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Neuroscience

Neuronas de kisspeptina hipotalámicas como objetivo para grabaciones de pinza de parche de células enteras

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/64989
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Anatomy, Instituto de Ciencias Biomedicas, Universidade de Sao Paulo

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para realizar un parche de pinza de células enteras en cortes cerebrales que contienen neuronas kisspeptina, el modulador principal de las células de la hormona liberadora de gonadotrofina (GnRH). Al agregar conocimiento sobre la actividad neuronal kisspeptina, esta herramienta electrofisiológica ha servido como base para avances significativos en el campo de la neuroendocrinología en los últimos 20 años.

Abstract

Las kisspeptinas son esenciales para la maduración del eje hipotalámico-pituitario-gonadal (HPG) y la fertilidad. Las neuronas kisspeptina hipotalámicas ubicadas en el núcleo periventricular anteroventral y el núcleo periventricular rostral, así como el núcleo arqueado del hipotálamo, se proyectan a las neuronas de la hormona liberadora de gonadotrofina (GnRH), entre otras células. Estudios previos han demostrado que la señalización de kisspeptina se produce a través del receptor Kiss1 (Kiss1r), lo que en última instancia excita la actividad neuronal GnRH. En humanos y modelos animales experimentales, las kisspeptinas son suficientes para inducir la secreción de GnRH y, en consecuencia, la liberación de la hormona luteinizante (LH) y la hormona estimulante del folículo (FSH). Dado que las kisspeptinas desempeñan un papel esencial en las funciones reproductivas, los investigadores están trabajando para evaluar cómo la actividad intrínseca de las neuronas hipotalámicas de kisspeptina contribuye a las acciones relacionadas con la reproducción e identificar los neurotransmisores / neuromoduladores primarios capaces de cambiar estas propiedades. La técnica de pinza de parche de células enteras se ha convertido en una herramienta valiosa para investigar la actividad de la neurona kisspeptina en células de roedores. Esta técnica experimental permite a los investigadores registrar y medir las corrientes iónicas excitatorias e inhibitorias espontáneas, el potencial de membrana en reposo, el disparo del potencial de acción y otras propiedades electrofisiológicas de las membranas celulares. En el presente estudio, se revisan aspectos cruciales de la técnica de pinza de parche de células enteras, conocidas como mediciones electrofisiológicas que definen las neuronas kisspeptina hipotalámicas, y una discusión de temas relevantes sobre la técnica.

Introduction

Hodgkin y Huxley hicieron el primer registro intracelular de un potencial de acción descrito en varios estudios científicos. Este registro se realizó en el axón del calamar, que tiene un gran diámetro (~ 500 μm), lo que permite colocar un microelectrodo dentro del axón. Este trabajo proporcionó grandes posibilidades para la investigación científica, culminando más tarde en la creación del modo de pinza de voltaje, que se utilizó para estudiar la base iónica de la generación de potencial de acción 1,2,3,4,5,6,7,8. A lo largo de los años, la técnica ha sido mejorada y se ha aplicado ampliamente en la investigación científica 6,9. La invención de la técnica patch-clamp, que tuvo lugar a finales de la década de 1970 a través de estudios iniciados por Erwin Neher y Bert Sakmann, permitió a los investigadores registrar canales iónicos individuales y potenciales o corrientes de membrana intracelular en prácticamente todos los tipos de células utilizando un solo electrodo 9,10,11,12 . Las grabaciones de patch-clamp pueden realizarse en una variedad de preparaciones tisulares, como células cultivadas o cortes de tejido, ya sea en modo de pinza de voltaje (sosteniendo la membrana celular a una tensión establecida que permita el registro de, por ejemplo, corrientes dependientes de voltaje y corrientes sinápticas) o en modo de abrazadera de corriente (que permite registrar, por ejemplo, cambios en el potencial de membrana en reposo inducidos por corrientes de iones, potenciales de acción, y frecuencia de potencial postsináptico).

El uso de la técnica patch-clamp hizo posible varios descubrimientos notables. De hecho, los hallazgos seminales sobre las propiedades electrofisiológicas de las neuronas kisspeptina hipotalámicas localizadas en los núcleos periventricular anteroventral y periventricular rostral (AVPV/PeNKisspeptin), también conocida como área periventricular rostral del tercer ventrículo (RP3V), y el núcleo arqueado del hipotálamo (ARHkisspeptina)13,14,15 son de particular interés. En 2010, Ducret et al. realizaron las primeras grabaciones de neuronas AVPV / PeNKisspeptinen ratones utilizando otra herramienta electrofisiológica, la técnica de pinza de parche de células sueltas. Estos estudios proporcionaron una descripción eléctrica de las neuronas AVPV/PeNKisspeptina y demostraron que sus patrones de disparo dependen del ciclo estral16. En 2011, Qiu et al. utilizaron la técnica de patch-clamp de células enteras para demostrar que las neuronas ARHkisspeptina expresan corrientes endógenas de marcapasos17. Posteriormente, Gottsch et al. demostraron que las neuronas kisspeptina exhiben actividad espontánea y expresan corrientes de calcio tipo h (marcapasos) y tipo T, sugiriendo que las neuronas dekisspeptina ARH comparten propiedades electrofisiológicas con otras neuronas marcapasos del sistema nervioso central18. Además, se ha demostrado que las neuronas dekisspeptina ARH exhiben tasas de disparo sexualmente dimórficas y que las neuronas AVPV/PeNKisspeptina exhiben un potencial de membrana en reposo bimodal (RMP) influenciado por canales de potasio sensibles al ATP (K ATP)19,20. Además, se estableció que los esteroides gonadales afectan positivamente la actividad eléctrica espontánea de las neuronas kisspeptina en ratones 19,20,21. Los primeros trabajos que estudian las propiedades electrofisiológicas de las neuronas kisspeptina se mencionan 16,17,18,19,20. Desde entonces, muchos estudios han utilizado la técnica de patch-clamp de células enteras para demostrar qué factores/neuromoduladores son suficientes para modular la actividad eléctrica de las neuronas kisspeptina (Figura 1)17,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32.

Dada la importancia de esta técnica para el estudio de las neuronas que se requieren para la reproducción, entre otros tipos de células no cubiertas aquí, este artículo describe los pasos básicos para el desarrollo de la técnica de pinza de parche de células completas, como preparar las soluciones, diseccionar y cortar el cerebro y realizar el sello de la membrana celular para las grabaciones. Además, se discuten cuestiones relevantes sobre la técnica, como sus ventajas, limitaciones técnicas y variables importantes que deben controlarse para un rendimiento experimental óptimo.

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Protocol

Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal del Instituto de Ciencias Biomédicas de la Universidad de São Paulo y fueron realizados de acuerdo con las directrices éticas adoptadas por el Colegio Brasileño de Experimentación Animal.

1. Preparación de soluciones

  1. Preparación de solución interna
    NOTA: La solución interna llena la micropipeta de la abrazadera de parche y entrará en contacto con el interior de la célula (ver un ejemplo en la Figura 2). Las soluciones internas pueden variar dependiendo del tipo de actividad a medir33.
    1. Elija la solución interna teniendo en cuenta su propósito experimental y el tipo de registro apropiado. Para registrar el potencial de membrana en el modo de pinza de corriente, utilice la solución interna compuesta de 120 mM de K-gluconato, 1 mM de NaCl, 5 mM de EGTA, 10 mM de HEPES, 1 mM de MgCl 2, 1 mM de CaCl2, 3 mM de KOH, 10 mM de KCl y 4 mM (Mg)-ATP. Pesar todas las sales de acuerdo con el volumen final deseado, como se indica en la Tabla 1.
    2. Use suficiente agua desionizada para alcanzar el 90% del volumen final de la solución. Este volumen asegurará suficiente espacio para ajustar el pH y la osmolaridad.
    3. Después de agregar y mezclar bien todos los ingredientes, ajuste el pH a 7.2-7.3 con 5 M KOH usando un medidor de pH. Use un osmómetro para verificar la osmolaridad, que debe ser de alrededor de 275-280 mOsm (ajuste, si es necesario, solo hacia abajo).
    4. Preparar la solución interna con antelación y conservar a 8 °C. Agregue el ATP el día del experimento. Conservar la solución interna que contiene ATP a -20 °C (1 ml de alícuotas) durante 3-4 meses.
  2. Preparación de la solución de corte
    1. Prepare una solución de corte que contenga 238 mM de sacarosa, 2,5 mM de KCl, 26 mM de NaHCO3, 1,0 mM de NaH 2 PO4, 10 mM de glucosa, 1,0 mM de CaCl 2 y 5,0 mM de MgCl2. Pesar todas las sales de acuerdo con el volumen final deseado, como se muestra en la Tabla 2. El volumen exacto de esta solución a preparar dependerá del tamaño de la cámara de corte.
    2. Mientras se mezclan todas las sales en agua desionizada, saturar constantemente con carbógeno (95% O2 y 5%CO2). Conecte un tubo de polietileno (diámetro exterior [OD] de 1,57 mm x diámetro interior [ID] de 1,14 mm) a un cilindro de carbogen para suministrar carbogen a la solución de corte. Sostenga el extremo abierto del tubo dentro del vaso de precipitados que contiene la solución de corte.
    3. Después de mezclar bien todos los ingredientes, ajuste el pH a 7.3 con ácido nítrico al 10% usando un medidor de pH. Use un osmómetro para verificar la osmolaridad, que debe ser de 290-295 mOsm (ajuste, si es necesario, solo hacia abajo). Después, enfriar la solución a 0-2 °C.
  3. Preparar la solución aCSF para grabaciones
    1. Preparar una solución artificial de líquido cefalorraquídeo (LCR) para grabaciones que contengan 124 mM de NaCl, 2,8 mM de KCl, 26 mM de NaHCO3, 1,25 mM deNaH2PO4, 1,2 mM de MgSO4, 5 mM de glucosa y 2,5 mM de CaCl2. Pesar todas las sales de acuerdo con el volumen final deseado, dado en la Tabla 3.
    2. Mientras se mezclan todas las sales en agua desionizada, saturar constantemente con carbógeno (95% O2 y 5%CO2), como se describe en el paso 1.2.2.
    3. Después de agregar y mezclar todos los ingredientes, ajuste el pH a 7.3 (se puede usar ácido nítrico al 10%) usando un medidor de pH. Use un osmómetro para verificar la osmolaridad, que debe ser de 290-300 mOsm. Después, vierta el aCSF en un vaso de precipitados y mantenga en un baño de agua a 30 ° C.

2. Disección cerebral y corte

NOTA: Dado que diferentes estructuras cerebrales pueden requerir cortes en diferentes planos (cortes coronales, sagitales u horizontales), el enfoque exacto para obtener los cortes depende de la región del cerebro de interés. Típicamente, para estudiar las células que expresan Kiss1 en las neuronas AVPV / PeN y ARH (aquí denominadas neuronasKisspeptina AVPV / PeN y neuronaskisspeptina ARH; Figura 2A,B), los cortes cerebrales coronales (200-300 μm) se hacen generalmente 17,19,20,21,34. Las neuronas AVPV/PeNKisspeptina se encuentran aproximadamente a 0,5 a -0,22 mm del bregma, mientras que las neuronas ARHkisspeptina están en -1,22 a -2,70 mm. La ubicación de los núcleos se puede determinar mediante el uso de un atlas cerebral de ratón estereotáxico35 o el Atlas de referencia del cerebro del ratón Allen (http://mouse.brain-map.org/). En este estudio se utilizaron ratones adultos Kiss1-Cre/GFP hembra (etapa diestral) y machos36.

  1. Extirpación del cerebro
    1. Prepare el sitio de disección y las herramientas necesarias para extraer el cerebro: tijeras de decapitación, tijeras de iris, tijeras curvas Castroviejo, osteotomo, pinzas, espátula, papel de filtro, placa de Petri, cuchilla de afeitar y pegamento de cianoacrilato.
    2. Antes de hacer las rodajas, prepare el banco en el que se realizará la disección, ya que todos los procedimientos posteriores deben realizarse rápidamente. Asegúrese de tener acceso a un dispositivo de corte como un vibratome.
    3. Prepare una cámara de grabación para mantener las rebanadas de cerebro antes de cortar el tejido. Adquiera una cámara de grabación, dimensiones de baño de 24 mm x 15 mm x 2 mm (L x W x H), de una marca comercial (Tabla de materiales) o haga una internamente.
      NOTA: Una cámara de recuperación interna se puede fabricar de la siguiente manera: corte una placa de 24 pocillos para que haya nueve pozos disponibles. Pegue una pantalla de nylon a la base de los nueve pocillos. Con el resto de la placa del pozo, haz una base para que la parte inferior del nylon quede libre. Esta base adaptada se puede colocar dentro de un vaso de precipitados de 500 ml que contiene el aCSF (Figura complementaria 1).
    4. Después de preparar todo, anestesiar al animal con anestésico inhalado usando 4% -5% de isoflurano. La anestesia debe estar de acuerdo con un protocolo aprobado por el comité de ética. Poco después de que el animal esté inmóvil, realice pruebas de pellizco de cola y pata para asegurarse de que el animal esté profundamente anestesiado.
    5. Decapitar rápidamente a los ratones mientras el corazón todavía está activo para aumentar la viabilidad celular. Cosecha el cerebro rápidamente después de la decapitación.
    6. Con tijeras quirúrgicas, haga una incisión en la piel en la parte superior del cráneo del animal, desde caudal hasta rostral, y retire el cuero cabelludo de la cabeza del animal. A continuación, corte la placa interparietal a lo largo de la sutura sagital con las tijeras del iris y retire el hueso occipital. Deslice el osteotomo debajo del hueso parietal y sáquelo suavemente hasta que el cerebro esté expuesto.
    7. Después de exponer el cerebro, gire la cabeza boca abajo, baje suavemente el cerebro para visualizar el nervio trigémino a cada lado, luego corte el nervio trigémino con tijeras curvas Castroviejo. Después de visualizar el hipotálamo, identifique el nervio óptico y córtelo suavemente.
      NOTA: Tenga cuidado al cortar el nervio óptico, ya que tirar de él desgarrará el área hipotalámica adyacente que contiene el núcleo AVPV / PeN.
    8. Cortar la porción más anterior del lóbulo frontal y extirpar el cerebro por completo. Inmediatamente sumerja el cerebro en la solución de corte hasta adquirir las rodajas.
  2. Cortar muestras de cerebro
    1. Coloque el cerebro en papel de filtro (apoyado en una placa de Petri) para secar el exceso de solución. Luego, con una cuchilla de afeitar de corte afilado, realice un corte coronal que separa el tronco encefálico con el cerebelo del resto del tejido.
    2. A continuación, pegue la porción caudal del cerebro a la base del vibratomo y llene la cámara del dispositivo de corte con la solución de corte / aCSF enfriada a 0-2 ° C. Durante el procedimiento, empaque hielo seco alrededor de la cámara de vibratomo para mantener fría la solución de corte.
    3. Inserte la cuchilla de afeitar en el vibratomo y ajuste los parámetros de corte apropiados del dispositivo: velocidad = 3, frecuencia = 9 y alimentación = 250 μm. Utilice una pipeta de transferencia de acrílico (pipeta de vidrio Pasteur invertida unida a una tetina de silicona) para transferir las rodajas a la cámara de recuperación (descrita en el paso 2.1.3) durante el procedimiento de corte de tejido. Espere 60 minutos para la recuperación del tejido después de la adquisición del corte.

3. Sellado de celdas para grabación

  1. Asegúrese de que todos los equipos (microscopio, amplificador, digitalizador, micromanipulador y otros) estén encendidos antes de comenzar la grabación.
  2. Llene la cámara de grabación, de una marca comercial (Tabla de materiales), unida al microscopio con la solución aCSF para grabaciones. Use una bomba de perfusión para perfundir constantemente el aCSF a una velocidad de 2 ml / min.
  3. Transfiera una porción cerebral de interés (una a la vez) a la cámara de grabación. Utilice una pipeta de transferencia de acrílico (pipeta de vidrio Pasteur invertida unida a una tetina de silicona) para transferir las rodajas hipotalámicas a la cámara. Use un anclaje de corte (Tabla de materiales) para sostener el corte de modo que no se mueva durante la perfusión de aCSF.
  4. Coloque una rebanada en el centro de la cámara de grabación conectada al microscopio. La posición del corte es crítica para permitir una buena visión de la región deseada bajo el microscopio y para un alcance perfecto de la micropipeta de registro.
  5. Utilice la lente de objetivo de baja potencia de un microscopio de inmersión (10x o 20x) para ayudar a posicionar la rebanada y localizar la región de interés.
  6. Después de localizar la región de interés, cambie la lente del objetivo a la lente de alta potencia (63x) y enfoque en el nivel del tejido, observando la proteína fluorescente endógena y las formas de las células en la región objetivo para localizar las células de kisspeptina en la superficie del corte cerebral20.
  7. Cuando se encuentre una posible celda de destino, márquela en la pantalla del ordenador con el cursor del ratón o dibujando un formato, como un cuadrado, sobre el área de interés. La marca de la pantalla de la computadora ayuda a guiar la posición de la micropipeta de grabación a la célula.
  8. Después de determinar la ubicación exacta de la célula diana, levante el objetivo e introduzca la micropipeta registradora llena con la solución interna. Al colocar la micropipeta en el soporte del electrodo, asegúrese de que la solución interna esté en contacto con el electrodo de plata.
    NOTA: Para la preparación, colocación y posicionamiento de micropipetas en el soporte del electrodo, consulte33.
  9. Aplique presión positiva antes de sumergir la micropipeta en la solución de aCSF, para evitar que los residuos entren en la micropipeta, utilizando una jeringa llena de aire de 1-3 ml conectada al soporte de micropipeta a través de un tubo de polietileno (≈130 cm más); aplicar casi 100-200 μL de aire.
  10. Usando el micromanipulador, guíe la micropipeta por debajo del centro del objetivo. Mueva los botones del micromanipulador para guiar la micropipeta del eje X-Y-Z hacia la celda de interés.
  11. Ajuste el enfoque para ver la punta de la micropipeta y acerque el enfoque, pero no demasiado, a la rodaja. Reduzca la velocidad del micromanipulador y baje lentamente la micropipeta hasta el plano de enfoque. Asegúrese de que la punta de la micropipeta no penetre bruscamente en el corte, sino que descienda lentamente hasta que toque la superficie de la célula/región objetivo.
  12. Aplique una ligera presión positiva (≈100 μL) con la jeringa llena de aire de 1-3 ml conectada al soporte de micropipeta para eliminar cualquier residuo de la trayectoria de aproximación.
  13. Concéntrese en la célula diana y mueva lentamente el micromanipulador en el eje X-Y-Z para acercar la micropipeta a la célula diana. Al tocar la micropipeta con la célula, se observará un hoyuelo causado por la presión aplicada a través de la punta de la micropipeta (Figura 2C).
  14. Después de formar el hoyuelo, debido a la proximidad de la micropipeta a la célula, aplique una succión débil y breve por vía oral (1-2 s) a través del tubo conectado al soporte de micropipeta para generar el sello entre la micropipeta y la célula (sello gigaohm o gigasello >1 GΩ; Figura 2D). Para formar el sello, utilice el modo de abrazadera de voltaje en el software. Para obtener detalles sobre la formación de focas, consulte33.
  15. Si el sello permanece estable (el sello gigaohm debe ser mecánicamente estable y sin interferencia de ruido, determinado por observación durante aproximadamente 1 min), ajuste el voltaje de retención en el potencial de reposo fisiológico más cercano de la celda de interés. Para las neuronas hipotalámicas de kisspeptina, se recomienda -50 mV.
  16. Aplicar una breve succión por vía oral (presión negativa) con la micropipeta sellada a la célula para romper la membrana plasmática (Figura 2E). La configuración adecuada de toda la célula se logra cuando la succión se realiza con suficiente fuerza para que la membrana rota no obstruya la micropipeta y no atraiga una porción considerable de la membrana o incluso de la célula.
  17. Consulte el manual de configuración del sistema utilizado. Utilice el software (consulte la Tabla de materiales) para verificar y calcular digitalmente la resistencia en serie (SR) y la capacitancia de celda completa (wcc).
  18. En el modo de abrazadera de voltaje, después de romper la membrana celular, habilite la opción de celda completa y haga clic en el comando Auto que se refiere a la pestaña de toda la celda. El SR y el wcc de la célula se calcularán automáticamente y el software los mostrará instantáneamente. Estos parámetros también se pueden verificar realizando la prueba de membrana con el amplificador mencionado en la Tabla de materiales33.
  19. Asegúrese de verificar los parámetros de viabilidad celular. Para las neuronas kisspeptina, compruebe que las mediciones electrofisiológicas son: SR < 25 mΩ, resistencia de entrada > 0,3 GΩ y manteniendo el valor absoluto actual < 30 pA (observaciones personales y referencia21). El valor medio del wcc de las neuronas AVPV/PeN kisspeptina oARH kisspeptina es ≈ 10-12 pF en ratones con gónadas intactas20.
  20. Monitoree la RS y la capacitancia de estado estacionario de la celda durante los experimentos. Asegúrese de que el SR no cambie más del 20% durante una grabación y que la capacitancia de la membrana sea estable.
  21. Compruebe la configuración del software. Crear protocolos específicos para las grabaciones según el tipo de experimento. Para registrar el potencial de membrana en el modo de abrazadera de corriente, con el equipo mencionado en la Tabla de materiales, el filtro de paso bajo filtra las señales electrofisiológicas a 2-4 kHz y analiza los resultados fuera de línea en un software (consulte la Tabla de materiales para obtener información sobre el software).
  22. Una vez que la configuración de toda la celda se haya logrado correctamente, mida las corrientes sinápticas en modo de abrazadera de voltaje (Figura 2G). Registrar los cambios en el potencial de membrana en reposo (RMP) y las variaciones de RMP inducidas en el modo de pinza de corriente (Figura 2H). Los cambios en la PMR, como la despolarización de la membrana celular, pueden ser inducidos mediante la administración de un fármaco/neurotransmisor conocido al baño (descrito en el paso 3.2), como se ilustra en la Figura 1.
    NOTA: En el modo de abrazadera de corriente, se puede inyectar corriente positiva o negativa para mantener el voltaje de la membrana a un voltaje deseado. Para las neuronas kisspeptina, generalmente establecemos una inyección de corriente cero (I = 0) para registrar la variación espontánea del potencial de membrana.

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Representative Results

Para estudiar los posibles efectos de la hormona de crecimiento recombinante humana (hGH) sobre la actividad de las neuronas kisspeptina hipotalámicas, realizamos registros de pinza de parche de células enteras en cortes cerebrales y evaluamos si esta hormona causa cambios agudos en la actividad de las neuronas AVPV / PeN kisspeptina y ARHkisspeptina. En este estudio se utilizaron ratones adultos Kiss1-Cre/GFP hembra (etapa diestral) y machos36. Se seleccionaron animales con gónadas intactas para los experimentos, ya que las propiedades de sus neuronas kisspeptina hipotalámicas pueden variar dependiendo de los niveles de esteroides sexuales19,20. Si bien estaba fuera del alcance del presente estudio evaluar las diferencias entre sexos, remitimos al lector a Croft et al. y Frazão et al.19,20 para obtener más información. Los animales modificados genéticamente, como ratones y ratas, representan herramientas interesantes para este tipo de experimentos, ya que las células que expresan un gen específico o una ablación inducida selectiva pueden ser identificadas por una proteína fluorescente como GFP, entre otras23,26,36. El uso de ratones modificados genéticamente representa un gran avance en la comprensión de la actividad de la neurona kisspeptina.

Las neuronas registradas (26 células de 12 animales) se determinaron de acuerdo con las características neuroanatómicas35 y la expresión de la GFP endógena20. En el modo de pinza actual, las neuronas se registraron bajo I = 0 en la configuración de pinza de parche de células completas. Las neuronas AVPV/PeNKisspeptin (12 células de nueve animales) exhibieron un RMP promedio de -59.0 mV ± 3.0 mV (rango: -75 mV a -46 mV), resistencia de entrada de 0.9 ± 0.1 GΩ, wcc de 12.3 pF ± 1.6 pF y SR de 19.4 ± 1.9 mΩ. Entre las neuronas registradas, tres de las 12 células AVPV/PeN deKisspeptina mostraron descargas espontáneas de potenciales de acción (AP) en reposo (0,1 Hz ± 0,06 Hz; el RMP promedio de las células espontáneamente activas fue de -50,7 mV ± 2,7 mV). El RMP promedio de las neuronasde kisspeptina ARH (14 células de 12 animales) fue de -50.0 mV ± 1.5 mV (rango: -62 mV a -39 mV), la resistencia de entrada promedio fue de 1.7 ± 0.1 GΩ, wcc fue de 9.2 pF ± 0.7 pF y SR de 16.9 ± 1.7 mΩ. La mayoría de las neuronasde kisspeptina ARH estaban inactivas, mientras que cuatro de las 14 células mostraron PA espontáneas en reposo (0,9 Hz ± 0,5 Hz; RMP promedio de las células espontáneamente activas fue de -52,7 mV ± 1,4 mV).

La administración de hGH (20 μg/g) al baño indujo una hiperpolarización significativa del RMP de muchas de las neuronas registradas, cinco de las 12 neuronas AVPV/PeN Kisspeptina (≈55% de las células de 9 ratones), y nueve de las 14 neuronas dekisspeptina ARH registradas (≈65% de las células de 12 ratones, p = 0,0006, prueba exacta de Fisher; Figura 3). Las neuronas hiperpolarizadas AVPV/PeNKisspeptin yARH kisspeptin cambiaron significativamente el RMP en comparación con las células que no responden (Figura 3B,E; Prueba de Mann-Whitney). Los efectos sobre la RMP (Figura 3C, F; ANOVA de medidas repetidas y post-prueba de Tukey) fueron seguidos por una reducción significativa de la resistencia de entrada (IR) de toda la célula en AVPV/PeNKisspeptina (0,9 ± 0,1 GΩ a 0,7 ± 0,1 GΩ durante la aplicación de hGH, p = 0,02; Figura 3D), y enARH kisspeptina (1,7 ± 0,1 GΩ a 1,0 ± 0,1 GΩ durante la aplicación de hGH, p < 0,0001; medidas repetidas ANOVA y post-prueba de Tukey; Figura 3G) Neuronas. Además, la frecuencia de AP espontáneas (fAP) de neuronas hiperpolarizadas con hGH disminuyó en ambas poblaciones de células (0,1 Hz ± 0,06 Hz a 0,0 Hz ± 0,0 Hz en AVPV/PeN Kisspeptina y 1,0 Hz ± 0,5 Hz a 0,2 Hz ± 0,1 Hz en neuronas ARHkisspeptina). Sin embargo, el alcance de esta disminución no alcanzó un nivel de significación estadística (p > 0,05, prueba de Mann-Whitney). Después del lavado de hGH, el RMP y el IR se restauraron a la línea de base (Figura 3A, C, D, F, G). Las neuronas kisspeptina restantes no respondían a la administración de hGH.

Hemos demostrado previamente que la pGH no induce efectos sobre la actividad de la neurona kisspeptina hipotalámica (consultar Silveira et al.25; Figura 3H). Cabe destacar que se sabe que la hGH puede activar los receptores de prolactina (PRL) además de los receptores de GH37,38. Además, PRL despolariza indirectamente sólo el ≈20% de las neuronas AVPV/PeNKisspeptina en ratones24. En contraste, PRL no modula la transmisión sináptica rápida de las células ARHkisspeptina 24. Por lo tanto, el efecto de hiperpolarización inducida por hGH reportado aquí parece ser inespecífico. Las diferencias observadas pueden depender de variables como la concentración del fármaco, la diferencia de especies (humano vs. ratón), o incluso la presencia de sales en la composición de los fármacos utilizados, como se informó anteriormente28.

Figure 1
Figura 1: Diagrama esquemático que resume la contribución de la técnica de patch-clamp de células enteras al conocimiento de la actividad de las neuronas kisspeptina. Las neuronas kisspeptina (mostradas en verde) se encuentran en los núcleos periventricular anteroventral y periventricular rostral (AVPV/PeN) y en el núcleo arqueado del hipotálamo (ARH). Las células AVPV/PeNKisspeptin y ARHkisspeptin envían conexiones directas al soma de las neuronas de la hormona liberadora de gonadotrofina (GnRH) ubicadas en el área preóptica (POA) y sus terminales en la eminencia mediana (EM), que culmina en la modulación del eje hipotálamo-hipófisis (HPG). Se ha demostrado que diferentes neuromoduladores, como las hormonas, modulan diferencialmente la actividad de las neuronas AVPV/PeNKisspeptina y ARHkisspeptina. Los posibles efectos sobre el potencial de la membrana en reposo se demuestran esquemáticamente mediante trazados representativos obtenidos utilizando la técnica de pinza de trayectoria de toda la célula y los registros de pinza de corriente. El color rojo indica que un neurotransmisor específico induce la despolarización del potencial de membrana en reposo (PMR)17,22,24,26,28,29,30,31,32; el color azul indica que no hay efecto sobre RMP 24,25,26,27,30. La línea discontinua indica el RMP. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Pasos básicos para obtener el sellado de la célula de interés mediante la técnica de patch-clamp de célula entera. (A,B) Micrografías representativas de cortes cerebrales (250 μm) que contienen células kisspeptina en el núcleo periventricular anteroventral (AVPV) y el núcleo arqueado del hipotálamo (ARH). Las neuronas kisspeptina fueron identificadas por la expresión de proteína verde fluorescente (GFP). (C) Microfotografía que demuestra una micropipeta (que contiene solución electrolítica [solución interna]) lo suficientemente cerca de la célula para crear un hoyuelo en la membrana plasmática para realizar el sello. (D,E) Se requiere una presión negativa leve (succión bucal realizada en un tubo conectado al cabezal y a la micropipeta) para sellar la membrana celular a la micropipeta (D). Una segunda aplicación de presión negativa (leve y breve) es necesaria para inducir la ruptura de la membrana plasmática (E). (F) El registro de la actividad celular se realiza mediante una configuración mecánica utilizada para experimentos de patch-clamp. Después de romper la membrana plasmática, las corrientes que fluyen a través de los canales iónicos en la celda parcheada pueden ser registradas por un electrodo conectado a un amplificador altamente sensible. Una resistencia de retroalimentación genera la corriente necesaria para las grabaciones de abrazadera de voltaje (G) o abrazadera de corriente (H). Abreviaturas: 3V = tercer ventrículo; ME = eminencia mediana. Barras de escala: A = 130 μm, B = 145 μm, C = 20 μm, D = 15 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Prueba de la especificidad del fármaco. (A) Registro representativo de pinza de corriente que demuestra que la hormona de crecimiento recombinante humana (hGH) indujo una hiperpolarización del potencial de membrana en reposo (RMP) de las neuronas kisspeptina ubicadas en el núcleo arqueado del hipotálamo (ARH kisspeptina). (B-G) Gráficos de barras que muestran el cambio promedio en el potencial de membrana en reposo (RMP) (B, C, E, F) y la resistencia de entrada promedio (IR) (D, G) de las neuronas kisspeptina sensibles a hGH ubicadas en los núcleos periventricular anteroventral y periventricular rostral (AVPV / PeNKisspeptin) (B-D) o ARH (E-G). Registro representativo de pinza de corriente que demuestra que la hormona de crecimiento porcino (pGH) no indujo ningún efecto sobre el RMP de las neuronas dekisspeptina ARH, como se informó anteriormente25 (H). Las pruebas de significación utilizadas son la prueba de Mann-Whitney para (B) y (E), y las medidas repetidas ANOVA y la prueba posterior de Tukey para (C, D, F, G). La línea discontinua indica el RMP. *p = 0,02; **p = 0,004,***p = 0,0003; p < 0,0001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Solución interna (100 mL)
Sal FW (g/mol) Concentración Peso (g)
K-gluconato 234.2 120 mM 2.81
NaCl 58.4 1,0 mM 0.006
Kcl 74.5 10 mM 0.074
HEPES 238.3 10 mM 0.24
EGTA 380.3 5,0 mM 0.19
CaCl2 147.0 1,0 mM 0.015
MgCl2 203.0 1,0 mM 0.02
KOH 56.11 3,0 mM 0.017
ATP 507.18 4,0 mM 0.20
pH =7.3 / osmolaridad = 275 - 280 mOsm

Tabla 1: Reactivos para la preparación de la solución interna. La tabla contiene el peso molecular (FW), las concentraciones deseadas y el peso calculado de las sales para la preparación de 100 ml de solución.

aCSF/Solución de corte (250 mL)
Sal FW Concentración Peso (g)
Sacarosa 342.3 238 mM 18.5
KCL 74.5 2,5 mM 0.046
NaHCO3 84.0 26 mM 0.546
NaH2PO4 120.0 1,0 mM 0.03
MgCl2 203.0 5 mM 0.254
D-glucosa 180.2 10 mM 0.450
CaCl2 147.0 1,0 mM 0.037
pH = 7.3 / osmolaridad = 290 - 295 mOsm

Tabla 2: Reactivos para preparar la solución de corte. La tabla contiene el peso molecular (FW), las concentraciones deseadas y el peso calculado de las sales para la preparación de 250 ml de solución. El cerebro se sumerge en esta solución para ser cortado.

aCSF para grabación (1 L)
Sal FW Concentración Peso (g)
NaCl 58.4 135 mM 7.88
KCL 74.5 3,5 mM 0.261
NaHCO3 84.0 26 mM 2,184
NaH2PO4 120.0 1,25 mM 0.150
MgSO4 246.5 1,2 mM 0.296
D-glucosa 180.2 10 mM 1,802
CaCl2 147.0 1,0 mM 0.148
pH = 7.3 / osmolaridad = 290-300 mOsm

Tabla 3: Reactivos para preparar el LCR para las grabaciones. La tabla contiene el peso molecular (FW), las concentraciones deseadas y el peso calculado de las sales para la preparación de 1 L de solución.

Figura complementaria 1: Ejemplo de una cámara de recuperación hecha internamente. (A,B) Una cámara de recuperación interna se puede fabricar de la siguiente manera: cortar una placa de 24 pocillos para que haya nueve pozos disponibles. Pegue una pantalla de nylon a la base de los nueve pocillos. Con el resto de la placa del pozo, haz una base para que la parte inferior del nylon quede libre. (C) Esta base adaptada se puede colocar dentro de un vaso de precipitados de 500 ml que contiene líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF) constantemente saturado con carbógeno (95% O2 y 5% CO2). (D) El vaso de precipitados que sostiene la cámara de recuperación se mantiene en el baño de agua durante la experimentación. (E,F) Se utiliza una pipeta de transferencia de acrílico para transferir las rebanadas de cerebro a la cámara de recuperación. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

El desarrollo de la técnica de patch-clamp de células enteras tuvo un impacto significativo en la comunidad científica, siendo considerado de suma importancia para desarrollar la investigación científica y permitir varios descubrimientos. Su impacto en la ciencia fue suficiente para culminar en el Premio Nobel de Medicina en 1991, ya que este descubrimiento abrió la puerta a una mejor comprensión de cómo funcionan los canales iónicos en condiciones fisiológicas y patológicas, así como a la identificación de posibles dianas para agentes terapéuticos 11,39,40,41 . En el campo de la medicina, uno de los hallazgos sobresalientes realizados con esta técnica fue que varias sustancias utilizadas clínicamente interactúan directamente con los canales iónicos (por ejemplo, anestésicos locales, antiarrítmicos, antidiabéticos y relajantes musculares)42. Por lo tanto, su aplicabilidad es evidente en institutos clínicos y departamentos de investigación básica. Este artículo describe el protocolo para la preparación básica para realizar experimentos de pinza de parche de células enteras en cortes cerebrales que contienen neuronas kisspeptina hipotalámicas. Describimos los pasos básicos y destacamos los parámetros notables que deben controlarse para obtener tejido y preparar soluciones para la técnica de parche-pinza. Sin embargo, este artículo no puede describir completamente la complejidad de esta técnica y los mecanismos involucrados en cada tipo de registro, especialmente el análisis. Para un mayor aprendizaje teórico, se recomiendan algunos libros y reseñas sobre la técnica patch-clamp 10,43,44,45,46.

Cada solución utilizada en el método patch-clamp tiene un propósito específico; Por lo tanto, sus composiciones y criterios específicos deben adoptarse rigurosamente durante la preparación. Por ejemplo, la composición de la solución interna debe determinarse de acuerdo con el objetivo del experimento, ya que varía según el tipo de corriente a medir. La solución a base de cloruro mencionada aquí, en la que Cl- (15 mM) imita la concentración fisiológica del citoplasma celular47, se utiliza para estudiar las propiedades neuronales activas y pasivas o las respuestas a la entrada sináptica. Es importante enfatizar que el contenido de cloruro en la solución interna mantiene el potencial de equilibrio de cloruro en niveles óptimos para el registro celular (en la solución mencionada ECL, es de aproximadamente -59 mV). La concentración de cloruro intracelular se puede estimar evaluando el potencial de reversión de la corriente inducida por GABA (EGABA), suponiendo que toda la corriente a través del receptorGABA A es transportada por Cl-21,48. Para el estudio de las neuronas kisspeptina hipotalámicas, se debe considerar que la concentración intracelular de Cl- para ARH kisspeptina es mayor que para las células AVPV/PeNKisspeptina 21. Esta característica debe tenerse en cuenta al planificar un experimento. Se recomienda que la osmolaridad de la solución interna sea al menos un 5% inferior a la de aCSF para los registros para evitar la pérdida de sello debido a una posible hinchazón y/o debilitamiento celular33,47. Si existe la necesidad de agregar un compuesto intracelular que pueda usarse como marcador celular a la solución interna, como la biocitina o un colorante intracelular (por ejemplo, Alexa Fluor 594), los niveles de K + pueden reducirse para que la osmolaridad se pueda mantener constantemente 20,47,49,50.

Realizar una disección cerebral rápida y mantener una temperatura baja (0-2 °C) durante el corte con una solución de corte adecuada es crucial. Las soluciones de corte pueden diferir según el tipo de célula y/o región cerebral evaluada 33,47. La solución de aCSF utilizada para obtener los cortes de cerebro (es decir, la solución de corte) generalmente tiene una composición diferente de la aCSF para los registros (para comparación, ver Tabla 2 y Tabla 3). Las concentraciones de cationes (Ca 2+ y Mg2+) pueden ajustarse para modificar la excitabilidad de las neuronas, lo que también puede afectar el umbral de disparo y la liberación de neurotransmisores47. Los medios de bajo Ca 2+ y alto Mg2+ se utilizan ampliamente para minimizar posibles procesos excitotóxicos (para más información, ver51). Además, los medios bajos de Ca 2+ y Mg2+ altos pueden estimular la actividad de las neuronas hipotalámicas52. En cuanto al aCSF para grabaciones, algunas características son similares. El sistema tampón se basa en NaHCO3, altas concentraciones de NaCl (generalmente >100 mM) y bajas concentraciones de KCl (generalmente <5 mM), concentraciones relativas de Ca 2+ y Mg2+ (a menudo se usa 2: 1) son generalmente alrededor de 2 mM, y los niveles de glucosa pueden variar de 1 a 10 mM47. Además de las variaciones de la osmolaridad, el pH o los cambios de temperatura de las soluciones (controlados digitalmente entre 30-32 °C), es importante destacar que pueden ocurrir otros problemas durante el protocolo experimental que interfieren sustancialmente con la experimentación. Las mediciones electrofisiológicas deben ser estables durante las grabaciones, y cualquier variación debe tener una lectura crítica. Por ejemplo, los cambios de SR tienen en cuenta el acceso celular en modo de célula completa y tienen consecuencias considerables en las corrientes y potenciales medidos. Además, es importante destacar que una limitación relevante relacionada a la metodología parche-pinza que debe ser considerada es la sobreestimulación mecánica de la célula por protocolos de succión/presión excesivos que pueden inducir cambios morfológicos y funcionales53. Este sesgo a menudo es difícil de controlar en protocolos donde la succión se realiza por vía oral en lugar de un dispositivo que puede controlar con precisión la intensidad de succión aplicada. Además, los problemas relacionados con los tejidos, que culminan con un alto porcentaje de mortalidad celular, pueden ocurrir debido a una disección inadecuada, hipoxia o la condición de salud del ratón que un investigador no puede identificar por observación.

La principal ventaja de la técnica de pinza de parche de células enteras es la capacidad de registrar neuronas en regiones cerebrales específicas de interés con precisión. Esta técnica se ha beneficiado enormemente de la creación de animales modificados genéticamente. Nuestro grupo típicamente trabaja con un modelo de ratón que expresa la hrGFP bajo el promotor del gen Kiss1 u otro que expresa Cre-recombinasa bajo el promotor del gen Kiss1 y GFP bajo la expresión Cre-condicional. Sin embargo, hay muchos modelos animales validados hoy en día23,26,36. Además, la ausencia de la barrera hematoencefálica y el hecho de que el entorno extracelular e intracelular puede controlarse y manipularse fácilmente representa ventajas de este método; Sin embargo, no representan necesariamente una condición fisiológica. Entre las limitaciones de esta técnica en comparación con las preparaciones in vivo, u otros tipos de registro con el objetivo de preservar la concentración iónica citoplasmática, como los registros en células o en parche perforado, es importante mencionar que la invasividad de la configuración de células enteras causa diálisis del contenido de citoplasma54. La diálisis puede causar la interrupción de los aspectos moleculares necesarios para que algunos fenómenos se desarrollen o se expresen. Al grabar a partir de rebanadas, debe recordarse que la mayoría de las proyecciones de las neuronas están seccionadas. Por lo tanto, está fuera del alcance de la técnica evaluar cuánto afecta esta interrupción a los efectos observados o a una condición fisiológica. Como se mencionó, generalmente se realizan cortes cerebrales coronales de 200-300 μm para estudiar la actividad de las neuronas kisspeptina hipotalámicas 17,19,20,21,34. La limitación de usar una sección de corte cerebral más gruesa para estudiar las células de kisspeptina y diferentes ángulos de corte que mantienen una conectividad AVPV / PeN o ARH específica55 necesita más investigación. Además, al probar el efecto de una hormona/fármaco, sintético o no, sobre el PGR de una neurona, varios estudios se basan en el fármaco EC50 (si se conoce) o en datos publicados que demuestran que una concentración específica es efectiva para activar la velocidad de disparo o cambiar los niveles de [Ca2+]i. Sin embargo, se debe tener en cuenta la composición/especificidad del fármaco a ser utilizado en los experimentos, ya que es posible que las drogas sintéticas purificadas, en comparación con otras drogas similares, puedan tener efectos antagónicos28. Como se demostró anteriormente25, mientras que la pGH purificada no induce ningún efecto sobre la actividad de la neurona kisspeptina hipotalámica, la hGH produjo datos controvertidos (ver Figura 3). Resultados similares se demostraron cuando se evaluaron los efectos de la insulina sobre la ARH28. Por lo tanto, se debe considerar la especificidad del fármaco al planificar un experimento e interpretar los resultados obtenidos.

La técnica patch-clamp es una excelente herramienta para obtener datos sobre la actividad eléctrica de las neuronas y ha contribuido significativamente al conocimiento de varias poblaciones neuronales, como las neuronas kisspeptina. La mayoría de los detalles proporcionados aquí se utilizan generalmente para registros de neuronas hipotalámicas, como hemos informado anteriormente 25,50,56,57,58,59,60. Es importante destacar que para registrar otras poblaciones neuronales además de las neuronas kisspeptina, uno debe conocer o determinar las mediciones electrofisiológicas que pueden ayudar a identificar los tipos de células, como la capacitancia celular, SR, resistencia de entrada, patrón de disparo celular y otros parámetros. Estas propiedades varían entre diferentes células cerebrales, núcleos cerebrales y condiciones fisiológicas o inducidas, como los niveles circulantes de esteroides sexuales 16,19,20,21,61, que pueden interferir sustancialmente con el análisis crítico de los resultados. Además, es necesario comprender las posibles variables implicadas en la preparación del tejido y sus ventajas y limitaciones asociadas para trabajar con esta técnica. Todos los pasos descritos aquí deben llevarse a cabo juiciosamente, ya que cualquier cambio en las variables involucradas en el protocolo puede interferir drásticamente con los resultados.

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Disclosures

No se declararán conflictos de intereses.

Acknowledgments

Este estudio fue apoyado por la Fundación de Investigación de São Paulo [números de subvención FAPESP: 2021/11551-4 (JNS), 2015/20198-5 (TTZ), 2019/21707/1 (RF); y por la Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) - Código de Finanzas 001" (HRV).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Compounds for aCSF, internal and slicing solutions
ATP Sigma Aldrich/various A9187
CaCl2 Sigma Aldrich/various C7902
D-(+)-Glucose Sigma Aldrich/various G7021
EGTA Sigma Aldrich/various O3777
HEPES Sigma Aldrich/various H3375
KCL Sigma Aldrich/various P5405
K-gluconate Sigma Aldrich/various G4500
KOH Sigma Aldrich/various P5958
MgCl2 Sigma Aldrich/various M9272
MgSO4 Sigma Aldrich/various 230391
NaCl Sigma Aldrich/various S5886
NaH2PO4  Sigma Aldrich/various S5011
NaHCO3 Sigma Aldrich/various S5761
nitric acid Sigma Aldrich/various 225711 CAUTION
Sucrose Sigma Aldrich/various S1888
Equipments
Air table TMC 63-534
Amplifier Molecular Devices Multiclamp 700B
Computer various -
DIGIDATA 1440 LOW-NOISE DATA ACQUISITION SYSTEM Molecular Devices DD1440
Digital peristaltic pump Ismatec ISM833C 
Faraday cage TMC 81-333-03
Imaging Camera Leica DFC 365 FX
Micromanipulator Sutter Instruments Roe-200
Micropipette Puller Narishige PC-10
Microscope Leica DM6000 FS
Osteotome Bonther equipamentos & Tecnologia/various 128
Recovery chamber Warner Instruments/Harvard apparatus - can be made in-house
Recording chamber Warner Instruments 640277
Spatula Fisher Scientific /various FISH-14-375-10; FISH-21-401-20
Vibratome  Leica VT1000 S
Water Bath  Fisher Scientific /various Isotemp
Software and systems
AxoScope 10 software Molecular Devices - Commander Software
LAS X wide field system Leica - Image acquisition and analysis
MultiClamp 700B Molecular Devices MULTICLAMP 700B Commander Software
PCLAMP 10 SOFTWARE FOR WINDOWS Molecular Devices Pclamp 10 Standard
Tools
Ag/AgCl electrode, pellet, 1.0 mm Warner Instruments 64-1309
Curved hemostatic forcep various -
cyanoacrylate glue LOCTITE/various -
Decapitation scissors various -
Filter paper various -
Glass capillaries (micropipette) World Precision Instruments, Inc TW150F-4
Iris scissors Bonther equipamentos & Tecnologia/various 65-66
Pasteur glass pipette  Sigma Aldrich/various CLS7095B9-1000EA
Petri dish various -
Polyethylene tubing  Warner Instruments 64-0756
Razor blade for brain dissection TED PELLA TEDP-121-1
Razor blade for the vibratome TED PELLA TEDP-121-9
Scissors Bonther equipamentos & Tecnologia/various 71-72, 48,49; 
silicone teat various -
Slice Anchor  Warner Instruments 64-0246
Syringe filters Merck Millipore Ltda SLGVR13SL Millex-GV 0.22 μm
Tweezers Bonther equipamentos & Tecnologia/various 131, 1518

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Este mes en JoVE Número 193 corte cerebral grabaciones de pinza actual Kiss1 hipotálamo
Neuronas de kisspeptina hipotalámicas como objetivo para grabaciones de pinza de parche de células enteras
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Silva, J. d. N., Zampieri, T. T.,… More

Silva, J. d. N., Zampieri, T. T., Vieira, H. R., Frazao, R. Hypothalamic Kisspeptin Neurons as a Target for Whole-Cell Patch-Clamp Recordings. J. Vis. Exp. (193), e64989, doi:10.3791/64989 (2023).

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