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Neuroscience

Stimulation multimodale automatisée et enregistrement neuronal simultané à partir de plusieurs petits organismes

Published: March 3, 2023 doi: 10.3791/65042
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1,3
1Department of Biomedical Engineering, Worcester Polytechnic Institute, 2Graduate School of Biomedical Sciences, UMass Chan Medical School, 3Department of Biology and Biotechnology, Worcester Polytechnic Institute

Summary

Nous présentons une méthode pour la stimulation chimique flexible et multimodale et l’enregistrement de l’activité neuronale simultanée de nombreux vers Caenorhabditis elegans . Cette méthode utilise la microfluidique, du matériel et des logiciels open source et une analyse automatisée supervisée des données pour permettre la mesure de phénomènes neuronaux tels que l’adaptation, l’inhibition temporelle et la diaphonie de stimulus.

Abstract

Les indicateurs de calcium fluorescents codés génétiquement ont grandement contribué à notre compréhension de la dynamique neuronale depuis le niveau des neurones individuels jusqu’à des circuits cérébraux entiers. Cependant, les réponses neuronales peuvent varier en raison de l’expérience antérieure, des états internes ou des facteurs stochastiques, générant ainsi le besoin de méthodes permettant d’évaluer la fonction neuronale chez de nombreux individus à la fois. Alors que la plupart des techniques d’enregistrement examinent un seul animal à la fois, nous décrivons l’utilisation de la microscopie à grand champ pour étendre les enregistrements neuronaux à des dizaines de Caenorhabditis elegans ou d’autres organismes à l’échelle inférieure à la fois. Le matériel et les logiciels open source offrent une grande flexibilité dans la programmation d’expériences entièrement automatisées qui contrôlent l’intensité et le moment de divers types de stimulus, y compris les stimuli chimiques, optiques, mécaniques, thermiques et électromagnétiques. En particulier, les dispositifs d’écoulement microfluidique fournissent un contrôle précis, reproductible et quantitatif des stimuli chimiosensoriels avec une résolution temporelle inférieure à la seconde. Le pipeline d’analyse de données semi-automatisé NeuroTracker extrait ensuite les réponses neuronales individuelles et à l’échelle de la population pour découvrir les changements fonctionnels dans l’excitabilité et la dynamique neuronales. Cet article présente des exemples de mesure de l’adaptation neuronale, de l’inhibition temporelle et de la diaphonie stimulus. Ces techniques augmentent la précision et la répétabilité de la stimulation, permettent l’exploration de la variabilité de la population et sont généralisables à d’autres signaux fluorescents dynamiques dans de petits biosystèmes, des cellules et organoïdes aux organismes entiers et aux plantes.

Introduction

Les techniques d’imagerie calcique ont permis l’enregistrement non invasif de la dynamique neuronale in vivo en temps réel à l’aide de la microscopie à fluorescence et d’indicateurs de calcium génétiquement codés exprimés dans les cellules cibles 1,2,3. Ces capteurs utilisent généralement une protéine fluorescente verte (GFP), telle que la famille de peptides GFP-calmodulin-M13 (GCaMP), pour augmenter l’intensité de fluorescence lors de l’activation neuronale et des niveaux élevés de calcium intracellulaire. L’imagerie calcique a été particulièrement puissante chez le nématode C. elegans pour examiner comment les neurones et les circuits neuronaux fonctionnent chez les animaux vivantsau comportement 4,5,6,7,8,9,10, car leur nature transparente signifie qu’aucun processus chirurgical n’est nécessaire pour l’accès optique, et les promoteurs de gènes spécifiques aux cellules ciblent l’expression des cellules d’intérêt. Ces techniques utilisent souvent des dispositifs microfluidiques, qui fournissent des environnements contrôlés avec précision pour étudier les phénomènes biologiques, chimiques et physiques à petite échellephysique 11,12. Les dispositifs microfluidiques abondent pour mesurer l’activité neuronale, avec de nouvelles conceptions continuellement en développement, et ils sont facilement fabriqués dans le laboratoire de recherche. Cependant, de nombreux modèles piègent un seul animal à la fois, limitant le débit expérimental 7,9,13. Les réponses neuronales varient souvent considérablement d’un animal à l’autre en raison de différences dans l’expérience antérieure, d’états internes tels que le stress ou la faim, ou de facteurs stochastiques tels que les niveaux d’expression génique. Ces différences établissent un besoin de méthodes capables simultanément de stimuler et d’observer de nombreux animaux et d’extraire des informations des individus4.

De plus, certains phénomènes neuromodulateurs ne se manifestent que dans des conditions de stimulation spécifiques, comme l’inhibition temporelle14, qui fait référence à la brève suppression des réponses lorsque la stimulation se produit en succession rapide. Les systèmes électrophysiologiques peuvent conduire l’activité neuronale à travers un large espace de stimulus à cette fin, modulant, par exemple, le courant d’impulsion électrique, la tension, la fréquence, la forme d’onde, le cycle de service et la synchronisation des trains de stimulus périodiques. La stimulation indirecte par des stimuli ou des systèmes optogénétiques détectés naturellement bénéficierait d’une gamme similaire de mécanismes de contrôle. Actuellement, de nombreux stimuli naturels sont présentés de manière simple « on-off », tels que la présentation et l’élimination des odeurs, en utilisant des systèmes commerciaux qui ont été lents à ajouter de la flexibilité. Cependant, les microcontrôleurs peu coûteux peuvent désormais automatiser la livraison de plusieurs types de stimuli d’une manière personnalisable en fonction des besoins des chercheurs. Combinés à la microfluidique, ces systèmes ont atteint l’objectif d’augmenter le débit expérimental et la flexibilité, permettant de mesurer simultanément les réponses neuronales à une variété de stimuli précis chez de nombreux animaux 4,6. La stimulation multimodale peut être utilisée pour interroger davantage les circuits neuronaux, par exemple en surveillant les changements dans l’excitabilité neuronale lors d’une stimulation constante avant, pendant et après une perturbation orthogonale telle que l’exposition à un médicament4. Les avantages des systèmes de microscopie ouverts peu coûteux sont évidents pour faire progresser la recherche scientifique, mais dans la pratique, la nécessité d’approvisionnement en pièces, de construction et de validation des performances peut entraver l’adoption de ces techniques.

Ce protocole vise à atténuer certains de ces défis techniques. Alors que les protocoles précédents se sont concentrés sur l’utilisation de dispositifs microfluidiques et la stimulation de base 9,15,17, nous décrivons ici la construction et l’utilisation d’un système de distribution de stimulus flexible, automatisé et multimodal pour l’imagerie neuronale chez C. elegans ou d’autres petits organismes utilisant des dispositifs microfluidiquesdécrits précédemment 4. Le système open-source est programmé via de simples fichiers texte pour définir les expériences, et le programme d’analyse de données NeuroTracker extrait semi-automatiquement les données d’activité neuronale des vidéos du microscope. Nous démontrons ce système avec des exemples d’évaluation de l’inhibition temporelle, de la désinhibition et de la diaphonie de stimulus à l’aide du neurone chimiosensoriel AWA, qui se dépolarise en réponse à différentes odeurs alimentaires ou en réponse à la lumière lors de l’expression de canaux ioniques optogénétiques sensibles à la lumière 5,6.

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Protocol

1. Équipement d’imagerie neuronale

REMARQUE : voir Lawler et Albrecht15 pour obtenir des instructions détaillées sur la construction du système d’imagerie et de stimulation, qui contrôle le moment de l’illumination du microscope, l’acquisition d’images et la délivrance de stimuli (Figure 1). Un contrôleur de stimulus Arduino Nano peu coûteux actionne les vannes fluidiques via des signaux numériques vers un contrôleur de vanne et contrôle l’éclairage optogénétique via des signaux de tension analogiques vers un contrôleur LED. D’autres stimuli, tels que les moteurs de vibration et les chauffages thermiques, peuvent être contrôlés à l’aide de signaux numériques ou analogiques. Le contrôleur de stimulus synchronise la stimulation et l’enregistrement d’images via les signaux de la caméra, comme spécifié par le logiciel de contrôle de microscope open source Micro-Manager (μManager)16. Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, réactifs, équipements et organismes utilisés dans ce protocole.

  1. Installez l’équipement d’imagerie neuronale, y compris un microscope à épifluorescence avec optique GFP, une caméra sCMOS avec un signal de sortie d’exposition numérique et un contrôleur de stimulus15.
  2. Connectez le contrôleur de stimulus aux systèmes souhaités via des signaux numériques ou analogiques. Pour les exemples présentés ci-dessous, les systèmes suivants sont utilisés :
    1. Utilisez un contrôleur de valve pour la stimulation chimique. Connectez le contrôleur de vanne à des électrovannes fluidiques ou à pincement (Figure 1)15.
    2. Utilisez une LED rouge de 615 nm et un contrôleur pour la stimulation optogénétique, montés au-dessus de la platine du microscope.
  3. Configurez l’ordinateur avec le logiciel de contrôle du microscope, créez un préréglage de configuration avec les paramètres de l’équipement et assurez-vous du bon fonctionnement du contrôle du stimulus15.

2. Fabrication de dispositifs microfluidiques

REMARQUE : Voir Lagoy et coll.17 pour obtenir des renseignements détaillés sur l’obtention ou la fabrication des moules maîtres et sur la production, l’utilisation et le nettoyage des dispositifs microfluidiques. Ces étapes sont résumées ci-dessous.

  1. Obtenir ou fabriquer un moule maître à l’aide du fichier de conception microfluidique fourni (albrechtlab.github.io/microfluidics)17. Pour les jeunes adultes C. elegans, assurez-vous que la hauteur du canal est de 55 à 70 μm.
  2. Combiner la base PDMS et l’agent de durcissement à un rapport de poids de 10:1 et bien mélanger avec des pipettes de transfert.
  3. Dégazer pendant 30-60 min dans un dessiccateur sous vide jusqu’à ce que les bulles disparaissent.
  4. Placez le moule maître dans une grande boîte de Petri (150 mm de diamètre) et versez le PDMS dégazé jusqu’à une profondeur de 4-5 mm (~100 g). Inspectez et enlevez toute poussière ou bulle à l’aide d’une pipette de transfert.
  5. Cuire au four à 65 °C sur une étagère plane pendant 3 h à toute la nuit.
  6. Une fois durci, utilisez un scalpel pour couper le PDMS du moule et une lame de rasoir droite pour séparer les appareils.
  7. Poinçonner les trous d’entrée et de sortie à l’aide d’un poinçon dermique de 1 mm et les nettoyer avec du dH 2 O, del’éthanol, et de nouveau avec du dH2O. Séchez l’appareil dans un flux d’air (voir la figure 2A).
  8. Nettoyez les deux côtés de l’appareil PDMS avec du ruban adhésif, en enlevant toute poussière ou débris.
  9. Préparez les lames de verre pour compléter le dispositif microfluidique comme décrit17. Percer les trous d’entrée de la lame supérieure à l’aide d’un trépan diamanté et rendre la lame inférieure hydrophobe en l’exposant aux vapeurs de TFOCS ou en appliquant un traitement hydrofuge du verre (figure 2B).
  10. Assemblez le sandwich verre-PDMS dans une pince (Figure 2C).

3. Préparation des animaux

  1. Obtenir ou créer des animaux avec des indicateurs de calcium génétiquement codés exprimés dans les neurones d’intérêt.
    REMARQUE : Par exemple, la ligne NZ1091 (kyIs587 [gpa-6p::GCaMP2.2b; unc-122p::d sRed]; kyIs5662 [odr-7p::Chrimson:SL2:mCherry; elt-2p::mCherry]) exprime GCaMP et le canal cationique sensible à la lumière rouge Chrimson dans la paire de neurones sensoriels AWA6. Les deux transgènes sont intégrés dans le génome pour une expression stable chez chaque animal.
  2. Un jour avant l’expérimentation, placer au moins 20 larves de stade larvaire L4 C. elegans par expérience sur une plaque de gélose en milieu de croissance des nématodes (NGM) ensemencée avec une pelouse OP50 E. coli. Lorsqu’il est maintenu à 20 °C, cela synchronisera les animaux de type sauvage au stade de jeune adulte le lendemain.
    REMARQUE: Pour les transgènes de réseau, choisissez les animaux à l’aide d’un stéréoscope à fluorescence pour assurer l’expression des transgènes chez les animaux choisis.

4. Préparation de la solution

  1. Préparer 1x tampon basal S (100 mM NaCl et 0,05 M KPO4, pH 6,0) à partir d’une solution mère 10x.
  2. Préparer le tampon tétramisole 1 mM en diluant 1 M de stock dans 1x S Basal. Utilisez ce tampon paralytique pour préparer tous les stimuli. Une expérience utilise généralement environ 150 mL.
  3. Ajouter 0,1-1 μg/mL de fluorescéine aux réservoirs tampons « témoins » pour visualiser le débit.
  4. Créer des solutions de stimulus par dilution en série jusqu’à la concentration finale souhaitée. Par exemple, créez une dilution de 10−7 de l’attractif diacétyle en créant d’abord un stock 10−3 .
    REMARQUE : Une petite quantité de fluorescéine (0,1 à 1 μg/mL) peut être ajoutée au stimulus ou à la solution tampon pour vérifier le moment du stimulus, mais la concentration doit être minimale pour éviter les artefacts de fluorescence neuronale.

5. Préparation du dispositif microfluidique

REMARQUE : Voir Reilly et al.9 pour un protocole vidéo montrant la génération du réservoir, la configuration de l’appareil et le chargement des animaux. Voir aussi Lagoy et coll.17 pour un protocole écrit comprenant de nombreux conseils utiles.

  1. Préparez trois réservoirs de fluide ou plus. Pour chacun, fixer un réservoir de seringue de 30 ml ou 60 ml, une seringue d’amorçage de 3 ml et une tige d’aiguille à une valve Luer à trois voies (figure 2D). Connectez l’aiguille à un tube de microforage muni d’un tube métallique à l’extrémité. Étiquetez les réservoirs, montez-les sur une crémaillère fixée à un support annulaire et remplissez-les avec le tampon ou les fluides de stimulus correspondants (Figure 2E).
  2. Dégazer le dispositif microfluidique assemblé dans un dessiccateur sous vide pendant ~1 h.
  3. Remplissez et retirez les bulles d’air du tube du réservoir à l’aide de la seringue d’amorçage. Remplissez le tube de sortie avec un tampon.
  4. Retirez le dispositif microfluidique du vide, insérez rapidement le tube de sortie et injectez le fluide à travers le dispositif jusqu’à ce qu’une gouttelette émerge d’une entrée.
  5. A cette entrée, utiliser un raccord « goutte à goutte »17 pour insérer le tube d’entrée fluidique correspondant (figure 2F). Assurez-vous que des gouttes de liquide sont présentes à la fois sur le tube d’entrée et sur le trou de port de l’appareil pour éviter l’introduction d’une bulle.
  6. Injectez plus de liquide à partir de la sortie, connectez le tube d’entrée suivant et répétez jusqu’à ce que toutes les entrées soient remplies. Insérez une broche de blocage solide à toutes les entrées inutilisées et au port de chargement de la vis sans fin.
  7. Initier l’écoulement en ouvrant les vannes Luer d’entrée et de sortie. Inspectez l’appareil pour détecter les fuites aux entrées et à la base en verre. Inspectez l’appareil à la recherche de bulles dans les canaux d’écoulement ou les entrées à l’aide du logiciel de capture d’images au microscope en mode live.
    REMARQUE: Si des bulles sont présentes, attendez qu’elles soient absorbées dans le matériau PDMS.

6. Chargement des animaux

NOTE : Voir Lagoy et coll.17.

  1. Transférer les jeunes animaux adultes sur une plaque de gélose NGM non ensemencée à l’aide d’un « pic » à bout métallique.
  2. Inonder la plaque avec environ 5 ml de tampon basal 1x S de sorte que les animaux nagent.
  3. Aspirez les vers dans une seringue de chargement (seringue de 1 mL ou 3 mL avec tube attaché qui a été prérempli de 1x S Basal).
    1. À l’aide d’un stéréoscope, déplacez l’extrémité du tube sous la surface du liquide avec une main vers chaque animal désiré et aspirez-la dans la tubulure à l’aide de la seringue tenue dans l’autre main.
    2. Aspirez les vers uniquement dans le tube, pas dans la seringue.
      REMARQUE: Le tube ne contient généralement qu’environ 100 μL. Les animaux peuvent être expulsés dans une zone locale, puis aspirés à nouveau dans le tube avec un petit volume.
  4. Fermez la ligne de prise, retirez la broche de chargement du ver et connectez la seringue de chargement de vers au périphérique à l’aide d’une connexion goutte-à-goutte.
  5. Faites couler doucement les animaux dans l’arène, établissez un écoulement tampon et laissez jusqu’à 1 h pour l’immobilisation par tétramisole.
    REMARQUE : Pendant la période d’immobilisation, assurez-vous que seul le liquide tampon pénètre dans l’arène. Les réservoirs de stimulus et de contrôle peuvent être désactivés pendant cette période, mais ouvrez-les et vérifiez le débit correct avant d’exécuter les essais de stimulation.

7. Stimulation automatisée et enregistrement neuronal

  1. Créez un fichier texte de définition de stimulus appelé « Paramètres d’acquisition définis par l’utilisateur .txt » avec un éditeur de texte (par exemple, le Bloc-notes) contenant les paramètres de stimulation pour l’acquisition automatisée d’images (voir les exemples de la figure 3). Les paramètres sont divisés en deux sections :
    1. Paramètres d’acquisition du microscope : Définissez le type d’expérience (Single-Stimulus ou Multi-Pattern), le moment de l’exposition et de l’excitation, la durée et les intervalles de l’essai, et le répertoire de sauvegarde.
    2. Paramètres de stimulation : Définissez les paramètres de contrôle du stimulus. Une « commande de stimulation » spécifie les actions se produisant sur certaines images vidéo avec la syntaxe , où les codes de lettre sont A = valve1, B = valve2, C = valve3, L = lumière LED; De plus, majuscules = activé et minuscules = désactivé. L’intensité de la LED est réglée avec le code alphabétique « i » et une valeur de 0 (off) à 255 (luminosité maximale).
      REMARQUE: La valeur d’intensité LED de 0 à 255 définit la tension analogique de sortie de 0 V à 5 V. Le contrôleur de courant utilisé ici a une mise à l’échelle d’intensité linéaire, et les autres doivent être étalonnés avec un capteur de puissance optique.
      1. Pour une expérience à stimulus unique avec une seule commande de stimulation répétée, utilisez le format de la figure 3A.
      2. Pour une expérience multi-motifs avec plusieurs commandes de stimulation, utilisez le format de la figure 3B. Incluez une « séquence de motifs » de chiffres qui représente l’ordre des modèles de stimulation. Pour chaque motif, entrez une commande de stimulation sur une ligne distincte.
        REMARQUE: Une séquence pseudo-aléatoire ou une séquence m peut être utile pour étudier la dépendance à l’historique des stimulus.
  2. Exécutez le logiciel de contrôle du microscope. Vérifiez que toutes les entrées fluidiques sont ouvertes, que le flux est comme souhaité dans l’arène (voir Figure 2H) et que les neurones d’intérêt sont au point dans la fenêtre en direct.
  3. Fermez la fenêtre en direct et exécutez le script « MultiPattern_RunScript.bsh » dans le logiciel.
    REMARQUE: Il est utile d’effectuer une expérience d’essai sans animaux pour vérifier le bon débit et la stimulation. La substitution d’une concentration de fluorescéine différente pour chaque fluide de stimulus peut aider à visualiser et à documenter de nouveaux modèles de stimulus.
  4. Après expérimentation, démontez le dispositif microfluidique et rincez toutes les surfaces, les tubes et les réservoirs avec de l’eau.
    REMARQUE: Tous les composants peuvent être réutilisés des dizaines de fois s’ils sont maintenus propres. S’assurer que les réservoirs, les tubes et les dispositifs microfluidiques sont maintenus humides ou complètement séchés dans un courant d’air pour éviter la cristallisation du sel, qui peut obstruer et est difficile à enlever. Les dispositifs peuvent être conservés dans de l’éthanol pour stérilisation, mais doivent être complètement séchés avant d’être réutilisés (>1 h à 65 °C)17.

8. Analyse des données à l’aide de NeuroTracker

REMARQUE: NeuroTracker 4,18,19 est un plugin logiciel ImageJ / FIJI20 pour suivre l’intensité de fluorescence de plusieurs neurones et animaux, même lorsqu’ils se déplacent pendant les essais. Ce plugin enregistre les données sous forme de fichiers texte avec la position de chaque neurone et l’intensité de fluorescence corrigée de l’arrière-plan (F). Les données de fluorescence sont normalisées à la fluorescence de base (F 0), par exemple, la moyenne de plusieurs secondes avant la stimulation, comme Δ F/F 0 = (F -F 0)/F 0, qui peut être moyennée entre les populations.

  1. Installez les scripts NeuroTracker comme indiqué (github.com/albrechtLab/Neurotracker).
  2. Exécutez NeuroTracker en cliquant sur Plugins | Suivi | NeuroTracker.
  3. Sélectionnez le dossier contenant le fichier . Fichiers vidéo TIF à suivre et sélectionnez les paramètres souhaités.
    Remarque : Si seulement un sous-ensemble des fichiers vidéo doivent être suivis, sélectionnez la plage numérique des fichiers à analyser à l’invite. Les paramètres de suivi par défaut sont appropriés pour les animaux non mobiles à une résolution de 250 pixels/mm. Ajustez les paramètres proportionnellement pour les autres résolutions. Consultez le Guide de l’utilisateur19 pour plus d’informations sur les paramètres.
  4. Réglez le seuil d’intensité de telle sorte que les neurones soient visibles pour la sélection (Figure 4).
  5. Ouvrez les fenêtres de contrôle Luminosité/Contraste (B/C) et Seuil à l’aide des fenêtres Image | Ajuster le menu.
  6. Dans la fenêtre B/C , ajustez les curseurs Minimum et Maximum jusqu’à ce que les neurones soient clairement discernables (Figure 4A).
  7. Dans la fenêtre Seuil , cochez Arrière-plan sombre et Ne pas réinitialiser la plage.
  8. Faites glisser le curseur du cadre pour observer le mouvement des neurones et les changements d’intensité, en notant les animaux à exclure du suivi, par exemple en raison d’un chevauchement avec d’autres animaux.
  9. Identifier les neurones à suivre.
  10. Pour chaque animal, ajustez le niveau de seuil de sorte que la zone de seuil rouge au-dessus du neurone soit visible dans chaque image avant, pendant et après la stimulation.
  11. Cliquez sur le neurone pour enregistrer sa position et son niveau de seuil.
  12. Répétez l’ajustement du seuil et la sélection pour chaque animal et neurone à suivre. Voir la figure 4C pour un bon exemple de niveau de seuil et la figure 4D,E pour des exemples de seuil supérieur et inférieur au seuil. Les neurones préalablement sélectionnés sont indiqués par une petite boîte.
  13. Lorsque tous les neurones sont sélectionnés, appuyez sur la barre d’espace pour commencer le suivi.
    REMARQUE: Pour des exemples supplémentaires de NeuroTracker, voir les référencesprécédentes 4,19.
  14. Surveillez le processus de suivi de chaque animal et apportez les corrections nécessaires.
  15. Si NeuroTracker fait une pause, il a perdu le neurone. Recliquez sur le neurone, en ajustant le niveau de seuil au besoin.
  16. Si la boîte d’intégration saute à une autre structure animale ou non neuronale à proximité, appuyez sur la barre d’espace pour faire une pause, déplacez le curseur vers la première image erronée et recliquez sur l’emplacement correct du neurone.

9. Exploration et visualisation des données

REMARQUE : Le script d’analyse MATLAB est utilisé pour le traitement et la visualisation des données et pour générer des PDF récapitulatifs pour chaque analyse.

  1. Exécutez le fichier « NeuroTrackerSummary_pdf.m » dans MATLAB et sélectionnez le dossier contenant les fichiers texte de données NeuroTracker.
  2. Attendez qu’un PDF récapitulatif soit produit, permettant la vérification du processus de suivi (Figure 5). Les animaux sont identifiés par un nombre (figure 5A), et les réponses neuronales de chaque animal et essai peuvent être visualisées pour évaluer la variabilité de la population (figure 5B).
  3. Utilisez la fonction « databrowse.m » pour explorer les données neuronales, par exemple, en les regroupant par numéro d’essai (Figure 5C), par nombre d’animaux (Figure 5D), par modèle de stimulation ou par une autre catégorie.

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Representative Results

Nous présentons plusieurs exemples de modèles de stimulus qui évaluent différents phénomènes neuronaux, y compris l’inhibition temporelle, l’adaptation et la désinhibition. L’inhibition temporelle est la suppression momentanée d’une réponse neuronale à une deuxième présentation de stimulus survenant peu de temps après la présentation initiale14. Pour tester ce phénomène, dans une expérience d’impulsion appariée, huit modèles consistant en deux impulsions odorantes de 1 s séparées par un intervalle allant de 0 s à 20 s ont été présentés (Figure 6B; voir Figure 3B pour le fichier de contrôle du stimulus correspondant). L’arène a été aménagée avec un seul fluide de stimulus (diacétyle de 1,1 μM), un tampon et un tube de débit de contrôle, l’orifice d’entrée inutilisé étant bloqué par une broche solide (figure 6A). En allumant la vanne 1, le fluide de contrôle pénètre dans l’entrée ctrl1, déplaçant les flux de fluide de telle sorte que le stimulus pénètre dans l’arène; Lorsque la vanne 1 est fermée, le liquide de commande pénètre dans l’entrée du CTRL2 et le tampon s’écoule dans l’arène (voir la figure 2G,H). Alors que la première impulsion olfactive de 1 s a provoqué une amplitude de réponse égale dans les neurones AWA détectant le diacétyle, les réponses à la deuxième impulsion variaient avec l’intervalle interstimulus (Figure 6D). Pour les intervalles d’impulsion inférieurs à 10 s, la deuxième réponse était plus faible, démontrant le phénomène d’inhibition temporelle. En utilisant cette configuration expérimentale, la perturbation du composant dynéine CHE-3 s’est avérée empêcher l’inhibition temporelle, impliquant le transport axonal dans ce phénomène5.

L’adaptation est la diminution progressive des réponses neuronales aux présentations répétées du même stimulus. Ce phénomène peut être causé par différents processus, tels que l’inhibition active, qui peut être rapidement inversée, ou d’autres processus qui sont lents à inverser. Une expérience pour évaluer la réversibilité rapide est un essai de « capture », dans lequel un stimulus est répété pour établir l’adaptation, suivi d’un stimulus « déviant » ou nouveau, puis d’un retour au stimulus original. La désinhibition est observée si les réponses neuronales augmentent à la suite du nouveau stimulus « désinhibant ». La figure 7 montre un exemple utilisant deux odorants, le diacétyle et la 2-méthylpyrazine (2-MP), détectés par les neurones chimiosensoriels AWA via différents récepteurs4. Deux réservoirs de stimulus et des tubes ont été connectés au dispositif microfluidique, avec une valve de pincement supplémentaire à trois voies pour déterminer quel stimulus pénètre dans l’arène (figure 7A). Les schémas de stimulus ont été définis pour présenter des impulsions chimiques pendant 4 s via la valve 1 pour les 30 essais et pour choisir entre le stimulus S1 ou S2 via la valve 3, qui a été activée après le 25e essai et désactivée après le 26e (Figure 7B). Cette disposition garantissait suffisamment de temps pour que les différents fluides de stimulus circulent à travers le dispositif microfluidique avant d’être présentés aux animaux. Une adaptation au stimulus diacétyle a été observée, mais la présentation du nouveau stimulus 2-MP n’a pas provoqué d’effet de désinhibition important (Figure 7C).

La stimulation optogénétique utilise la lumière pour activer les neurones via des canaux ioniques sensibles à la lumière. Bien que pratique à utiliser, l’activation optogénétique contourne les récepteurs sensoriels et certaines voies de régulation, de sorte que certains phénomènes neuronaux peuvent différer de l’activation par des stimuli naturels. Pour tester ces différences, les expériences multimodales sont utiles pour présenter différents types de stimulation au sein d’une seule expérience. Les neurones exprimant la variante channelrhodopsin Chrimson sont activés par l’exposition à la lumière rouge5. Pour évaluer si les neurones AWA s’adaptent de manière similaire à la stimulation chimique et optogénétique, la souche NZ1091 exprimant à la fois Chrimson et GCaMP dans les neurones AWA a été maintenue sur une plaque contenant le cofacteur tout-trans-rétinien (ATR, 100 μM) pendant 14-28 h. Une LED rouge de 615 nm a éclairé l’arène microfluidique par le haut (Figure 8A), et un ensemble de modèles de stimulus multimodaux a été généré en fournissant des impulsions de 5 s de diacétyle, de lumière rouge ou des deux dans le même essai (Figure 8B). La stimulation chimique seule a provoqué une adaptation, alors que la stimulation optique seule n’en a pas provoqué (Figure 8C). Cependant, le schéma de stimulus multimodal combiné a démontré que les réponses optogénétiques étaient sensibles à l’adaptation induite chimiquement (Figure 8C,D). Ces expériences suggèrent que l’adaptation est initiée au niveau des récepteurs sensoriels ou des processus dendritiques, mais que ses effets se propagent dans tout le neurone.

Figure 1
Figure 1 : Schéma de l’équipement d’enregistrement et de stimulation du calcium neuronal. La capture d’image au microscope, la lumière d’excitation par fluorescence et la stimulation sont contrôlées par un ordinateur et un microcontrôleur Arduino open source. La stimulation chimique dans l’arène microfluidique bascule entre les solutions tampons B et S de stimulus via le flux de fluide de contrôle C. Les éléments optionnels du système sont indiqués par un astérisque (*), tels que des valves supplémentaires et des modalités de stimulation optiques ou autres. Les images du microscope à fluorescence sont utilisées pour mesurer l’activité neuronale via des transitoires calciques, par exemple, en utilisant l’indicateur de calcium GCaMP. Les lignes pointillées représentent les connexions électriques (numériques ou analogiques), les lignes courbes sont les tubes de fluide et les flèches pleines droites sont les chemins optiques de la lumière. Abréviation : LED = diode électroluminescente. Cette figure est modifiée à partir de Lawler et Albrecht15. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Assemblage et configuration du dispositif microfluidique. Le dispositif microfluidique est composé d’un (A) dispositif PDMS à micromotifs pris en sandwich entre un dessus en verre percé (B) et une base en verre hydrophobe et (C) serré. (D) Les réservoirs sont placés au-dessus de l’appareil avec un support de crémaillère de tubes (E). Le tube des réservoirs est connecté directement dans l’appareil ou via des vannes actionnées pour le contrôle fluidique. L’appareil est positionné au-dessus de l’objectif sur le microscope. (F) Image rapprochée du dispositif microfluidique avec tous les tubes fixés dans les entrées, l’orifice de chargement de la vis sans fin et la sortie. G) Schéma du dispositif microfluidique de 20 mm x 20 mm. Les lignes noires représentent les canaux fluides de 55 à 70 μm de haut. Cette géométrie est conçue pour permettre un contrôle spatio-temporel précis avec un front de stimulus perpendiculaire à l’écoulement tout en maintenant les animaux dans l’arène et le champ de vision du microscope. Le flux tampon et un flux de stimulus (ou éventuellement Stim2, le cas échéant) s’écoulent continuellement, alors qu’une seule entrée de fluide de contrôle s’écoule à la fois, déplaçant le fluide qui entre dans l’arène. (H) Lorsque la vanne 1 est sous tension, le fluide de commande s’écoule de l’orifice normalement fermé vers l’entrée de commande1, et le stimulus s’allume et circule dans l’arène. Lorsque la vanne 1 est éteinte, le fluide s’écoule de l’orifice normalement ouvert vers l’entrée de commande2 et le tampon pénètre dans l’arène. L’équilibre correct de l’écoulement est montré, avec un colorant fluorescéine utilisé comme fluide de stimulation. Notez qu’une partie du fluide entrant dans l’arène la contourne également par les canaux incurvés supérieurs et inférieurs. Ces cours d’eau doivent être étroits et avoir une largeur égale dans les chenaux supérieur et inférieur. Les hauteurs du réservoir peuvent être ajustées au besoin. Abréviations : PDMS = polydiméthylsiloxane; WL = chargement de vers; Buf = tampon; Stim1 = premier stimulus; Stim2 = deuxième stimulus; NC = normalement fermé; NO = normalement ouvert. Cette figure est modifiée à partir de Lawler et Albrecht15. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Exemples de fichiers de définition de stimulus. (A) Exemple d’expérience de stimulus répétitif unique : une impulsion lumineuse de 5 s à une intensité de 200 de 2 s à 7 s (image 20 à 70). (B) Exemple d’expérience de stimulus multi-modèles avec huit modèles de stimulus différents, correspondant à la figure 6. Deux impulsions chimiques de 1 s sont présentées avec un intervalle de 0 s à 20 s entre elles. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4: Sélection des neurones et des niveaux seuils dans NeuroTracker. (A) Champ de vision complet du microscope, avec la luminosité et le contraste ajustés pour voir clairement les neurones AWA. (B) Vue agrandie de la région de la tête d’un animal représentant la boîte d’intégration à partir de laquelle l’intensité de fluorescence est calculée et l’anneau de fond pour la soustraction de fond. (C) Diagramme d’intensité intégré montrant une réponse neuronale robuste. (D) Une bonne sélection de seuil se traduira par une région de seuil rouge supérieure au paramètre Taille minimale et inférieure au paramètre Taille maximale pour chaque image de la pile d’images et ne comprenant aucune région voisine, telle que l’autofluorescence intestinale (voir panneau B). (E) Un seuil fixé trop haut peut sembler bon lorsque le neurone est actif, mais lorsqu’il est inactif, le neurone peut être perdu. Il est donc important de vérifier à la fois les cadres de pré-stimulation et de post-stimulation lors de la sélection d’un seuil. (F) Un seuil fixé trop bas peut mettre en évidence d’autres structures non neuronales. La sélection au-dessus ou au-dessous du seuil peut entraîner la perte du neurone par NeuroTracker et une pause pour obtenir les commentaires de l’utilisateur afin de corriger le seuil et la position du neurone. Abréviation : B&C = luminosité et contraste. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Exemple d’analyse de données. Réponses neuronales de 15 animaux exposés à 10 répétitions d’une stimulation optogénétique d’une durée de 5 s une fois par minute. (A) Image sommaire indiquant les animaux suivis et le mouvement des neurones dans l’essai (boîtes rouges). L’animal 2 s’est déplacé pendant l’essai. (B) Les réponses individuelles des animaux au fil du temps montrent une réponse relativement constante à la stimulation de la lumière rouge. (C) Sortie d’exploration des données à l’aide de la fonction databrowse. Les traces sont regroupées par répétition d’essai (ci-dessus), et les moyennes sont indiquées ci-dessous pour les essais sélectionnables par l’utilisateur. (D) Données regroupées par nombre d’animaux individuels et moyennées sur des essais répétés. Cet ensemble de données montre une variabilité interanimale minimale, justifiant la moyenne des réponses dans l’ensemble de la population. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Expérience d’impulsions appariées avec un intervalle interstimulus variable pour évaluer l’inhibition temporelle. (A) Raccords d’entrée de dispositifs microfluidiques. L’entrée inutilisée est bloquée par une broche solide (X). Le réservoir de fluide de commande et la vanne1 sont connectés aux entrées c1 et c2, omises ici pour plus de clarté. (B) Calendrier de relance pour huit modèles. Les impulsions durent 1 s et sont séparées par 0-20 s. La séquence des motifs est illustrée ci-dessous; Chaque motif a été présenté six ou sept fois. (C) Activité neuronale de l’AWA provenant de 50 essais et de neuf animaux. Une carte thermique des réponses triées par modèle de stimulation est présentée ci-dessus; L’activité neuronale moyenne pour chaque modèle (n = 56-63 réponses) est indiquée ci-dessous. L’inhibition temporelle se produit pendant ~10 s après l’impulsion initiale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : Expérience d’essai de capture pour évaluer la désinhibition. (A) Raccords d’entrée de dispositifs microfluidiques. Une soupape à pincement à trois voies permet uniquement au stimulus S1 de passer au repos et à S2 de passer lorsqu’il est sous tension. (B) Diagramme des trois séquences de motifs utilisées pour délivrer les impulsions répétées d’odeur de diacétyle, avec le nouveau stimulus 2-méthylpyrazine présenté en place lors du 26e essai. (C) Réponses moyennes de l’activité neuronale AWA chez 20 animaux. Abréviations : DA = diacétyle; 2-MP = 2-méthylpyrazine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 8
Figure 8 : Exemple de stimulation multimodale. (A) Raccords d’entrée de dispositif microfluidique, avec une entrée inutilisée bloquée par une broche solide. Une LED rouge illumine l’arène d’en haut. (B) Modèles de stimulation optique, chimique ou multimodale. (C) Activité neuronale moyenne de l’AWA (n = 11 animaux) pour 30 essais répétés avec une stimulation optogénétique et chimiosensorielle appariée (en haut), optogénétique uniquement (au milieu) et chimiosensorielle uniquement (en bas). (D) Moyenne de la réponse neuronale maximale pour chaque essai pour les impulsions optogénétiques ci-dessus et les impulsions chimiques ci-dessous. Les impulsions optogénétiques ne provoquent pas directement l’adaptation, mais leurs réponses sont sensibles à l’adaptation chimiosensorielle. Abréviations : DA = diacétyle. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Dans ce protocole, nous décrivons un système de microscopie en libre accès pour l’évaluation des phénomènes d’activité neuronale en utilisant la livraison temporellement précise de différents modèles de stimulus. La plate-forme microfluidique fournit des stimuli reproductibles tout en maintenant des dizaines d’animaux dans le champ de vision du microscope. Peu de logiciels de microscopie commerciaux permettent de programmer facilement divers modèles de synchronisation de stimulus, et ceux qui le font nécessitent souvent la saisie manuelle de chaque modèle ou format de fichier propriétaire. En revanche, les expériences sont définies dans ce système par des fichiers texte, qui peuvent être générés par ordinateur et sont lisibles par des logiciels d’analyse. Ici, nous démontrons l’utilité d’utiliser des modèles de stimulus variables pour évaluer des phénomènes neuronaux tels que l’inhibition temporelle, l’adaptation et la diaphonie pendant la stimulation multimodale. Le pipeline d’analyse des données réduit les fichiers vidéo de microscopie volumineux aux données d’activité neuronale qui peuvent être visualisées et analysées pour la variabilité de la population (Figure 5B), les changements au fil du temps (Figure 7C et Figure 8C,D) et les changements après perturbation (Figure7C).

L’un des principaux avantages de l’automatisation est la reproductibilité de la stimulation à travers les répétitions d’essais et entre les expériences, et le format d’arène microfluidique permet une augmentation du débit d’au moins 20 fois par rapport aux méthodes précédentes sur un seul animal 7,9,13. Le fait de soumettre une population d’animaux aux mêmes conditions de stimulus et d’environnement garantit que les données sont comparables et évite les variations quotidiennes potentielles de la préparation de la solution, de la température, des sources animales ou d’autres facteurs. Cependant, une limite de cette approche est la microscopie à faible grossissement et à faible résolution qui maintient tous les animaux dans le champ de vision. Un seul neurone doit être surveillé par animal pour minimiser les erreurs de suivi, bien que les neurones séparés par au moins 50 μm puissent, en principe, être distingués. Les paires bilatérales de neurones peuvent être imagées ensemble si les réponses sont attendues symétriques. Il est important d’identifier d’abord quels neurones spécifiques sont impliqués dans un processus neuronal d’intérêt, par exemple par imagerie du cerveau entier7, puis d’exprimer GCaMP uniquement dans les neurones pertinents pour un débit accru.

Les réponses neuronales en calcium varient d’un animal à l’autre en raison des niveaux d’expression du rapporteur ou d’autres différences interindividuelles. Par exemple, les réponses normalisées de la GCaMP de l’AWA varient deux fois en magnitude maximale, même chez les animaux isogéniques de type sauvage avec le rapporteur de calcium intégré de manière stable dans le génome4. Certains stimuli montrent des réponses variables dans l’ensemble de la population (p. ex. acétate de butyle4), ce qui suggère une expression variable des récepteurs. En pratique, au moins 20 animaux individuels devraient être évalués pour déterminer la variabilité de la population. Il est recommandé d’utiliser des données animales individuelles pour augmenter la puissance statistique dans la détermination des changements de réponse, par exemple par la comparaison statistique des réponses neuronales individuelles appariées avant et après une perturbation.

Avec de grands ensembles de données et une expérimentation automatisée, il est important de valider et de vérifier la fonction d’expérience, le suivi et la réduction des données, en particulier pour les étapes sans surveillance. Les modèles d’écoulement doivent être vérifiés avec des solutions fluorescentes (comme dans la figure 2H) en observant qu’aucune bulle ou fluide de contrôle ne pénètre dans l’arène dans les vidéos enregistrées. Les ensembles de données doivent être validés, par exemple, en notant tout mouvement animal (comme dans la figure 5A) et en vérifiant les réponses neuronales lisses (comme dans les figures 4C et 5B). Toute donnée problématique doit être exclue. Il est également important de vérifier le regroupement des données avant de faire la moyenne à l’aide de la fonction « parcourir, » pour s’assurer que la réponse moyenne reflète les réponses individuelles.

Le système de contrôle de stimulation open source est facilement extensible à d’autres stimuli via des signaux numériques ou analogiques ou des commandes de communication série. Les stimuli gradués sont généralement contrôlables par des entrées de tension analogique (0-5 V), telles que l’intensité lumineuse LED ou l’amplitude d’impulsion du stimulateur nerveux. Les stimuli on-off sont généralement contrôlés par des signaux numériques (TTL), tels que la synchronisation du stimulateur électrique. Ces signaux numériques peuvent également actionner des commutateurs de relais pour activer d’autres systèmes électriques, tels que des moteurs vibrants pour la stimulation mécanosensorielle. D’autres équipements utilisent la communication série, par exemple par connexion USB, avec des commandes de caractères spécifiques transmises pour définir des actions. Par exemple, les expériences dose-réponse peuvent présenter automatiquement plusieurs concentrations chimiques à l’aide d’une vanne rotative5 contrôlée par USB ou d’un système de plaques multipuits6. Ces commandes peuvent être ajoutées aux scripts de contrôle de microscope open source pour être envoyées à des numéros d’essai spécifiques. Les délais peuvent être incorporés de la même manière; Par exemple, pour suspendre les essais pendant 1 heure entre deux séances de stimulation de 30 essais, il faudrait spécifier une expérience de 60 essais et ajouter une seule ligne de code pour faire une pause de 1 heure lorsque le nombre d’essais atteint 31.

La complexité expérimentale est pratiquement illimitée et peut même changer au cours d’une expérience basée sur un retour en direct dans un système « en boucle fermée ». Par exemple, la stimulation pourrait varier en temps réel en fonction de l’activité neuronale, du comportement animal ou d’un autre paramètre quantifiable. Nous avons récemment utilisé un tel système pour évaluer les réponses neuronales sensorielles chez les animaux endormis par rapport aux animaux éveillés en déclenchant une stimulation et un enregistrement neuronal après un changement de comportement 8,15. La fonction de suivi de mouvement de NeuroTracker permet l’analyse de l’activité neuronale chez les animaux en mouvement libre pour la corrélation avec la sortie comportementale. Cependant, le suivi des animaux individuels en mouvement nécessite une attention particulière, par exemple lorsqu’ils se croisent, et il est donc recommandé de charger moins d’animaux par arène (environ cinq) pour minimiser ces interactions.

Dans l’ensemble, ces techniques augmentent la précision de la stimulation et le débit expérimental dans l’exploration de la variabilité de la population et des phénomènes neuronaux spécifiques. En plus de mesurer l’activité neuronale, ces méthodes sont généralisables à d’autres biosystèmes, y compris les plantes, qui communiquent également via des signaux de calcium 21, la culture de cellules neurales et les organoïdes cérébraux 22, ainsi qu’à d’autres signaux fluorescents dynamiques, tels que les capteurs d’activité synaptique, la libération de neurotransmetteurs23 et la transcription24.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Acknowledgments

Nous remercions Fox Avery d’avoir testé ces protocoles et d’avoir révisé le manuscrit et Eric Hall pour son aide à la programmation. Le financement des méthodes présentées ici a été fourni en partie par la National Science Foundation 1724026 (D.R.A.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bacterial strains
E. coli (OP50) Caenorhabditis Genetics Center (CGC) Cat# OP50
Experimental models: Organisms/strains
C. elegans strains expressing GCaMP (and optionally, Chrimson) in desired neurons Caenorhabditis Genetics Center (CGC) or corresponding authors of published work NZ1091, for example
Chemicals, Treatments, and Worm Preparation Supplies
2,3-Butanedione Sigma-Aldrich Cat# B85307 diacetyl, example chemical stimulus
Calcium chloride, CaCl2 Sigma-Aldrich Cat# C3881
Fluorescein, Sodium salt Sigma-Aldrich Cat# F6377
Glass water repellant Rain-X Cat #800002250 glass hydrophobic treatment (single-use)
Magnesium chloride, MgCl2 Sigma-Aldrich Cat# M2393
Nematode Growth Medium (NGM) agar Genesee Cat #: 20-273NGM
Petri dishes (60 mm) Tritech Cat #T3305
Poly(dimethyl siloxane) (PDMS): Sylgard 184 Dow Chemical Cat# 1673921
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich Cat# P5655
Potassium phosphate dibasic Sigma-Aldrich Cat# P8281
Sodium chloride, NaCl Sigma-Aldrich Cat# S7653
(tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane (TFOCS) Gelest CAS# 78560-45-9 glass hydrophobic treatment (durable)
Software and algorithms
Arduino IDE Arduino https://www.arduino.cc/en/software
ImageJ NIH https://imagej.nih.gov/ij/
MATLAB MathWorks https://www.mathworks.com/products/matlab.html
Micro-manager Micro-manager https://micro-manager.org/
Microscope control software Albrecht Lab https://github.com/albrechtLab/MicroscopeControl
Neurotracker data analysis software Albrecht Lab https://github.com/albrechtLab/Neurotracker
Automated Microscope and Stimulation System
Axio Observer.A1 inverted microscope set up for epifluorescence (GFP filter cubes, 5× objective or similar) Zeiss Cat #491237-0012-000
Excelitas X-cite XYLIS LED illuminator Excelitas Cat #XYLIS
Orca Flash 4.0 Digital sCMOS camera Hamamatsu Cat #C11440-22CU
Arduino nano Arduino Cat #A000005
3-way Miniature Diapragm Isolation Valve (LQX12) Parker Cat #LQX12-3W24FF48-000 Valve 1: Control
2-way normally-closed (NC) Pinch Valve Bio-Chem Valve Inc Cat #075P2-S432 Valve 2: Outflow
3-way Pinch Valve NResearch Cat #161P091 Valve 3: Stimulus selection
Optogenetic stimulation LED and controller (615 nm) Mightex Cat #PLS-0625-030-S and #SLA-1200-2
ValveLink 8.2 digital/manual valve controller AutoMate Scientific Cat #01-18
Wires and connectors various See Fig. 2 of Cell STARS Protocol (Lawler, 2021)
Microfluidic Device Preparation
Dremel variable speed rotary cutter 4000  Dremel Cat #F0134000AB Set speed to 5k RPM for cutting glass
Dremel drill press rotary tool workstation Dremel Cat #220-01
Diamond drill bit Dremel Cat #7134
Glass slide, 1 mm thick VWR Cat #75799-268
Glass scribe (Diamond scriber) Ted Pella Cat #54468
Luer 3-way stopcock Cole-Parmer Cat #EW-30600-07
Luer 23 G blunt needle VWR Cat #89134-100
Microfluidic device Corresponing author or fabricate from CAD files associated with this article N/A
Microfluidic device clamp Warner Instruments (or machine shop) P-2
Microfluidic tubing, 0.02″ ID Cole-Parmer Cat #EW-06419-01
Tube 19 G, 0.5″ New England Small Tube Cat #NE-1027-12

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References

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  24. Boulin, T. Reporter gene fusions. WormBook. , (2006).

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Neurosciences numéro 193
Stimulation multimodale automatisée et enregistrement neuronal simultané à partir de plusieurs petits organismes
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White, H., Kamara, V., Gorski, V.,… More

White, H., Kamara, V., Gorski, V., Busby, M., Albrecht, D. R. Automated Multimodal Stimulation and Simultaneous Neuronal Recording from Multiple Small Organisms. J. Vis. Exp. (193), e65042, doi:10.3791/65042 (2023).

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