Summary
نقدم طريقة للتحفيز الكيميائي والمتعدد الوسائط المرن وتسجيل النشاط العصبي المتزامن من العديد من ديدان Caenorhabditis elegans . تستخدم هذه الطريقة الموائع الدقيقة والأجهزة والبرامج مفتوحة المصدر وتحليل البيانات الآلي الخاضع للإشراف لتمكين قياس الظواهر العصبية مثل التكيف والتثبيط الزمني والحديث المتبادل للتحفيز.
Abstract
ساهمت مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا الفلورية بشكل كبير في فهمنا للديناميكيات العصبية من مستوى الخلايا العصبية الفردية إلى دوائر الدماغ بأكملها. ومع ذلك ، قد تختلف الاستجابات العصبية بسبب الخبرة السابقة أو الحالات الداخلية أو العوامل العشوائية ، مما يولد الحاجة إلى طرق يمكنها تقييم الوظيفة العصبية عبر العديد من الأفراد في وقت واحد. في حين أن معظم تقنيات التسجيل تفحص حيوانا واحدا في كل مرة ، فإننا نصف استخدام الفحص المجهري واسع المجال لتوسيع نطاق التسجيلات العصبية إلى العشرات من Caenorhabditis elegans أو غيرها من الكائنات الحية دون المليمترية في وقت واحد. تتيح الأجهزة والبرامج مفتوحة المصدر مرونة كبيرة في برمجة التجارب المؤتمتة بالكامل التي تتحكم في شدة وتوقيت أنواع التحفيز المختلفة ، بما في ذلك المحفزات الكيميائية والبصرية والميكانيكية والحرارية والكهرومغناطيسية. على وجه الخصوص ، توفر أجهزة تدفق الموائع الدقيقة تحكما دقيقا ومتكررا وكميا في المنبهات الحسية الكيميائية بدقة زمنية دون الثانية. ثم يستخرج خط أنابيب تحليل البيانات شبه الآلي NeuroTracker الاستجابات العصبية الفردية وعلى مستوى السكان للكشف عن التغييرات الوظيفية في الإثارة والديناميكيات العصبية. تقدم هذه الورقة أمثلة على قياس التكيف العصبي ، والتثبيط الزمني ، والحديث المتبادل للتحفيز. تزيد هذه التقنيات من دقة التحفيز وتكراره ، وتسمح باستكشاف التباين السكاني ، ويمكن تعميمها على إشارات الفلورسنت الديناميكية الأخرى في الأنظمة الحيوية الصغيرة من الخلايا والكائنات العضوية إلى الكائنات الحية والنباتات بأكملها.
Introduction
سمحت تقنيات تصوير الكالسيوم بالتسجيل غير الباضع للديناميكيات العصبية في الجسم الحي في الوقت الفعلي باستخدام الفحص المجهري الفلوري ومؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا المعبر عنها في الخلايا المستهدفة1،2،3. تستخدم هذه المستشعرات عادة بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) ، مثل عائلة الببتيد GFP-calmodulin-M13 (GCaMP) ، لزيادة شدة التألق عند تنشيط الخلايا العصبية وارتفاع مستويات الكالسيوم داخل الخلايا. كان تصوير الكالسيوم قويا بشكل خاص في الديدان الخيطية C. elegans لفحص كيفية عمل الخلايا العصبية والدوائر العصبية في الحيوانات الحية والتصرف4،5،6،7،8،9،10 ، لأن طبيعتها الشفافة تعني عدم الحاجة إلى عملية جراحية للوصول البصري ، وتستهدف محفزات الجينات الخاصة بالخلية التعبير إلى الخلايا محل الاهتمام. غالبا ما تستخدم هذه التقنيات أجهزة الموائع الدقيقة ، والتي توفر بيئات يتم التحكم فيها بدقة لدراسة الظواهر البيولوجية والكيميائية والفيزيائية على نطاق فيزيائي صغير11,12. تكثر أجهزة الموائع الدقيقة لقياس النشاط العصبي ، مع تصميمات جديدة قيد التطوير باستمرار ، ويتم تصنيعها بسهولة في مختبر الأبحاث. ومع ذلك ، فإن العديد من التصميمات تحبس حيوانا واحدا في كل مرة ، مما يحد من الإنتاجية التجريبية7،9،13. غالبا ما تختلف الاستجابات العصبية اختلافا كبيرا بين الحيوانات بسبب الاختلافات في الخبرة السابقة ، أو الحالات الداخلية مثل الإجهاد أو الجوع ، أو العوامل العشوائية مثل مستويات التعبير الجيني. هذه الاختلافات تحدد الحاجة إلى طرق يمكن أن تحفز وتراقب في وقت واحد العديد من الحيوانات واستخراج المعلومات من الأفراد4.
بالإضافة إلى ذلك ، تصبح بعض الظواهر العصبية واضحة فقط في ظل ظروف تحفيز محددة ، مثل التثبيط الزمني14 ، والذي يشير إلى قمع قصير للاستجابات عندما يحدث التحفيز في تتابع سريع. يمكن للأنظمة الفيزيولوجية الكهربية أن تدفع النشاط العصبي عبر مساحة تحفيز واسعة لهذا الغرض ، حيث تعدل ، على سبيل المثال ، تيار النبض الكهربائي ، والجهد ، والتردد ، وشكل الموجة ، ودورة العمل ، وتوقيت قطارات التحفيز الدورية. سيستفيد التحفيز غير المباشر بواسطة المحفزات المكتشفة بشكل طبيعي أو الأنظمة البصرية الوراثية من اتساع مماثل لآليات التحكم. في الوقت الحالي ، يتم تقديم العديد من المحفزات الطبيعية بطريقة "تشغيل-إيقاف" بسيطة ، مثل عرض الرائحة وإزالتها ، باستخدام أنظمة تجارية كانت بطيئة في إضافة المرونة. ومع ذلك ، يمكن للمتحكمات الدقيقة غير المكلفة الآن أتمتة توصيل عدة أنواع من المحفزات بطريقة قابلة للتخصيص وفقا لاحتياجات الباحثين. بالاقتران مع الموائع الدقيقة ، حققت هذه الأنظمة هدف زيادة الإنتاجية التجريبية والمرونة ، مما يسمح بقياس الاستجابات العصبية لمجموعة متنوعة من المحفزات الدقيقة في وقت واحد في العديد من الحيوانات 4,6. يمكن استخدام التحفيز متعدد الوسائط لمزيد من استجواب الدوائر العصبية ، مثل مراقبة التغيرات في استثارة الأعصاب عند التحفيز المستمر قبل وأثناء وبعد الاضطراب المتعامد مثل التعرض للأدوية4. إن فوائد أنظمة الفحص المجهري المفتوحة وغير المكلفة واضحة للنهوض بالبحث العلمي ، ولكن من الناحية العملية ، يمكن أن تعيق الحاجة إلى مصادر الأجزاء والبناء والتحقق من الأداء اعتماد هذه التقنيات.
يهدف هذا البروتوكول إلى التخفيف من بعض هذه التحديات التقنية. في حين ركزت البروتوكولات السابقة على استخدام جهاز الموائع الدقيقة والتحفيز الأساسي9،15،17 ، فإننا نصف هنا بناء واستخدام نظام توصيل تحفيز مرن وآلي ومتعدد الوسائط للتصوير العصبي في C. elegans أو الكائنات الصغيرة الأخرى باستخدام أجهزة الموائع الدقيقة الموصوفة سابقا4. تتم برمجة النظام مفتوح المصدر عبر ملفات نصية بسيطة لتحديد التجارب ، ويقوم برنامج تحليل البيانات NeuroTracker باستخراج بيانات النشاط العصبي بشكل شبه تلقائي من مقاطع الفيديو المجهرية. نوضح هذا النظام بأمثلة لتقييم التثبيط الزمني ، وإزالة التثبيط ، والحديث المتبادل للتحفيز باستخدام الخلايا العصبية الحسية الكيميائية AWA ، والتي تزيل الاستقطاب استجابة لروائح الطعام المختلفة أو استجابة للضوء عند التعبير عن القنوات الأيونية الحساسة للضوء البصري 5,6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. معدات التصوير العصبي
ملاحظة: انظر Lawler and Albrecht15 للحصول على تعليمات مفصلة حول بناء نظام التصوير والتحفيز ، الذي يتحكم في توقيت إضاءة المجهر ، والحصول على الصور ، وتسليم التحفيز (الشكل 1). تقوم وحدة التحكم في التحفيز Arduino Nano غير المكلفة بتشغيل الصمامات السائلة من خلال الإشارات الرقمية إلى وحدة التحكم في الصمام والتحكم في الإضاءة البصرية الجينية من خلال إشارات الجهد التناظرية إلى وحدة تحكم LED. يمكن التحكم في المحفزات الأخرى ، مثل محركات الاهتزاز والسخانات الحرارية ، باستخدام إشارات رقمية أو تناظرية. تقوم وحدة التحكم في التحفيز بمزامنة التحفيز وتسجيل الصور عبر إشارات الكاميرا ، كما هو محدد بواسطة برنامج التحكم في مجهر Micro-Manager مفتوح المصدر (μManager) 16. انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بجميع المواد والكواشف والمعدات والكائنات الحية المستخدمة في هذا البروتوكول.
- قم بإعداد معدات التصوير العصبي ، بما في ذلك مجهر التألق مع بصريات GFP ، وكاميرا sCMOS مع إشارة خرج التعرض الرقمية ، ووحدة تحكم التحفيز15.
- قم بتوصيل وحدة التحكم في التحفيز بالأنظمة المطلوبة عبر الإشارات الرقمية أو التناظرية. بالنسبة للأمثلة المعروضة أدناه ، يتم استخدام الأنظمة التالية:
- استخدم وحدة تحكم الصمام للتحفيز الكيميائي. قم بتوصيل وحدة التحكم في الصمام بالملف اللولبي السائل أو صمامات القرص (الشكل 1)15.
- استخدم مصباح LED أحمر 615 نانومتر ووحدة تحكم للتحفيز البصري الوراثي ، مثبتة فوق مرحلة المجهر.
- قم بإعداد الكمبيوتر باستخدام برنامج التحكم في المجهر ، وقم بإنشاء إعداد مسبق للتكوين مع إعدادات المعدات ، وتأكد من التشغيل السليم للتحكم في التحفيز15.
2. تصنيع جهاز الموائع الدقيقة
ملاحظة: انظر Lagoy et al.17 للحصول على معلومات مفصلة حول الحصول على القوالب الرئيسية أو تصنيعها وإنتاج واستخدام وتنظيف أجهزة الموائع الدقيقة. ويرد أدناه موجز لهذه الخطوات.
- الحصول على أو تصنيع قالب رئيسي باستخدام ملف تصميم الموائع الدقيقة المقدم (albrechtlab.github.io/microfluidics)17. بالنسبة للشباب البالغين C. elegans ، تأكد من أن ارتفاع القناة هو 55-70 ميكرومتر.
- اجمع بين قاعدة PDMS وعامل المعالجة بنسبة 10: 1 بالوزن واخلطها جيدا مع ماصات النقل.
- ديغا لمدة 30-60 دقيقة في مجفف فراغ حتى تختفي الفقاعات.
- ضع القالب الرئيسي في طبق بتري كبير (قطره 150 مم) ، واسكب PDMS المنزوع الغازات حتى عمق 4-5 مم (~ 100 جم). افحص وأزل أي غبار أو فقاعات باستخدام ماصة النقل.
- تخبز على حرارة 65 درجة مئوية على رف فرن مستو لمدة 3 ساعات حتى طوال الليل.
- بمجرد الشفاء ، استخدم مشرطا لقطع PDMS من القالب وشفرة حلاقة مستقيمة لفصل الأجهزة.
- قم بثقب فتحات المدخل والمخرج باستخدام لكمة جلدية 1 مم ، وقم بتنظيفها باستخدام dH 2 O ،والإيثانول ، ومرة أخرى باستخدام dH2O. جفف الجهاز في تيار هوائي (انظر الشكل 2A).
- نظف جانبي جهاز PDMS بشريط لاصق ، وقم بإزالة أي غبار أو حطام.
- قم بإعداد الشرائح الزجاجية لإكمال جهاز الموائع الدقيقة كما هو موضح17. قم بحفر فتحات مدخل في الشريحة العلوية باستخدام لقمة ماسية ، واجعل الشريحة السفلية كارهة للماء عن طريق التعرض لأبخرة TFOCS أو عن طريق تطبيق معالجة الزجاج المقاوم للماء (الشكل 2 ب).
- قم بتجميع شطيرة جهاز PDMS الزجاجية في مشبك (الشكل 2C).
3. إعداد الحيوان
- الحصول على أو إنشاء الحيوانات مع مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا المعبر عنها في الخلايا العصبية ذات الأهمية.
ملاحظة: على سبيل المثال، السطر NZ1091 (kyIs587 [gpa-6p::GCaMP2.2b; UNC-122p::d sRed]; kyIs5662 [odr-7p::Chrimson:SL2:mCherry; elt-2p :: mCherry]) يعبر GCaMP وقناة الكاتيون الحساسة للضوء الأحمر Chrimson في زوج الخلايا العصبية الحسية AWA6. يتم دمج كل من الجينات المحورة في الجينوم للتعبير المستقر في كل. - قبل يوم واحد من التجربة ، ضع ما لا يقل عن 20 مرحلة يرقية L4 C. elegans لكل تجربة على صفيحة أجار متوسطة نمو الديدان الخيطية (NGM) المصنفة بعشب OP50 E. coli. عند الحفاظ على درجة حرارة 20 درجة مئوية ، سيؤدي ذلك إلى مزامنة الحيوانات البرية في مرحلة الشباب في اليوم التالي.
ملاحظة: بالنسبة لجينات التحوير الصفيفية، اختر الحيوانات باستخدام مجسمة مضان لضمان التعبير الجيني المحورة في الحيوانات المختارة.
4. إعداد الحل
- قم بإعداد 1x S المخزن المؤقت القاعدي (100 mM NaCl و 0.05 M KPO4 ، pH 6.0) من محلول مخزون 10x.
- قم بإعداد مخزن مؤقت رباعي 1 مللي متر عن طريق تخفيف مخزون 1 متر في 1x S Basal. استخدم هذا المخزن المؤقت المشلول لإعداد جميع المحفزات. تستخدم التجربة عادة حوالي 150 mL.
- أضف 0.1-1 ميكروغرام / مل فلوريسئين إلى الخزانات العازلة "التحكم" لتصور التدفق.
- إنشاء حلول التحفيز عن طريق التخفيف التسلسلي إلى التركيز النهائي المطلوب. على سبيل المثال ، قم بإنشاء تخفيف 10−7 من جاذب ثنائي الأسيتيل عن طريق إنشاء مخزون 10−3 أولا.
ملاحظة: يمكن إضافة كمية صغيرة من الفلوريسئين (0.1-1 ميكروغرام / مل) إلى المحفز أو المحلول العازل للتحقق من توقيت التحفيز ، ولكن يجب أن يكون التركيز ضئيلا لتجنب القطع الأثرية في التألق العصبي.
5. إعداد جهاز الموائع الدقيقة
ملاحظة: انظر Reilly et al.9 للحصول على بروتوكول فيديو يوضح توليد الخزان وإعداد الجهاز وتحميل الحيوانات. انظر أيضا Lagoy et al.17 للحصول على بروتوكول مكتوب يتضمن العديد من النصائح المفيدة.
- تحضير ثلاثة أو أكثر من خزانات السوائل. لكل منها ، قم بتوصيل خزان حقنة سعة 30 مل أو 60 مل ، وحقنة تحضير سعة 3 مل ، وكعب إبرة بصمام Luer ثلاثي الاتجاهات (الشكل 2D). قم بتوصيل الإبرة بأنبوب التجويف الصغير المزود بأنبوب معدني في النهاية. قم بتسمية الخزانات ، وقم بتثبيتها على رف متصل بحامل حلقي ، واملأها بالمخزن المؤقت أو سوائل التحفيز المقابلة (الشكل 2E).
- قم بإزالة غاز جهاز الموائع الدقيقة المجمع في مجفف فراغ لمدة ~ 1 ساعة.
- املأ وإزالة فقاعات الهواء من أنبوب الخزان باستخدام حقنة التحضير. املأ أنبوب التدفق الخارجي بالمخزن المؤقت.
- قم بإزالة جهاز الموائع الدقيقة من الفراغ ، وأدخل أنبوب المخرج بسرعة وحقن السائل عبر الجهاز حتى تظهر قطرة من مدخل واحد.
- عند هذا المدخل ، استخدم وصلة "قطرة إلى إسقاط"17 لإدخال أنبوب مدخل السوائل المقابل (الشكل 2F). تأكد من وجود قطرات سائلة على كل من أنبوب المدخل وفتحة منفذ الجهاز لتجنب إدخال فقاعة.
- قم بحقن المزيد من السوائل من المخرج ، وقم بتوصيل أنبوب المدخل التالي ، وكرر ذلك حتى تمتلئ جميع المداخل. أدخل دبوس حظر صلبا في أي مداخل غير مستخدمة ومنفذ تحميل الدودة.
- ابدأ التدفق عن طريق فتح صمامات Luer للمدخل والمخرج. افحص الجهاز بحثا عن تسربات عند المداخل والقاعدة الزجاجية. افحص الجهاز بحثا عن أي فقاعات داخل قنوات التدفق أو المداخل باستخدام برنامج التقاط الصور المجهري في الوضع المباشر.
ملاحظة: في حالة وجود فقاعات ، انتظر حتى يتم امتصاصها في مادة PDMS.
6. تحميل الحيوانات
ملاحظة: انظر Lagoy et al.17.
- انقل الحيوانات البالغة الصغيرة إلى صفيحة أجار NGM غير مصنفة باستخدام "معول" ذو رأس سلكي.
- اغمر اللوحة بحوالي 5 مل من المخزن المؤقت القاعدي 1x S بحيث تسبح الحيوانات.
- ارسم الديدان في حقنة تحميل (حقنة 1 مل أو 3 مل مع أنبوب متصل تم ملؤه مسبقا ب 1x S Basal).
- باستخدام مجسم، حرك طرف الأنبوب أسفل سطح السائل بيد واحدة لكل مرغوب فيه، واسحبه إلى الأنبوب باستخدام المحقنة الموجودة في اليد الأخرى.
- ارسم الديدان فقط في الأنبوب ، وليس في المحقنة.
ملاحظة: يستوعب الأنبوب عادة حوالي 100 ميكرولتر فقط. يمكن طرد الحيوانات إلى منطقة محلية ثم سحبها مرة أخرى إلى الأنبوب بحجم صغير.
- أغلق خط المخرج ، وقم بإزالة دبوس تحميل الفيروس المتنقل ، وقم بتوصيل حقنة تحميل الفيروس المتنقل بالجهاز باستخدام اتصال قطرة إلى إسقاط.
- تدفق الحيوانات بلطف إلى الساحة ، وإنشاء تدفق عازلة ، والسماح لما يصل إلى 1 ساعة للشلل بواسطة tetramisole.
ملاحظة: خلال فترة التثبيت ، تأكد من دخول السائل العازل فقط إلى الساحة. يمكن إيقاف تشغيل خزانات التحفيز والتحكم خلال هذه الفترة ولكن فتحها والتحقق من التدفق الصحيح قبل إجراء تجارب التحفيز.
7. التحفيز الآلي والتسجيل العصبي
- قم بإنشاء ملف نصي لتعريف التحفيز يسمى "إعدادات الاستحواذ المعرفة من قبل المستخدم.txt" باستخدام محرر نصوص (على سبيل المثال ، المفكرة) يحتوي على إعدادات التحفيز للحصول على الصور تلقائيا (انظر الأمثلة في الشكل 3). تنقسم الإعدادات إلى قسمين:
- إعدادات اكتساب المجهر: حدد نوع التجربة (تحفيز واحد أو متعدد الأنماط) ، وتوقيت التعرض والإثارة ، ومدة التجربة وفواصل زمنية ، وحفظ الدليل.
- إعدادات التحفيز: تحديد معلمات التحكم في التحفيز. يحدد "أمر التحفيز" الإجراءات التي تحدث في إطارات فيديو معينة مع بناء الجملة <رمز الحرف >< رقم الإطار> ، حيث تكون رموز الحروف A = valve1 ، B = valve2 ، C = valve3 ، L = ضوء LED ؛ بالإضافة إلى ذلك ، الأحرف الكبيرة = تشغيل والأحرف الصغيرة = إيقاف. يتم ضبط شدة LED برمز الحرف "i" وقيمة من 0 (إيقاف) إلى 255 (أقصى سطوع).
ملاحظة: تحدد قيمة شدة LED من 0 إلى 255 الجهد التناظري الناتج من 0 فولت إلى 5 فولت. تحتوي وحدة التحكم الحالية المستخدمة هنا على مقياس كثافة خطي ، ويجب معايرة الآخرين باستخدام مقياس طاقة خفيف.- في تجربة التحفيز الأحادي باستخدام أمر تحفيز متكرر واحد فقط، استخدم التنسيق الوارد في الشكل 3 أ.
- لتجربة متعددة الأنماط مع أوامر تحفيز متعددة ، استخدم التنسيق في الشكل 3 ب. قم بتضمين "تسلسل نمطي" من الأرقام التي تمثل ترتيب أنماط التحفيز. لكل نمط ، أدخل أمر تحفيز في سطر منفصل.
ملاحظة: يمكن أن يكون التسلسل شبه العشوائي أو التسلسل m مفيدا للتحقيق في الاعتماد على تاريخ التحفيز.
- قم بتشغيل برنامج التحكم المجهري. تحقق من أن جميع مداخل السوائل مفتوحة ، وأن التدفق كما هو مطلوب داخل الساحة (انظر الشكل 2H) ، وأن الخلايا العصبية ذات الأهمية في بؤرة التركيز داخل النافذة الحية.
- أغلق النافذة الحية وقم بتشغيل البرنامج النصي "MultiPattern_RunScript.bsh" داخل البرنامج.
ملاحظة: من المفيد إجراء تجربة اختبار بدون للتحقق من التدفق والتحفيز المناسبين. يمكن أن يساعد استبدال تركيز فلوريسئين مختلف لكل سائل مثير في تصور وتوثيق أنماط التحفيز الجديدة. - بعد التجريب ، قم بتفكيك جهاز الموائع الدقيقة ، وشطف جميع الأسطح والأنابيب والخزانات بالماء.
ملاحظة: يمكن إعادة استخدام جميع المكونات عشرات المرات إذا تم الحفاظ عليها نظيفة. تأكد من الحفاظ على الخزانات والأنابيب وأجهزة الموائع الدقيقة رطبة أو جافة تماما في تيار هوائي لتجنب تبلور الملح ، والذي يمكن أن يسد ويصعب إزالته. يمكن الاحتفاظ بالأجهزة في الإيثانول للتعقيم ولكن يجب تجفيفها بالكامل قبل إعادة استخدامها (>1 ساعة عند 65 درجة مئوية) 17.
8. تحليل البيانات باستخدام NeuroTracker
ملاحظة: NeuroTracker4،18،19 هو مكون إضافي لبرنامج ImageJ / FIJI20 لتتبع شدة التألق للعديد من الخلايا العصبية والحيوانات ، حتى أثناء تحركها أثناء التجارب. يحفظ هذا المكون الإضافي البيانات كملفات نصية مع موضع كل خلية عصبية وشدة مضان مصححة في الخلفية (F). يتم تطبيع بيانات التألق إلى مضان خط الأساس (F 0) ، على سبيل المثال ، متوسط عدة ثوان قبل التحفيز ، مثل Δ F / F 0 = (F -F 0) / F 0 ، والتي يمكن حسابها في المتوسط عبر السكان.
- قم بتثبيت البرامج النصية NeuroTracker وفقا للتعليمات (github.com/albrechtLab/Neurotracker).
- قم بتشغيل NeuroTracker بالنقر فوق المكونات الإضافية | التتبع | نيوروتراكر.
- حدد المجلد الذي يحتوي على ملف. ملفات فيديو TIF المراد تتبعها ، وحدد الإعدادات المطلوبة.
ملاحظة: إذا كان سيتم تعقب مجموعة فرعية فقط من ملفات الفيديو، حدد النطاق العددي للملفات المراد تحليلها عند المطالبة. إعدادات التتبع الافتراضية مناسبة للحيوانات غير المتحركة بدقة 250 بكسل / مم. اضبط المعلمات بشكل متناسب مع درجات الدقة الأخرى. راجع دليل المستخدم19 للحصول على مزيد من المعلومات حول الإعدادات. - اضبط عتبة الشدة بحيث تكون الخلايا العصبية مرئية للاختيار (الشكل 4).
- افتح نوافذ التحكم في السطوع / التباين (B / C) وعتبة التحكم باستخدام الصورة | ضبط القائمة.
- في نافذة B / C ، اضبط منزلقات الحد الأدنى والحد الأقصى حتى يمكن تمييز الخلايا العصبية بوضوح (الشكل 4 أ).
- في نافذة العتبة ، تحقق من الخلفية الداكنة وعدم إعادة تعيين النطاق.
- حرك منزلق الإطار لمراقبة حركة الخلايا العصبية وتغيرات شدتها، مع ملاحظة أي يجب استبعادها من التتبع، مثل التداخل مع الحيوانات الأخرى.
- تحديد الخلايا العصبية للتتبع.
- لكل ، اضبط مستوى العتبة بحيث تكون منطقة العتبة الحمراء فوق الخلية العصبية مرئية في كل إطار قبل التحفيز وأثناءه وبعده.
- انقر على الخلية العصبية لتسجيل موقعها ومستوى العتبة.
- كرر تعديل العتبة واختيارها لكل وخلية عصبية لتتبعها. انظر الشكل 4C للحصول على مثال جيد لمستوى العتبة والشكل 4D و E للحصول على أمثلة فوق العتبة وتحت العتبة. يشار إلى الخلايا العصبية المحددة مسبقا بواسطة صندوق صغير.
- عند تحديد جميع الخلايا العصبية ، اضغط على مفتاح المسافة لبدء التتبع.
ملاحظة: للحصول على أمثلة إضافية على NeuroTracker ، راجع المراجع السابقة 4,19. - مراقبة عملية التتبع لكل ، وإجراء أي تصحيحات ضرورية.
- إذا توقف NeuroTracker مؤقتا ، فقد فقد الخلايا العصبية. أعد النقر على الخلية العصبية ، واضبط مستوى العتبة حسب الحاجة.
- إذا قفز مربع التكامل إلى آخر قريب أو بنية غير عصبية ، فاضغط على مفتاح المسافة للتوقف مؤقتا ، وحرك شريط التمرير مرة أخرى إلى الإطار الخاطئ الأول ، وأعد النقر فوق موقع الخلية العصبية الصحيح.
9. استكشاف البيانات والتصور
ملاحظة: يتم استخدام البرنامج النصي لتحليل MATLAB لمعالجة البيانات والتصور ولإنشاء ملفات PDF موجزة لكل تحليل.
- قم بتشغيل ملف "NeuroTrackerSummary_pdf.m" في MATLAB ، وحدد المجلد الذي يحتوي على ملفات نصية لبيانات NeuroTracker.
- انتظر حتى يتم إنتاج ملف PDF موجز ، مما يسمح بالتحقق من عملية التتبع (الشكل 5). يتم تحديد الحيوانات برقم (الشكل 5 أ) ، ويمكن عرض الاستجابات العصبية من كل والتجربة لتقييم تباين السكان (الشكل 5 ب).
- استخدم الوظيفة "databrowse.m" لاستكشاف البيانات العصبية ، على سبيل المثال ، التجميع حسب رقم التجربة (الشكل 5C) ، حسب رقم الحيوان (الشكل 5D) ، حسب نمط التحفيز ، أو حسب فئة أخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
نقدم العديد من الأمثلة على أنماط التحفيز التي تقيم الظواهر العصبية المختلفة ، بما في ذلك التثبيط الزمني والتكيف وإزالة التثبيط. التثبيط الزمني هو قمع مؤقت للاستجابة العصبية لعرض التحفيز الثاني الذي يحدث بعد وقت قصير من العرض الأولي14. لاختبار هذه الظاهرة ، في تجربة النبض المزدوج ، تم تقديم ثمانية أنماط تتكون من نبضتين رائحتين 1 ثانية مفصولة بفاصل يتراوح من 0 ثانية إلى 20 ثانية (الشكل 6 ب ؛ انظر الشكل 3 ب للحصول على ملف التحكم في التحفيز المقابل). تم إعداد الساحة بسائل تحفيز واحد (1.1 ميكرومتر ثنائي الأسيتيل) ، وعازل ، وأنبوب تدفق تحكم ، مع حظر منفذ المدخل غير المستخدم بدبوس صلب (الشكل 6 أ). عن طريق تشغيل الصمام 1 ، يدخل سائل التحكم إلى مدخل ctrl1 ، ويحول تيارات السوائل بحيث يدخل التحفيز إلى الساحة ؛ عند إيقاف تشغيل الصمام 1 ، يدخل سائل التحكم إلى مدخل ctrl2 ، ويتدفق المخزن المؤقت عبر الساحة (انظر الشكل 2G ، H). في حين أن نبضة الرائحة الأولى 1 ثانية أثارت حجم استجابة متساو في الخلايا العصبية AWA التي تكتشف ثنائي الأسيتيل ، اختلفت الاستجابات للنبضة الثانية مع فترة التحفيز (الشكل 6D). بالنسبة لفترات النبض التي تقل عن 10 ثوان ، كانت الاستجابة الثانية أضعف ، مما يدل على ظاهرة التثبيط الزمني. باستخدام هذا الإعداد التجريبي ، تم العثور على تعطيل مكون الداينين CHE-3 لمنع التثبيط الزمني ، مما يعني تورط النقل المحوري في هذه الظاهرة5.
التكيف هو الانخفاض التدريجي في الاستجابات العصبية للعروض المتكررة لنفس الحافز. يمكن أن تحدث هذه الظاهرة بسبب عمليات مختلفة ، مثل التثبيط النشط ، والذي يمكن عكسه بسرعة ، أو العمليات الأخرى البطيئة في الانعكاس. إحدى التجارب لتقييم الانعكاس السريع هي تجربة "الصيد" ، حيث يتم تكرار حافز واحد لتأسيس التكيف ، يليه حافز "منحرف" أو جديد ، ثم العودة إلى التحفيز الأصلي. لوحظ إزالة التثبيط إذا زادت الاستجابات العصبية بعد التحفيز الجديد "المثبط". يوضح الشكل 7 مثالا باستخدام اثنين من الروائح ، ثنائي الأسيتيل و 2-ميثيل بيرازين (2-MP) ، تم اكتشافهما بواسطة الخلايا العصبية الحسية الكيميائية AWA عبر مستقبلات مختلفة4. تم توصيل خزانين وأنابيب تحفيز بجهاز الموائع الدقيقة ، مع صمام قرصة إضافي ثلاثي الاتجاهات لتحديد التحفيز الذي يدخل الساحة (الشكل 7 أ). تم تحديد أنماط التحفيز لتقديم نبضات كيميائية لمدة 4 ثوان عبر الصمام 1 لجميع التجارب الثلاثين والاختيار بين التحفيز S1 أو S2 عبر الصمام 3 ، والذي تم تشغيله بعد التجربة 25 وإيقافه بعد 26 (الشكل 7B). ضمن هذا الترتيب وقتا كافيا لتدفق سوائل التحفيز المختلفة عبر جهاز الموائع الدقيقة قبل تقديمها للحيوانات. لوحظ التكيف مع محفز ثنائي الأسيتيل ، لكن عرض التحفيز الجديد 2-MP لم يثر تأثيرا قويا لإزالة التثبيط (الشكل 7C).
يستخدم التحفيز البصري الوراثي الضوء لتنشيط الخلايا العصبية عبر القنوات الأيونية الحساسة للضوء. في حين أن التنشيط البصري الوراثي مناسب للاستخدام ، إلا أنه يتجاوز المستقبلات الحسية وبعض المسارات التنظيمية ، لذلك قد تختلف بعض الظواهر العصبية مقارنة بالتنشيط بواسطة المحفزات الطبيعية. لاختبار هذه الاختلافات ، تعد التجارب متعددة الوسائط مفيدة لتقديم أنواع مختلفة من التحفيز في تجربة واحدة. يتم تنشيط الخلايا العصبية التي تعبر عن قناة رودوبسين البديل Chrimson عن طريق التعرض للضوء الأحمر5. لتقييم ما إذا كانت الخلايا العصبية AWA تتكيف بشكل مشابه مع التحفيز الكيميائي والبصري الوراثي ، تم الحفاظ على سلالة NZ1091 التي تعبر عن كل من Chrimson و GCaMP في الخلايا العصبية AWA على لوحة تحتوي على العامل المساعد بالكامل عبر الشبكية (ATR ، 100 μM) لمدة 14-28 ساعة. أضاء مصباح LED أحمر 615 نانومتر ساحة الموائع الدقيقة من الأعلى (الشكل 8 أ) ، وتم إنشاء مجموعة من أنماط التحفيز متعددة الوسائط من خلال توفير نبضات 5 ثوان من ثنائي الأسيتيل أو الضوء الأحمر أو كليهما في نفس التجربة (الشكل 8 ب). تسبب التحفيز الكيميائي وحده في التكيف ، في حين أن التحفيز البصري وحده لم يفعل ذلك (الشكل 8C). ومع ذلك ، أظهر نمط التحفيز متعدد الوسائط المشترك أن الاستجابات البصرية الجينية كانت عرضة للتكيف المستحث كيميائيا (الشكل 8C ، D). تشير هذه التجارب إلى أن التكيف يبدأ في المستقبلات الحسية أو العمليات المتغصنة ، لكن آثاره تنتشر في جميع أنحاء الخلايا العصبية.
الشكل 1: رسم تخطيطي لمعدات تسجيل الكالسيوم العصبي وتحفيزه. يتم التحكم في التقاط صورة المجهر وضوء الإثارة الفلورية والتحفيز بواسطة جهاز كمبيوتر ومتحكم Arduino مفتوح المصدر. يتحول التحفيز الكيميائي في ساحة الموائع الدقيقة بين المخزن المؤقت B ومحاليل التحفيز S عبر التحكم في تدفق السوائل C. يشار إلى عناصر النظام الاختيارية بعلامة النجمة (*) ، مثل الصمامات الإضافية وطرق التحفيز البصرية أو غيرها. تستخدم صور المجهر الفلوري لقياس النشاط العصبي عبر عابرات الكالسيوم ، على سبيل المثال ، باستخدام مؤشر الكالسيوم GCaMP. تمثل الخطوط المتقطعة التوصيلات الكهربائية (الرقمية أو التناظرية) ، والخطوط المنحنية هي الأنابيب السائلة ، والأسهم الصلبة المستقيمة هي مسارات الضوء البصري. اختصار: LED = الصمام الثنائي الباعث للضوء. تم تعديل هذا الرقم من لولر وألبريشت15. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تجميع وإعداد جهاز الموائع الدقيقة. يتكون جهاز الموائع الدقيقة من جهاز PDMS (A) دقيق النمط محصور بين سطح زجاجي محفور (B) وقاعدة زجاجية كارهة للماء و (C) مثبت. (د) توضع الخزانات فوق الجهاز بحامل رف أنابيب (E). يتم توصيل الأنبوب من الخزانات إما مباشرة بالجهاز أو من خلال صمامات تعمل للتحكم في السوائل. يتم وضع الجهاز فوق الهدف على المجهر. (F) صورة مقربة لجهاز الموائع الدقيقة مع جميع الأنابيب المرفقة في المداخل ومنفذ تحميل الدودة والمخرج. (ز) رسم تخطيطي لجهاز الموائع الدقيقة 20 مم × 20 مم. تمثل الخطوط السوداء قنوات السوائل التي يبلغ طولها 55-70 ميكرومتر. تم تصميم هذه الهندسة للسماح بالتحكم الدقيق في الزمان المكاني مع محفز أمامي عمودي على التدفق مع الحفاظ على الحيوانات داخل الساحة ومجال رؤية المجهر. يتدفق تيار المخزن المؤقت وتيار تحفيز واحد (أو اختياريا Stim2 ، إذا تم استخدامه) بشكل مستمر ، بينما يتدفق مدخل سائل تحكم واحد فقط في كل مرة ، مما يؤدي إلى تغيير السائل الذي يدخل الساحة. (H) عندما يتم تنشيط الصمام 1 ، يتدفق سائل التحكم من المنفذ المغلق عادة إلى مدخل التحكم 1 ، ويتم تشغيل التحفيز ويتدفق عبر الساحة. عند إيقاف تشغيل الصمام 1 ، يتدفق السائل من المنفذ المفتوح عادة إلى مدخل التحكم 2 ، ويدخل المخزن المؤقت إلى الساحة. يظهر توازن التدفق المناسب ، مع استخدام صبغة الفلوريسئين كسائل تحفيز. لاحظ أن بعض السوائل التي تدخل الساحة تتجاوزها أيضا عبر القنوات المنحنية العلوية والسفلية. يجب أن تكون هذه التدفقات ضيقة ولها عرض متساو في القنوات العلوية والسفلية. يمكن تعديل ارتفاعات الخزان حسب الحاجة. الاختصارات: PDMS = بوليديميثيل سيلوكسان. WL = تحميل الدودة ؛ بوف = المخزن المؤقت ؛ Stim1 = التحفيز الأول ؛ Stim2 = التحفيز الثاني ؛ NC = مغلق عادة ؛ لا = مفتوح عادة. تم تعديل هذا الرقم من لولر وألبريشت15. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: مثال على ملفات تعريف المثيرات. (أ) مثال على تجربة التحفيز المتكرر المفرد: نبضة ضوئية مقدارها 5 ثوان عند شدتها 200 من 2 ث إلى 7 ث (الإطار من 20 إلى 70). (ب) مثال على تجربة مثيرة متعددة الأنماط مع ثمانية أنماط تحفيز مختلفة، تقابل الشكل 6. يتم تقديم نبضتين كيميائيتين 1 s بفاصل زمني من 0 s إلى 20 s بينهما. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: اختيار الخلايا العصبية ومستويات العتبة في NeuroTracker . (أ) مجال رؤية مجهري كامل ، مع ضبط السطوع والتباين لرؤية الخلايا العصبية AWA بوضوح. (ب) منظر مكبرة لمنطقة رأس تصور مربع التكامل الذي تحسب منه شدة التألق وحلقة الخلفية لطرح الخلفية. (ج) مخطط الشدة المتكامل الذي يوضح استجابة عصبية قوية. (د) سيؤدي تحديد العتبة الجيد إلى منطقة عتبة حمراء أعلى من معلمة الحد الأدنى للحجم وأقل من معلمة الحجم الأقصى لكل إطار في مكدس الصور ولا تتضمن مناطق قريبة ، مثل التألق الذاتي للأمعاء (انظر اللوحة ب). (ه) قد تبدو العتبة المحددة بدرجة عالية جدا جيدة عندما تكون الخلية العصبية نشطة، ولكن عندما تكون غير نشطة، قد تفقد الخلية العصبية. لذلك ، من المهم التحقق من كل من إطارات ما قبل التحفيز وما بعد التحفيز عند اختيار العتبة. (F) قد تبرز العتبة المنخفضة جدا الهياكل غير العصبية الأخرى. يمكن أن يؤدي الاختيار الزائد عن العتبة أو تحت العتبة إلى فقدان NeuroTracker للخلية العصبية والتوقف مؤقتا للحصول على تعليقات المستخدم لتصحيح العتبة وموضع الخلايا العصبية. الاختصار: B&C = السطوع والتباين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: مثال على تحليل البيانات. الاستجابات العصبية ل 15 حيوانا تعرضت ل 10 تكرارات من التحفيز البصري الوراثي لمدة 5 ثوان مرة واحدة في الدقيقة. (أ) صورة موجزة تشير إلى الحيوانات التي تم تتبعها وحركة الخلايا العصبية داخل التجربة (المربعات الحمراء). انتقل الحيوان 2 أثناء المحاكمة. (ب) تظهر استجابات الحيوانات الفردية بمرور الوقت استجابة متسقة نسبيا لتحفيز الضوء الأحمر. (ج) ناتج استكشاف البيانات باستخدام وظيفة تصفح البيانات . يتم تجميع عمليات التتبع حسب تكرار التجربة (أعلاه)، وتظهر المتوسطات أدناه للتجارب التي يمكن للمستخدم تحديدها. (د) البيانات مجمعة حسب عدد الحيوانات الفردية ومتوسطها عبر التجارب المتكررة. تظهر مجموعة البيانات هذه الحد الأدنى من التباين بين الحيوانات ، مما يبرر متوسط الاستجابات عبر السكان. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: تجربة النبضة المزدوجة مع فترة تحفيز متغيرة لتقييم التثبيط الزمني . (أ) وصلات مدخل جهاز الموائع الدقيقة. يتم حظر المدخل غير المستخدم بدبوس صلب (X). يتم توصيل خزان سائل التحكم والصمام 1 بمداخل c1 و c2 ، مع حذفهما هنا من أجل الوضوح. ب: توقيت المثير لثمانية أنماط. مدة النبضات 1 ثانية وتفصل بينها 0-20 ثانية. تسلسل الأنماط موضح أدناه ؛ تم تقديم كل نمط ست أو سبع مرات. (ج) النشاط العصبي AWA من 50 تجربة وتسعة. تظهر أعلاه خريطة حرارية للاستجابات مرتبة حسب نمط التحفيز ؛ يظهر أدناه متوسط النشاط العصبي لكل نمط (n = 56-63 استجابة). يحدث تثبيط الصدغي لمدة ~ 10 ثوان بعد النبض الأولي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: تجربة التقاط لتقييم إزالة التثبيط . (أ) وصلات مدخل جهاز الموائع الدقيقة. يسمح صمام الضغط ثلاثي الاتجاهات فقط للتحفيز S1 بالمرور أثناء الراحة و S2 فقط بالمرور عند تنشيطه. (ب) رسم تخطيطي لتسلسلات الأنماط الثلاثة المستخدمة لتوصيل نبضات رائحة ثنائي الأسيتيل المتكررة ، مع تقديم التحفيز الجديد 2-ميثيل بيرازين في مكانه في التجربة 26. (ج) متوسط استجابات النشاط العصبي AWA عبر 20 حيوانا. الاختصارات: DA = ثنائي الأسيتيل ؛ 2-ميجابكسل = 2-ميثيل بيرازين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 8: مثال على التحفيز متعدد الوسائط . (أ) وصلات مدخل جهاز الموائع الدقيقة ، مع مدخل غير مستخدم مسدود بدبوس صلب. يضيء مؤشر LED أحمر الساحة من الأعلى. (ب) أنماط التحفيز البصري أو الكيميائي أو متعدد الوسائط. (ج) متوسط النشاط العصبي AWA (ن = 11 حيوانا) ل 30 تجربة متكررة مع تحفيز بصري وراثي وكيميائي مقترن (أعلى) ، وعلم البصريات الوراثي فقط (وسط) ، وتحفيز حسي كيميائي فقط (أسفل). (د) متوسط ذروة الاستجابة العصبية لكل تجربة للنبضات البصرية الجينية أعلاه والنبضات الكيميائية أدناه. لا تسبب النبضات البصرية الوراثية التكيف بشكل مباشر ، لكن استجاباتها عرضة للتكيف الحسي الكيميائي. الاختصارات: DA = ثنائي الأسيتيل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذا البروتوكول ، نصف نظام الفحص المجهري المفتوح الوصول لتقييم ظواهر النشاط العصبي باستخدام التسليم الدقيق زمنيا لأنماط التحفيز المختلفة. توفر منصة الموائع الدقيقة محفزات قابلة للتكرار مع إبقاء عشرات الحيوانات في مجال رؤية المجهر. يسمح عدد قليل من حزم برامج الفحص المجهري التجاري بالبرمجة السهلة لأنماط توقيت التحفيز المختلفة ، وتلك التي تتطلب غالبا الإدخال اليدوي لكل نمط أو تنسيقات ملفات خاصة. في المقابل ، يتم تعريف التجارب في هذا النظام من خلال الملفات النصية ، والتي يمكن إنشاؤها بواسطة الكمبيوتر ويمكن قراءتها بواسطة برامج التحليل. هنا ، نوضح فائدة استخدام أنماط التحفيز المتغيرة لتقييم الظواهر العصبية مثل التثبيط الزمني والتكيف والحديث المتبادل أثناء التحفيز متعدد الوسائط. يقلل خط أنابيب تحليل البيانات من ملفات الفيديو المجهرية الكبيرة إلى بيانات النشاط العصبي التي يمكن تصورها وتحليلها لتقلب السكان (الشكل 5B) ، والتغيرات بمرور الوقت (الشكل 7C والشكل8C ، D) ، والتغيرات بعد الاضطراب (الشكل 7C).
تتمثل إحدى الفوائد الرئيسية للأتمتة في قابلية استنساخ التحفيز عبر تكرار التجارب وبين التجارب ، ويسمح تنسيق ساحة الموائع الدقيقة بزيادة الإنتاجية بمقدار 20 ضعفا على الأقل مقارنة بالطرق السابقة للحيوانالواحد 7،9،13. إن إخضاع مجموعة من الحيوانات لنفس الحافز والظروف البيئية يضمن أن تكون البيانات قابلة للمقارنة ويتجنب الاختلافات اليومية المحتملة في تحضير المحلول أو درجة الحرارة أو المصادر الحيوانية أو عوامل أخرى. ومع ذلك ، فإن أحد قيود هذا النهج هو الفحص المجهري منخفض التكبير ومنخفض الدقة الذي يبقي جميع الحيوانات في مجال الرؤية. يجب مراقبة خلية عصبية واحدة فقط لكل لتقليل أخطاء التتبع ، على الرغم من أنه يمكن تمييز الخلايا العصبية المفصولة بما لا يقل عن 50 ميكرومتر ، من حيث المبدأ. يمكن تصوير أزواج الخلايا العصبية الثنائية معا إذا كان من المتوقع أن تكون الاستجابات متماثلة. من المهم أولا تحديد الخلايا العصبية المحددة التي تشارك في عملية عصبية ذات أهمية ، مثل تصوير الدماغبالكامل 7 ، ثم التعبير عن GCaMP فقط في الخلايا العصبية ذات الصلة لزيادة الإنتاجية.
تختلف استجابات الكالسيوم العصبية حسب الحيوان بسبب مستويات تعبير المراسل أو الاختلافات الأخرى بين الأفراد. على سبيل المثال ، تختلف استجابات AWA GCaMP الطبيعية مرتين في حجم الذروة ، حتى في الحيوانات البرية من النوع المتماثل المنشأ مع دمج مراسل الكالسيوم بثبات في الجينوم4. تظهر بعض المحفزات استجابات متغيرة عبر السكان (على سبيل المثال ، أسيتات البوتيل4) ، مما يشير إلى تعبير مستقبلات متغير. في الممارسة العملية ، يجب تقييم ما لا يقل عن 20 حيوانا فرديا لتحديد تقلب السكان. يوصى باستخدام البيانات الحيوانية الفردية لزيادة القوة الإحصائية في تحديد تغييرات الاستجابة ، مثل المقارنة الإحصائية للاستجابات العصبية الفردية المقترنة قبل وبعد الاضطراب.
مع مجموعات البيانات الكبيرة والتجارب الآلية ، من المهم التحقق من صحة وظيفة التجربة المناسبة والتتبع وتقليل البيانات والتحقق منها ، خاصة بالنسبة للخطوات غير المراقبة. يجب التحقق من أنماط التدفق باستخدام محاليل الفلورسنت (كما في الشكل 2H) من خلال ملاحظة عدم دخول أي فقاعات أو سائل تحكم إلى الساحة في مقاطع الفيديو المسجلة. يجب التحقق من صحة مجموعات البيانات ، على سبيل المثال ، من خلال ملاحظة أي حركة حيوانية (كما في الشكل 5 أ) والتحقق من الاستجابات العصبية السلسة (كما في الشكل 4 ج والشكل 5 ب). يجب استبعاد أي بيانات إشكالية. من المهم أيضا التحقق من تجميع البيانات قبل حساب المتوسط باستخدام وظيفة "تصفح البيانات" للتأكد من أن متوسط الاستجابة يعكس الاستجابات الفردية.
يمكن تمديد نظام التحكم في التحفيز مفتوح المصدر بسهولة إلى محفزات أخرى عبر الإشارات الرقمية أو التناظرية أو أوامر الاتصال التسلسلي. عادة ما يمكن التحكم في المحفزات المتدرجة عن طريق مدخلات الجهد التناظري (0-5 فولت) ، مثل شدة ضوء LED أو حجم نبض محفز الأعصاب. عادة ما يتم التحكم في محفزات التشغيل والإيقاف باستخدام إشارات رقمية (TTL) ، مثل توقيت المحفز الكهربائي. يمكن لهذه الإشارات الرقمية أيضا تشغيل مفاتيح الترحيل لتنشيط الأنظمة الكهربائية الأخرى ، مثل محركات الاهتزاز للتحفيز الحسي الميكانيكي. تستخدم المعدات الأخرى الاتصال التسلسلي ، مثل اتصال USB ، مع إرسال أوامر أحرف محددة لتحديد الإجراءات. على سبيل المثال ، يمكن أن تقدم تجارب الاستجابة للجرعة عدة تركيزات كيميائية تلقائياباستخدام صمام دوراني 5 يتم التحكم فيه بواسطة USB أو نظام لوحة متعددة الآبار6. يمكن إضافة هذه الأوامر إلى البرامج النصية للتحكم في المجهر مفتوح المصدر لإرسالها بأرقام تجريبية محددة. ويمكن إدراج التأخيرات الزمنية بالمثل؛ على سبيل المثال ، لإيقاف الاختبار مؤقتا لمدة 1 ساعة بين نوبتي تحفيز تجريبيتين 30 ، يمكن للمرء تحديد تجربة تجريبية 60 وإضافة سطر واحد من التعليمات البرمجية للتوقف مؤقتا لمدة 1 ساعة عندما يصل رقم التجربة إلى 31.
التعقيد التجريبي لا حدود له تقريبا ويمكن أن يتغير حتى أثناء التجربة بناء على ردود الفعل الحية في نظام "الحلقة المغلقة". على سبيل المثال ، يمكن أن يختلف التحفيز في الوقت الفعلي بناء على النشاط العصبي أو سلوك الحيوان أو معلمة أخرى قابلة للقياس الكمي. استخدمنا مؤخرا مثل هذا النظام لتقييم الاستجابات العصبية الحسية في الحيوانات النائمة مقابل الحيوانات المستيقظة عن طريق تحفيز التحفيز والتسجيل العصبي بعد تغيير السلوك 8,15. تتيح ميزة تتبع الحركة في NeuroTracker تحليل النشاط العصبي في الحيوانات التي تتحرك بحرية لارتباطها بالإنتاج السلوكي. ومع ذلك ، فإن تتبع الحيوانات المتحركة الفردية يتطلب اهتماما وثيقا ، كما هو الحال عندما تتقاطع المسارات ، وبالتالي يوصى بتحميل عدد أقل من الحيوانات لكل ساحة (حوالي خمسة) لتقليل هذه التفاعلات.
بشكل عام ، تزيد هذه التقنيات من دقة التحفيز والإنتاجية التجريبية في استكشاف التباين السكاني والظواهر العصبية المحددة. بالإضافة إلى قياس النشاط العصبي ، فإن هذه الطرق قابلة للتعميم على الأنظمة الحيوية الأخرى ، بما في ذلك النباتات ، التي تتواصل أيضا عبر إشارات الكالسيوم21 ، وثقافة الخلايا العصبية ، وعضويات الدماغ 22 ، وكذلك إلى إشارات الفلورسنت الديناميكية الأخرى ، مثل أجهزة استشعار النشاط المشبكي ، وإطلاق الناقل العصبي 23 ، والنسخ 24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.
Acknowledgments
نشكر Fox Avery لاختبار هذه البروتوكولات ومراجعة المخطوطة وإريك هول للمساعدة في البرمجة. تم توفير التمويل للطرق المعروضة هنا جزئيا من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم 1724026 (D.R.A.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacterial strains | |||
| E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Cat# OP50 | |
| Experimental models: Organisms/strains | |||
| C. elegans strains expressing GCaMP (and optionally, Chrimson) in desired neurons | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) or corresponding authors of published work | NZ1091, for example | |
| Chemicals, Treatments, and Worm Preparation Supplies | |||
| 2,3-Butanedione | Sigma-Aldrich | Cat# B85307 | diacetyl, example chemical stimulus |
| Calcium chloride, CaCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# C3881 | |
| Fluorescein, Sodium salt | Sigma-Aldrich | Cat# F6377 | |
| Glass water repellant | Rain-X | Cat #800002250 | glass hydrophobic treatment (single-use) |
| Magnesium chloride, MgCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# M2393 | |
| Nematode Growth Medium (NGM) agar | Genesee | Cat #: 20-273NGM | |
| Petri dishes (60 mm) | Tritech | Cat #T3305 | |
| Poly(dimethyl siloxane) (PDMS): Sylgard 184 | Dow Chemical | Cat# 1673921 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | Cat# P5655 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | Cat# P8281 | |
| Sodium chloride, NaCl | Sigma-Aldrich | Cat# S7653 | |
| (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane (TFOCS) | Gelest | CAS# 78560-45-9 | glass hydrophobic treatment (durable) |
| Software and algorithms | |||
| Arduino IDE | Arduino | https://www.arduino.cc/en/software | |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| Micro-manager | Micro-manager | https://micro-manager.org/ | |
| Microscope control software | Albrecht Lab | https://github.com/albrechtLab/MicroscopeControl | |
| Neurotracker data analysis software | Albrecht Lab | https://github.com/albrechtLab/Neurotracker | |
| Automated Microscope and Stimulation System | |||
| Axio Observer.A1 inverted microscope set up for epifluorescence (GFP filter cubes, 5× objective or similar) | Zeiss | Cat #491237-0012-000 | |
| Excelitas X-cite XYLIS LED illuminator | Excelitas | Cat #XYLIS | |
| Orca Flash 4.0 Digital sCMOS camera | Hamamatsu | Cat #C11440-22CU | |
| Arduino nano | Arduino | Cat #A000005 | |
| 3-way Miniature Diapragm Isolation Valve (LQX12) | Parker | Cat #LQX12-3W24FF48-000 | Valve 1: Control |
| 2-way normally-closed (NC) Pinch Valve | Bio-Chem Valve Inc | Cat #075P2-S432 | Valve 2: Outflow |
| 3-way Pinch Valve | NResearch | Cat #161P091 | Valve 3: Stimulus selection |
| Optogenetic stimulation LED and controller (615 nm) | Mightex | Cat #PLS-0625-030-S and #SLA-1200-2 | |
| ValveLink 8.2 digital/manual valve controller | AutoMate Scientific | Cat #01-18 | |
| Wires and connectors | various | See Fig. 2 of Cell STARS Protocol (Lawler, 2021) | |
| Microfluidic Device Preparation | |||
| Dremel variable speed rotary cutter 4000 | Dremel | Cat #F0134000AB | Set speed to 5k RPM for cutting glass |
| Dremel drill press rotary tool workstation | Dremel | Cat #220-01 | |
| Diamond drill bit | Dremel | Cat #7134 | |
| Glass slide, 1 mm thick | VWR | Cat #75799-268 | |
| Glass scribe (Diamond scriber) | Ted Pella | Cat #54468 | |
| Luer 3-way stopcock | Cole-Parmer | Cat #EW-30600-07 | |
| Luer 23 G blunt needle | VWR | Cat #89134-100 | |
| Microfluidic device | Corresponing author or fabricate from CAD files associated with this article | N/A | |
| Microfluidic device clamp | Warner Instruments (or machine shop) | P-2 | |
| Microfluidic tubing, 0.02″ ID | Cole-Parmer | Cat #EW-06419-01 | |
| Tube 19 G, 0.5″ | New England Small Tube | Cat #NE-1027-12 |
References
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2 (2013).
- Badura, A., Sun, X. R., Giovannucci, A., Lynch, L. A., Wang, S. S. -H. Fast calcium sensor proteins for monitoring neural activity. Neurophotonics. 1, 025008 (2014).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Larsch, J., Ventimiglia, D., Bargmann, C. I., Albrecht, D. R. High-throughput imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (45), 4266-4273 (2013).
- Larsch, J., et al. A circuit for gradient climbing in C. elegans chemotaxis. Cell Reports. 12 (11), 1748-1760 (2015).
- Lagoy, R. C., Albrecht, D. R. Automated fluid delivery from multiwell plates to microfluidic devices for high-throughput experiments and microscopy. Scientific Reports. 8, 6217 (2018).
- Schrödel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light. Nature Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).
- Lawler, D. E., et al. Sleep analysis in adult C. elegans reveals state-dependent alteration of neural and behavioral responses. The Journal of Neuroscience. 41 (9), 1892-1907 (2021).
- Reilly, D. K., Lawler, D. E., Albrecht, D. R., Srinivasan, J. Using an adapted microfluidic olfactory chip for the imaging of neuronal activity in response to pheromones in male C. elegans head neurons. Journal of Visualized Experiments. (127), e56026 (2017).
- Han, X., et al. A polymer index-matched to water enables diverse applications in fluorescence microscopy. Lab on a Chip. 21 (8), 1549-1562 (2021).
- Whitesides, G. M. The origins and the future of microfluidics. Nature. 442 (7101), 368-373 (2006).
- Albrecht, D. R., Bargmann, C. I. High-content behavioral analysis of Caenorhabditis elegans in precise spatiotemporal chemical environments. Nature Methods. 8 (7), 599-605 (2011).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
- Cohen, R. A. Temporal Inhibition. Encyclopedia of Clinical Neuropsychology. Kreutzer, J. S., DeLuca, J., Caplan, B. , Springer. New York, NY. 2480-2481 (2011).
- Lawler, D. E., Albrecht, D. R. Monitoring neural activity during sleep/wake events in adult C. elegans by automated sleep detection and stimulation. STAR Protocols. 3 (3), 101532 (2022).
- Edelstein, A. D., et al. Advanced methods of microscope control using µManager software. Journal of Biological Methods. 1 (2), 10 (2014).
- Lagoy, R. C., Larsen, E., Lawler, D., White, H., Albrecht, D. R. Microfluidic devices for behavioral analysis, microscopy, and neuronal imaging in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 2468, 293-318 (2022).
- NeuroTracker. GitHub. , Available from: https://github.com/albrechtLab/Neurotracker (2022).
- NeuroTracker User Guide. GitHub. , Available from: https://github.com/albrechtLab/Neurotracker (2022).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Galotto, G. Chitin triggers calcium-mediated immune response in the plant model Physcomitrella patens. Molecular Plant-Microbe Interactions. 33 (7), 911-920 (2020).
- Qian, X., Song, H., Ming, G. Brain organoids: Advances, applications and challenges. Development. 146 (8), 166074 (2019).
- Ventimiglia, D., Bargmann, C. I. Diverse modes of synaptic signaling, regulation, and plasticity distinguish two classes of C. elegans glutamatergic neurons. eLife. 6, 31234 (2017).
- Boulin, T.
