير على نشاط الخلايا العصبية تحت المهاد kisspeptin ، أنتج هرمون النمو بيانات مثيرة للجدل (انظر الشكل 3). تم إثبات نتائج مماثلة عندما تم تقييم تأثيرات الأنسولين على ARH28. لذلك ، ينبغي النظر في خصوصية الدواء عند التخطيط لتجربة وتفسير النتائج التي تم الحصول عليها.

تعد تقنية Patch-clamp أداة ممتازة للحصول على بيانات حول النشاط الكهربائي للخلايا العصبية وقد ساهمت بشكل كبير في معرفة العديد من المجموعات العصبية ، مثل الخلايا العصبية kisspeptin. تستخدم معظم التفاصيل المقدمة هنا بشكل عام لتسجيلات الخلايا العصبية تحت المهاد ، كما ذكرنا سابقا25،50،56،57،58،59،60. الأهم من ذلك ، لتسجيل مجموعات الخلايا العصبية الأخرى إلى جانب الخلايا العصبية kisspeptin ، يجب على المرء معرفة أو تحديد القياسات الكهربية التي يمكن أن تساعد في تحديد أنواع الخلايا ، مثل سعة الخلية ، SR ، مقاومة المدخلات ، نمط إطلاق الخلية ، وغيرها من المعالم. تختلف هذه الخصائص بين خلايا الدماغ المختلفة ، ونوى الدماغ ، والظروف الفسيولوجية أو المستحثة ، مثل تعميم مستويات الستيرويد الجنسي16،19،20،21،61 ، والتي يمكن أن تتداخل بشكل كبير مع التحليل النقدي للنتائج. بالإضافة إلى ذلك ، من الضروري فهم المتغيرات المحتملة التي ينطوي عليها إعداد الأنسجة والمزايا والقيود المرتبطة بها للعمل مع هذه التقنية. يجب إجراء جميع الخطوات الموضحة هنا بحكمة ، لأن أي تغيير في المتغيرات المتضمنة في البروتوكول قد يتداخل بشكل كبير مع النتائج.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

لا يوجد تضارب في المصالح ليتم الإعلان عنه.

Acknowledgments

تم دعم هذه الدراسة من قبل مؤسسة أبحاث ساو باولو [أرقام منح FAPESP: 2021/11551-4 (JNS) ، 2015/20198-5 (TTZ) ، 2019/21707/1 (RF) ؛ ومن قبل Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) - قانون المالية 001" (HRV).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Compounds for aCSF, internal and slicing solutions
ATP Sigma Aldrich/various A9187
CaCl2 Sigma Aldrich/various C7902
D-(+)-Glucose Sigma Aldrich/various G7021
EGTA Sigma Aldrich/various O3777
HEPES Sigma Aldrich/various H3375
KCL Sigma Aldrich/various P5405
K-gluconate Sigma Aldrich/various G4500
KOH Sigma Aldrich/various P5958
MgCl2 Sigma Aldrich/various M9272
MgSO4 Sigma Aldrich/various 230391
NaCl Sigma Aldrich/various S5886
NaH2PO4  Sigma Aldrich/various S5011
NaHCO3 Sigma Aldrich/various S5761
nitric acid Sigma Aldrich/various 225711 CAUTION
Sucrose Sigma Aldrich/various S1888
Equipments
Air table TMC 63-534
Amplifier Molecular Devices Multiclamp 700B
Computer various -
DIGIDATA 1440 LOW-NOISE DATA ACQUISITION SYSTEM Molecular Devices DD1440
Digital peristaltic pump Ismatec ISM833C 
Faraday cage TMC 81-333-03
Imaging Camera Leica DFC 365 FX
Micromanipulator Sutter Instruments Roe-200
Micropipette Puller Narishige PC-10
Microscope Leica DM6000 FS
Osteotome Bonther equipamentos & Tecnologia/various 128
Recovery chamber Warner Instruments/Harvard apparatus - can be made in-house
Recording chamber Warner Instruments 640277
Spatula Fisher Scientific /various FISH-14-375-10; FISH-21-401-20
Vibratome  Leica VT1000 S
Water Bath  Fisher Scientific /various Isotemp
Software and systems
AxoScope 10 software Molecular Devices - Commander Software
LAS X wide field system Leica - Image acquisition and analysis
MultiClamp 700B Molecular Devices MULTICLAMP 700B Commander Software
PCLAMP 10 SOFTWARE FOR WINDOWS Molecular Devices Pclamp 10 Standard
Tools
Ag/AgCl electrode, pellet, 1.0 mm Warner Instruments 64-1309
Curved hemostatic forcep various -
cyanoacrylate glue LOCTITE/various -
Decapitation scissors various -
Filter paper various -
Glass capillaries (micropipette) World Precision Instruments, Inc TW150F-4
Iris scissors Bonther equipamentos & Tecnologia/various 65-66
Pasteur glass pipette  Sigma Aldrich/various CLS7095B9-1000EA
Petri dish various -
Polyethylene tubing  Warner Instruments 64-0756
Razor blade for brain dissection TED PELLA TEDP-121-1
Razor blade for the vibratome TED PELLA TEDP-121-9
Scissors Bonther equipamentos & Tecnologia/various 71-72, 48,49; 
silicone teat various -
Slice Anchor  Warner Instruments 64-0246
Syringe filters Merck Millipore Ltda SLGVR13SL Millex-GV 0.22 μm
Tweezers Bonther equipamentos & Tecnologia/various 131, 1518

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bezanilla, F. Single sodium channels from the squid giant axon. Biophysical Journal. 52 (6), 1087-1090 (1987).
  2. Clay, J. R. Potassium current in the squid giant axon. International Review of Neurobiology. 27, 363-384 (1985).
  3. Gandini, M. A., Sandoval, A., Felix, R. Patch-clamp recording of voltage-sensitive Ca2+ channels. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (4), 329-325 (2014).
  4. Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve. The Journal of Physiology. 117 (4), 500-544 (1952).
  5. Perkins, K. L. Cell-attached voltage-clamp and current-clamp recording and stimulation techniques in brain slices. Journal of Neuroscience Methods. 154 (1-2), 1-18 (2006).
  6. Suk, H. J., Boyden, E. S., van Welie, I. Advances in the automation of whole-cell patch clamp technology. Journal of Neuroscience Methods. 326, 108357 (2019).
  7. Cole, K. S., Curtis, H. J. Electric impedance of the squid giant axon during activity. The Journal of General Physiology. 22 (5), 649-670 (1939).
  8. Bernstein, J. Ueber den zeitlichen Verlauf der negativen Schwankung des Nervenstroms. Pflüger, Archiv für die Gesammte Physiologie des Menschen und der Thiere. 1 (1), 173-207 (1868).
  9. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Archiv. 391 (2), 85-100 (1981).
  10. Hill, C. L., Stephens, G. J. An introduction to patch clamp recording. Methods in Molecular Biology. 2188, 1-19 (2021).
  11. Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).
  12. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review of Physiology. 46, 455-472 (1984).
  13. Gottsch, M. L., et al. A role for kisspeptins in the regulation of gonadotropin secretion in the mouse. Endocrinology. 145 (9), 4073-4077 (2004).
  14. Smith, J. T., Cunningham, M. J., Rissman, E. F., Clifton, D. K., Steiner, R. A. Regulation of Kiss1 gene expression in the brain of the female mouse. Endocrinology. 146 (9), 3686-3692 (2005).
  15. Smith, J. T., et al. Differential regulation of KiSS-1 mRNA expression by sex steroids in the brain of the male mouse. Endocrinology. 146 (7), 2976-2984 (2005).
  16. Ducret, E., Gaidamaka, G., Herbison, A. E. Electrical and morphological characteristics of anteroventral periventricular nucleus kisspeptin and other neurons in the female mouse. Endocrinology. 151 (5), 2223-2232 (2010).
  17. Qiu, J., Fang, Y., Bosch, M. A., Rønnekleiv, O. K., Kelly, M. J. Guinea pig kisspeptin neurons are depolarized by leptin via activation of TRPC channels. Endocrinology. 152 (4), 1503-1514 (2011).
  18. Gottsch, M. L., et al. Molecular properties of Kiss1 neurons in the arcuate nucleus of the mouse. Endocrinology. 152 (11), 4298-4309 (2011).
  19. de Croft, S., et al. Spontaneous kisspeptin neuron firing in the adult mouse reveals marked sex and brain region differences but no support for a direct role in negative feedback. Endocrinology. 153 (11), 5384-5393 (2012).
  20. Frazão, R., et al. Shift in Kiss1 cell activity requires estrogen receptor alpha. The Journal of Neuroscience. 33 (7), 2807-2820 (2013).
  21. DeFazio, R. A., Elias, C. F., Moenter, S. M. GABAergic transmission to kisspeptin neurons is differentially regulated by time of day and estradiol in female mice. The Journal of Neuroscience. 34 (49), 16296-16308 (2014).
  22. Mansano, N. D. S., et al. Vasoactive intestinal peptide exerts an excitatory effect on hypothalamic kisspeptin neurons during estrogen negative feedback. Molecular and Cellular Endocrinology. 542, 111532 (2022).
  23. Jamieson, B. B., Piet, R. Kisspeptin neuron electrophysiology: Intrinsic properties, hormonal modulation, and regulation of homeostatic circuits. Frontiers in Neuroendocrinology. 66, 101006 (2022).
  24. Silveira, M. A., et al. STAT5 signaling in kisspeptin cells regulates the timing of puberty. Molecular and Cellular Endocrinology. 448, 55-65 (2017).
  25. Silveira, M. A., et al. Acute effects of somatomammotropin hormones on neuronal components of the hypothalamic-pituitary-gonadal axis. Brain Research. 1714, 210-217 (2019).
  26. Cravo, R. M., et al. Leptin signaling in Kiss1 neurons arises after pubertal development. PLoS One. 8 (3), e58698 (2013).
  27. Manfredi-Lozano, M., et al. Defining a novel leptin-melanocortin-kisspeptin pathway involved in the metabolic control of puberty. Molecular Metabolism. 5 (10), 844-857 (2016).
  28. Qiu, J., et al. Insulin excites anorexigenic proopiomelanocortin neurons via activation of canonical transient receptor potential channels. Cell Metabolism. 19 (4), 682-693 (2014).
  29. de Croft, S., Boehm, U., Herbison, A. E. Neurokinin B activates arcuate kisspeptin neurons through multiple tachykinin receptors in the male mouse. Endocrinology. 154 (8), 2750-2760 (2013).
  30. Frazao, R., et al. Estradiol modulates Kiss1 neuronal response to ghrelin. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 306 (6), E606-E614 (2014).
  31. True, C., Verma, S., Grove, K. L., Smith, M. S. Cocaine- and amphetamine-regulated transcript is a potent stimulator of GnRH and kisspeptin cells and may contribute to negative energy balance-induced reproductive inhibition in females. Endocrinology. 154 (8), 2821-2832 (2013).
  32. Navarro, V. M., et al. Regulation of NKB pathways and their roles in the control of Kiss1 neurons in the arcuate nucleus of the male mouse. Endocrinology. 152 (11), 4265-4275 (2011).
  33. Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell patch-clamp recordings in brain slices. Journal of Visualized Experiments. (112), e54024 (2016).
  34. Gibson, A. G., Jaime, J., Burger, L. L., Moenter, S. M. Prenatal androgen treatment does not alter the firing activity of hypothalamic arcuate kisspeptin neurons in female mice. eNeuro. 8 (5), (2021).
  35. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain. Stereotaxic Coordinates. 2nd edition. , Academic Press. (2001).
  36. Cravo, R. M., et al. Characterization of Kiss1 neurons using transgenic mouse models. Neuroscience. 173, 37-56 (2011).
  37. Emane, M. N., Delouis, C., Kelly, P. A., Djiane, J. Evolution of prolactin and placental lactogen receptors in ewes during pregnancy and lactation. Endocrinology. 118 (2), 695-700 (1986).
  38. Fuh, G., Colosi, P., Wood, W. I., Wells, J. A. Mechanism-based design of prolactin receptor antagonists. The Journal of Biological Chemistry. 268 (8), 5376-5381 (1993).
  39. Barinaga, M. Ion channel research wins physiology Nobel. Science. 254 (5030), 380 (1991).
  40. Colquhoun, D. Neher and Sakmann win Nobel Prize for patch-clamp work. Trends in Pharmacological Sciences. 12 (12), 449 (1991).
  41. Greger, R. Nobel Prize for Medicine and Physiology 1991. Analysis of the function of single ion channel. Deutsche Medizinische Wochenschrift. 116 (48), 1849-1851 (1991).
  42. Brau, M. E., Vogel, W., Hempelmann, G. Possible applications of the "patch-clamp" method in anesthesiologic research; comment. Anasthesiologie, Intensivmedizin, Notfallmedizin, Schmerztherapie. 31 (9), 537-542 (1996).
  43. Cahalan, M., Neher, E. Patch clamp techniques: an overview. Methods in Enzymology. 207, 3-14 (1992).
  44. Kornreich, B. G. The patch clamp technique: principles and technical considerations. Journal of Veterinary Cardiology. 9 (1), 25-37 (2007).
  45. Neher, E., Sakmann, B. The patch clamp technique. Scientific American. 266 (3), 44-51 (1992).
  46. Sachs, F., Auerbach, A. Single-channel electrophysiology: use of the patch clamp. Methods in Enzymology. 103, 147-176 (1983).
  47. Dallas, M., Bell, D. Patch Clamp Electrophysiology: Methods and Protocols. 1st edition. , (2021).
  48. Robinson, R. A., Stokes, R. H. Electrolyte Solutions. 2nd edition. , Butterworths Scientific. (1959).
  49. de Souza, G. O., et al. Gap junctions regulate the activity of AgRP neurons and diet-induced obesity in male mice. The Journal of Endocrinology. 255 (2), 75-90 (2022).
  50. Houades, V., Koulakoff, A., Ezan, P., Seif, I., Giaume, C. Gap junction-mediated astrocytic networks in the mouse barrel cortex. The Journal of Neuroscience. 28 (20), 5207-5217 (2008).
  51. Richerson, G. B., Messer, C. Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing. Experimental Neurology. 131 (1), 133-143 (1995).
  52. Pan, J. T., Li, C. S., Tang, K. C., Lin, J. Y. Low calcium/high magnesium medium increases activities of hypothalamic arcuate and suprachiasmatic neurons in brain tissue slices. Neuroscience Letters. 144 (1-2), 157-160 (1992).
  53. Hamill, O. P., McBride, D. W. Induced membrane hypo/hyper-mechanosensitivity: a limitation of patch-clamp recording. Annual Review of Physiology. 59, 621-631 (1997).
  54. Herbison, A. E., Moenter, S. M. Depolarising and hyperpolarising actions of GABA(A) receptor activation on gonadotrophin-releasing hormone neurones: towards an emerging consensus. Journal of Neuroendocrinology. 23 (7), 557-569 (2011).
  55. Qiu, J., et al. High-frequency stimulation-induced peptide release synchronizes arcuate kisspeptin neurons and excites GnRH neurons. eLife. 5, e16246 (2016).
  56. Chaves, F. M., Mansano, N. S., Frazão, R., Donato, J. Tumor necrosis factor α and interleukin-1β acutely inhibit AgRP neurons in the arcuate nucleus of the hypothalamus. International Journal of Molecular Sciences. 21 (23), 8928 (2020).
  57. Chaves, F. M., et al. Effects of the isolated and combined ablation of growth hormone and IGF-1 receptors in somatostatin neurons. Endocrinology. 163 (5), 045 (2022).
  58. Wasinski, F., et al. Growth hormone receptor in dopaminergic neurones regulates stress-induced prolactin release in male mice. Journal of Neuroendocrinology. 33 (3), e12957 (2021).
  59. Furigo, I. C., Ramos-Lobo, A. M., Frazao, R., Donato, J. Brain STAT5 signaling and behavioral control. Molecular and Cellular Endocrinology. 438, 70-76 (2016).
  60. Zampieri, T. T., et al. Postnatal overnutrition induces changes in synaptic transmission to leptin receptor-expressing neurons in the arcuate nucleus of female mice. Nutrients. 12 (8), 2425 (2020).
  61. Furigo, I. C., et al. Growth hormone regulates neuroendocrine responses to weight loss via AgRP neurons. Nature Communication. 10 (1), 662 (2019).

Tags

هذا الشهر في JoVE ، العدد 193 ، شريحة الدماغ ، تسجيلات المشبك الحالي ، Kiss1 ، ما تحت المهاد
الخلايا العصبية تحت المهاد كيسبيبتين كهدف لتسجيلات المشبك التصحيحي للخلية الكاملة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Silva, J. d. N., Zampieri, T. T.,… More

Silva, J. d. N., Zampieri, T. T., Vieira, H. R., Frazao, R. Hypothalamic Kisspeptin Neurons as a Target for Whole-Cell Patch-Clamp Recordings. J. Vis. Exp. (193), e64989, doi:10.3791/64989 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter