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Neuroscience

Neuroni ipotalamici di kisspeptina come bersaglio per le registrazioni di patch-clamp a cellule intere

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/64989
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Anatomy, Instituto de Ciencias Biomedicas, Universidade de Sao Paulo

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per eseguire un patch-clamp a cellule intere su fette di cervello contenenti neuroni kisspeptina, il modulatore primario delle cellule dell'ormone di rilascio delle gonadotropine (GnRH). Aggiungendo conoscenze sull'attività dei neuroni kisspeptina, questo strumento elettrofisiologico è servito come base per progressi significativi nel campo della neuroendocrinologia negli ultimi 20 anni.

Abstract

Le kisspeptine sono essenziali per la maturazione dell'asse ipotalamo-ipofisi-gonadia (HPG) e la fertilità. I neuroni kisspeptina ipotalamici situati nel nucleo periventricolare anteroventrale e nel nucleo periventricolare rostrale, così come il nucleo arcuato dell'ipotalamo, proiettano i neuroni dell'ormone di rilascio della gonadotropina (GnRH), tra le altre cellule. Studi precedenti hanno dimostrato che la segnalazione della kisspeptina avviene attraverso il recettore Kiss1 (Kiss1r), in ultima analisi, eccitando l'attività dei neuroni GnRH. Nell'uomo e nei modelli animali sperimentali, le kisspeptine sono sufficienti per indurre la secrezione di GnRH e, di conseguenza, il rilascio di ormone luteinizzante (LH) e ormone follicolo-stimolante (FSH). Poiché le kisspeptine svolgono un ruolo essenziale nelle funzioni riproduttive, i ricercatori stanno lavorando per valutare come l'attività intrinseca dei neuroni ipotalamici della kisspeptina contribuisca alle azioni correlate alla riproduzione e identificare i neurotrasmettitori primari / neuromodulatori in grado di modificare queste proprietà. La tecnica patch-clamp dell'intera cellula è diventata uno strumento prezioso per studiare l'attività dei neuroni kisspeptina nelle cellule dei roditori. Questa tecnica sperimentale consente ai ricercatori di registrare e misurare le correnti ioniche eccitatorie e inibitorie spontanee, il potenziale di membrana a riposo, il potenziale d'azione e altre proprietà elettrofisiologiche delle membrane cellulari. Nel presente studio, vengono esaminati aspetti cruciali della tecnica patch-clamp dell'intera cellula, nota come misurazioni elettrofisiologiche che definiscono i neuroni kisspeptin ipotalamici e una discussione di questioni rilevanti sulla tecnica.

Introduction

Hodgkin e Huxley hanno fatto la prima registrazione intracellulare di un potenziale d'azione descritto in diversi studi scientifici. Questa registrazione è stata eseguita sull'assone del calamaro, che ha un grande diametro (~ 500 μm), consentendo di posizionare un microelettrodo all'interno dell'assone. Questo lavoro ha fornito grandi possibilità per la ricerca scientifica, culminando in seguito nella creazione del modo di morsetto di tensione, che è stato utilizzato per studiare la base ionica della generazione del potenziale d'azione 1,2,3,4,5,6,7,8. Nel corso degli anni, la tecnica è stata migliorata ed è diventata ampiamente applicata nella ricerca scientifica 6,9. L'invenzione della tecnica patch-clamp, avvenuta alla fine del 1970 attraverso studi avviati da Erwin Neher e Bert Sakmann, ha permesso ai ricercatori di registrare singoli canali ionici e potenziali o correnti di membrana intracellulare praticamente in ogni tipo di cellula utilizzando un solo elettrodo 9,10,11,12. Le registrazioni patch-clamp possono essere effettuate su una varietà di preparati tissutali, come cellule coltivate o fette di tessuto, in modalità tension-clamp (mantenendo la membrana cellulare a una tensione impostata che consente la registrazione, ad esempio, di correnti dipendenti dalla tensione e correnti sinaptiche) o in modalità current-clamp (consentendo la registrazione, ad esempio, delle variazioni del potenziale di membrana a riposo indotte da correnti ioniche, potenziali d'azione e frequenza del potenziale postsinaptico).

L'uso della tecnica patch-clamp ha reso possibili diverse scoperte degne di nota. Infatti, i risultati seminali sulle proprietà elettrofisiologiche dei neuroni ipotalamici kisspeptin situati nei nuclei periventricolare anteroventrale e periventricolare rostrale (AVPV / PeN Kisspeptin), noto anche come area periventricolare rostrale del terzo ventricolo (RP3V), e il nucleo arcuato dell'ipotalamo (ARHkisspeptin)13,14,15 sono di particolare interesse. Nel 2010, Ducret et al. hanno eseguito le prime registrazioni di neuroni AVPV / PeNKisspeptinnei topi utilizzando un altro strumento elettrofisiologico, la tecnica patch-clamp a cellule sciolte. Questi studi hanno fornito una descrizione elettrica dei neuroni AVPV/PeNKisspeptin e hanno dimostrato che i loro schemi di attivazione sono estrali dipendenti dal ciclo16. Nel 2011, Qiu et al. hanno utilizzato la tecnica dell'intero patch-clamp cellulare per dimostrare che i neuroni ARHkisspeptin esprimono correnti pacemaker endogene17. Successivamente, Gottsch et al. hanno dimostrato che i neuroni kisspeptin mostrano attività spontanea ed esprimono sia correnti di calcio di tipo H (pacemaker) che di tipo T, suggerendo che i neuroni ARHkisspeptin condividono proprietà elettrofisiologiche con altri neuroni pacemaker del sistema nervoso centrale18. Inoltre, è stato dimostrato che i neuroni ARH kisspeptin mostrano velocità di attivazione sessualmente dimorfiche e che i neuroni AVPV/PeNKisspeptin mostrano un potenziale di membrana a riposo bimodale (RMP) influenzato dai canali del potassio sensibili all'ATP (KATP)19,20. Inoltre, è stato stabilito che gli steroidi gonadici influenzano positivamente l'attività elettrica spontanea dei neuroni kisspeptina nei topi 19,20,21. I primi lavori che studiano le proprietà elettrofisiologiche dei neuroni kisspeptina sono menzionati 16,17,18,19,20. Da allora, molti studi hanno utilizzato la tecnica patch-clamp dell'intera cellula per dimostrare quali fattori/neuromodulatori sono sufficienti a modulare l'attività elettrica dei neuroni kisspeptina (Figura 1)17,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32.

Data l'importanza di questa tecnica per lo studio dei neuroni necessari per la riproduzione, tra gli altri tipi di cellule non trattati qui, questo articolo descrive i passaggi fondamentali per lo sviluppo della tecnica patch-clamp dell'intera cellula, come la preparazione delle soluzioni, la dissezione e il taglio del cervello e l'esecuzione del sigillo della membrana cellulare per le registrazioni. Inoltre, vengono discusse questioni rilevanti sulla tecnica, come i suoi vantaggi, i limiti tecnici e le variabili importanti che devono essere controllate per prestazioni sperimentali ottimali.

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Protocol

Tutte le procedure animali sono state approvate dal Comitato Etico degli Animali dell'Istituto di Scienze Biomediche dell'Università di San Paolo e sono state eseguite secondo le linee guida etiche adottate dal Collegio brasiliano di sperimentazione animale.

1. Preparazione delle soluzioni

  1. Preparazione della soluzione interna
    NOTA: La soluzione interna riempie la micropipetta patch-clamp e contatterà l'interno della cella (vedere un esempio nella Figura 2). Le soluzioni interne possono variare a seconda del tipo di attività da misurare33.
    1. Scegliere la soluzione interna considerando il suo scopo sperimentale e il tipo di record appropriato. Per registrare il potenziale di membrana in modalità corrente-mors, utilizzare la soluzione interna composta da 120 mM K-gluconato, 1 mM NaCl, 5 mM EGTA, 10 mM HEPES, 1 mM MgCl 2, 1 mM CaCl2, 3 mM KOH, 10 mM KCl e 4 mM (Mg)-ATP. Pesare tutti i sali secondo il volume finale desiderato, come indicato nel prospetto 1.
    2. Utilizzare abbastanza acqua deionizzata per raggiungere il 90% del volume finale della soluzione. Questo volume garantirà spazio sufficiente per regolare il pH e l'osmolarità.
    3. Dopo aver aggiunto e mescolato accuratamente tutti gli ingredienti, regolare il pH a 7,2-7,3 con 5 M KOH utilizzando un pHmetro. Utilizzare un osmometro per controllare l'osmolarità, che dovrebbe essere di circa 275-280 mOsm (regolare, se necessario, solo verso il basso).
    4. Preparare preventivamente la soluzione interna e conservare a 8 °C. Aggiungi l'ATP il giorno dell'esperimento. Conservare la soluzione interna contenente ATP a -20 °C (1 mL di aliquote) per 3-4 mesi.
  2. Preparazione della soluzione di affettatura
    1. Preparare una soluzione affettante contenente 238 mM di saccarosio, 2,5 mM KCl, 26 mM di NaHCO3, 1,0 mM di NaH 2 PO4, 10 mM di glucosio, 1,0 mM di CaCl 2 e 5,0 mM di MgCl 2. Pesare tutti i sali secondo il volume finale desiderato, come mostrato nella tabella 2. Il volume esatto di questa soluzione da preparare dipenderà dalle dimensioni della camera di taglio.
    2. Mescolando tutti i sali in acqua deionizzata, saturare costantemente con carbogeno (95% O 2 e 5% CO2). Collegare tubi in polietilene (diametro esterno 1,57 mm [OD] x 1,14 mm diametro interno [ID]) a un cilindro di carbogeno per fornire carbogeno alla soluzione di affettatura. Tenere l'estremità aperta del tubo all'interno del becher contenente la soluzione affettata.
    3. Dopo aver mescolato bene tutti gli ingredienti, regolare il pH a 7,3 con acido nitrico al 10% utilizzando un pHmetro. Utilizzare un osmometro per controllare l'osmolarità, che dovrebbe essere 290-295 mOsm (regolare, se necessario, solo verso il basso). Successivamente raffreddare la soluzione a 0-2 °C.
  3. Preparare la soluzione aCSF per le registrazioni
    1. Preparare la soluzione di liquido cerebrospinale artificiale (aCSF) per registrazioni contenenti 124 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1,25 mM NaH 2 PO 4, 1,2 mM MgSO4, 5 mM glucosio e 2,5 mM CaCl2. Pesare tutti i sali secondo il volume finale desiderato, indicato nella tabella 3.
    2. Mescolando tutti i sali in acqua deionizzata, saturare costantemente con carbogeno (95% O 2 e 5% CO 2), come descritto al punto 1.2.2.
    3. Dopo aver aggiunto e mescolato tutti gli ingredienti, regolare il pH a 7,3 (è possibile utilizzare acido nitrico al 10%) utilizzando un pHmetro. Utilizzare un osmometro per controllare l'osmolarità, che dovrebbe essere 290-300 mOsm. Successivamente, versare l'aCSF in un becher e mantenerlo a bagnomaria a 30 °C.

2. Dissezione del cervello e affettamento

NOTA: Poiché diverse strutture cerebrali possono richiedere il taglio su piani diversi (fette coronali, sagittali o orizzontali), l'approccio esatto per ottenere le fette dipende dalla regione cerebrale di interesse. Tipicamente, per studiare le cellule che esprimono Kiss1 in AVPV / PeN e ARH (qui denominati come neuroni dikisspeptina AVPV / PeN e neuroni dikisspeptina ARH; Figura 2A,B), le fette di cervello coronale (200-300 μm) sono solitamente fatte 17,19,20,21,34. I neuroni AVPV/PeNKisspeptin si trovano a circa 0,5-0,22 mm dal bregma, mentre i neuroni ARHkisspeptin sono compresi tra -1,22 e -2,70 mm. La posizione dei nuclei può essere determinata utilizzando un atlante stereotassico del cervello di topo35 o l'Allen Mouse Brain Reference Atlas (http://mouse.brain-map.org/). In questo studio sono stati utilizzati topi adulti Kiss1-Cre/GFP femmina (stadio di diestro) e topi maschi36.

  1. Rimozione del cervello
    1. Preparare il sito di dissezione e gli strumenti necessari per estrarre il cervello: forbici da decapitazione, forbici per iride, forbici curve Castroviejo, osteotomo, pinzette, spatola, carta da filtro, piastra di Petri, lama di rasoio e colla cianoacrilica.
    2. Prima di fare le fette, preparare il banco su cui verrà eseguita la dissezione, poiché tutte le procedure successive devono essere eseguite rapidamente. Assicurati di avere accesso a un dispositivo di affettatura come un vibratomo.
    3. Preparare una camera di registrazione per mantenere le fette di cervello prima di tagliare il tessuto. Acquista una camera di registrazione, dimensioni del bagno di 24 mm x 15 mm x 2 mm (L x L x A), da un marchio commerciale (Table of Materials) o creane uno in-house.
      NOTA: Una camera di recupero interna può essere fabbricata come segue: tagliare una piastra da 24 pozzetti in modo che siano disponibili nove pozzi. Incollare uno schermo di nylon alla base dei nove pozzetti. Con il resto della piastra del pozzo, fare una base in modo che la parte inferiore del nylon sia libera. Questa base adattata può essere collocata all'interno di un becher da 500 mL contenente l'aCSF (Figura supplementare 1).
    4. Dopo aver preparato tutto, anestetizzare l'animale con anestetico inalato usando isoflurano al 4% -5%. L'anestesia deve essere conforme a un protocollo approvato dal comitato etico. Poco dopo che l'animale è immobile, eseguire test di pizzicamento della coda e della zampa per assicurarsi che l'animale sia profondamente anestetizzato.
    5. Decapitare rapidamente i topi mentre il cuore è ancora attivo per aumentare la vitalità cellulare. Raccogli il cervello rapidamente dopo la decapitazione.
    6. Con le forbici chirurgiche, praticare un'incisione nella pelle nella parte superiore del cranio dell'animale, dal caudale al rostrale, e rimuovere il cuoio capelluto dalla testa dell'animale. Quindi, tagliare la piastra interparietale lungo la sutura sagittale con le forbici dell'iride e rimuovere l'osso occipitale. Far scorrere l'osteotomo sotto l'osso parietale e tirarlo delicatamente fuori fino a quando il cervello è esposto.
    7. Dopo aver esposto il cervello, capovolgere la testa, abbassare delicatamente il cervello per visualizzare il nervo trigemino su ciascun lato, quindi tagliare il nervo trigemino usando le forbici curve Castroviejo. Dopo aver visualizzato l'ipotalamo, identificare il nervo ottico e tagliarlo delicatamente.
      NOTA: Fare attenzione quando si taglia il nervo ottico, poiché tirandolo si strappa l'area ipotalamica adiacente contenente il nucleo AVPV / PeN.
    8. Tagliare la porzione più anteriore del lobo frontale e rimuovere completamente il cervello. Immergere immediatamente il cervello nella soluzione di affettatura fino ad acquisire le fette.
  2. Affettare campioni di cervello
    1. Posizionare il cervello su carta da filtro (supportata su una capsula di Petri) per asciugare la soluzione in eccesso. Quindi, con una lama di rasoio tagliente, eseguire un taglio coronale separando il tronco cerebrale con il cervelletto dal resto del tessuto.
    2. Quindi, incollare la porzione caudale del cervello alla base del vibratomo e riempire la camera del dispositivo di affettatura con la soluzione di affettatura / aCSF raffreddata a 0-2 °C. Durante la procedura, imballare ghiaccio secco intorno alla camera di vibratomo per mantenere fredda la soluzione affettante.
    3. Inserire la lametta nel vibratomo e impostare i parametri di taglio appropriati del dispositivo: velocità = 3, frequenza = 9 e avanzamento = 250 μm. Utilizzare una pipetta di trasferimento acrilico (pipetta di vetro Pasteur rovesciata attaccata a una tettarella di silicone) per trasferire le fette nella camera di recupero (descritta al punto 2.1.3) durante la procedura di affettatura del tessuto. Attendere 60 minuti per il recupero dei tessuti dopo l'acquisizione della fetta.

3. Sigillatura delle celle per la registrazione

  1. Assicurarsi che tutte le apparecchiature (microscopio, amplificatore, digitalizzatore, micromanipolatore e altri) siano accese prima di iniziare la registrazione.
  2. Riempire la camera di registrazione, da un marchio commerciale (Table of Materials), attaccata al microscopio con la soluzione aCSF per le registrazioni. Utilizzare una pompa di perfusione per perfondere costantemente l'aCSF ad una velocità di 2 ml / min.
  3. Trasferire una fetta di cervello di interesse (una alla volta) nella camera di registrazione. Utilizzare una pipetta di trasferimento acrilico (pipetta di vetro Pasteur invertita attaccata a una tettarella di silicone) per trasferire le fette ipotalamiche nella camera. Utilizzate un ancoraggio di fetta (Table of Materials) per tenere la fetta in modo che non si muova durante la perfusione di aCSF.
  4. Posizionare una fetta al centro della camera di registrazione collegata al microscopio. La posizione della fetta è fondamentale per consentire una buona visione della regione desiderata al microscopio e per una perfetta portata della micropipetta di registrazione.
  5. Utilizzare la lente a bassa potenza di un microscopio ad immersione (10x o 20x) per aiutare a posizionare la fetta e localizzare la regione di interesse.
  6. Dopo aver individuato la regione di interesse, passare la lente dell'obiettivo alla lente ad alta potenza (63x) e concentrarsi sul livello del tessuto, osservando la proteina fluorescente endogena e le forme delle cellule nella regione target per localizzare le cellule kisspeptin sulla superficie della fetta cerebrale20.
  7. Quando viene individuata una possibile cella di destinazione, contrassegnarla sullo schermo del computer con il cursore del mouse o disegnando un formato, come un quadrato, sull'area di interesse. Il segno dello schermo del computer aiuta a guidare la posizione della micropipetta di registrazione verso la cella.
  8. Dopo aver determinato la posizione esatta della cella target, sollevare l'obiettivo e introdurre la micropipetta di registrazione riempita con la soluzione interna. Quando si posiziona la micropipetta nel supporto dell'elettrodo, assicurarsi che la soluzione interna sia a contatto con l'elettrodo d'argento.
    NOTA: Per la preparazione, il posizionamento e il posizionamento delle micropipette sul supporto dell'elettrodo, fare riferimento alpunto 33.
  9. Applicare una pressione positiva prima di immergere la micropipetta nella soluzione aCSF, per evitare che i detriti entrino nella micropipetta, utilizzando una siringa riempita d'aria da 1-3 ml collegata al supporto della micropipetta attraverso un tubo di polietilene (≈130 cm più lungo); applicare quasi 100-200 μL di aria.
  10. Utilizzando il micromanipolatore, guidare la micropipetta sotto il centro dell'obiettivo. Spostare i pulsanti sul micromanipolatore per guidare la micropipetta sull'asse X-Y-Z verso la cella di interesse.
  11. Regolare la messa a fuoco per vedere la punta della micropipetta e avvicinare la messa a fuoco, ma non troppo, alla fetta. Ridurre la velocità del micromanipolatore e abbassare lentamente la micropipetta sul piano di messa a fuoco. Assicurarsi che la punta della micropipetta non penetri bruscamente nella fetta, ma piuttosto scenda lentamente fino a toccare la superficie della cellula/regione target.
  12. Applicare una leggera pressione positiva (≈100 μL) con la siringa riempita d'aria da 1-3 mL attaccata al supporto della micropipetta per rimuovere eventuali detriti dal percorso di avvicinamento.
  13. Concentrarsi sulla cellula bersaglio e spostare lentamente il micromanipolatore sull'asse X-Y-Z per avvicinare la micropipetta alla cellula bersaglio. Quando si tocca la micropipetta alla cella, si osserva una fossetta causata dalla pressione applicata attraverso la punta della micropipetta (Figura 2C).
  14. Dopo aver formato la fossetta, a causa della vicinanza della micropipetta alla cellula, applicare una debole, breve aspirazione per bocca (1-2 s) attraverso il tubo collegato al supporto della micropipetta per generare la tenuta tra la micropipetta alla cellula (sigillo gigaohm o gigaseal >1 GΩ; Figura 2D). Per formare il sigillo, utilizzare la modalità tension-clamp sul software. Per i dettagli sulla formazione delle guarnizioni, fare riferimento alpunto 33.
  15. Se la tenuta rimane stabile (la guarnizione gigaohm deve essere meccanicamente stabile e senza interferenze di rumore, determinate dall'osservazione per circa 1 minuto), impostare la tensione di mantenimento al potenziale di riposo fisiologico più vicino della cella di interesse. Per i neuroni ipotalamici kisspeptina, si raccomanda -50 mV.
  16. Applicare una breve aspirazione per bocca (pressione negativa) con la micropipetta sigillata alla cellula per rompere la membrana plasmatica (Figura 2E). Un'adeguata configurazione dell'intera cellula si ottiene quando l'aspirazione viene eseguita con forza sufficiente in modo che la membrana rotta non ostruisca la micropipetta e non attragga una porzione considerevole della membrana o addirittura della cellula.
  17. Controllare il manuale delle impostazioni di sistema utilizzato. Utilizzare il software (vedere Tabella dei materiali) per controllare e calcolare digitalmente la resistenza in serie (SR) e la capacità dell'intera cella (wcc).
  18. In modalità tension-clamp , dopo aver rotto la membrana della cella, abilitare l'opzione dell'intera cella e fare clic sul comando Auto che fa riferimento all'intera scheda cella. L'SR e il wcc della cella verranno calcolati automaticamente e visualizzati istantaneamente dal software. Questi parametri possono anche essere verificati eseguendo il test della membrana con l'amplificatore menzionato nella Tabella dei Materiali33.
  19. Assicurati di controllare i parametri di vitalità cellulare. Per i neuroni kisspeptina, controllare che le misurazioni elettrofisiologiche siano: SR < 25 mΩ, resistenza di ingresso > 0,3 GΩ e mantenimento del valore assoluto < 30 pA (osservazioni personali e riferimento21). Il valore medio del wcc dei neuroni AVPV/PeN kisspeptin o ARHkisspeptin è ≈ 10-12 pF nei topi gonadi-intatti20.
  20. Monitorare l'SR e la capacità stazionaria della cella durante gli esperimenti. Assicurarsi che l'SR non cambi più del 20% durante una registrazione e che la capacità della membrana sia stabile.
  21. Controllare le impostazioni del software. Creare protocolli specifici per le registrazioni in base al tipo di esperimento. Per registrare il potenziale di membrana in modalità corrente-morsetto, con apparecchiature menzionate nella Tabella dei materiali, filtrare passa-basso i segnali elettrofisiologici a 2-4 kHz e analizzare i risultati offline in un software (vedere la Tabella dei materiali per informazioni sul software).
  22. Una volta ottenuta correttamente la configurazione dell'intera cella, misurare le correnti sinaptiche in modalità tension-clamp (Figura 2G). Registrare le variazioni del potenziale di membrana a riposo (RMP) e le variazioni RMP indotte nella modalità di morsetto di corrente (Figura 2H). Cambiamenti nella RMP, come la depolarizzazione della membrana cellulare, possono essere indotti somministrando un farmaco/neurotrasmettitore noto al bagno (descritto nella fase 3.2), come illustrato nella Figura 1.
    NOTA: In modalità corrente-morsetto, è possibile iniettare corrente positiva o negativa per mantenere la tensione della membrana alla tensione desiderata. Per i neuroni kisspeptina, di solito impostiamo l'iniezione di corrente zero (I = 0) per registrare la variazione spontanea del potenziale di membrana.

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Representative Results

Per studiare i possibili effetti dell'ormone della crescita umano ricombinante (hGH) sull'attività dei neuroni ipotalamici kisspeptina, abbiamo eseguito registrazioni patch-clamp di intere cellule in fette di cervello e valutato se questo ormone provoca cambiamenti acuti nell'attività dei neuroni AVPV / PeNkisspeptin e ARHkisspeptin. In questo studio sono stati utilizzati topi adulti Kiss1-Cre/GFP femmina (stadio di diestro) e topi maschi36. Per gli esperimenti sono stati selezionati animali gonadi-intatti, poiché le proprietà dei loro neuroni ipotalamici kisspeptin possono variare a seconda dei livelli di steroidi sessuali 19,20. Mentre era al di là dello scopo del presente studio valutare le differenze tra i sessi, rimandiamo il lettore a Croft et al. e Frazão et al.19,20 per ulteriori informazioni. Gli animali geneticamente modificati, come topi e ratti, rappresentano strumenti interessanti per questo tipo di esperimento, poiché le cellule che esprimono un gene specifico o un'ablazione indotta selettiva possono essere identificate da una proteina fluorescente come GFP, tra le altre23,26,36. L'uso di topi geneticamente modificati rappresenta una svolta nella comprensione dell'attività dei neuroni kisspeptina.

I neuroni registrati (26 cellule su 12 animali) sono stati determinati in base alle caratteristiche neuroanatomiche35 e all'espressione della GFP20 endogena. In modalità current-camp, i neuroni sono stati registrati sotto I = 0 nella configurazione patch-clamp a cellule intere. I neuroni AVPV/PeNKisspeptin (12 cellule di nove animali) hanno mostrato un RMP medio di -59,0 mV ± 3,0 mV (range: da -75 mV a -46 mV), resistenza di ingresso di 0,9 ± 0,1 GΩ, wcc di 12,3 pF ± 1,6 pF e SR di 19,4 ± 1,9 mΩ. Tra i neuroni registrati, tre su 12 cellule AVPV/PeN di Kisspeptin hanno mostrato scariche spontanee di potenziali d'azione (AP) a riposo (0,1 Hz ± 0,06 Hz; RMP medio delle cellule spontaneamente attive era -50,7 mV ± 2,7 mV). L'RMP medio dei neuroni ARHkisspeptin (14 cellule di 12 animali) era -50,0 mV ± 1,5 mV (intervallo: da -62 mV a -39 mV), la resistenza media di ingresso era 1,7 ± 0,1 GΩ, wcc era 9,2 pF ± 0,7 pF e SR di 16,9 ± 1,7 mΩ. La maggior parte dei neuroni ARHkisspeptina erano quiescenti, mentre quattro cellule su 14 mostravano AP spontanei a riposo (0,9 Hz ± 0,5 Hz; RMP medio delle cellule spontaneamente attive era -52,7 mV ± 1,4 mV).

La somministrazione di hGH (20 μg/g) al bagno ha indotto una significativa iperpolarizzazione della RMP di molti dei neuroni registrati, cinque dei 12 neuroni AVPV/PeN Kisspeptin (≈55% delle cellule di 9 topi) e nove su 14 neuroni ARH kisspeptin registrati (≈65% delle cellule di 12 topi, p = 0,0006, test esatto di Fisher; Figura 3). I neuroni iperpolarizzati AVPV/PeN kisspeptin e ARHkisspeptin hanno modificato significativamente la RMP rispetto alle cellule non responsibili (Figura 3B,E; Test di Mann-Whitney). Gli effetti sulla RMP (Figura 3C,F; misure ripetute ANOVA e post-test di Tukey) sono stati seguiti da una significativa riduzione della resistenza di ingresso dell'intera cella (IR) su AVPV/PeNKisspeptin (da 0,9 ± 0,1 GΩ a 0,7 ± 0,1 GΩ durante l'applicazione di hGH, p = 0,02; Figura 3D), e su ARHkisspeptin (da 1,7 ± 0,1 GΩ a 1,0 ± 0,1 GΩ durante l'applicazione di hGH, p < 0,0001; misure ripetute ANOVA e Tukey post-test; Figura 3G) Neuroni. Inoltre, la frequenza degli AP spontanei (fAP) dei neuroni iperpolarizzati hGH è diminuita in entrambe le popolazioni di cellule (0,1 Hz ± 0,06 Hz a 0,0 Hz ± 0,0 Hz in AVPV/PeN kisspeptin e 1,0 Hz ± 0,5 Hz a 0,2 Hz ± 0,1 Hz nei neuroni ARHkisspeptina). Tuttavia, l'entità di questa diminuzione non è riuscita a raggiungere un livello di significatività statistica (p > 0,05, test di Mann-Whitney). Dopo il washout dell'hGH, RMP e IR sono stati ripristinati al basale (Figura 3A,C,D,F,G). I restanti neuroni kisspeptina non rispondevano alla somministrazione di hGH.

Abbiamo precedentemente dimostrato che il pGH non induce effetti sull'attività ipotalamica dei neuroni kisspeptina (si veda Silveira et al.25; Figura 3H). Da notare, è noto che hGH può attivare i recettori della prolattina (PRL) oltre ai recettori GH37,38. Inoltre, PRL depolarizza indirettamente solo il ≈20% dei neuroni AVPV/PeNKisspeptin nei topi24. Al contrario, PRL non modula la trasmissione sinaptica veloce delle cellule ARHkisspeptin 24. Pertanto, l'effetto di iperpolarizzazione indotto da hGH riportato qui sembra essere non specifico. Le differenze osservate possono dipendere da variabili quali la concentrazione del farmaco, la differenza di specie (uomo vs. topo) o anche la presenza di sali nella composizione dei farmaci usati, come precedentemente riportato28.

Figure 1
Figura 1: Diagramma schematico che riassume il contributo della tecnica patch-clamp dell'intera cellula alla conoscenza dell'attività dei neuroni kisspeptina. I neuroni kisspeptina (mostrati in verde) si trovano nei nuclei periventricolari anteroventrali e periventricolari rostrali (AVPV/PeN) e nel nucleo arcuato dell'ipotalamo (ARH). Le cellule AVPV/PeN kisspeptin e ARHkisspeptin inviano connessioni dirette al soma dei neuroni dell'ormone di rilascio delle gonadotropine (GnRH) situati nell'area preottica (POA) e ai loro terminali all'eminenza mediana (ME), culminando nella modulazione dell'asse ipotalamo-ipofisi (HPG). Diversi neuromodulatori, come gli ormoni, hanno dimostrato di modulare in modo differenziale l'attività dei neuroni AVPV/PeNkisspeptin e ARHkisspeptin. I possibili effetti sul potenziale della membrana a riposo sono schematicamente dimostrati da tracciati rappresentativi ottenuti utilizzando la tecnica del path-clamp a tutta cellula e registrazioni di corrente-clamp. Il colore rosso indica che uno specifico neurotrasmettitore induce la depolarizzazione del potenziale di membrana a riposo (RMP)17,22,24,26,28,29,30,31,32; il colore blu indica nessun effetto su RMP 24,25,26,27,30. La linea tratteggiata indica l'RMP. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Passaggi fondamentali per ottenere la sigillatura della cella di interesse mediante la tecnica patch-clamp a tutta cella. (A,B) Fotomicrografie rappresentative di fette cerebrali (250 μm) contenenti cellule kisspeptina sul nucleo periventricolare anteroventrale (AVPV) e sul nucleo arcuato dell'ipotalamo (ARH). I neuroni kisspeptina sono stati identificati mediante espressione di proteine fluorescenti verdi (GFP). (C) Fotomicrografia che dimostra una micropipetta (contenente una soluzione elettrolitica [soluzione interna]) abbastanza vicina alla cellula da creare una fossetta nella membrana plasmatica per eseguire la tenuta. (D,E) È necessaria una leggera pressione negativa (aspirazione della bocca eseguita su un tubo collegato alla testa e alla micropipetta) per sigillare la membrana cellulare alla micropipetta (D). Una seconda applicazione di pressione negativa (lieve e breve) è necessaria per indurre la rottura della membrana plasmatica (E). (F) La registrazione dell'attività della cella viene eseguita da una configurazione meccanica utilizzata per esperimenti patch-clamp. Dopo aver rotto la membrana plasmatica, le correnti che fluiscono attraverso i canali ionici nella cella patchata possono essere registrate da un elettrodo collegato a un amplificatore altamente sensibile. Un resistore di retroazione genera la corrente necessaria per le registrazioni di tension-clamp (G) o current-clamp (H). Abbreviazioni: 3V = terzo ventricolo; ME = eminenza mediana. Barre della scala: A = 130 μm, B = 145 μm, C = 20 μm, D = 15 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Test della specificità del farmaco. (A) Registrazione rappresentativa del morsetto di corrente che dimostra che l'ormone della crescita ricombinante umano (hGH) ha indotto un'iperpolarizzazione del potenziale di membrana a riposo (RMP) dei neuroni kisspeptina situati nel nucleo arcuato dell'ipotalamo (ARHkisspeptin). (B-G) Grafici a barre che dimostrano la variazione media del potenziale di membrana a riposo (RMP) (B,C,E,F) e della resistenza media di ingresso (IR) (D,G) dei neuroni kisspeptina hGH-responsive situati nei nuclei periventricolari anteroventrali e periventricolari rostrali (AVPV/PeNKisspeptin) (B-D) o ARH (E-G). Registrazione rappresentativa del morsetto di corrente che dimostra che l'ormone della crescita suino (pGH) non ha indotto alcun effetto sulla RMP dei neuroni ARHkisspeptina, come precedentemente riportato25 (H). I test di significatività utilizzati sono il test di Mann-Whitney per (B) e (E), e le misure ripetute ANOVA e il post-test di Tukey per (C,D,F,G). La linea tratteggiata indica l'RMP. *p = 0,02; **p = 0,004,***p = 0,0003; p < 0,0001. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Soluzione interna (100 ml)
Sale FW (g/mol) Concentrazione Peso (g)
K-gluconato 234.2 120 mM 2.81
NaCl 58.4 1,0 mM 0.006
Kcl 74.5 10 mM 0.074
HEPES 238.3 10 mM 0.24
EGTA 380.3 5,0 mM 0.19
CaCl2 147.0 1,0 mM 0.015
MgCl2 203.0 1,0 mM 0.02
KOH 56.11 3,0 mM 0.017
ATP 507.18 4,0 mM 0.20
pH = 7,3 / osmolarità = 275 - 280 mOsm

Tabella 1: Reagenti per la preparazione della soluzione interna. La tabella contiene il peso molecolare (FW), le concentrazioni desiderate e il peso calcolato dei sali per la preparazione di 100 ml di soluzione.

aCSF/Slicing Solution (250 mL)
Sale FW Concentrazione Peso (g)
Saccarosio 342.3 238 mM 18.5
KCL 74.5 2,5 mM 0.046
NaHCO3 84.0 26 mM 0.546
NaH2PO4 120.0 1,0 mM 0.03
MgCl2 203.0 5 mM 0.254
D-glucosio 180.2 10 mM 0.450
CaCl2 147.0 1,0 mM 0.037
pH = 7,3 / osmolarità = 290 - 295 mOsm

Tabella 2: Reagenti per preparare la soluzione affettante. La tabella contiene il peso molecolare (FW), le concentrazioni desiderate e il peso calcolato dei sali per la preparazione di 250 ml di soluzione. Il cervello è immerso in questa soluzione per essere affettato.

aCSF per la registrazione (1 L)
Sale FW Concentrazione Peso (g)
NaCl 58.4 135 mM 7.88
KCL 74.5 3,5 mM 0.261
NaHCO3 84.0 26 mM 2,184
NaH2PO4 120.0 1,25 mM 0.150
MgSO4 246.5 1,2 mM 0.296
D-glucosio 180.2 10 mM 1,802
CaCl2 147.0 1,0 mM 0.148
pH = 7,3 / osmolarità = 290-300 mOsm

Tabella 3: Reagenti per preparare aCSF per le registrazioni. La tabella contiene il peso molecolare (FW), le concentrazioni desiderate e il peso calcolato dei sali per la preparazione di 1 L di soluzione.

Figura supplementare 1: Esempio di camera di recupero realizzata internamente. (A,B) Una camera di recupero interna può essere fabbricata come segue: tagliare una piastra da 24 pozzetti in modo che siano disponibili nove pozzi. Incollare uno schermo di nylon alla base dei nove pozzetti. Con il resto della piastra del pozzo, fare una base in modo che la parte inferiore del nylon sia libera. (C) Questa base adattata può essere collocata all'interno di un becher da 500 mL contenente liquido cerebrospinale artificiale (aCSF) costantemente saturo di carbogeno (95% O2 e 5% CO2). D) Il becher che contiene la camera di recupero sia tenuto a bagnomaria durante la sperimentazione. (E,F) Una pipetta di trasferimento acrilico viene utilizzata per trasferire le fette di cervello nella camera di recupero. Clicca qui per scaricare questo file.

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Discussion

Lo sviluppo della tecnica patch-clamp a cellule intere ha avuto un impatto significativo sulla comunità scientifica, essendo considerato di fondamentale importanza per lo sviluppo della ricerca scientifica e consentendo diverse scoperte. Il suo impatto sulla scienza è stato sufficiente per culminare nel premio Nobel per la medicina nel 1991, poiché questa scoperta ha aperto la porta a una migliore comprensione di come funzionano i canali ionici in condizioni fisiologiche e patologiche, nonché all'identificazione di potenziali bersagli per agenti terapeutici 11,39,40,41 . Nel campo della medicina, una delle scoperte eccezionali fatte usando questa tecnica è stata che diverse sostanze utilizzate clinicamente interagiscono direttamente con i canali ionici (ad esempio, anestetici locali, antiaritmici, antidiabetici e miorilassanti)42. Pertanto, la sua applicabilità è evidente negli istituti clinici e nei dipartimenti di ricerca di base. Questo articolo descrive il protocollo per la preparazione di base per eseguire esperimenti di patch-clamp a cellule intere su fette di cervello contenenti neuroni kisspeptin ipotalamici. Descriviamo i passaggi di base ed evidenziamo i parametri importanti che devono essere controllati per ottenere tessuto e preparare soluzioni per la tecnica patch-clamp. Tuttavia, questo articolo non può descrivere completamente la complessità di questa tecnica e i meccanismi coinvolti in ogni tipo di registrazione, in particolare l'analisi. Per un ulteriore apprendimento teorico, alcuni libri e recensioni sulla tecnica patch-clamp sono raccomandati 10,43,44,45,46.

Ogni soluzione utilizzata nel metodo patch-clamp ha uno scopo specifico; Pertanto, le sue composizioni e criteri specifici devono essere rigorosamente adottati durante la preparazione. Ad esempio, la composizione della soluzione interna dovrebbe essere determinata in base all'obiettivo dell'esperimento, poiché varia a seconda del tipo di corrente da misurare. La soluzione a base di cloruro qui menzionata, in cui Cl- (15 mM) imita la concentrazione fisiologica del citoplasma cellulare47, viene utilizzata per studiare le proprietà neuronali attive e passive o le risposte all'input sinaptico. È importante sottolineare che il contenuto di cloruro nella soluzione interna mantiene il potenziale di equilibrio del cloruro a livelli ottimali per la registrazione cellulare (nella soluzione menzionata ECL, è di circa -59 mV). La concentrazione intracellulare di cloruro può essere stimata valutando il potenziale di inversione per la corrente indotta da GABA (E GABA), assumendo che tutta la corrente attraverso il recettoreGABA A sia trasportata da Cl-21,48. Per lo studio dei neuroni ipotalamici kisspeptina, si deve considerare che la concentrazione intracellulare di Cl- per ARH kisspeptin è superiore a quella per le cellule AVPV/PeNKisspeptin 21. Questa caratteristica deve essere considerata quando si pianifica un esperimento. Si raccomanda che l'osmolarità della soluzione interna sia inferiore di almeno il 5% rispetto a quella dell'aCSF per le registrazioni per evitare la perdita del sigillo dovuta a possibili gonfiori e/o indebolimento cellulare33,47. Se è necessario aggiungere un composto intracellulare che può essere ulteriormente utilizzato come marcatore cellulare alla soluzione interna, come la biocitina o un colorante intracellulare (ad esempio, Alexa Fluor 594), i livelli di K + possono essere ridotti in modo che l'osmolarità possa essere costantemente mantenuta 20,47,49,50.

È fondamentale eseguire una rapida dissezione cerebrale e mantenere una bassa temperatura (0-2 °C) durante l'affettatura con una soluzione di affettatura appropriata. Le soluzioni di affettamento possono differire a seconda del tipo di cellula e/o regione cerebrale da valutare33,47. La soluzione aCSF utilizzata per ottenere le fette di cervello (cioè la soluzione di slicing) di solito ha una composizione diversa dall'aCSF per le registrazioni (per confronto, vedi Tabella 2 e Tabella 3). Le concentrazioni di cationi (Ca 2+ e Mg2+) possono essere regolate per modificare l'eccitabilità dei neuroni, che può anche influenzare la soglia di attivazione e il rilascio del neurotrasmettitore47. I mezzi a basso Ca 2+ e ad alto Mg2+ sono ampiamente utilizzati per ridurre al minimo i possibili processi eccitotossici (per ulteriori informazioni, vedere51). Inoltre, bassi media di Ca2+ e Mg2+ alti possono stimolare l'attività dei neuroni ipotalamici52. Per quanto riguarda l'aCSF per le registrazioni, alcune caratteristiche sono simili. Il sistema tampone è basato su NaHCO3, alte concentrazioni di NaCl (generalmente >100 mM) e basse concentrazioni di KCl (generalmente <5 mM), le concentrazioni relative di Ca 2+ e Mg2+ (2:1 è spesso usato) sono di solito intorno a 2 mM, e i livelli di glucosio possono variare da 1 a 10 mM47. Oltre alle variazioni dell'osmolarità, del pH o delle variazioni di temperatura delle soluzioni (controllate digitalmente tra 30-32 °C), è importante evidenziare che durante il protocollo sperimentale possono verificarsi altri problemi che interferiscono sostanzialmente con la sperimentazione. Le misurazioni elettrofisiologiche devono essere stabili durante le registrazioni e le eventuali variazioni devono avere una lettura critica. Ad esempio, i cambiamenti SR tengono conto dell'accesso cellulare in modalità a cellula intera e hanno conseguenze considerevoli sulle correnti e sui potenziali misurati. Inoltre, è importante sottolineare che una limitazione rilevante relativa alla metodologia patch-clamp che deve essere considerata è la sovrastimolazione meccanica della cellula mediante protocolli di aspirazione/pressione eccessivi che possono indurre cambiamenti morfologici e funzionali53. Questa distorsione è spesso difficile da controllare nei protocolli in cui l'aspirazione viene eseguita per via orale piuttosto che un dispositivo in grado di controllare con precisione l'intensità di aspirazione applicata. Inoltre, i problemi legati ai tessuti, che culminano con un'alta percentuale di mortalità cellulare, possono verificarsi a causa di dissezione inadeguata, ipossia o condizioni di salute del topo che un ricercatore non può identificare dall'osservazione.

Il principale vantaggio della tecnica patch-clamp a cellule intere è la capacità di registrare con precisione i neuroni in specifiche regioni cerebrali di interesse. Questa tecnica ha beneficiato enormemente della creazione di animali geneticamente modificati. Il nostro gruppo lavora tipicamente con un modello murino che esprime l'hrGFP sotto il promotore del gene Kiss1 o un altro che esprime Cre-ricombinasi sotto il promotore del gene Kiss1 e GFP sotto l'espressione Cre-condizionale. Tuttavia, ci sono molti modelli animali validati al giorno d'oggi23,26,36. Inoltre, l'assenza della barriera emato-encefalica e il fatto che l'ambiente extracellulare e intracellulare possa essere facilmente controllato e manipolato rappresenta vantaggi di questo metodo; Tuttavia, non rappresentano necessariamente una condizione fisiologica. Tra i limiti di questa tecnica rispetto ai preparati in vivo, o ad altri tipi di registrazione volti a preservare la concentrazione ionica citoplasmatica, come le registrazioni on-cell o perforated-patch, è importante ricordare che l'invasività della configurazione dell'intera cellula provoca la dialisi del contenuto citoplasmatico54. La dialisi può causare l'interruzione degli aspetti molecolari necessari affinché alcuni fenomeni si sviluppino o si esprimano. Registrando da fette, è necessario ricordare che la maggior parte delle proiezioni dei neuroni sono sezionate. Pertanto, è fuori dallo scopo della tecnica valutare quanto questa interruzione influenzi gli effetti osservati o una condizione fisiologica. Come accennato, fette di cervello coronale di 200-300 μm vengono solitamente eseguite per studiare l'attività dei neuroni ipotalamici kisspeptina 17,19,20,21,34. La limitazione dell'uso di una sezione di fetta di cervello più spessa per studiare le cellule di kisspeptin e diversi angoli di fetta mantenendo una specifica connettività AVPV / PeN o ARH55 richiede ulteriori indagini. Inoltre, testando l'effetto di un ormone/farmaco, sintetico o meno, sul RMP di un neurone, diversi studi si basano sul farmaco EC50 (se è noto) o su dati pubblicati che dimostrano che una concentrazione specifica è efficace nell'attivare la velocità di attivazione o modificare i livelli di [Ca2+]i. Tuttavia, si dovrebbe essere consapevoli della composizione/specificità del farmaco da utilizzare negli esperimenti, in quanto è possibile che le droghe sintetiche purificate, rispetto ad altre droghe simili, possano avere effetti antagonisti28. Come dimostrato in precedenza25, mentre il pGH purificato non induce alcun effetto sull'attività ipotalamica del neurone kisspeptina, l'hGH ha prodotto dati controversi (vedi Figura 3). Risultati simili sono stati dimostrati quando gli effetti dell'insulina sull'ARH sono stati valutati28. Pertanto, la specificità del farmaco dovrebbe essere considerata quando si pianifica un esperimento e si interpretano i risultati ottenuti.

La tecnica patch-clamp è uno strumento eccellente per ottenere dati sull'attività elettrica dei neuroni e ha contribuito in modo significativo alla conoscenza di diverse popolazioni neuronali, come i neuroni kisspeptina. La maggior parte dei dettagli forniti qui sono generalmente utilizzati per le registrazioni di neuroni ipotalamici, come abbiamo riportato in precedenza 25,50,56,57,58,59,60. È importante sottolineare che, per registrare altre popolazioni neuronali oltre ai neuroni kisspeptina, è necessario conoscere o determinare le misurazioni elettrofisiologiche che possono aiutare a identificare i tipi di cellule, come la capacità cellulare, SR, resistenza di ingresso, modello di attivazione cellulare e altri parametri. Queste proprietà variano tra diverse cellule cerebrali, nuclei cerebrali e condizioni fisiologiche o indotte, come i livelli di steroidi sessuali circolanti 16,19,20,21,61, che possono interferire sostanzialmente con l'analisi critica dei risultati. Inoltre, è necessario comprendere le possibili variabili coinvolte nella preparazione dei tessuti e i loro vantaggi e limiti associati per lavorare con questa tecnica. Tutti i passaggi qui descritti devono essere condotti con giudizio, poiché qualsiasi cambiamento nelle variabili coinvolte nel protocollo può interferire drasticamente con i risultati.

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Disclosures

Nessun conflitto di interessi da dichiarare.

Acknowledgments

Questo studio è stato sostenuto dalla Fondazione di ricerca di San Paolo [numeri di sovvenzione FAPESP: 2021/11551-4 (JNS), 2015/20198-5 (TTZ), 2019/21707/1 (RF); e dal Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) - Codice finanziario 001" (HRV).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Compounds for aCSF, internal and slicing solutions
ATP Sigma Aldrich/various A9187
CaCl2 Sigma Aldrich/various C7902
D-(+)-Glucose Sigma Aldrich/various G7021
EGTA Sigma Aldrich/various O3777
HEPES Sigma Aldrich/various H3375
KCL Sigma Aldrich/various P5405
K-gluconate Sigma Aldrich/various G4500
KOH Sigma Aldrich/various P5958
MgCl2 Sigma Aldrich/various M9272
MgSO4 Sigma Aldrich/various 230391
NaCl Sigma Aldrich/various S5886
NaH2PO4  Sigma Aldrich/various S5011
NaHCO3 Sigma Aldrich/various S5761
nitric acid Sigma Aldrich/various 225711 CAUTION
Sucrose Sigma Aldrich/various S1888
Equipments
Air table TMC 63-534
Amplifier Molecular Devices Multiclamp 700B
Computer various -
DIGIDATA 1440 LOW-NOISE DATA ACQUISITION SYSTEM Molecular Devices DD1440
Digital peristaltic pump Ismatec ISM833C 
Faraday cage TMC 81-333-03
Imaging Camera Leica DFC 365 FX
Micromanipulator Sutter Instruments Roe-200
Micropipette Puller Narishige PC-10
Microscope Leica DM6000 FS
Osteotome Bonther equipamentos & Tecnologia/various 128
Recovery chamber Warner Instruments/Harvard apparatus - can be made in-house
Recording chamber Warner Instruments 640277
Spatula Fisher Scientific /various FISH-14-375-10; FISH-21-401-20
Vibratome  Leica VT1000 S
Water Bath  Fisher Scientific /various Isotemp
Software and systems
AxoScope 10 software Molecular Devices - Commander Software
LAS X wide field system Leica - Image acquisition and analysis
MultiClamp 700B Molecular Devices MULTICLAMP 700B Commander Software
PCLAMP 10 SOFTWARE FOR WINDOWS Molecular Devices Pclamp 10 Standard
Tools
Ag/AgCl electrode, pellet, 1.0 mm Warner Instruments 64-1309
Curved hemostatic forcep various -
cyanoacrylate glue LOCTITE/various -
Decapitation scissors various -
Filter paper various -
Glass capillaries (micropipette) World Precision Instruments, Inc TW150F-4
Iris scissors Bonther equipamentos & Tecnologia/various 65-66
Pasteur glass pipette  Sigma Aldrich/various CLS7095B9-1000EA
Petri dish various -
Polyethylene tubing  Warner Instruments 64-0756
Razor blade for brain dissection TED PELLA TEDP-121-1
Razor blade for the vibratome TED PELLA TEDP-121-9
Scissors Bonther equipamentos & Tecnologia/various 71-72, 48,49; 
silicone teat various -
Slice Anchor  Warner Instruments 64-0246
Syringe filters Merck Millipore Ltda SLGVR13SL Millex-GV 0.22 μm
Tweezers Bonther equipamentos & Tecnologia/various 131, 1518

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Questo mese in JoVE Numero 193 Brain slice registrazioni current-clamp Kiss1 ipotalamo
Neuroni ipotalamici di kisspeptina come bersaglio per le registrazioni di patch-clamp a cellule intere
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Silva, J. d. N., Zampieri, T. T.,… More

Silva, J. d. N., Zampieri, T. T., Vieira, H. R., Frazao, R. Hypothalamic Kisspeptin Neurons as a Target for Whole-Cell Patch-Clamp Recordings. J. Vis. Exp. (193), e64989, doi:10.3791/64989 (2023).

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