Summary
在这里，我们提出了一种协议，用于对含有kisspeptin神经元的脑切片进行全细胞膜片钳，kisspeptin神经元是促性腺激素释放激素（GnRH）细胞的主要调节剂。通过增加有关kisspeptin神经元活性的知识，这种电生理工具已成为过去20年来神经内分泌领域取得重大进展的基础。
Abstract
Kisspeptins对于下丘脑 - 垂体 - 性腺（HPG）轴的成熟和生育能力至关重要。位于前腹侧脑室周围核和脑室周围核以及下丘脑弓形核中的下丘脑kisspeptin神经元投射到促性腺激素释放激素（GnRH）神经元等细胞。先前的研究表明，kisspeptin信号通过Kiss1受体（Kiss1r）发生，最终激发GnRH神经元活动。在人类和实验动物模型中，吻肽足以诱导GnRH分泌，从而诱导促黄体生成素（LH）和卵泡兴奋素（FSH）释放。由于kisspeptin在生殖功能中起着至关重要的作用，研究人员正在努力评估下丘脑kisspeptin神经元的内在活性如何有助于与生殖相关的行动，并确定能够改变这些特性的主要神经递质/神经调节剂。全细胞膜片钳技术已成为研究啮齿动物细胞中kisspeptin神经元活性的宝贵工具。这种实验技术使研究人员能够记录和测量细胞膜的自发兴奋性和抑制性离子电流、静息膜电位、动作电位放电和其他电生理特性。在本研究中，回顾了全细胞膜片钳技术的关键方面，称为定义下丘脑kisspeptin神经元的电生理测量，并讨论了有关该技术的相关问题。
Introduction
霍奇金和赫胥黎在几项科学研究中首次记录了动作电位。该记录是在鱿鱼轴突上进行的，该轴突具有大直径（~500μm），允许将微电极放置在轴突内。这项工作为科学研究提供了巨大的可能性，后来最终创建了电压钳模式，该模式用于研究动作电位产生1，2，3，4，5，6，7，8的离子基。多年来，该技术不断改进，并在科学研究中得到广泛应用6，9。膜片钳技术的发明发生在 1970 年代后期，通过 Erwin Neher 和 Bert Sakmann 发起的研究，使研究人员能够仅使用单个电极记录几乎所有类型细胞中的单离子通道和细胞内膜电位或电流9，10，11，12.膜片钳记录可以在各种组织制剂上进行，例如培养的细胞或组织切片，在电压钳模式（将细胞膜保持在设定电压下，允许记录例如电压依赖性电流和突触电流）或电流钳模式（允许记录例如由离子电流引起的静息膜电位的变化， 动作电位和突触后电位频率）。
膜片钳技术的使用使几个值得注意的发现成为可能。事实上，关于位于前腹侧脑室周围和喙室周围核（AVPV/PeN Kisspeptin）的下丘脑kisspeptin神经元（也称为第三脑室的喙周围脑室区域（RP3V）和下丘脑弓形核（ARH kisspeptin）的电生理特性的开创性发现13，14，15特别令人感兴趣。2010年，Ducret等人使用另一种电生理工具松散细胞膜片钳技术在小鼠中首次记录了AVPV / PeNKisspeptin神经元。这些研究提供了AVPV / PeNKisspeptin神经元的电学描述，并证明它们的放电模式是发情周期依赖性的16。2011年，Qiu等人使用全细胞膜片钳技术证明ARH基斯肽汀神经元表达内源性起搏器电流17。随后，Gottsch等人表明kisspeptin神经元表现出自发活动并表达h型（起搏器）和T型钙电流，这表明ARH吻肽蛋白神经元与其他中枢神经系统起搏器神经元具有电生理特性18。此外，已经证明ARH基斯肽汀神经元表现出性别二态性放电率，AVPV / PeN基斯肽汀神经元表现出受ATP敏感钾通道（K ATP）影响的双峰静息膜电位（RMP）19，20。此外，确定性腺类固醇对小鼠kisspeptin神经元的自发电活动产生积极影响19，20，21。研究kisspeptin神经元电生理特性的第一项工作被提及16，17，18，19，20。从那时起，许多研究使用全细胞膜片钳技术来证明哪些因子/神经调节剂足以调节kisspeptin神经元的电活动（图1）17，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32.
鉴于该技术对于研究生殖所需的神经元的重要性，以及此处未涵盖的其他细胞类型，本文描述了开发全细胞膜片钳技术的基本步骤，例如制备溶液，解剖和切片大脑，以及执行细胞膜密封以进行记录。此外，还讨论了有关该技术的相关问题，例如其优点，技术限制以及必须控制以获得最佳实验性能的重要变量。
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Protocol
所有动物程序均由圣保罗大学生物医学科学研究所动物伦理委员会批准，并根据巴西动物实验学院采用的伦理准则进行。
1. 溶液的制备
- 内溶液的制备
注意：内部溶液填充膜片钳微量移液器，并将接触细胞内部（参见 图2中的示例）。内部溶液可能因要测量的活动类型而异33.- 根据实验目的和适当的记录类型选择内部解决方案。要在电流钳模式下记录膜电位，请使用由 120 mM K-葡萄糖酸盐、1 mM NaCl、5 mM EGTA、10 mM HEPES、1 mM MgCl2、1 mM CaCl2、3 mM KOH、10 mM KCl 和 4 mM （Mg）-ATP 组成的内部溶液。根据所需的最终体积称量所有盐，如 表1所示。
- 使用足够的去离子水达到溶液最终体积的90%。该体积将确保有足够的空间来调节pH和渗透压。
- 彻底加入并混合所有成分后，使用pH计用5M KOH将pH调节至7.2-7.3。使用渗透压计检查渗透压，渗透压应在 275-280 mOsm 左右（如有必要，仅向下调整）。
- 提前准备内部溶液并储存在8°C。 在实验当天添加 ATP。将含ATP的内部溶液在-20°C（1mL等分试样）下储存3-4个月。
- 切片溶液的制备
- 制备含有 238 mM 蔗糖、2.5 mM KCl、26 mM NaHCO3、1.0 mM NaH 2 PO4、10 mM 葡萄糖、1.0 mM CaCl 2 和 5.0 mM MgCl2 的切片溶液。根据所需的最终体积称量所有盐，如表2所示。要制备的溶液的确切体积将取决于切割室的大小。
- 在去离子水中混合所有盐的同时，不断用碳原（95%O 2和5%CO2）饱和。将聚乙烯管（外径 1.57 mm x 内径 [ID]）连接到碳原圆柱体上，以向切片溶液供应碳原。将试管的开口端保持在装有切片溶液的烧杯内。
- 将所有成分充分混合后，使用pH计用10%硝酸将pH值调节至7.3。使用渗透压计检查渗透压，应为 290-295 mOsm（如有必要，仅向下调整）。然后，将溶液冷却至0-2°C。
- 准备用于录制的 aCSF 解决方案
- 制备人工脑脊髓液 （aCSF） 溶液，用于含有 124 mM NaCl、2.8 mM KCl、26 mM NaHCO3、1.25 mM NaH 2 PO 4、1.2 mM MgSO4、5 mM 葡萄糖和 2.5 mM CaCl2的记录。根据所需的最终体积称量所有盐，如表3所示。
- 在去离子水中混合所有盐的同时，不断用碳原（95%O 2和5%CO 2）饱和，如步骤1.2.2中所述。
- 加入并混合所有成分后，使用pH计将pH调节至7.3（可以使用10%硝酸）。使用渗透压计检查渗透压，应为290-300 mOsm。之后，将aCSF倒入烧杯中，并在30°C的水浴中保持。
2.脑解剖切片
注意：由于不同的大脑结构可能需要在不同的平面（冠状，矢状或水平切片）上进行切割，因此获得切片的确切方法取决于感兴趣的大脑区域。通常，研究AVPV / PeN和ARH（此处称为AVPV / PeNkisspeptin神经元和ARH kisspeptin神经元;图2A，B），冠状脑切片（200-300μm）通常制成17，19，20，21，34。AVPV / PeNkisspeptin神经元距离前膛约0.5至-0.22毫米，而ARH基斯肽蛋白神经元位于-1.22至-2.70毫米。细胞核位置可以通过使用立体定位小鼠脑图谱35或艾伦小鼠脑参考图谱（http://mouse.brain-map.org/）来确定。本研究使用成年Kiss1-Cre / GFP雌性（二线期）和雄性小鼠36。
- 脑切除
- 准备解剖部位和提取大脑所需的工具：斩首剪刀、虹膜剪刀、卡斯特罗维耶霍弯曲剪刀、截骨器、镊子、刮刀、滤纸、培养皿、剃须刀片和氰基丙烯酸酯胶。
- 在制作切片之前，请准备将进行解剖的工作台，因为必须快速执行所有后续程序。确保能够使用切片设备，例如振动切片机。
- 在切片组织之前准备一个记录室以维护脑切片。从商业品牌（材料表）购买一个录音室，浴槽尺寸为 24 毫米 x 15 毫米 x 2 毫米（长 x 宽 x 高），或在内部制作一个。
注意：内部回收室可以按如下方式制造：切割一个 24 孔板，以便有 9 个孔可用。将尼龙屏粘在九孔的底部。用孔板的其余部分制作一个底座，使尼龙的下部自由。这种适应性强的碱基可以放置在含有aCSF的500 mL烧杯中（补充图1）。 - 准备好所有东西后，使用4%-5%异氟醚用吸入麻醉剂麻醉动物。麻醉必须符合伦理委员会批准的协议。动物不动后不久，进行尾巴和爪子捏咬测试，以确保动物被深度麻醉。
- 在心脏仍处于活动状态时快速斩首小鼠以增强细胞活力。斩首后迅速收获大脑。
- 用手术剪刀，在动物头骨顶部的皮肤上切开一个切口，从尾部到嘴部，然后从动物的头部取下头皮。接下来，用虹膜剪刀沿着矢状缝线切割顶板并去除枕骨。将截骨器滑到顶骨下方，轻轻将其拉出，直到大脑暴露。
- 露出大脑后，将头部倒置，轻轻降低大脑以可视化两侧的三叉神经，然后用Castroviejo弯曲剪刀剪断三叉神经。可视化下丘脑后，识别视神经并轻轻切割。
注意：切割视神经时要小心，因为拉动它会撕裂包含AVPV / PeN核的相邻下丘脑区域。 - 切开额叶的最前部，完全切除大脑。立即将大脑浸入切片溶液中，直到获得切片。
- 切片大脑样本
- 将大脑放在滤纸上（支撑在培养皿上）以干燥多余的溶液。然后，用锋利的切割刀片进行冠状切割，将脑干与小脑与组织的其他部分分开。
- 接下来，将大脑的尾部粘在振动切片机的底部，并用冷却至0-2°C的切片/ aCSF溶液填充切片装置的腔室。 在手术过程中，在振动切片机室周围包装干冰，以保持切片溶液低温。
- 将剃须刀片插入振动切片机并设置设备的相应切割参数：速度 = 3，频率 = 9，进给 = 250 μm。在组织切片过程中，使用丙烯酸转移移液管（连接到硅胶奶嘴的倒置巴斯德玻璃移液管）将切片转移到回收室（如步骤2.1.3中所述）。切片采集后等待60分钟组织恢复。
3. 用于记录的电池密封
- 在开始记录之前，请确保所有设备（显微镜、放大器、数字化仪、显微操纵器等）都已打开。
- 用aCSF溶液填充来自商业品牌（材料表）的记录室，该记录室连接到显微镜上。使用灌注泵以 2 mL/min 的速率持续灌注 aCSF。
- 将感兴趣的脑切片（一次一个）转移到记录室。使用丙烯酸转移移液器（连接到硅胶奶嘴的倒置巴斯德玻璃移液管）将下丘脑切片转移到腔室。使用切片锚点（材料表）固定切片，使其在aCSF灌注过程中不会移动。
- 在连接到显微镜的记录室的中心放置一个切片。切片位置对于在显微镜下获得所需区域的良好视野以及完美到达记录微量移液器至关重要。
- 使用浸没式显微镜的低折射率物镜（10倍或20倍）协助定位切片并定位感兴趣区域。
- 定位感兴趣区域后，将物镜切换到高倍透镜（63x）并聚焦组织水平，观察目标区域中细胞的内源性荧光蛋白和形状，以定位脑切片20表面的kisspeptin细胞。
- 找到可能的目标单元格后，使用鼠标光标或在感兴趣的区域上绘制格式（如正方形）在计算机屏幕上对其进行标记。计算机屏幕标记有助于将记录的微量移液器的位置引导到细胞中。
- 确定目标细胞的确切位置后，抬起物镜并引入装有内部溶液的记录微量移液器。将微量移液器放入电极支架时，请确保内部溶液与银电极接触。
注意：有关微量移液器的制备、放置和电极支架上的定位，请参阅33。 - 在将微量移液器浸入aCSF溶液之前施加正压，以防止碎片进入微量移液器，使用1-3 mL充气注射器通过聚乙烯管连接到微量移液器支架（长≈130厘米）;涂抹近 100-200 μL 空气。
- 使用显微操纵器将微量移液器引导到物镜中心下方。移动显微操纵器上的按钮，将X-Y-Z轴上的微量移液器引导至感兴趣的细胞。
- 调整焦点以查看微量移液器的尖端，并使焦点靠近切片，但不要太近。降低显微操纵器的速度，慢慢将微量移液器降低到焦点平面。确保微量移液器吸头不会突然穿透切片，而是缓慢下降，直到接触细胞/目标区域的表面。
- 使用连接到微量移液器支架的 1-3 mL 充气注射器施加轻微的正压 （≈100 μL），以清除接近路径中的任何碎屑。
- 聚焦在靶细胞上，在X-Y-Z轴上缓慢移动显微操纵器，使微量移液器更接近靶细胞。当将微量移液器接触细胞时，将观察到由通过微量移液器吸头施加的压力引起的凹坑（图2C）。
- 形成酒窝后，由于微量移液器靠近细胞，通过连接到微量移液器支架的管子通过微移液器支架的管子施加微弱的短暂吸力（1-2秒），以在微量移液器与细胞之间产生密封（千兆欧密封或千兆密封>1GΩ; 图 2D）。要形成密封，请使用软件上的电压钳模式。有关密封形成的详细信息，请参阅33。
- 如果密封保持稳定（千兆欧姆密封应机械稳定且无噪声干扰，通过观察约1分钟确定），则将保持电压设置为感兴趣细胞的最接近的生理静息电位。对于kisspeptin下丘脑神经元，建议使用-50 mV。
- 用微移液器密封在细胞上，用口腔（负压）短暂抽吸以破坏质膜（图2E）。当以足够的力进行抽吸时，可以实现充分的全细胞配置，以使破裂的膜不会堵塞微量移液器，也不会吸引膜的很大一部分甚至细胞。
- 检查所使用的系统设置手册。使用该软件（参见 材料表）以数字方式检查和计算串联电阻（SR）和全电池电容（WCC）。
- 在电压钳模式下，在破坏细胞膜后，启用整个细胞选项，然后单击引用整个细胞选项卡的自动命令。细胞的SR和wcc将自动计算并由软件立即显示。这些参数也可以通过使用 材料表33中提到的放大器进行膜测试来检查。
- 确保检查细胞活力参数。对于kisspeptin神经元，检查电生理测量值是否为：SR < 25 mΩ，输入电阻>0.3 GΩ，保持电流绝对值<30 pA（个人观察和参考文献21）。在性腺完整小鼠中，AVPV / PeN基斯肽汀或ARH基斯肽汀神经元的wcc的平均值≈10-12pF。
- 在实验过程中监测SR和电池稳态电容。确保SR在记录过程中的变化不超过20%，并且膜电容稳定。
- 检查软件设置。根据实验类型为记录创建特定的协议。为了记录电流钳模式下的膜电位，使用材料 表中提到的设备，低通滤波2-4 kHz的电生理信号，并在软件中离线分析结果（有关软件信息，请参阅 材料表 ）。
- 正确实现全电池配置后，在电压钳模式下测量突触电流（图2G）。记录静息膜电位（RMP）的变化和电流钳位模式下的诱导RMP变化（图2H）。RMP的变化，例如细胞膜的去极化，可以通过向浴中施用已知的药物/神经递质来诱导（如步骤3.2中所述），如图 1所示。
注意： 在电流钳模式下，可以注入正电流或负电流以将膜电压保持在所需电压。对于kisspeptin神经元，我们通常设置零电流注入（I = 0）来记录膜电位的自发变化。
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Representative Results
为了研究人重组生长激素（hGH）对下丘脑kisspeptin神经元活性的可能影响，我们在脑切片中进行全细胞膜片钳记录，并评估这种激素是否引起AVPV / PeN基斯肽汀和ARH基斯肽神经元活性的急性变化。本研究使用成年Kiss1-Cre / GFP雌性（二线期）和雄性小鼠36。选择性腺完整的动物进行实验，因为它们的下丘脑kisspeptin神经元的性质可能因性类固醇水平而变化19，20。虽然评估性别差异超出了本研究的范围，但我们请读者参考Croft等人和Frazão等人19，20以获取更多信息。转基因动物，如小鼠和大鼠，代表了这类实验的令人兴奋的工具，因为表达特定基因或选择性诱导消融的细胞可以通过荧光蛋白（如GFP）来识别，其中包括23，26，36。转基因小鼠的使用代表了理解kisspeptin神经元活性的突破。
记录的神经元（12只动物中的26个细胞）根据神经解剖学特征35 和内源性GFP20的表达确定。在电流钳模式下，在全细胞膜片钳配置中记录I = 0下的神经元。AVPV / PeNKisspeptin 神经元（来自9只动物的12个细胞）表现出-59.0 mV±3.0 mV（范围：-75 mV至-46 mV）的平均RMP，输入电阻为0.9 ± 0.1 GΩ，WCC为12.3 pF ± 1.6 pF，SR为19.4 ± 1.9 mΩ。在记录的神经元中，12个AVPV / PeNKisspeptin 细胞中有3个在静止时显示出自发放电的动作电位（AP）（0.1 Hz±0.06 Hz;自发活性细胞的平均RMP为-50.7 mV±2.7 mV）。ARHkisspeptin 神经元（来自12只动物的14个细胞）的平均RMP为-50.0 mV±1.5 mV（范围：-62 mV至-39 mV），平均输入电阻为1.7 ± 0.1 GΩ，WCC为9.2 pF ± 0.7 pF，SR为16.9 ± 1.7 mΩ。大多数ARH亲吻蛋白 神经元是静止的，而14个细胞中有4个在静止时显示自发AP（0.9 Hz±0.5 Hz;自发活性细胞的平均RMP为-52.7 mV±1.4 mV）。
向浴中施用hGH（20μg/ g）诱导了许多记录神经元的RMP显着超极化，12个AVPV / PeNKisspeptin神经元中的5个（来自9只小鼠的细胞的≈55%）和14个记录的ARH基斯肽神经元中的9个（来自12只小鼠的≈65%的细胞，p = 0.0006，费舍尔精确测试;图3）。与无反应细胞相比，AVPV / PeN kisspeptin和ARHkisspeptin超极化神经元显着改变了RMP（图3B，E;曼-惠特尼检验）。对RMP的影响（图3C，F;重复测量方差分析和Tukey的后测试）之后，在hGH应用期间，AVPV / PeNKisspeptin的全细胞输入电阻（IR）显着降低（0.9 ± 0.1 GΩ至0.7 ± 0.1 GΩ，p = 0.02;图3D），以及在hGH施用期间ARH基斯肽汀（1.7±0.1GΩ至1.0±0.1GΩ，p <0.0001; 重复测量方差分析和Tukey的后测试;图3G）神经元。此外，hGH超极化神经元的自发AP（fAP）的频率在两个细胞群中都降低了（AVPV / PeNkisspeptin中的0.1 Hz±0.06 Hz至0.0 Hz± 0.0 Hz和ARHkisspeptin神经元中的0.5 Hz至0.2 Hz±0.1 Hz）的1.0 ±Hz）。然而，这种下降的程度未能达到统计学意义水平（p > 0.05，曼-惠特尼检验）。hGH洗刷后，RMP和IR恢复到基线（图3A，C，D，F，G）。剩余的kisspeptin神经元对hGH给药无反应。
我们之前已经证明pGH对下丘脑kisspeptin神经元活性没有影响（请参考Silveira等人25; 图 3H）。值得注意的是，已知hGH除了GH受体37，38外，还可以激活催乳素（PRL）受体。此外，PRL间接地使小鼠中AVPV / PeNKisspeptin 神经元的≈20%去极化24。相反，PRL不调节ARH亲吻肽素 细胞的快速突触传递24。因此，这里报道的hGH诱导的超极化效应似乎是非特异性的。观察到的差异可能取决于诸如药物浓度，物种差异（人与小鼠）甚至所用药物组合物中盐的存在等变量，如先前报道的28。
图 1：总结全细胞膜片钳技术对 kisspeptin 神经元活性知识的贡献的示意图。Kisspeptin 神经元（以绿色显示）位于前腹侧脑室周围核和喙室周围核 （AVPV/PeN） 和下丘脑 （ARH） 的弓形核中。AVPV / PeNKisspeptin和ARHkisspeptin细胞直接连接到位于视前区（POA）的促性腺激素释放激素（GnRH）神经元的体细胞及其位于中位隆起（ME）的末端，最终调节下丘脑 - 垂体轴（HPG）。不同的神经调节剂，如激素，已被证明可以差异调节AVPV / PeN kisspeptin和ARHkisspeptin神经元的活性。通过使用全细胞路径钳技术和电流钳记录获得的代表性示踪，示意性地证明了对静息膜电位的可能影响。红色表示特定的神经递质诱导静息膜电位（RMP）的去极化17，22，24，26，28，29，30，31，32;蓝色表示对RMP24，25，26，27，30没有影响。虚线表示 RMP。请点击此处查看此图的大图。
图 2：通过全细胞膜片钳技术获得目标电池密封的基本步骤。 （一，二）脑切片（250μm）的代表性显微照片，含有前腹侧脑周核（AVPV）和下丘脑弓形核（ARH）的kisspeptin细胞。通过绿色荧光蛋白（GFP）表达鉴定基斯肽神经元。（C）显微照片显示微量移液器（含有电解质溶液[内部溶液]）足够靠近细胞，以在质膜中形成酒窝以进行密封。（D，E）需要轻度负压（在连接到头部和微量移液器的管子上进行口吸）以将细胞膜密封到微量移液器（D）。第二次应用负压（轻度和短暂）是诱导质膜破裂（E）所必需的。（F）细胞活性的记录由用于膜片钳实验的机械装置执行。在破坏质膜后，流过贴片细胞中离子通道的电流可以通过连接到高灵敏度放大器的电极来记录。反馈电阻产生电压钳位 （G） 或电流钳位 （H） 记录所需的电流。缩写：3V = 第三心室;ME = 中位数突出度。比例尺：A = 130 μm、B = 145 μm、C = 20 μm、D = 15 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：测试药物特异性。 （A）代表性电流钳记录，表明人重组生长激素（hGH）诱导位于下丘脑弓形核（ARH基斯肽）的kisspeptin神经元的静息膜电位（RMP）的超极化。（B-G）条形图显示了位于前腹侧脑室周围和喙室周围核（AVPV / PeN Kisspeptin）（B-D）或ARH（E-G）的hGH响应性kisspeptin神经元的静息膜电位（RMP）（B，C，E，F）和平均输入阻力（IR）（D，G）的平均变化).代表性的电流钳记录表明猪生长激素（pGH）对ARH亲吻肽神经元的RMP没有影响，如先前报道的25（H）。使用的显著性检验是（B）和（E）的曼-惠特尼检验，以及（C，D，F，G）的方差分析和Tukey后检验的重复测量。虚线表示 RMP。*p = 0.02;**p = 0.004，***p = 0.0003;p < 0.0001。请点击此处查看此图的大图。
| 内溶液 （100 mL） | |||
| 盐 | 分子量（克/摩尔） | 浓度 | 重量（g） |
| K-葡萄糖酸酯 | 234.2 | 120 毫米 | 2.81 |
| 氯化钠 | 58.4 | 1.0 毫米 | 0.006 |
| 氯化钾 | 74.5 | 10 毫米 | 0.074 |
| 赫佩斯 | 238.3 | 10 毫米 | 0.24 |
| 埃格塔 | 380.3 | 5.0 毫米 | 0.19 |
| 氯化钙2 | 147.0 | 1.0 毫米 | 0.015 |
| 氯化镁2 | 203.0 | 1.0 毫米 | 0.02 |
| 郭 | 56.11 | 3.0 毫米 | 0.017 |
| 可供使用量 ATP | 507.18 | 4.0 毫米 | 0.20 |
| pH = 7.3 / 渗透压 = 275 - 280 mOsm | |||
表1：用于制备内溶液的试剂。 该表包含用于制备 100 mL 溶液的分子量 （FW）、所需浓度和计算的盐重量。
| aCSF/切片液（250毫升） | |||
| 盐 | 固件 | 浓度 | 重量（g） |
| 蔗糖 | 342.3 | 238 毫米 | 18.5 |
| 氯化钾 | 74.5 | 2.5 毫米 | 0.046 |
| 氢氧化钠3 | 84.0 | 26 毫米 | 0.546 |
| NaH2PO4 | 120.0 | 1.0 毫米 | 0.03 |
| 氯化镁2 | 203.0 | 5 毫米米 | 0.254 |
| D-葡萄糖 | 180.2 | 10 毫米 | 0.450 |
| 氯化钙2 | 147.0 | 1.0 毫米 | 0.037 |
| pH = 7.3 / 渗透压 = 290 - 295 mOsm | |||
表2：制备切片溶液的试剂。 该表包含用于制备 250 mL 溶液的盐的分子量 （FW）、所需浓度和计算重量。大脑被淹没在这个溶液中被切片。
| 用于记录的脑脊液（1 L） | |||
| 盐 | 固件 | 浓度 | 重量（g） |
| 氯化钠 | 58.4 | 135 毫米 | 7.88 |
| 氯化钾 | 74.5 | 3.5 毫米 | 0.261 |
| 氢氧化钠3 | 84.0 | 26 毫米 | 2,184 |
| NaH2PO4 | 120.0 | 1.25 毫米 | 0.150 |
| 镁硫4 | 246.5 | 1.2 毫米 | 0.296 |
| D-葡萄糖 | 180.2 | 10 毫米 | 1,802 |
| 氯化钙2 | 147.0 | 1.0 毫米 | 0.148 |
| pH = 7.3 / 渗透压 = 290-300 mOsm | |||
表3：用于制备用于记录的aCSF的试剂。 该表包含用于制备1L溶液的盐的分子量（FW），所需浓度和计算重量。
补充图1：内部制造的回收室示例。 （一，二）内部回收室可以按如下方式制造：切割一个 24 孔板，以便有 9 个孔可用。将尼龙屏粘在九孔的底部。用孔板的其余部分制作一个底座，使尼龙的下部自由。（C）这种适应的基质可以放置在含有人工脑脊髓液（aCSF）的500毫升烧杯中，该烧杯中不断饱和碳原（95%O2和5%CO2）。（D）在实验过程中，将装有回收室的烧杯保存在水浴中。（中、女）丙烯酸转移移液器用于将脑切片转移到恢复室。 请点击此处下载此文件。
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Discussion
全细胞膜片钳技术的发展对科学界产生了重大影响，被认为对发展科学研究和实现多项发现至关重要。它对科学的影响足以在1991年获得诺贝尔医学奖，因为这一发现为更好地了解离子通道在生理和病理条件下的功能以及确定治疗剂的潜在靶点打开了大门11，39，40，41.在医学领域，使用该技术得出的突出发现之一是临床上使用的几种物质直接与离子通道相互作用（例如，局部麻醉药，抗心律失常药，抗糖尿病药和肌肉松弛剂）42。因此，其适用性在临床研究所和基础研究部门是显而易见的。本文描述了对含有下丘脑kisspeptin神经元的脑切片进行全细胞膜片钳实验的基本准备方案。我们概述了基本步骤，并重点介绍了必须控制的显着参数，以获得组织和制备膜片钳技术的溶液。但是，本文无法完全描述该技术的复杂性以及每种记录类型所涉及的机制，尤其是分析。为了进一步的理论学习，建议使用一些关于膜片钳技术的书籍和评论10，43，44，45，46。
膜片钳方法中使用的每种解决方案都有特定的用途;因此，在编制过程中必须严格采用其具体成分和标准。例如，内部溶液的成分应根据实验的目标确定，因为它因要测量的电流类型而异。这里提到的基于氯化物的溶液，其中Cl-（15mM）模拟细胞质47的生理浓度，用于研究主动和被动神经元特性或对突触输入的反应。重要的是要强调，内部溶液中的氯化物含量使氯化物平衡电位保持在细胞记录的最佳水平（在上述溶液ECL中，约为-59mV）。细胞内氯化物浓度可以通过评估GABA诱导电流（EGABA）的反转电位来估计，假设所有通过GABAA受体的电流都由Cl-21，48携带。对于下丘脑kisspeptin神经元的研究，必须考虑到ARHkisspeptin的细胞内Cl-浓度高于AVPV / PeNKisspeptin细胞21。在计划实验时必须考虑这一特性。建议内部溶液的渗透压至少比记录的aCSF低5%，以避免由于可能的肿胀和/或细胞减弱而失去密封33，47。如果需要添加可进一步用作细胞标志物的内部溶液的细胞内化合物，例如生物细胞素或细胞内染料（例如Alexa Fluor 594），则可以降低K+水平，以便渗透压可以持续维持20，47，49，50。
在切片过程中使用适当的切片溶液进行快速脑解剖并保持低温（0-2°C）至关重要。切片溶液可能根据被评估的细胞和/或大脑区域的类型而有所不同33，47。用于获得脑切片的aCSF溶液（即切片溶液）通常与用于记录的aCSF具有不同的成分（为了进行比较，请参阅表2和表3）。阳离子（Ca 2+和Mg2+）浓度可以调节以改变神经元的兴奋性，这也会影响放电阈值和神经递质释放47。低钙2+和高镁2+培养基被广泛用于最小化可能的兴奋毒性过程（有关更多信息，请参阅51）。此外，低Ca2+和高Mg2+培养基可刺激下丘脑神经元活动52。关于用于记录的aCSF，一些特征是相似的。缓冲系统基于NaHCO3，高NaCl浓度（通常为>100mM）和低KCl浓度（通常为<5mM），Ca 2+和Mg 2+（通常使用2：1）的相对浓度通常在2mM左右，葡萄糖水平范围为1至10mM47。除了溶液的渗透压、pH或温度变化（数字控制在30-32°C之间）的变化外，重要的是要强调，在实验方案中可能会出现其他严重干扰实验的问题。电生理测量在记录过程中必须稳定，任何变化都必须具有临界读数。例如，SR变化考虑了全细胞模式下的蜂窝访问，并对测量的电流和电位产生相当大的影响。此外，重要的是要强调，必须考虑的与膜片钳方法相关的相关限制是通过过度的吸力/压力协议对细胞进行机械过度刺激，这可能会引起形态和功能变化53。在通过口腔而不是可以精确控制所施加的吸力强度的装置的方案中，这种偏差通常难以控制。此外，由于解剖不充分、缺氧或研究人员无法通过观察确定的小鼠健康状况，可能以高比例的细胞死亡率达到高水平的组织相关问题。
全细胞膜片钳技术的主要优点是能够精确记录特定大脑感兴趣区域中的神经元。这项技术极大地受益于转基因动物的创造。我们的小组通常使用在Kiss1基因启动子下表达hrGFP的小鼠模型，或者在Kiss1基因启动子下表达Cre-重组酶和在Cre条件表达下表达GFP的小鼠模型。然而，现在有许多经过验证的动物模型23，26，36。此外，没有血脑屏障以及细胞外和细胞内环境可以轻松控制和操纵的事实代表了该方法的优点;然而，它们并不一定代表一种生理状况。与体内制剂或其他旨在保持细胞质离子浓度的记录类型（例如细胞上或穿孔贴片记录）相比，该技术的局限性中，重要的是要提到全细胞配置的侵入性导致细胞质内容物透析54。透析可能导致某些现象发展或表达所必需的分子方面的中断。通过切片记录，需要记住大多数神经元的投影都是切片的。因此，评估这种破坏对观察到的效果或生理状况的影响程度超出了该技术的范围。如前所述，通常进行200-300μm的冠状脑切片以研究下丘脑kisspeptin神经元17，19，20，21，34的活性。使用较厚的脑切片来研究kisspeptin细胞和保持特定AVPV / PeN或ARH连接的不同切片角度的局限性55需要进一步研究。此外，通过测试激素/药物（无论是否合成）对神经元RMP的影响，一些研究基于药物EC50（如果已知）或已发表的数据，这些数据表明特定浓度可有效激活放电速率或改变[Ca2 + ]i水平。然而，人们应该意识到实验中使用的药物的组成/特异性，因为与其他类似药物相比，纯化的合成药物可能具有拮抗作用28。如前25所示，虽然纯化的pGH对下丘脑kisspeptin神经元活性没有影响，但hGH产生了有争议的数据（见图3）。当评估胰岛素对ARH的影响时，也显示出类似的结果28。因此，在计划实验和解释获得的结果时，应考虑药物特异性。
膜片钳技术是获取神经元电活动数据的绝佳工具，并且对几个神经元群体（例如kisspeptin神经元）的知识做出了重大贡献。这里提供的大部分细节通常用于记录下丘脑神经元，正如我们之前报道的那样25，50，56，57，58，59，60。重要的是，为了记录除kisspeptin神经元之外的其他神经元群，必须知道或确定可以帮助识别细胞类型的电生理测量值，例如细胞电容，SR，输入电阻，细胞放电模式和其他参数。这些特性在不同的脑细胞、脑核和生理或诱导条件之间有所不同，例如循环性类固醇水平16、19、20、21、61，这会严重干扰结果的批判性分析。此外，有必要了解组织制备中涉及的可能变量及其相关的优点和局限性，以使用该技术。此处描述的所有步骤都必须明智地进行，因为协议中涉及的变量的任何更改都可能极大地干扰结果。
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Disclosures
无需声明利益冲突。
Acknowledgments
这项研究得到了圣保罗研究基金会[FAPESP资助号：2021/11551-4（JNS），2015/20198-5（TTZ），2019/21707/1（RF）;以及由Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior（CAPES）-财务代码001“（HRV）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Compounds for aCSF, internal and slicing solutions | |||
| ATP | Sigma Aldrich/various | A9187 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich/various | C7902 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich/various | G7021 | |
| EGTA | Sigma Aldrich/various | O3777 | |
| HEPES | Sigma Aldrich/various | H3375 | |
| KCL | Sigma Aldrich/various | P5405 | |
| K-gluconate | Sigma Aldrich/various | G4500 | |
| KOH | Sigma Aldrich/various | P5958 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich/various | M9272 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich/various | 230391 | |
| NaCl | Sigma Aldrich/various | S5886 | |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich/various | S5011 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich/various | S5761 | |
| nitric acid | Sigma Aldrich/various | 225711 | CAUTION |
| Sucrose | Sigma Aldrich/various | S1888 | |
| Equipments | |||
| Air table | TMC | 63-534 | |
| Amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | |
| Computer | various | - | |
| DIGIDATA 1440 LOW-NOISE DATA ACQUISITION SYSTEM | Molecular Devices | DD1440 | |
| Digital peristaltic pump | Ismatec | ISM833C | |
| Faraday cage | TMC | 81-333-03 | |
| Imaging Camera | Leica | DFC 365 FX | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | Roe-200 | |
| Micropipette Puller | Narishige | PC-10 | |
| Microscope | Leica | DM6000 FS | |
| Osteotome | Bonther equipamentos & Tecnologia/various | 128 | |
| Recovery chamber | Warner Instruments/Harvard apparatus | - | can be made in-house |
| Recording chamber | Warner Instruments | 640277 | |
| Spatula | Fisher Scientific /various | FISH-14-375-10; FISH-21-401-20 | |
| Vibratome | Leica | VT1000 S | |
| Water Bath | Fisher Scientific /various | Isotemp | |
| Software and systems | |||
| AxoScope 10 software | Molecular Devices | - | Commander Software |
| LAS X wide field system | Leica | - | Image acquisition and analysis |
| MultiClamp 700B | Molecular Devices | MULTICLAMP 700B | Commander Software |
| PCLAMP 10 SOFTWARE FOR WINDOWS | Molecular Devices | Pclamp 10 Standard | |
| Tools | |||
| Ag/AgCl electrode, pellet, 1.0 mm | Warner Instruments | 64-1309 | |
| Curved hemostatic forcep | various | - | |
| cyanoacrylate glue | LOCTITE/various | - | |
| Decapitation scissors | various | - | |
| Filter paper | various | - | |
| Glass capillaries (micropipette) | World Precision Instruments, Inc | TW150F-4 | |
| Iris scissors | Bonther equipamentos & Tecnologia/various | 65-66 | |
| Pasteur glass pipette | Sigma Aldrich/various | CLS7095B9-1000EA | |
| Petri dish | various | - | |
| Polyethylene tubing | Warner Instruments | 64-0756 | |
| Razor blade for brain dissection | TED PELLA | TEDP-121-1 | |
| Razor blade for the vibratome | TED PELLA | TEDP-121-9 | |
| Scissors | Bonther equipamentos & Tecnologia/various | 71-72, 48,49; | |
| silicone teat | various | - | |
| Slice Anchor | Warner Instruments | 64-0246 | |
| Syringe filters | Merck Millipore Ltda | SLGVR13SL | Millex-GV 0.22 μm |
| Tweezers | Bonther equipamentos & Tecnologia/various | 131, 1518 |
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