Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Hypothalamische kisspeptine-neuronen als doelwit voor patchklem-opnames met hele cellen

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/64989
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Anatomy, Instituto de Ciencias Biomedicas, Universidade de Sao Paulo

Summary

Hier presenteren we een protocol om een pleisterklem van hele cellen uit te voeren op hersenplakken die kisspeptine-neuronen bevatten, de primaire modulator van gonadotrofine-releasing hormoon (GnRH) -cellen. Door kennis toe te voegen over de activiteit van kisspeptine-neuronen, heeft dit elektrofysiologische hulpmiddel de afgelopen 20 jaar als basis gediend voor aanzienlijke vooruitgang op het gebied van neuro-endocrinologie.

Abstract

Kisspeptinen zijn essentieel voor de rijping van de hypothalamus-hypofyse-gonadale (HPG) as en vruchtbaarheid. Hypothalamische kisspeptine-neuronen in de anteroventrale periventriculaire kern en rostrale periventriculaire kern, evenals de boogvormige kern van de hypothalamus, projecteren op gonadotrofine-releasing hormoon (GnRH) neuronen, naast andere cellen. Eerdere studies hebben aangetoond dat kisspeptine-signalering plaatsvindt via de Kiss1-receptor (Kiss1r), uiteindelijk opwindende GnRH-neuronactiviteit. In menselijke en experimentele diermodellen zijn kisspeptinen voldoende voor het induceren van GnRH-secretie en bijgevolg luteïniserend hormoon (LH) en follikelstimulerend hormoon (FSH) afgifte. Omdat kisspeptinen een essentiële rol spelen in reproductieve functies, werken onderzoekers eraan om te beoordelen hoe de intrinsieke activiteit van hypothalamische kisspeptine-neuronen bijdraagt aan reproductiegerelateerde acties en de primaire neurotransmitters / neuromodulatoren te identificeren die in staat zijn om deze eigenschappen te veranderen. De whole-cell patch-clamp techniek is een waardevol hulpmiddel geworden voor het onderzoeken van kisspeptin neuron activiteit in knaagdiercellen. Deze experimentele techniek stelt onderzoekers in staat om spontane exciterende en remmende ionische stromen, rustmembraanpotentiaal, actiepotentiaal en andere elektrofysiologische eigenschappen van celmembranen vast te leggen en te meten. In de huidige studie worden cruciale aspecten van de whole-cell patch-clamp-techniek, bekend als elektrofysiologische metingen die hypothalamische kisspeptine-neuronen definiëren, en een bespreking van relevante kwesties over de techniek, besproken.

Introduction

Hodgkin en Huxley maakten het eerste intracellulaire record van een actiepotentiaal beschreven in verschillende wetenschappelijke studies. Deze opname werd uitgevoerd op het inktvis-axon, dat een grote diameter heeft (~ 500 μm), waardoor een micro-elektrode in het axon kan worden geplaatst. Dit werk bood grote mogelijkheden voor wetenschappelijk onderzoek, later culminerend in de creatie van de spanningsklemmodus, die werd gebruikt om de ionische basis van actiepotentiaalgeneratie 1,2,3,4,5,6,7,8 te bestuderen. In de loop der jaren is de techniek verbeterd en op grote schaal toegepast in wetenschappelijk onderzoek 6,9. De uitvinding van de patch-clamp-techniek, die plaatsvond in de late jaren 1970 door studies geïnitieerd door Erwin Neher en Bert Sakmann, stelde onderzoekers in staat om enkele ionkanalen en intracellulaire membraanpotentialen of -stromen in vrijwel elk type cel vast te leggen met behulp van slechts een enkele elektrode 9,10,11,12 . Patch-clamp-opnamen kunnen worden gemaakt op verschillende weefselpreparaten, zoals gekweekte cellen of weefselplakken, in spanningsklemmodus (waarbij het celmembraan op een ingestelde spanning wordt gehouden waardoor bijvoorbeeld spanningsafhankelijke stromen en synaptische stromen kunnen worden geregistreerd) of stroomklemmodus (waardoor bijvoorbeeld veranderingen in rustmembraanpotentiaal geïnduceerd door ionenstromen kunnen worden geregistreerd, actiepotentialen en postsynaptische potentiaalfrequentie).

Het gebruik van de patch-clamp techniek maakte verschillende opmerkelijke ontdekkingen mogelijk. Inderdaad, de baanbrekende bevindingen over de elektrofysiologische eigenschappen van hypothalamische kisspeptine-neuronen gelegen op de anteroventrale periventriculaire en rostrale periventriculaire kernen (AVPV / PeN Kisspeptin), ook bekend als het rostrale periventriculaire gebied van de derde ventrikel (RP3V), en de boogvormige kern van de hypothalamus (ARHkisspeptin)13,14,15 zijn van bijzonder belang. In 2010 voerden Ducret et al. de eerste opnames uit van AVPV / PeNKisspeptine-neuronenin muizen met behulp van een ander elektrofysiologisch hulpmiddel, de lose-cell patch-clamp-techniek. Deze studies gaven een elektrische beschrijving van AVPV / PeNKisspeptine-neuronen en toonden aan dat hun vuurpatronen afhankelijk zijn van de oestruscyclus-afhankelijke16. In 2011 gebruikten Qiu et al. de hele cel patch-clamp-techniek om aan te tonen dat ARHkisspeptin neuronen endogene pacemakerstromen tot expressie brengen17. Vervolgens toonden Gottsch et al. aan dat kisspeptine-neuronen spontane activiteit vertonen en zowel h-type (pacemaker) als T-type calciumstromen tot expressie brengen, wat suggereert dat ARHkisspeptine-neuronen elektrofysiologische eigenschappen delen met andere pacemakerneuronen van het centrale zenuwstelsel18. Bovendien is aangetoond dat ARHkisspeptine-neuronen seksueel dimorfe vuursnelheden vertonen en dat AVPV / PeNKisspeptine-neuronen een bimodaal rustmembraanpotentiaal (RMP) vertonen dat wordt beïnvloed door ATP-gevoelige kaliumkanalen (KATP)19,20. Bovendien werd vastgesteld dat gonadale steroïden de spontane elektrische activiteit van de kisspeptine-neuronen bij muizen positief beïnvloeden 19,20,21. De eerste werken die de elektrofysiologische eigenschappen van kisspeptine-neuronen bestuderen, worden genoemd 16,17,18,19,20. Sindsdien hebben veel studies de whole-cell patch-clamp techniek gebruikt om aan te tonen welke factoren/neuromodulatoren voldoende zijn om de elektrische activiteit van kisspeptin neuronen te moduleren (Figuur 1)17,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32.

Gezien het belang van deze techniek voor de studie van neuronen die nodig zijn voor reproductie, naast andere celtypen die hier niet worden behandeld, beschrijft dit artikel de basisstappen voor de ontwikkeling van de patch-clamp-techniek van de hele cel, zoals het voorbereiden van de oplossingen, het ontleden en snijden van de hersenen en het uitvoeren van de afdichting van het celmembraan voor opnames. Bovendien worden relevante kwesties over de techniek besproken, zoals de voordelen, technische beperkingen en belangrijke variabelen die moeten worden gecontroleerd voor optimale experimentele prestaties.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dierprocedures werden goedgekeurd door het Instituut voor Biomedische Wetenschappen Dierenethiekcommissie aan de Universiteit van São Paulo en werden uitgevoerd volgens de ethische richtlijnen van het Braziliaanse College voor Dierproeven.

1. Bereiding van oplossingen

  1. Bereiding van interne oplossing
    OPMERKING: De interne oplossing vult de patchklemmicropipette en maakt contact met het binnenste van de cel (zie een voorbeeld in figuur 2). Interne oplossingen kunnen variëren afhankelijk van het type activiteit dat moet worden gemeten33.
    1. Kies de interne oplossing rekening houdend met het experimentele doel en het juiste recordtype. Om de membraanpotentiaal in de stroomklemmodus te registreren, gebruikt u de interne oplossing bestaande uit 120 mM K-gluconaat, 1 mM NaCl, 5 mM EGTA, 10 mM HEPES, 1 mM MgCl 2, 1 mM CaCl2, 3 mM KOH, 10 mM KCl en 4 mM (Mg)-ATP. Weeg alle zouten af volgens het gewenste eindvolume, zoals aangegeven in tabel 1.
    2. Gebruik voldoende gedeïoniseerd water om 90% van het uiteindelijke volume van de oplossing te bereiken. Dit volume zorgt voor voldoende ruimte om de pH en osmolariteit aan te passen.
    3. Nadat u alle ingrediënten grondig hebt toegevoegd en gemengd, stelt u de pH in op 7,2-7,3 met 5 M KOH met behulp van een pH-meter. Gebruik een osmometer om de osmolariteit te controleren, die ongeveer 275-280 mOsm moet zijn (indien nodig alleen naar beneden aanpassen).
    4. Bereid de interne oplossing van tevoren en bewaar bij 8 °C. Voeg de ATP toe op de dag van het experiment. Bewaar de ATP-bevattende interne oplossing bij -20 °C (1 ml aliquots) gedurende 3-4 maanden.
  2. Bereiding van snijoplossing
    1. Bereid een snijoplossing die 238 mM sucrose, 2,5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1,0 mM NaH 2 PO4, 10 mM glucose, 1,0 mM CaCl 2 en 5,0 mM MgCl2 bevat. Weeg alle zouten af volgens het gewenste eindvolume, zoals weergegeven in tabel 2. Het exacte volume van deze te bereiden oplossing hangt af van de grootte van de snijkamer.
    2. Terwijl u alle zouten in gedeïoniseerd water mengt, verzadigt u voortdurend met carbogen (95% O 2 en 5% CO2). Bevestig polyethyleen buizen (1,57 mm buitendiameter [OD] x 1,14 mm binnendiameter [ID]) aan een carbogencilinder om carbogen aan de snijoplossing te leveren. Houd het open uiteinde van de buis in het bekerglas met de snijoplossing.
    3. Nadat je alle ingrediënten goed hebt gemengd, stel je de pH in op 7,3 met 10% salpeterzuur met behulp van een pH-meter. Gebruik een osmometer om de osmolariteit te controleren, die 290-295 mOsm moet zijn (indien nodig alleen naar beneden aanpassen). Laat de oplossing daarna afkoelen tot 0-2 °C.
  3. ACSF-oplossing voorbereiden voor opnames
    1. Bereid kunstmatige cerebrospinale spinale vloeistof (aCSF) oplossing voor opnames met 124 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1,25 mM NaH 2 PO 4, 1,2 mM MgSO4, 5 mM glucose en 2,5 mM CaCl2. Weeg alle zouten af volgens het gewenste eindvolume in tabel 3.
    2. Tijdens het mengen van alle zouten in gedeïoniseerd water, constant verzadigen met carbogen (95% O 2 en 5% CO 2), zoals beschreven in stap 1.2.2.
    3. Nadat u alle ingrediënten hebt toegevoegd en gemengd, stelt u de pH in op 7,3 (10% salpeterzuur kan worden gebruikt) met behulp van een pH-meter. Gebruik een osmometer om de osmolariteit te controleren, die 290-300 mOsm moet zijn. Giet daarna de aCSF in een bekerglas en onderhoud in een waterbad op 30 °C.

2. Hersendissectie en slicing

OPMERKING: Aangezien verschillende hersenstructuren mogelijk in verschillende vlakken moeten worden gesneden (coronale, sagittale of horizontale plakjes), hangt de exacte aanpak voor het verkrijgen van de plakjes af van het hersengebied van belang. Typisch, om de Kiss1-tot expressie brengende cellen in de AVPV / PeN en ARH te bestuderen (hier aangeduid als AVPV / PeN Kisspeptine-neuronen en ARHkisspeptine-neuronen; Figuur 2A,B), coronale hersenschijfjes (200-300 μm) worden meestalgemaakt 17,19,20,21,34. De AVPV/PeNKisspeptin neuronen bevinden zich op ongeveer 0,5 tot -0,22 mm van de bregma, terwijl ARHkisspeptin neuronen zich op -1,22 tot -2,70 mm bevinden. De locatie van de kernen kan worden bepaald met behulp van een stereotaxische muizenhersenatlas35 of de Allen Mouse Brain Reference Atlas (http://mouse.brain-map.org/). Volwassen Kiss1-Cre/GFP vrouwelijke (diestrus-stadium) en mannelijke muizen36 werden gebruikt in deze studie.

  1. Hersenverwijdering
    1. Bereid de dissectieplaats voor en de hulpmiddelen die nodig zijn om de hersenen te extraheren: onthoofdingsschaar, irisschaar, Castroviejo gebogen schaar, osteotoom, pincet, spatel, filterpapier, petrischaal, scheermesje en cyanoacrylaatlijm.
    2. Voordat u de plakjes maakt, bereidt u de bank voor waarop de dissectie zal worden uitgevoerd, omdat alle volgende procedures snel moeten worden uitgevoerd. Zorg ervoor dat je toegang hebt tot een snijapparaat zoals een vibratome.
    3. Bereid een opnamekamer voor om de hersenplakken te onderhouden voordat u het weefsel snijdt. Koop een opnamekamer, badafmetingen van 24 mm x 15 mm x 2 mm (L x B x H), van een commercieel merk (Table of Materials) of maak er een in eigen huis.
      OPMERKING: Een interne herstelkamer kan als volgt worden vervaardigd: snijd een plaat met 24 putten zodat er negen putten beschikbaar zijn. Lijm een nylon scherm aan de basis van de negen putjes. Maak met de rest van de putplaat een basis zodat het onderste deel van het nylon vrij is. Deze aangepaste basis kan in een bekerglas van 500 ml met de aCSF worden geplaatst (aanvullende figuur 1).
    4. Na het bereiden van alles, verdoof het dier met geïnhaleerde verdoving met behulp van 4% -5% isofluraan. De anesthesie moet in overeenstemming zijn met een protocol dat is goedgekeurd door de ethische commissie. Kort nadat het dier onbeweeglijk is, voert u staart- en pootknijptests uit om ervoor te zorgen dat het dier diep verdoofd is.
    5. Onthoofd de muizen snel terwijl het hart nog actief is om de levensvatbaarheid van de cel te vergroten. Oogst de hersenen snel na onthoofding.
    6. Maak met een chirurgische schaar een incisie in de huid aan de bovenkant van de schedel van het dier, van caudaal tot rostral, en verwijder de hoofdhuid van het hoofd van het dier. Knip vervolgens de interpariëtale plaat langs de sagittale hechting met de irisschaar en verwijder het achterhoofdsbeen. Schuif het osteotoom onder het pariëtale bot en trek het voorzichtig uit totdat de hersenen worden blootgesteld.
    7. Nadat je de hersenen hebt blootgesteld, draai je het hoofd ondersteboven, laat je de hersenen zachtjes zakken om de nervus trigeminus aan elke kant te visualiseren en knip je vervolgens de nervus trigeminus door met een gebogen schaar van Castroviejo. Na het visualiseren van de hypothalamus, identificeert u de oogzenuw en snijdt u deze voorzichtig door.
      OPMERKING: Wees voorzichtig bij het snijden van de oogzenuw, omdat het trekken ervan het aangrenzende hypothalamische gebied met de AVPV / PeN-kern zal scheuren.
    8. Snijd het meest voorste deel van de frontale kwab en verwijder de hersenen volledig. Dompel de hersenen onmiddellijk onder in de snijoplossing totdat de plakjes zijn verkregen.
  2. Hersenmonsters snijden
    1. Plaats de hersenen op filterpapier (ondersteund op een petrischaaltje) om de overtollige oplossing te drogen. Voer vervolgens met een scherp snijdend scheermesje een coronale snede uit die de hersenstam met het cerebellum scheidt van de rest van het weefsel.
    2. Lijm vervolgens het caudale deel van de hersenen op de basis van het vibratoom en vul de kamer van het snijapparaat met de snij-/aCSF-oplossing gekoeld tot 0-2 °C. Verpak tijdens de procedure droogijs rond de vibratomenkamer om de snijoplossing koud te houden.
    3. Steek het scheermesje in het vibratoom en stel de juiste snijparameters van het apparaat in: snelheid = 3, frequentie = 9 en voeding = 250 μm. Gebruik een acryl transfer pipet (omgekeerde Pasteur glazen pipet bevestigd aan een siliconen speen) om de plakjes over te brengen naar de herstelkamer (beschreven in stap 2.1.3) tijdens de weefselsnijprocedure. Wacht 60 minuten op weefselherstel na het verkrijgen van een plak.

3. Celafdichting voor opname

  1. Zorg ervoor dat alle apparaten (microscoop, versterker, digitizer, micromanipulator en andere) zijn ingeschakeld voordat u de opname start.
  2. Vul de opnamekamer, van een commercieel merk (Table of Materials), bevestigd aan de microscoop met de aCSF-oplossing voor opnames. Gebruik een perfusiepomp om de aCSF constant te doordrenken met een snelheid van 2 ml / min.
  3. Breng een hersenschijfje van belang (één voor één) over naar de opnamekamer. Gebruik een acryl transfer pipet (omgekeerde Pasteur glazen pipet bevestigd aan een siliconen speen) om de hypothalamische plakjes over te brengen naar de kamer. Gebruik een segmentanker (materiaaltabel) om het segment vast te houden zodat het niet beweegt tijdens de aCSF-perfusie.
  4. Plaats een plakje in het midden van de opnamekamer die aan de microscoop is bevestigd. De snijpositie is van cruciaal belang voor een goed zicht op het gewenste gebied onder de microscoop en voor een perfect bereik van de opnamemicropipette.
  5. Gebruik de low-power objectieflens van een dompelmicroscoop (10x of 20x) om te helpen bij het positioneren van het segment en het lokaliseren van het interessegebied.
  6. Na het lokaliseren van het interessegebied, schakelt u de objectieflens over naar de krachtige lens (63x) en concentreert u zich op het weefselniveau, waarbij u het endogene fluorescerende eiwit en de vormen van de cellen in het doelgebied observeert om de kisspeptine-cellen op het oppervlak van de hersenschijf20 te lokaliseren.
  7. Wanneer een mogelijke doelcel zich bevindt, markeert u deze op het computerscherm met de muiscursor of door een indeling, zoals een vierkant, over het interessegebied te tekenen. De markering van het computerscherm helpt de positie van de opnamemicropipet naar de cel te leiden.
  8. Nadat u de exacte locatie van de doelcel hebt bepaald, tilt u het doel op en introduceert u de opnamemicropipette gevuld met de interne oplossing. Wanneer u de micropipet in de elektrodehouder plaatst, moet u ervoor zorgen dat de interne oplossing in contact is met de zilveren elektrode.
    OPMERKING: Voor de voorbereiding, plaatsing en positionering van micropipetten op de elektrodehouder raadpleegt u33.
  9. Oefen positieve druk uit voordat u de micropipette onderdompelt in de aCSF-oplossing, om te voorkomen dat vuil de micropipette binnendringt, met behulp van een met lucht gevulde spuit van 1-3 ml die via een polyethyleenslang (≈130 cm langer) op de micropipettehouder is aangesloten; Breng bijna 100-200 μL lucht aan.
  10. Gebruik de micromanipulator om de micropipet onder het midden van het objectief te leiden. Beweeg de knoppen op de micromanipulator om de micropipette op de X-Y-Z-as naar de cel van belang te leiden.
  11. Pas de scherpstelling aan om de punt van de micropipette te zien en breng de focus dichterbij, maar niet te dicht, bij het segment. Verlaag de snelheid van de micromanipulator en laat de micropipette langzaam zakken tot het scherpstelvlak. Zorg ervoor dat de punt van de micropipet niet abrupt in de plak doordringt, maar langzaam afdaalt totdat deze het oppervlak van de cel / het doelgebied raakt.
  12. Breng lichte positieve druk (≈100 μL) aan met de 1-3 ml luchtgevulde spuit die aan de micropipethouder is bevestigd om vuil van de aanvliegroute te verwijderen.
  13. Focus op de doelcel en beweeg de micromanipulator langzaam op de X-Y-Z-as om de micropipette dichter bij de doelcel te brengen. Bij het aanraken van de micropipette op de cel zal een kuiltje worden waargenomen dat wordt veroorzaakt door de druk die door de punt van de micropipet wordt uitgeoefend (figuur 2C).
  14. Na het vormen van het kuiltje, vanwege de nabijheid van de micropipette tot de cel, brengt u zwakke, korte zuigkracht via de mond (1-2 s) aan door de buis die is aangesloten op de micropipettehouder om de afdichting tussen de micropipette en de cel te genereren (gigaohm-afdichting of gigaseal >1 GΩ; Figuur 2D). Om de afdichting te vormen, gebruikt u de spanningsklemmodus op de software. Voor details over de samenstelling van de afdichting, zie33.
  15. Als de afdichting stabiel blijft (de gigaohm-afdichting moet mechanisch stabiel zijn en zonder ruisinterferentie, bepaald door observatie gedurende ongeveer 1 min), stelt u de houdspanning in op de dichtstbijzijnde fysiologische rustpotentiaal van de cel van belang. Voor kisspeptin hypothalamische neuronen wordt -50 mV aanbevolen.
  16. Breng een korte zuiging via de mond (negatieve druk) aan met de micropipette die aan de cel is afgedicht om het plasmamembraan te breken (figuur 2E). Adequate configuratie van de hele cel wordt bereikt wanneer de zuigkracht met voldoende kracht wordt uitgevoerd, zodat het gescheurde membraan de micropipette niet verstopt en geen aanzienlijk deel van het membraan of zelfs de cel aantrekt.
  17. Raadpleeg de gebruikte handleiding voor systeeminstellingen. Gebruik de software (zie Materiaaltabel) om de serieweerstand (SR) en de whole-cell capacitance (wcc) digitaal te controleren en te berekenen.
  18. In de spanningsklemmodus, na het breken van het celmembraan, schakelt u de optie voor de hele cel in en klikt u op de opdracht Auto die verwijst naar het tabblad hele cel. De SR en wcc van de cel worden automatisch berekend en direct weergegeven door de software. Deze parameters kunnen ook worden gecontroleerd door de membraantest uit te voeren met de versterker die wordt vermeld in de materiaaltabel33.
  19. Zorg ervoor dat u de parameters voor de levensvatbaarheid van cellen controleert. Controleer voor kisspeptineneuronen of de elektrofysiologische metingen zijn: SR < 25 mΩ, ingangsweerstand > 0,3 GΩ en met de huidige absolute waarde < 30 pA (persoonlijke waarnemingen en referentie21). De gemiddelde waarde van de wcc van AVPV/PeNKisspeptin of ARHkisspeptin neuronen is ≈ 10-12 pF bij gonade-intacte muizen20.
  20. Bewaak de SR en de steady-state capaciteit van de cel tijdens de experimenten. Zorg ervoor dat de SR niet meer dan 20% verandert tijdens een opname en dat de membraancapaciteit stabiel is.
  21. Controleer de software-instellingen. Maak specifieke protocollen voor de opnames op basis van het type experiment. Om de membraanpotentiaal in de stroomklemmodus vast te leggen, met apparatuur die in de materiaaltabel wordt genoemd, filtert u de elektrofysiologische signalen op 2-4 kHz en analyseert u de resultaten offline in een software (zie de materiaaltabel voor software-informatie).
  22. Zodra de configuratie van de hele cel correct is bereikt, meet u synaptische stromen in de spanningsklemmodus (figuur 2G). Registreer veranderingen in rustmembraanpotentiaal (RMP) en geïnduceerde RMP-variaties in de stroomklemmodus (figuur 2H). Veranderingen in RMP, zoals depolarisatie van het celmembraan, kunnen worden geïnduceerd door toediening van een bekend geneesmiddel/neurotransmitter aan het bad (beschreven in stap 3.2), zoals geïllustreerd in figuur 1.
    OPMERKING: In de stroomklemmodus kan positieve of negatieve stroom worden geïnjecteerd om de membraanspanning op een gewenste spanning te houden. Voor kisspeptine-neuronen stellen we meestal nulstroominjectie (I = 0) in om de spontane variatie van de membraanpotentiaal te registreren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Om de mogelijke effecten van humaan recombinant groeihormoon (hGH) op de activiteit van hypothalamische kisspeptine-neuronen te bestuderen, voerden we hele cel patch-clamp-opnames uit in hersenplakken en beoordeelden we of dit hormoon acute veranderingen veroorzaakt in de activiteit van AVPV / PeN Kisspeptin en ARHkisspeptin neuronen. Volwassen Kiss1-Cre/GFP vrouwelijke (diestrus-stadium) en mannelijke muizen36 werden gebruikt in deze studie. Gonad-intacte dieren werden geselecteerd voor de experimenten, omdat de eigenschappen van hun hypothalamische kisspeptine-neuronen kunnen variëren afhankelijk van geslachtssteroïde niveaus19,20. Hoewel het buiten het bestek van de huidige studie viel om verschillen tussen geslachten te evalueren, verwijzen we de lezer naar Croft et al. en Frazão et al.19,20 voor meer informatie. Genetisch gemodificeerde dieren, zoals muizen en ratten, vertegenwoordigen spannende hulpmiddelen voor dit soort experimenten, omdat cellen die een specifiek gen of een selectief geïnduceerde ablatie tot expressie brengen, kunnen worden geïdentificeerd door een fluorescerend eiwit zoals GFP, onder andere23,26,36. Het gebruik van genetisch gemodificeerde muizen betekent een doorbraak in het begrijpen van de activiteit van kisspeptine-neuronen.

Geregistreerde neuronen (26 cellen van de 12 dieren) werden bepaald op basis van neuroanatomische kenmerken35 en de expressie van de endogene GFP20. In de stroomklemmodus werden neuronen geregistreerd onder I = 0 in de patch-clampconfiguratie van de hele cel. De AVPV/PeNKisspeptin neuronen (12 cellen van negen dieren) vertoonden een gemiddelde RMP van -59,0 mV ± 3,0 mV (bereik: -75 mV tot -46 mV), ingangsweerstand van 0,9 ± 0,1 GΩ, wcc van 12,3 pF ± 1,6 pF en SR van 19,4 ± 1,9 mΩ. Van de geregistreerde neuronen vertoonden drie van de 12 AVPV/PeNKisspeptine-cellen spontane ontladingen van actiepotentialen (AP's) in rust (0,1 Hz ± 0,06 Hz; gemiddelde RMP van de spontaan actieve cellen was -50,7 mV ± 2,7 mV). De gemiddelde RMP van ARHkisspeptin neuronen (14 cellen van 12 dieren) was -50,0 mV ± 1,5 mV (bereik: -62 mV tot -39 mV), de gemiddelde ingangsweerstand was 1,7 ± 0,1 GΩ, wcc was 9,2 pF ± 0,7 pF en SR van 16,9 ± 1,7 mΩ. De meeste ARHkisspeptin neuronen waren rustig, terwijl vier van de 14 cellen spontane AP's vertoonden in rust (0,9 Hz ± 0,5 Hz; gemiddelde RMP van de spontaan actieve cellen was -52,7 mV ± 1,4 mV).

De toediening van hGH (20 μg/g) aan het bad veroorzaakte een significante hyperpolarisatie van de RMP van veel van de geregistreerde neuronen, vijf van de 12 AVPV/PeN Kisspeptine-neuronen (≈55% van de cellen van 9 muizen) en negen van de 14 geregistreerde ARH kisspeptine-neuronen (≈65% van de cellen van 12 muizen, p = 0,0006, Fisher's exacte test; Figuur 3). De AVPV/PeN Kisspeptin en ARHkisspeptin hyperpolarized neuronen veranderden de RMP significant in vergelijking met de niet-reagerende cellen (Figuur 3B,E; Mann-Whitney-test). De effecten op RMP (figuur 3C,F; herhaalde metingen ANOVA en Tukey's post-test) werden gevolgd door een significante vermindering van de whole-cell input resistance (IR) op AVPV/PeNKisspeptin (0,9 ± 0,1 GΩ tot 0,7 ± 0,1 GΩ tijdens hGH-toediening, p = 0,02; Figuur 3D), en op ARHkisspeptin (1,7 ± 0,1 GΩ tot 1,0 ± 0,1 GΩ tijdens hGH-toediening, p < 0,0001; herhaalde metingen ANOVA en Tukey's post-test; Figuur 3G) Neuronen. Bovendien daalde de frequentie van spontane AP's (fAP's) van hGH-hyperpolariseerde neuronen in beide populaties van cellen (0,1 Hz ± 0,06 Hz tot 0,0 Hz ± 0,0 Hz in AVPV / PeN Kisspeptin en 1,0 Hz ± 0,5 Hz tot 0,2 Hz ± 0,1 Hz in ARHkisspeptin neuronen). De omvang van deze daling bereikte echter geen niveau van statistische significantie (p > 0,05, Mann-Whitney-test). Na de hGH-uitspoeling werden de RMP en IR hersteld naar de uitgangswaarde (figuur 3A, C, D, F, G). De resterende kisspeptine-neuronen reageerden niet op hGH-toediening.

We hebben eerder aangetoond dat pGH geen effecten heeft op de activiteit van hypothalamische kisspeptine-neuronen (zie Silveira et al.25; Figuur 3H). Het is bekend dat hGH naast GH-receptoren ook prolactine (PRL) receptoren kan activeren37,38. Bovendien depolariseert PRL indirect slechts ≈20% van de AVPV / PeNKisspeptine-neuronen bij muizen24. PRL daarentegen moduleert de snelle synaptische transmissie van de ARHkisspeptinecellen niet 24. Daarom lijkt het hGH-geïnduceerde hyperpolarisatie-effect dat hier wordt gerapporteerd niet-specifiek te zijn. De waargenomen verschillen kunnen afhankelijk zijn van variabelen zoals medicijnconcentratie, soortverschil (mens versus muis) of zelfs de aanwezigheid van zouten in de samenstelling van de gebruikte geneesmiddelen, zoals eerder gemeld28.

Figure 1
Figuur 1: Schematisch diagram dat de bijdrage van de hele cel patch-clamp-techniek aan de kennis van de activiteit van de kisspeptine-neuronen samenvat. Kisspeptine-neuronen (weergegeven in het groen) bevinden zich in de anteroventrale periventriculaire en rostrale periventriculaire kernen (AVPV / PeN) en boogvormige kern van de hypothalamus (ARH). De AVPV / PeNKisspeptine- en ARHkisspeptine-cellen sturen directe verbindingen naar de soma van gonadotrofine-releasing hormone (GnRH) neuronen in het preoptische gebied (POA) en hun terminals bij de mediane eminentie (ME), culminerend in de modulatie van de hypothalamus-hypofyse-as (HPG). Van verschillende neuromodulatoren, zoals hormonen, is aangetoond dat ze de activiteit van de AVPV / PeNKisspeptine- en ARH-kisspeptineneuronen differentieel moduleren. Mogelijke effecten op de rustmembraanpotentiaal worden schematisch aangetoond door representatieve traceringen verkregen met behulp van de whole-cell path-clamp techniek en current-clamp recordings. De rode kleur geeft aan dat een specifieke neurotransmitter de depolarisatie van de rustmembraanpotentiaal (RMP) induceert 17,22,24,26,28,29,30,31,32; de blauwe kleur geeft geen effect aan op RMP 24,25,26,27,30. De stippellijn geeft de RMP aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Basisstappen om de afdichting van de cel van belang te verkrijgen door middel van de patch-clamp-techniek van de hele cel. (A,B) Representatieve fotomicrografieën van hersenplakken (250 μm) met kisspeptinecellen aan de anteroventrale periventriculaire kern (AVPV) en boogvormige kern van de hypothalamus (ARH). Kisspeptin neuronen werden geïdentificeerd door groene fluorescerende eiwit (GFP) expressie. (C) Fotomicrograaf die een micropipette (met elektrolytoplossing [interne oplossing]) die dicht genoeg bij de cel ligt om een kuiltje in het plasmamembraan te creëren om de afdichting uit te voeren. (D,E) Milde negatieve druk (mondafzuiging uitgevoerd op een buis die is bevestigd aan de headstage en micropipette) is vereist om het celmembraan af te sluiten op de micropipette (D). Een tweede toepassing van negatieve druk (mild en kort) is nodig om de plasmamembraanruptuur (E) te induceren. (F) De registratie van de celactiviteit wordt uitgevoerd door een mechanische opstelling die wordt gebruikt voor patch-clamp-experimenten. Na het breken van het plasmamembraan kunnen stromen die door de ionische kanalen in de gepatchte cel stromen, worden geregistreerd door een elektrode die is aangesloten op een zeer gevoelige versterker. Een feedbackweerstand genereert de stroom die nodig is voor spanningsklem (G) of stroomklem (H) opnames. Afkortingen: 3V = derde ventrikel; ME = mediane eminentie. Schaalstaven: A = 130 μm, B = 145 μm, C = 20 μm, D = 15 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Testen van geneesmiddelspecificiteit. (A) Representatieve stroomklemregistratie die aantoont dat humaan recombinant groeihormoon (hGH) een hyperpolarisatie van het rustmembraanpotentiaal (RMP) van de kisspeptine-neuronen in de boogvormige kern van de hypothalamus (ARHkisspeptin) veroorzaakte. (B-G) Staafdiagrammen die de gemiddelde verandering in de rustmembraanpotentiaal (RMP) (B,C,E,F) en gemiddelde ingangsweerstand (IR) (D,G) van hGH-responsieve kisspeptineneuronen op de anteroventrale periventriculaire en rostrale periventriculaire kernen (AVPV/PeNKisspeptin) (B-D) of ARH (E-G) aantonen ). Representatieve stroomklemregistratie die aantoont dat groeihormoon voor varkens (pGH) geen effect heeft op de RMP van ARH-kisspeptineneuronen, zoals eerder gemeld25 (H). De gebruikte significantietests zijn de Mann-Whitney-test voor (B) en (E), en herhaalde metingen ANOVA en Tukey's post-test voor (C,D,F,G). De stippellijn geeft de RMP aan. *p = 0,02; **p = 0,004,***p = 0,0003; p < 0,0001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Interne oplossing (100 ml)
Zout FW (g/mol) Concentratie Gewicht (g)
K-gluconaat 234.2 120mM 2.81
NaCl 58.4 1,0 mM 0.006
Kcl 74.5 10 mM 0.074
HEPES 238.3 10 mM 0.24
EGTA 380.3 5,0 mM 0.19
CaCl2 147.0 1,0 mM 0.015
MgCl2 203.0 1,0 mM 0.02
KOH 56.11 3,0 mM 0.017
ATP 507.18 4,0 mM 0.20
pH =7,3 / osmolariteit = 275 - 280 mOsm

Tabel 1: Reagentia voor de bereiding van de inwendige oplossing. De tabel bevat het molecuulgewicht (FW), de gewenste concentraties en het berekende gewicht van de zouten voor de bereiding van 100 ml oplossing.

aCSF/snijoplossing (250 ml)
Zout FW Concentratie Gewicht (g)
Sacharose 342.3 238mMm 18.5
KCL 74.5 2,5 mM 0.046
NaHCO3 84.0 26mM 0.546
NaH2PO4 120.0 1,0 mM 0.03
MgCl2 203.0 5 mM 0.254
D-glucose 180.2 10 mM 0.450
CaCl2 147.0 1,0 mM 0.037
pH = 7,3 / osmolariteit = 290 - 295 mOsm

Tabel 2: Reagentia voor de bereiding van de snijoplossing. De tabel bevat het molecuulgewicht (FW), de gewenste concentraties en het berekende gewicht van de zouten voor de bereiding van 250 ml oplossing. De hersenen worden ondergedompeld in deze oplossing om te worden gesneden.

aCSF voor opname (1 L)
Zout FW Concentratie Gewicht (g)
NaCl 58.4 135 mM 7.88
KCL 74.5 3,5 mM 0.261
NaHCO3 84.0 26mM 2,184
NaH2PO4 120.0 1,25 mM 0.150
Mgso4 246.5 1,2 mM 0.296
D-glucose 180.2 10 mM 1,802
CaCl2 147.0 1,0 mM 0.148
pH = 7,3 / osmolariteit = 290-300 mOsm

Tabel 3: Reagentia ter voorbereiding van aCSF voor opnames. De tabel bevat het molecuulgewicht (FW), de gewenste concentraties en het berekende gewicht van de zouten voor de bereiding van 1 l oplossing.

Aanvullende figuur 1: Voorbeeld van een in eigen beheer gemaakte herstelkamer. (A,B) Een eigen herstelkamer kan als volgt worden vervaardigd: snijd een plaat met 24 putten zodat er negen putten beschikbaar zijn. Lijm een nylon scherm aan de basis van de negen putjes. Maak met de rest van de putplaat een basis zodat het onderste deel van het nylon vrij is. (C) Deze aangepaste base kan worden geplaatst in een bekerglas van 500 ml dat kunstmatig hersenvocht (aCSF) bevat dat constant verzadigd is met carbogen (95% O2 en 5% CO2). D) Het bekerglas dat de terugwinningskamer vasthoudt, wordt tijdens de experimenten in het waterbad bewaard. (E,F) Een acryl transfer pipet wordt gebruikt om de hersenplakken over te brengen naar de herstelkamer. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De ontwikkeling van de whole-cell patch-clamp techniek had een aanzienlijke impact op de wetenschappelijke gemeenschap en werd van het grootste belang geacht voor de ontwikkeling van wetenschappelijk onderzoek en het mogelijk maken van verschillende ontdekkingen. De impact ervan op de wetenschap was voldoende om te culmineren in de Nobelprijs voor de Geneeskunde in 1991, omdat deze ontdekking de deur opende naar een beter begrip van hoe ionkanalen functioneren onder fysiologische en pathologische omstandigheden, evenals de identificatie van potentiële doelwitten voor therapeutische middelen 11,39,40,41. Op het gebied van de geneeskunde was een van de opmerkelijke bevindingen met behulp van deze techniek dat verschillende stoffen die klinisch worden gebruikt, rechtstreeks interageren met ionkanalen (bijv. Lokale anesthetica, antiaritmica, antidiabetica en spierverslappers)42. Daarom is de toepasbaarheid ervan duidelijk in klinische instituten en fundamentele onderzoeksafdelingen. Dit artikel beschrijft het protocol voor de basisvoorbereiding om patch-clamp-experimenten met hele cellen uit te voeren op hersenplakken die hypothalamische kisspeptine-neuronen bevatten. We schetsen de basisstappen en markeren opmerkelijke parameters die moeten worden gecontroleerd om weefsel te verkrijgen en oplossingen voor de patch-clamp-techniek voor te bereiden. Dit artikel kan echter niet volledig de complexiteit van deze techniek beschrijven en de mechanismen die betrokken zijn bij elk type opname, met name de analyse. Voor verder theoretisch leren worden enkele boeken en recensies over de patch-clamp-techniek aanbevolen 10,43,44,45,46.

Elke oplossing die in de patch-clamp-methode wordt gebruikt, heeft een specifiek doel; Daarom moeten de specifieke samenstellingen en criteria tijdens de voorbereiding strikt worden aangenomen. De samenstelling van de interne oplossing moet bijvoorbeeld worden bepaald op basis van het doel van het experiment, omdat deze varieert afhankelijk van het type stroom dat moet worden gemeten. De hier genoemde oplossing op basis van chloride, waarin Cl- (15 mM) de fysiologische concentratie van het celcytoplasma47 nabootst, wordt gebruikt om actieve en passieve neuronale eigenschappen of reacties op synaptische input te bestuderen. Het is belangrijk om te benadrukken dat het chloridegehalte in de interne oplossing het chloride-evenwichtspotentieel op optimale niveaus houdt voor celregistratie (in de genoemde oplossing ECL is het ongeveer -59 mV). De intracellulaire chlorideconcentratie kan worden geschat door het omkeerpotentieel voor GABA-geïnduceerde stroom (E GABA) te evalueren, ervan uitgaande dat alle stroom door deGABA A-receptor wordt gedragen door Cl-21,48. Voor de studie van hypothalamische kisspeptine-neuronen moet men overwegen dat de intracellulaire Cl-concentratie voor ARHkisspeptin hoger is dan voor AVPV / PeNKisspeptine-cellen 21. Met dit kenmerk moet rekening worden gehouden bij het plannen van een experiment. De osmolariteit van de inwendige oplossing wordt aanbevolen ten minste 5% lager te zijn dan die van aCSF voor opnames om verlies van afdichting als gevolg van mogelijke zwelling en/of celverzwakking te voorkomen33,47. Als het nodig is om een intracellulaire verbinding toe te voegen die verder kan worden gebruikt als een celmarker aan de interne oplossing, zoals biocytine of een intracellulaire kleurstof (bijv. Alexa Fluor 594), kunnen K + -niveaus worden verlaagd, zodat osmolariteit constant kan worden gehandhaafd 20,47,49,50.

Het uitvoeren van een snelle hersendissectie en het handhaven van een lage temperatuur (0-2 °C) tijdens het snijden met een geschikte snijoplossing is cruciaal. De snijoplossingen kunnen verschillen afhankelijk van het type cel en/of hersengebied dat wordt geëvalueerd33,47. De aCSF-oplossing die wordt gebruikt om de hersenplakken te verkrijgen (d.w.z. een snijoplossing) heeft meestal een andere samenstelling dan de aCSF voor opnames (ter vergelijking, zie tabel 2 en tabel 3). De kationconcentraties (Ca 2+ en Mg2+) kunnen worden aangepast om de prikkelbaarheid van neuronen te wijzigen, wat ook de vuurdrempel en neurotransmitterafgiftekan beïnvloeden 47. Lage Ca 2+ en hoge Mg2+ media worden veel gebruikt voor het minimaliseren van mogelijke excitotoxische processen (voor meer informatie, zie51). Bovendien kunnen lage Ca 2+ en hoge Mg2+ media de hypothalamische neuronactiviteitstimuleren 52. Met betrekking tot de aCSF voor opnames zijn sommige kenmerken vergelijkbaar. Het buffersysteem is gebaseerd op NaHCO3, hoge NaCl-concentraties (over het algemeen >100 mM) en lage KCl-concentraties (over het algemeen <5 mM), relatieve concentraties van Ca 2+ en Mg2+ (2:1 wordt vaak gebruikt) liggen meestal rond de 2 mM en glucosespiegels kunnen variëren van 1 tot 10 mM47. Naast variaties van de osmolariteit, pH of temperatuurveranderingen van de oplossingen (digitaal geregeld tussen 30-32 °C), is het belangrijk om te benadrukken dat er tijdens het experimentele protocol andere problemen kunnen optreden die de experimenten aanzienlijk verstoren. Elektrofysiologische metingen moeten stabiel zijn tijdens de opnames en eventuele variaties moeten een kritische meting hebben. SR-veranderingen houden bijvoorbeeld rekening met cellulaire toegang in de hele celmodus en hebben aanzienlijke gevolgen voor gemeten stromen en potentialen. Verder is het belangrijk om te benadrukken dat een relevante beperking met betrekking tot de patch-clamp-methodologie die moet worden overwogen, mechanische overstimulatie van de cel is door overmatige zuig- / drukprotocollen die morfologische en functionele veranderingen kunnen veroorzaken53. Deze bias is vaak moeilijk te beheersen in protocollen waarbij de zuigkracht via de mond wordt uitgevoerd in plaats van een apparaat dat de toegepaste zuigintensiteit nauwkeurig kan regelen. Bovendien kunnen weefselgerelateerde problemen, die culmineren in een hoog percentage celsterfte, optreden als gevolg van onvoldoende dissectie, hypoxie of de gezondheidstoestand van de muis die een onderzoeker niet kan identificeren door observatie.

Het belangrijkste voordeel van de whole-cell patch-clamp techniek is de mogelijkheid om neuronen in specifieke hersengebieden van belang nauwkeurig vast te leggen. Deze techniek heeft enorm geprofiteerd van het creëren van genetisch gemodificeerde dieren. Onze groep werkt meestal met een muismodel dat de hrGFP uitdrukt onder de Kiss1-genpromotor of een ander model dat Cre-recombinase uitdrukt onder de Kiss1-genpromotor en GFP onder de Cre-voorwaardelijke expressie. Er zijn echter veel gevalideerde diermodellen tegenwoordig23,26,36. Bovendien vertegenwoordigt de afwezigheid van de bloed-hersenbarrière en het feit dat de extracellulaire en intracellulaire omgeving gemakkelijk kan worden gecontroleerd en gemanipuleerd voordelen van deze methode; ze vertegenwoordigen echter niet noodzakelijkerwijs een fysiologische toestand. Onder de beperkingen van deze techniek in vergelijking met in vivo preparaten, of andere opnametypen die gericht zijn op het behoud van de cytoplasmatische ionische concentratie, zoals on-cell of geperforeerde patchopnamen, is het belangrijk om te vermelden dat de invasiviteit van de hele celconfiguratie dialyse van het cytoplasmagehalte veroorzaakt54. Dialyse kan de onderbreking van moleculaire aspecten veroorzaken die nodig zijn om sommige verschijnselen te ontwikkelen of tot expressie te brengen. Door te registreren van plakjes, moet eraan worden herinnerd dat de meeste projecties van de neuronen gesegmenteerd zijn. Het valt dus buiten het bereik van de techniek om te evalueren hoeveel deze verstoring de waargenomen effecten of een fysiologische toestand beïnvloedt. Zoals vermeld, worden coronale hersenplakken van 200-300 μm meestal uitgevoerd om de activiteit van hypothalamische kisspeptine-neuronen 17,19,20,21,34 te bestuderen. De beperking van het gebruik van een dikkere hersenschijfsectie om kisspeptinecellen en verschillende plakhoeken te bestuderen met behoud van specifieke AVPV / PeN- of ARH-connectiviteit55 moet verder worden onderzocht. Bovendien, door het testen van het effect van een hormoon / medicijn, synthetisch of niet, op de RMP van een neuron, zijn verschillende studies gebaseerd op het medicijn EC50 (als het bekend is) of op gepubliceerde gegevens die aantonen dat een specifieke concentratie effectief is in het activeren van de vuursnelheid of het veranderen van [Ca2 +] i-niveaus. Men moet zich echter bewust zijn van de samenstelling / specificiteit van het geneesmiddel dat in de experimenten moet worden gebruikt, omdat het mogelijk is dat gezuiverde synthetische drugs, in vergelijking met andere vergelijkbare geneesmiddelen, antagonistische effecten kunnen hebben28. Zoals eerder aangetoond25, terwijl gezuiverde pGH geen effect heeft op de activiteit van hypothalamische kisspeptine-neuronen, produceerde de hGH controversiële gegevens (zie figuur 3). Vergelijkbare resultaten werden aangetoond toen insuline-effecten op de ARH werden beoordeeld28. Daarom moet rekening worden gehouden met geneesmiddelspecificiteit bij het plannen van een experiment en het interpreteren van de verkregen resultaten.

De patch-clamp techniek is een uitstekend hulpmiddel voor het verkrijgen van gegevens over neuron elektrische activiteit en heeft aanzienlijk bijgedragen aan de kennis van verschillende neuronale populaties, zoals de kisspeptin neuronen. De meeste details die hier worden verstrekt, worden over het algemeen gebruikt voor opnames van hypothalamische neuronen, zoals we eerder hebben gemeld 25,50,56,57,58,59,60. Belangrijk is dat voor het registreren van andere neuronale populaties naast kisspeptine-neuronen, men de elektrofysiologische metingen moet kennen of bepalen die kunnen helpen bij het identificeren van celtypen, zoals celcapaciteit, SR, ingangsweerstand, celvuurpatroon en andere parameters. Deze eigenschappen variëren tussen verschillende hersencellen, hersenkernen en fysiologische of geïnduceerde aandoeningen, zoals circulerende geslachtssteroïde niveaus 16,19,20,21,61, die de kritische analyse van de resultaten aanzienlijk kunnen verstoren. Bovendien is het noodzakelijk om de mogelijke variabelen te begrijpen die betrokken zijn bij weefselvoorbereiding en de bijbehorende voordelen en beperkingen om met deze techniek te werken. Alle hier beschreven stappen moeten oordeelkundig worden uitgevoerd, omdat elke wijziging in de variabelen die betrokken zijn bij het protocol de resultaten drastisch kan verstoren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Er mogen geen belangenconflicten worden aangegeven.

Acknowledgments

Deze studie werd ondersteund door de São Paulo Research Foundation [FAPESP-subsidienummers: 2021/11551-4 (JNS), 2015/20198-5 (TTZ), 2019/21707/1 (RF); en door de Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) - Finance Code 001" (HRV).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Compounds for aCSF, internal and slicing solutions
ATP Sigma Aldrich/various A9187
CaCl2 Sigma Aldrich/various C7902
D-(+)-Glucose Sigma Aldrich/various G7021
EGTA Sigma Aldrich/various O3777
HEPES Sigma Aldrich/various H3375
KCL Sigma Aldrich/various P5405
K-gluconate Sigma Aldrich/various G4500
KOH Sigma Aldrich/various P5958
MgCl2 Sigma Aldrich/various M9272
MgSO4 Sigma Aldrich/various 230391
NaCl Sigma Aldrich/various S5886
NaH2PO4  Sigma Aldrich/various S5011
NaHCO3 Sigma Aldrich/various S5761
nitric acid Sigma Aldrich/various 225711 CAUTION
Sucrose Sigma Aldrich/various S1888
Equipments
Air table TMC 63-534
Amplifier Molecular Devices Multiclamp 700B
Computer various -
DIGIDATA 1440 LOW-NOISE DATA ACQUISITION SYSTEM Molecular Devices DD1440
Digital peristaltic pump Ismatec ISM833C 
Faraday cage TMC 81-333-03
Imaging Camera Leica DFC 365 FX
Micromanipulator Sutter Instruments Roe-200
Micropipette Puller Narishige PC-10
Microscope Leica DM6000 FS
Osteotome Bonther equipamentos & Tecnologia/various 128
Recovery chamber Warner Instruments/Harvard apparatus - can be made in-house
Recording chamber Warner Instruments 640277
Spatula Fisher Scientific /various FISH-14-375-10; FISH-21-401-20
Vibratome  Leica VT1000 S
Water Bath  Fisher Scientific /various Isotemp
Software and systems
AxoScope 10 software Molecular Devices - Commander Software
LAS X wide field system Leica - Image acquisition and analysis
MultiClamp 700B Molecular Devices MULTICLAMP 700B Commander Software
PCLAMP 10 SOFTWARE FOR WINDOWS Molecular Devices Pclamp 10 Standard
Tools
Ag/AgCl electrode, pellet, 1.0 mm Warner Instruments 64-1309
Curved hemostatic forcep various -
cyanoacrylate glue LOCTITE/various -
Decapitation scissors various -
Filter paper various -
Glass capillaries (micropipette) World Precision Instruments, Inc TW150F-4
Iris scissors Bonther equipamentos & Tecnologia/various 65-66
Pasteur glass pipette  Sigma Aldrich/various CLS7095B9-1000EA
Petri dish various -
Polyethylene tubing  Warner Instruments 64-0756
Razor blade for brain dissection TED PELLA TEDP-121-1
Razor blade for the vibratome TED PELLA TEDP-121-9
Scissors Bonther equipamentos & Tecnologia/various 71-72, 48,49; 
silicone teat various -
Slice Anchor  Warner Instruments 64-0246
Syringe filters Merck Millipore Ltda SLGVR13SL Millex-GV 0.22 μm
Tweezers Bonther equipamentos & Tecnologia/various 131, 1518

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bezanilla, F. Single sodium channels from the squid giant axon. Biophysical Journal. 52 (6), 1087-1090 (1987).
  2. Clay, J. R. Potassium current in the squid giant axon. International Review of Neurobiology. 27, 363-384 (1985).
  3. Gandini, M. A., Sandoval, A., Felix, R. Patch-clamp recording of voltage-sensitive Ca2+ channels. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (4), 329-325 (2014).
  4. Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve. The Journal of Physiology. 117 (4), 500-544 (1952).
  5. Perkins, K. L. Cell-attached voltage-clamp and current-clamp recording and stimulation techniques in brain slices. Journal of Neuroscience Methods. 154 (1-2), 1-18 (2006).
  6. Suk, H. J., Boyden, E. S., van Welie, I. Advances in the automation of whole-cell patch clamp technology. Journal of Neuroscience Methods. 326, 108357 (2019).
  7. Cole, K. S., Curtis, H. J. Electric impedance of the squid giant axon during activity. The Journal of General Physiology. 22 (5), 649-670 (1939).
  8. Bernstein, J. Ueber den zeitlichen Verlauf der negativen Schwankung des Nervenstroms. Pflüger, Archiv für die Gesammte Physiologie des Menschen und der Thiere. 1 (1), 173-207 (1868).
  9. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Archiv. 391 (2), 85-100 (1981).
  10. Hill, C. L., Stephens, G. J. An introduction to patch clamp recording. Methods in Molecular Biology. 2188, 1-19 (2021).
  11. Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).
  12. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review of Physiology. 46, 455-472 (1984).
  13. Gottsch, M. L., et al. A role for kisspeptins in the regulation of gonadotropin secretion in the mouse. Endocrinology. 145 (9), 4073-4077 (2004).
  14. Smith, J. T., Cunningham, M. J., Rissman, E. F., Clifton, D. K., Steiner, R. A. Regulation of Kiss1 gene expression in the brain of the female mouse. Endocrinology. 146 (9), 3686-3692 (2005).
  15. Smith, J. T., et al. Differential regulation of KiSS-1 mRNA expression by sex steroids in the brain of the male mouse. Endocrinology. 146 (7), 2976-2984 (2005).
  16. Ducret, E., Gaidamaka, G., Herbison, A. E. Electrical and morphological characteristics of anteroventral periventricular nucleus kisspeptin and other neurons in the female mouse. Endocrinology. 151 (5), 2223-2232 (2010).
  17. Qiu, J., Fang, Y., Bosch, M. A., Rønnekleiv, O. K., Kelly, M. J. Guinea pig kisspeptin neurons are depolarized by leptin via activation of TRPC channels. Endocrinology. 152 (4), 1503-1514 (2011).
  18. Gottsch, M. L., et al. Molecular properties of Kiss1 neurons in the arcuate nucleus of the mouse. Endocrinology. 152 (11), 4298-4309 (2011).
  19. de Croft, S., et al. Spontaneous kisspeptin neuron firing in the adult mouse reveals marked sex and brain region differences but no support for a direct role in negative feedback. Endocrinology. 153 (11), 5384-5393 (2012).
  20. Frazão, R., et al. Shift in Kiss1 cell activity requires estrogen receptor alpha. The Journal of Neuroscience. 33 (7), 2807-2820 (2013).
  21. DeFazio, R. A., Elias, C. F., Moenter, S. M. GABAergic transmission to kisspeptin neurons is differentially regulated by time of day and estradiol in female mice. The Journal of Neuroscience. 34 (49), 16296-16308 (2014).
  22. Mansano, N. D. S., et al. Vasoactive intestinal peptide exerts an excitatory effect on hypothalamic kisspeptin neurons during estrogen negative feedback. Molecular and Cellular Endocrinology. 542, 111532 (2022).
  23. Jamieson, B. B., Piet, R. Kisspeptin neuron electrophysiology: Intrinsic properties, hormonal modulation, and regulation of homeostatic circuits. Frontiers in Neuroendocrinology. 66, 101006 (2022).
  24. Silveira, M. A., et al. STAT5 signaling in kisspeptin cells regulates the timing of puberty. Molecular and Cellular Endocrinology. 448, 55-65 (2017).
  25. Silveira, M. A., et al. Acute effects of somatomammotropin hormones on neuronal components of the hypothalamic-pituitary-gonadal axis. Brain Research. 1714, 210-217 (2019).
  26. Cravo, R. M., et al. Leptin signaling in Kiss1 neurons arises after pubertal development. PLoS One. 8 (3), e58698 (2013).
  27. Manfredi-Lozano, M., et al. Defining a novel leptin-melanocortin-kisspeptin pathway involved in the metabolic control of puberty. Molecular Metabolism. 5 (10), 844-857 (2016).
  28. Qiu, J., et al. Insulin excites anorexigenic proopiomelanocortin neurons via activation of canonical transient receptor potential channels. Cell Metabolism. 19 (4), 682-693 (2014).
  29. de Croft, S., Boehm, U., Herbison, A. E. Neurokinin B activates arcuate kisspeptin neurons through multiple tachykinin receptors in the male mouse. Endocrinology. 154 (8), 2750-2760 (2013).
  30. Frazao, R., et al. Estradiol modulates Kiss1 neuronal response to ghrelin. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 306 (6), E606-E614 (2014).
  31. True, C., Verma, S., Grove, K. L., Smith, M. S. Cocaine- and amphetamine-regulated transcript is a potent stimulator of GnRH and kisspeptin cells and may contribute to negative energy balance-induced reproductive inhibition in females. Endocrinology. 154 (8), 2821-2832 (2013).
  32. Navarro, V. M., et al. Regulation of NKB pathways and their roles in the control of Kiss1 neurons in the arcuate nucleus of the male mouse. Endocrinology. 152 (11), 4265-4275 (2011).
  33. Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell patch-clamp recordings in brain slices. Journal of Visualized Experiments. (112), e54024 (2016).
  34. Gibson, A. G., Jaime, J., Burger, L. L., Moenter, S. M. Prenatal androgen treatment does not alter the firing activity of hypothalamic arcuate kisspeptin neurons in female mice. eNeuro. 8 (5), (2021).
  35. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain. Stereotaxic Coordinates. 2nd edition. , Academic Press. (2001).
  36. Cravo, R. M., et al. Characterization of Kiss1 neurons using transgenic mouse models. Neuroscience. 173, 37-56 (2011).
  37. Emane, M. N., Delouis, C., Kelly, P. A., Djiane, J. Evolution of prolactin and placental lactogen receptors in ewes during pregnancy and lactation. Endocrinology. 118 (2), 695-700 (1986).
  38. Fuh, G., Colosi, P., Wood, W. I., Wells, J. A. Mechanism-based design of prolactin receptor antagonists. The Journal of Biological Chemistry. 268 (8), 5376-5381 (1993).
  39. Barinaga, M. Ion channel research wins physiology Nobel. Science. 254 (5030), 380 (1991).
  40. Colquhoun, D. Neher and Sakmann win Nobel Prize for patch-clamp work. Trends in Pharmacological Sciences. 12 (12), 449 (1991).
  41. Greger, R. Nobel Prize for Medicine and Physiology 1991. Analysis of the function of single ion channel. Deutsche Medizinische Wochenschrift. 116 (48), 1849-1851 (1991).
  42. Brau, M. E., Vogel, W., Hempelmann, G. Possible applications of the "patch-clamp" method in anesthesiologic research; comment. Anasthesiologie, Intensivmedizin, Notfallmedizin, Schmerztherapie. 31 (9), 537-542 (1996).
  43. Cahalan, M., Neher, E. Patch clamp techniques: an overview. Methods in Enzymology. 207, 3-14 (1992).
  44. Kornreich, B. G. The patch clamp technique: principles and technical considerations. Journal of Veterinary Cardiology. 9 (1), 25-37 (2007).
  45. Neher, E., Sakmann, B. The patch clamp technique. Scientific American. 266 (3), 44-51 (1992).
  46. Sachs, F., Auerbach, A. Single-channel electrophysiology: use of the patch clamp. Methods in Enzymology. 103, 147-176 (1983).
  47. Dallas, M., Bell, D. Patch Clamp Electrophysiology: Methods and Protocols. 1st edition. , (2021).
  48. Robinson, R. A., Stokes, R. H. Electrolyte Solutions. 2nd edition. , Butterworths Scientific. (1959).
  49. de Souza, G. O., et al. Gap junctions regulate the activity of AgRP neurons and diet-induced obesity in male mice. The Journal of Endocrinology. 255 (2), 75-90 (2022).
  50. Houades, V., Koulakoff, A., Ezan, P., Seif, I., Giaume, C. Gap junction-mediated astrocytic networks in the mouse barrel cortex. The Journal of Neuroscience. 28 (20), 5207-5217 (2008).
  51. Richerson, G. B., Messer, C. Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing. Experimental Neurology. 131 (1), 133-143 (1995).
  52. Pan, J. T., Li, C. S., Tang, K. C., Lin, J. Y. Low calcium/high magnesium medium increases activities of hypothalamic arcuate and suprachiasmatic neurons in brain tissue slices. Neuroscience Letters. 144 (1-2), 157-160 (1992).
  53. Hamill, O. P., McBride, D. W. Induced membrane hypo/hyper-mechanosensitivity: a limitation of patch-clamp recording. Annual Review of Physiology. 59, 621-631 (1997).
  54. Herbison, A. E., Moenter, S. M. Depolarising and hyperpolarising actions of GABA(A) receptor activation on gonadotrophin-releasing hormone neurones: towards an emerging consensus. Journal of Neuroendocrinology. 23 (7), 557-569 (2011).
  55. Qiu, J., et al. High-frequency stimulation-induced peptide release synchronizes arcuate kisspeptin neurons and excites GnRH neurons. eLife. 5, e16246 (2016).
  56. Chaves, F. M., Mansano, N. S., Frazão, R., Donato, J. Tumor necrosis factor α and interleukin-1β acutely inhibit AgRP neurons in the arcuate nucleus of the hypothalamus. International Journal of Molecular Sciences. 21 (23), 8928 (2020).
  57. Chaves, F. M., et al. Effects of the isolated and combined ablation of growth hormone and IGF-1 receptors in somatostatin neurons. Endocrinology. 163 (5), 045 (2022).
  58. Wasinski, F., et al. Growth hormone receptor in dopaminergic neurones regulates stress-induced prolactin release in male mice. Journal of Neuroendocrinology. 33 (3), e12957 (2021).
  59. Furigo, I. C., Ramos-Lobo, A. M., Frazao, R., Donato, J. Brain STAT5 signaling and behavioral control. Molecular and Cellular Endocrinology. 438, 70-76 (2016).
  60. Zampieri, T. T., et al. Postnatal overnutrition induces changes in synaptic transmission to leptin receptor-expressing neurons in the arcuate nucleus of female mice. Nutrients. 12 (8), 2425 (2020).
  61. Furigo, I. C., et al. Growth hormone regulates neuroendocrine responses to weight loss via AgRP neurons. Nature Communication. 10 (1), 662 (2019).

Tags

Deze maand in JoVE Nummer 193 brain slice current-clamp recordings Kiss1 hypothalamus
Hypothalamische kisspeptine-neuronen als doelwit voor patchklem-opnames met hele cellen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Silva, J. d. N., Zampieri, T. T.,… More

Silva, J. d. N., Zampieri, T. T., Vieira, H. R., Frazao, R. Hypothalamic Kisspeptin Neurons as a Target for Whole-Cell Patch-Clamp Recordings. J. Vis. Exp. (193), e64989, doi:10.3791/64989 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter