Summary
Presentamos un método para la estimulación química flexible y multimodal y el registro de la actividad neuronal simultánea de muchos gusanos Caenorhabditis elegans . Este método utiliza microfluídica, hardware y software de código abierto y análisis de datos automatizados supervisados para permitir la medición de fenómenos neuronales como la adaptación, la inhibición temporal y la diafonía de estímulos.
Abstract
Los indicadores fluorescentes de calcio codificados genéticamente han contribuido en gran medida a nuestra comprensión de la dinámica neuronal desde el nivel de las neuronas individuales hasta los circuitos cerebrales completos. Sin embargo, las respuestas neuronales pueden variar debido a la experiencia previa, los estados internos o los factores estocásticos, lo que genera la necesidad de métodos que puedan evaluar la función neuronal en muchos individuos a la vez. Mientras que la mayoría de las técnicas de registro examinan un solo animal a la vez, describimos el uso de microscopía de campo amplio para ampliar las grabaciones neuronales a docenas de Caenorhabditis elegans u otros organismos a escala submilimétrica a la vez. El hardware y el software de código abierto permiten una gran flexibilidad en la programación de experimentos totalmente automatizados que controlan la intensidad y el tiempo de varios tipos de estímulos, incluidos los estímulos químicos, ópticos, mecánicos, térmicos y electromagnéticos. En particular, los dispositivos de flujo microfluídico proporcionan un control preciso, repetible y cuantitativo de los estímulos quimiosensoriales con una resolución de tiempo inferior a un segundo. La tubería de análisis de datos semiautomatizada NeuroTracker extrae respuestas neuronales individuales y de toda la población para descubrir cambios funcionales en la excitabilidad y dinámica neuronal. Este artículo presenta ejemplos de medición de la adaptación neuronal, la inhibición temporal y la diafonía de estímulos. Estas técnicas aumentan la precisión y la repetibilidad de la estimulación, permiten la exploración de la variabilidad de la población y son generalizables a otras señales fluorescentes dinámicas en pequeños biosistemas, desde células y organoides hasta organismos completos y plantas.
Introduction
Las técnicas de imagen de calcio han permitido el registro no invasivo de la dinámica neuronal in vivo en tiempo real utilizando microscopía de fluorescencia e indicadores de calcio codificados genéticamente expresados en células diana 1,2,3. Estos sensores suelen utilizar una proteína fluorescente verde (GFP), como la familia de péptidos GFP-calmodulina-M13 (GCaMP), para aumentar la intensidad de fluorescencia tras la activación neuronal y los niveles elevados de calcio intracelular. Las imágenes de calcio han sido especialmente poderosas en el nematodo C. elegans para examinar cómo funcionan las neuronas y los circuitos neuronales en animales vivos, comportándose 4,5,6,7,8,9,10, ya que su naturaleza transparente significa que no se requiere ningún proceso quirúrgico para el acceso óptico, y los promotores de genes específicos de células dirigen la expresión a las células de interés. Estas técnicas a menudo hacen uso de dispositivos microfluídicos, que proporcionan ambientes controlados con precisión para estudiar fenómenos biológicos, químicos y físicos a pequeña escala física11,12. Los dispositivos microfluídicos abundan para medir la actividad neuronal, con nuevos diseños continuamente en desarrollo, y se fabrican fácilmente en el laboratorio de investigación. Sin embargo, muchos diseños atrapan a un solo animal a la vez, limitando el rendimiento experimental 7,9,13. Las respuestas neuronales a menudo varían sustancialmente entre los animales debido a diferencias en la experiencia previa, estados internos como el estrés o el hambre, o factores estocásticos como los niveles de expresión génica. Estas diferencias establecen la necesidad de métodos que puedan estimular y observar simultáneamente muchos animales y extraer información de los individuos4.
Además, ciertos fenómenos neuromoduladores se hacen evidentes sólo bajo condiciones específicas de estimulación, como la inhibición temporal14, que se refiere a la breve supresión de las respuestas cuando la estimulación ocurre en rápida sucesión. Los sistemas electrofisiológicos pueden impulsar la actividad neuronal a través de un amplio espacio de estímulo para este propósito, modulando, por ejemplo, la corriente de pulso eléctrico, el voltaje, la frecuencia, la forma de onda, el ciclo de trabajo y la sincronización de los trenes de estímulos periódicos. La estimulación indirecta por estímulos detectados naturalmente o sistemas optogenéticos se beneficiaría de una amplitud similar de mecanismos de control. Actualmente, muchos estímulos naturales se presentan de una manera simple "on-off", como la presentación y eliminación de olores, utilizando sistemas comerciales que han tardado en agregar flexibilidad. Sin embargo, los microcontroladores de bajo costo ahora pueden automatizar la entrega de varios tipos de estímulos de una manera que se puede personalizar según las necesidades de los investigadores. Combinados con la microfluídica, estos sistemas han logrado el objetivo de aumentar el rendimiento experimental y la flexibilidad, permitiendo que las respuestas neuronales a una variedad de estímulos precisos se midan simultáneamente en muchos animales 4,6. La estimulación multimodal se puede utilizar para interrogar aún más los circuitos neuronales, por ejemplo, mediante el monitoreo de los cambios en la excitabilidad neuronal cuando se estimula consistentemente antes, durante y después de una perturbación ortogonal como la exposición a drogas4. Los beneficios de los sistemas de microscopía abiertos y económicos son claros para avanzar en la investigación científica, pero en la práctica, la necesidad de abastecimiento de piezas, construcción y validación del rendimiento puede impedir la adopción de estas técnicas.
Este protocolo tiene como objetivo aliviar algunos de estos desafíos técnicos. Mientras que los protocolos anteriores se han centrado en el uso de dispositivos microfluídicos y la estimulación básica 9,15,17, describimos aquí la construcción y el uso de un sistema de administración de estímulos flexible, automatizado y multimodal para imágenes neuronales en C. elegans u otros organismos pequeños utilizando dispositivos microfluídicos previamente descritos4. El sistema de código abierto está programado a través de archivos de texto simples para definir los experimentos, y el programa de análisis de datos NeuroTracker extrae semiautomáticamente los datos de actividad neuronal de los videos del microscopio. Demostramos este sistema con ejemplos de evaluación de la inhibición temporal, la desinhibición y la diafonía de estímulos utilizando la neurona quimiosensorial AWA, que se despolariza en respuesta a diferentes olores de alimentos o en respuesta a la luz al expresar canales iónicos optogenéticos sensibles a la luz 5,6.
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Protocol
1. Equipo de imagen neuronal
NOTA: Consulte Lawler y Albrecht15 para obtener instrucciones detalladas sobre la construcción del sistema de imágenes y estimulación, que controla el tiempo de iluminación del microscopio, la adquisición de imágenes y la entrega de estímulos (Figura 1). Un controlador de estímulo Arduino Nano de bajo costo acciona las válvulas fluídicas a través de señales digitales a un controlador de válvula y controla la iluminación optogenética a través de señales de voltaje analógicas a un controlador LED. Otros estímulos, como los motores de vibración y los calentadores térmicos, se pueden controlar mediante señales digitales o analógicas. El controlador de estímulo sincroniza la estimulación y la grabación de imágenes a través de señales de cámara, según lo especificado por el software de control de microscopio Micro-Manager (μManager) de código abierto16. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales, reactivos, equipos y organismos utilizados en este protocolo.
- Configure el equipo de imágenes neuronales, incluido un microscopio de epifluorescencia con óptica GFP, una cámara sCMOS con una señal de salida de exposición digital y un controlador de estímulo15.
- Conecte el controlador de estímulo a los sistemas deseados a través de señales digitales o analógicas. Para los ejemplos que se presentan a continuación, se utilizan los siguientes sistemas:
- Use un controlador de válvula para la estimulación química. Conecte el controlador de la válvula al solenoide fluídico o a las válvulas de pellizco (Figura 1)15.
- Utilice un LED rojo de 615 nm y un controlador para la estimulación optogenética, montado sobre la etapa del microscopio.
- Configure la computadora con el software de control del microscopio, cree un ajuste preestablecido de configuración con los ajustes del equipo y asegúrese de que el control de estímulofuncione correctamente 15.
2. Fabricación de dispositivos microfluídicos
NOTA: Ver Lagoy et al.17 para información detallada sobre la obtención o fabricación de los moldes maestros y la producción, uso y limpieza de los dispositivos microfluídicos. Estos pasos se resumen a continuación.
- Obtenga o fabrique un molde maestro utilizando el archivo de diseño microfluídico proporcionado (albrechtlab.github.io/microfluidics)17. Para adultos jóvenes C. elegans, asegúrese de que la altura del canal sea de 55-70 μm.
- Combine la base PDMS y el agente de curado en una proporción de 10:1 en peso y mezcle bien con pipetas de transferencia.
- Desgasificar durante 30-60 min en un desecador al vacío hasta que las burbujas desaparezcan.
- Coloque el molde maestro en una placa de Petri grande (150 mm de diámetro) y vierta el PDMS desgasificado hasta una profundidad de 4-5 mm (~ 100 g). Inspeccione y elimine cualquier polvo o burbuja con una pipeta de transferencia.
- Hornear a 65 °C en un estante de horno nivelado durante 3 h durante toda la noche.
- Una vez curado, use un bisturí para cortar el PDMS del molde y una cuchilla de afeitar recta para separar los dispositivos.
- Perfore los orificios de entrada y salida con un punzón dérmico de 1 mm y límpielos con dH 2 O, etanol y nuevamente condH2O. Seque el dispositivo en una corriente de aire (consulte la figura 2A).
- Limpie ambos lados del dispositivo PDMS con cinta adhesiva, eliminando cualquier polvo o suciedad.
- Prepare los portaobjetos de vidrio para completar el dispositivo microfluídico como se describe17. Perfore los orificios de entrada en el portaobjetos superior con una broca de diamante y haga que el portaobjetos inferior sea hidrófobo mediante la exposición a vapores TFOCS o aplicando un tratamiento de vidrio repelente al agua (Figura 2B).
- Ensamble el sándwich de dispositivo PDMS de vidrio en una abrazadera (Figura 2C).
3. Preparación animal
- Obtener o crear animales con indicadores de calcio codificados genéticamente expresados en las neuronas de interés.
NOTA: Por ejemplo, la línea NZ1091 (kyIs587 [gpa-6p::GCaMP2.2b; unc-122p::d sRed]; kyIs5662 [odr-7p::Chrimson:SL2:mCherry; elt-2p::mCherry]) expresa GCaMP y el canal catiónico sensible a la luz roja Chrimson en el par6 de neuronas sensoriales AWA. Ambos transgenes están integrados en el genoma para una expresión estable en cada animal. - Un día antes de la experimentación, coloque al menos 20 larvas L4 en estadio larvario C. elegans por experimento en una placa de agar del medio de crecimiento de nematodos (NGM) sembrada con un césped OP50 E. coli. Cuando se mantiene a 20 °C, esto sincronizará a los animales de tipo salvaje en la etapa adulta joven al día siguiente.
NOTA: Para los transgenes de matriz, seleccione animales utilizando un estereoscopio de fluorescencia para garantizar la expresión transgénica en los animales elegidos.
4. Preparación de la solución
- Preparar 1x tampón basal S (100 mM NaCl y 0,05 M KPO4, pH 6,0) a partir de una solución madre 10x.
- Preparar 1 mM de tampón tetramisol diluyendo 1 M de caldo en 1x S Basal. Utiliza este tampón paralítico para preparar todos los estímulos. Un experimento típicamente usa alrededor de 150 ml.
- Agregue 0.1-1 μg / ml de fluoresceína a los depósitos de tampón de "control" para visualizar el flujo.
- Crear soluciones de estímulo por dilución en serie a la concentración final deseada. Por ejemplo, cree una dilución 10−7 del atrayente de diacetilo creando primero una cepa 10−3 .
NOTA: Se puede agregar una pequeña cantidad de fluoresceína (0.1–1 μg/mL) al estímulo o solución tampón para verificar el momento del estímulo, pero la concentración debe ser mínima para evitar artefactos en la fluorescencia neural.
5. Preparación del dispositivo microfluídico
NOTA: Consulte Reilly et al.9 para un protocolo de video que muestra la generación del reservorio, la configuración del dispositivo y la carga de los animales. Ver también Lagoy et al.17 para un protocolo escrito que incluye muchos consejos útiles.
- Prepare tres o más depósitos de líquido. Para cada uno, conecte un depósito de jeringa de 30 ml o 60 ml, una jeringa de cebado de 3 ml y un talón de aguja a una válvula Luer de tres vías (Figura 2D). Conecte la aguja a un tubo de microorificio equipado con un tubo de metal en el extremo. Etiquete los depósitos, móntelos en un bastidor conectado a un soporte de anillo y llénelos con el tampón correspondiente o fluidos de estímulo (Figura 2E).
- Desgasificar el dispositivo microfluídico ensamblado en un desecador de vacío durante ~ 1 h.
- Llene y retire las burbujas de aire del tubo del depósito con la jeringa de cebado. Llene el tubo de salida con tampón.
- Retire el dispositivo microfluídico de la aspiradora e inserte rápidamente el tubo de salida e inyecte el líquido a través del dispositivo hasta que surja una gota de una entrada.
- En esta entrada, utilice una conexión "gota a gota"17 para insertar el tubo de entrada fluídico correspondiente (Figura 2F). Asegúrese de que haya gotas de líquido tanto en el tubo de entrada como en el orificio del puerto del dispositivo para evitar la introducción de una burbuja.
- Inyecte más líquido de la salida, conecte el siguiente tubo de entrada y repita hasta que todas las entradas estén llenas. Inserte un pasador de bloqueo sólido en cualquier entrada no utilizada y en el puerto de carga del gusano.
- Inicie el flujo abriendo las válvulas Luer de entrada y salida. Inspeccione el dispositivo en busca de fugas en las entradas y la base de vidrio. Inspeccione el dispositivo en busca de burbujas dentro de los canales de flujo o entradas utilizando el software de captura de imágenes de microscopio en modo en vivo.
NOTA: Si hay burbujas, espere a que se absorban en el material PDMS.
6. Carga de animales
NOTA: Ver Lagoy et al.17.
- Transfiera animales adultos jóvenes a una placa de agar NGM sin semillas usando un "pico" con punta de alambre.
- Inunde la placa con aproximadamente 5 ml de tampón basal 1x S de modo que los animales estén nadando.
- Extraiga los gusanos en una jeringa de carga (jeringa de 1 ml o 3 ml con tubo conectado que haya sido prellenado con 1x S Basal).
- Usando un estereoscopio, mueva el extremo del tubo debajo de la superficie del líquido con una mano hacia cada animal deseado, y tráigalo hacia el tubo usando la jeringa sostenida en la otra mano.
- Extraiga los gusanos solo en el tubo, no en la jeringa.
NOTA: El tubo generalmente contiene solo alrededor de 100 μL. Los animales pueden ser expulsados a un área local y luego arrastrados nuevamente al tubo con un pequeño volumen.
- Cierre la línea de salida, retire el pasador de carga del gusano y conecte la jeringa de carga del gusano al dispositivo mediante una conexión gota a gota.
- Fluya suavemente a los animales hacia la arena, establezca un flujo amortiguador y permita hasta 1 h para la inmovilización por tetramisole.
NOTA: Durante el período de inmovilización, asegúrese de que solo el líquido amortiguador ingrese a la arena. Los depósitos de estímulo y control se pueden apagar durante este período, pero ábralos y verifique el flujo correcto antes de ejecutar los ensayos de estimulación.
7. Estimulación automatizada y registro neuronal
- Cree un archivo de texto de definición de estímulo llamado "Configuración de adquisición definida por el usuario.txt" con un editor de texto (por ejemplo, Bloc de notas) que contenga los ajustes de estimulación para la adquisición automatizada de imágenes (consulte los ejemplos de la Figura 3). La configuración se divide en dos secciones:
- Configuración de adquisición del microscopio: Defina el tipo de experimento (estímulo único o patrón múltiple), el tiempo de exposición y excitación, la duración y los intervalos de la prueba, y guarde el directorio.
- Ajustes de estimulación: Definir los parámetros de control de estímulos. Un "comando de estimulación" especifica las acciones que ocurren en ciertos fotogramas de video con la sintaxis
, donde los códigos de letras son A = válvula1, B = válvula2, C = válvula3, L = luz LED; Además, mayúsculas = on y minúsculas = off. La intensidad del LED se establece con el código de letra "i" y un valor de 0 (apagado) a 255 (brillo máximo).
NOTA: El valor de intensidad del LED de 0 a 255 establece el voltaje analógico de salida de 0 V a 5 V. El controlador de corriente utilizado aquí tiene una escala de intensidad lineal, y otros deben calibrarse con un medidor de potencia ligera.- Para un experimento de estímulo único con un solo comando de estimulación repetida, use el formato de la Figura 3A.
- Para un experimento multipatrón con múltiples comandos de estimulación, use el formato de la Figura 3B. Incluye una "secuencia de patrones" de dígitos que represente el orden de los patrones de estímulo. Para cada patrón, introduzca un comando de estimulación en una línea separada.
NOTA: Una secuencia pseudoaleatoria o secuencia m puede ser útil para investigar la dependencia del historial de estímulos.
- Ejecute el software de control del microscopio. Verifique que todas las entradas fluídicas estén abiertas, que el flujo sea el deseado dentro de la arena (ver Figura 2H) y que las neuronas de interés estén enfocadas dentro de la ventana activa.
- Cierre la ventana en vivo y ejecute el script "MultiPattern_RunScript.bsh" dentro del software.
NOTA: Es útil realizar un experimento de prueba sin animales para verificar el flujo y la estimulación adecuados. Sustituir una concentración de fluoresceína diferente para cada fluido de estímulo puede ayudar a visualizar y documentar nuevos patrones de estímulo. - Después de la experimentación, desmonte el dispositivo microfluídico y enjuague todas las superficies, tubos y depósitos con agua.
NOTA: Todos los componentes se pueden reutilizar docenas de veces si se mantienen limpios. Asegúrese de que los depósitos, tubos y dispositivos microfluídicos se mantengan húmedos o completamente secos en una corriente de aire para evitar la cristalización de la sal, que puede obstruirse y es difícil de eliminar. Los dispositivos pueden conservarse en etanol para esterilizar, pero deben secarse completamente antes de su reutilización (>1 h a 65 °C)17.
8. Análisis de datos con NeuroTracker
NOTA: NeuroTracker 4,18,19 es un complemento de software ImageJ / FIJI20 para rastrear la intensidad de fluorescencia de múltiples neuronas y animales, incluso mientras se mueven durante los ensayos. Este complemento guarda los datos como archivos de texto con la posición de cada neurona y la intensidad de fluorescencia (F) corregida en segundo plano. Los datos de fluorescencia se normalizan a la fluorescencia basal (F 0), por ejemplo, el promedio de varios segundos antes de la estimulación, como Δ F / F 0 = (F -F 0) / F 0, que se puede promediar entre las poblaciones.
- Instale los scripts de NeuroTracker según las instrucciones (github.com/albrechtLab/Neurotracker).
- Ejecute NeuroTracker haciendo clic en Plugins | Seguimiento | NeuroTracker.
- Seleccione la carpeta que contiene el archivo . Archivos de video TIF para ser rastreados y seleccione la configuración deseada.
NOTA: Si sólo se va a realizar un seguimiento de un subconjunto de los archivos de vídeo, seleccione el rango numérico de los archivos que desea analizar cuando se le solicite. La configuración de seguimiento predeterminada es adecuada para animales inmóviles con una resolución de 250 píxeles/mm. Ajuste los parámetros proporcionalmente para otras resoluciones. Consulte la Guía del usuario19 para obtener más información sobre la configuración. - Establezca el umbral de intensidad de tal manera que las neuronas sean visibles para la selección (Figura 4).
- Abra las ventanas de control Brillo/Contraste (B/C) y Umbral mediante la imagen | Ajustar menú.
- En la ventana B/C , ajuste los controles deslizantes Mínimo y Máximo hasta que las neuronas sean claramente distinguibles (Figura 4A).
- En la ventana Umbral , marque Fondo oscuro y No restablecer rango.
- Deslice el control deslizante del marco para observar el movimiento de la neurona y los cambios de intensidad, observando cualquier animal que se excluya del seguimiento, como debido a la superposición con otros animales.
- Identificar las neuronas para el seguimiento.
- Para cada animal, ajuste el nivel umbral de tal manera que el área umbral roja sobre la neurona sea visible en cada cuadro antes, durante y después de la estimulación.
- Haga clic en la neurona para registrar su posición y nivel de umbral.
- Repita el ajuste y la selección del umbral para cada animal y neurona a rastrear. Consulte la Figura 4C para un buen ejemplo de nivel de umbral y la Figura 4D,E para ejemplos de umbral superior y bajo. Las neuronas previamente seleccionadas se indican mediante una pequeña caja.
- Cuando se seleccionen todas las neuronas, presione la barra espaciadora para comenzar el seguimiento.
NOTA: Para ejemplos adicionales de NeuroTracker, consulte las referencias anteriores 4,19. - Supervise el proceso de seguimiento de cada animal y realice las correcciones necesarias.
- Si NeuroTracker se detiene, ha perdido la neurona. Vuelva a hacer clic en la neurona, ajustando el nivel de umbral según sea necesario.
- Si el cuadro de integración salta a otro animal cercano o estructura no neuronal, presione la barra espaciadora para hacer una pausa, mueva el control deslizante de nuevo al primer fotograma erróneo y vuelva a hacer clic en la ubicación correcta de la neurona.
9. Exploración y visualización de datos
NOTA: El script de análisis de MATLAB se utiliza para el procesamiento y la visualización de datos y para generar PDF de resumen para cada análisis.
- Ejecute el archivo "NeuroTrackerSummary_pdf.m" en MATLAB y seleccione la carpeta que contiene los archivos de texto de datos de NeuroTracker.
- Espere a que se produzca un PDF resumido, que permita la verificación del proceso de seguimiento (Figura 5). Los animales se identifican por un número (Figura 5A), y las respuestas neuronales de cada animal y ensayo se pueden ver para evaluar la variabilidad de la población (Figura 5B).
- Utilice la función "databrowse.m" para explorar los datos neuronales, por ejemplo, agrupando por número de ensayo (Figura 5C), por número de animal (Figura 5D), por patrón de estimulación o por otra categoría.
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Representative Results
Presentamos varios ejemplos de patrones de estímulo que evalúan diferentes fenómenos neuronales, incluida la inhibición temporal, la adaptación y la desinhibición. La inhibición temporal es la supresión momentánea de una respuesta neural a una segunda presentación de estímulo que ocurre poco después de la presentación inicial14. Para probar este fenómeno, en un experimento de pulso pareado, se presentaron ocho patrones que consisten en dos pulsos odorantes de 1 s separados por un intervalo que varía de 0 s a 20 s (Figura 6B; ver Figura 3B para el archivo de control de estímulo correspondiente). La arena se configuró con un solo fluido de estímulo (1.1 μM de diacetilo), tampón y tubo de flujo de control, con el puerto de entrada no utilizado bloqueado con un pin sólido (Figura 6A). Al encender la válvula 1, el fluido de control entra en la entrada ctrl1, desplazando las corrientes de fluido de tal manera que el estímulo entra en la arena; cuando la válvula 1 está apagada, el fluido de control entra en la entrada CTRL2 y el amortiguador fluye a través de la arena (ver Figura 2G,H). Mientras que el primer pulso de olor de 1 s provocó una magnitud de respuesta igual en las neuronas AWA que detectan diacetil, las respuestas al segundo pulso variaron con el intervalo interestímulo (Figura 6D). Para intervalos de pulso de menos de 10 s, la segunda respuesta fue más débil, lo que demuestra el fenómeno de inhibición temporal. Usando esta configuración experimental, se encontró que la interrupción del componente de dineína CHE-3 previene la inhibición temporal, implicando el transporte axonal en este fenómeno5.
La adaptación es la disminución gradual de las respuestas neuronales a presentaciones repetidas del mismo estímulo. Este fenómeno puede ser causado por diferentes procesos, como la inhibición activa, que puede revertirse rápidamente, u otros procesos que son lentos para revertirse. Un experimento para evaluar la reversibilidad rápida es un ensayo de "captura", en el que se repite un estímulo para establecer la adaptación, seguido de un estímulo "desviado" o novedoso, y luego un retorno al estímulo original. La desinhibición se observa si las respuestas neuronales aumentan después del nuevo estímulo "desinhibidor". La Figura 7 muestra un ejemplo utilizando dos odorantes, diacetilo y 2-metilpirazina (2-MP), detectados por las neuronas quimiosensoriales AWA a través de diferentes receptores4. Se conectaron dos depósitos de estímulo y tubos al dispositivo microfluídico, con una válvula de pellizco adicional de tres vías para determinar qué estímulo ingresa a la arena (Figura 7A). Los patrones de estímulo se definieron para presentar pulsos químicos durante 4 s a través de la válvula 1 para los 30 ensayos y para seleccionar entre el estímulo S1 o S2 a través de la válvula 3, que se encendió después del 25º ensayo y se apagó después del 26º (Figura 7B). Esta disposición aseguró el tiempo suficiente para que los diferentes fluidos de estímulo fluyeran a través del dispositivo microfluídico antes de su presentación a los animales. Se observó adaptación al estímulo diacetilo, pero la presentación del nuevo estímulo 2-MP no provocó un fuerte efecto de desinhibición (Figura 7C).
La estimulación optogenética utiliza la luz para activar las neuronas a través de canales iónicos sensibles a la luz. Si bien es conveniente de usar, la activación optogenética evita los receptores sensoriales y algunas vías reguladoras, por lo que algunos fenómenos neuronales pueden diferir en comparación con la activación por estímulos naturales. Para probar estas diferencias, los experimentos multimodales son útiles para presentar diferentes tipos de estimulación dentro de un solo experimento. Las neuronas que expresan la variante Chrimson de canalrodopsina se activan por la exposición a la luz roja5. Para evaluar si las neuronas AWA se adaptan de manera similar a la estimulación química y optogenética, la cepa NZ1091 que expresa tanto Chrimson como GCaMP en las neuronas AWA se mantuvo en una placa que contiene el cofactor todo-trans-retinal (ATR, 100 μM) durante 14-28 h. Un LED rojo de 615 nm iluminó la arena microfluídica desde arriba (Figura 8A), y se generó un conjunto de patrones de estímulo multimodal al proporcionar pulsos de 5 s de diacetilo, luz roja o ambos dentro del mismo ensayo (Figura 8B). La estimulación química sola causó adaptación, mientras que la estimulación óptica sola no lo hizo (Figura 8C). Sin embargo, el patrón de estímulo multimodal combinado demostró que las respuestas optogenéticas eran susceptibles a la adaptación inducida químicamente (Figura 8C, D). Estos experimentos sugieren que la adaptación se inicia en los receptores sensoriales o procesos dendríticos, pero sus efectos se extienden por toda la neurona.
Figura 1: Esquema del equipo de registro y estimulación del calcio neural. La captura de imágenes del microscopio, la luz de excitación fluorescente y la estimulación son controladas por una computadora y un microcontrolador Arduino de código abierto. La estimulación química en el campo microfluídico cambia entre el tampón B y las soluciones de estímulo S a través del flujo de fluido de control C. Los elementos opcionales del sistema se indican con un asterisco (*), como válvulas adicionales y modalidades de estimulación óptica u otras. Las imágenes de microscopio de fluorescencia se utilizan para medir la actividad neuronal a través de transitorios de calcio, por ejemplo, utilizando el indicador de calcio GCaMP. Las líneas discontinuas representan las conexiones eléctricas (digitales o analógicas), las líneas curvas son el tubo de fluido y las flechas rectas sólidas son las trayectorias de luz óptica. Abreviatura: LED = diodo emisor de luz. Esta cifra se modifica de Lawler y Albrecht15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Montaje y configuración del dispositivo microfluídico. El dispositivo microfluídico se compone de un (A) dispositivo PDMS microestampado intercalado entre una (B) tapa de vidrio perforado y una base de vidrio hidrófobo y (C) sujetado. (D) Los depósitos se colocan sobre el dispositivo con un soporte de bastidor de tubos (E). La tubería de los depósitos se conecta directamente al dispositivo o a través de válvulas accionadas para el control fluídico. El dispositivo se coloca por encima del objetivo en el microscopio. (F) Imagen en primer plano del dispositivo microfluídico con todos los tubos conectados en las entradas, el puerto de carga de gusanos y la salida. (G) Esquema del dispositivo microfluídico de 20 mm x 20 mm. Las líneas negras representan los canales de fluido de 55-70 μm de altura. Esta geometría está diseñada para permitir un control espaciotemporal preciso con un estímulo frontal perpendicular al flujo mientras se mantiene a los animales dentro de la arena y el campo de visión del microscopio. La corriente de amortiguación y una corriente de estímulo (u opcionalmente Stim2, si se usa) fluyen continuamente, mientras que solo una entrada de fluido de control fluye a la vez, cambiando qué fluido ingresa a la arena. (H) Cuando la válvula 1 está energizada, el fluido de control fluye desde el puerto normalmente cerrado a la entrada de control1, y el estímulo se enciende y fluye a través de la arena. Cuando la válvula 1 está apagada, el fluido fluye desde el puerto normalmente abierto hasta la entrada de control2, y el búfer entra en la arena. Se muestra el equilibrio de flujo adecuado, con colorante fluoresceína utilizado como fluido de estímulo. Tenga en cuenta que parte del fluido que ingresa a la arena también lo evita a través de los canales curvos superior e inferior. Estas corrientes deben ser estrechas y tener el mismo ancho en los canales superior e inferior. Las alturas del depósito se pueden ajustar según sea necesario. Abreviaturas: PDMS = polidimetilsiloxano; WL = carga de gusanos; Buf = búfer; Stim1 = primer estímulo; Stim2 = segundo estímulo; NC = normalmente cerrado; NO = normalmente abierto. Esta cifra se modifica de Lawler y Albrecht15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Ejemplo de archivos de definición de estímulos. (A) Ejemplo de experimento de estímulo repetido único: un pulso de luz de 5 s a intensidad 200 de 2 s a 7 s (fotograma 20 a 70). (B) Ejemplo de experimento de estímulo multipatrón con ocho patrones de estímulo diferentes, correspondientes a la Figura 6. Se presentan dos pulsos químicos de 1 s con un intervalo de 0 s a 20 s entre ellos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Selección de neuronas y niveles umbral en NeuroTracker. (A) Campo de visión de microscopio completo, con el brillo y el contraste ajustados para ver claramente las neuronas AWA. (B) Vista ampliada de la región de la cabeza de un animal que representa la caja de integración desde la cual se calcula la intensidad de fluorescencia y el anillo de fondo para la resta de fondo. (C) Diagrama de intensidad integrado que muestra una respuesta neuronal robusta. (D) Una buena selección de umbral dará como resultado una región de umbral roja que está por encima del parámetro Tamaño mínimo y por debajo del parámetro Tamaño máximo para cada fotograma de la pila de imágenes y no incluye regiones cercanas, como la autofluorescencia intestinal (consulte el panel B). (E) Un umbral demasiado alto puede parecer bueno cuando la neurona está activa, pero cuando está inactiva, la neurona puede perderse. Por lo tanto, es importante verificar los marcos de preestimulación y postestimulación al seleccionar un umbral. (F) Un umbral demasiado bajo puede resaltar otras estructuras no neuronales. La selección por encima o por debajo del umbral puede hacer que NeuroTracker pierda la neurona y haga una pausa para recibir comentarios del usuario para corregir el umbral y la posición de la neurona. Abreviatura: B&C = brillo y contraste. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Ejemplo de análisis de datos. Respuestas neuronales de 15 animales expuestos a 10 repeticiones de estimulación optogenética de 5 s de duración una vez por minuto. (A) Imagen resumida que indica los animales rastreados y el movimiento de las neuronas dentro del ensayo (cajas rojas). El animal 2 se movió durante el ensayo. (B) Las respuestas individuales de los animales a lo largo del tiempo muestran una respuesta relativamente consistente a la estimulación de la luz roja. (C) Salida de exploración de datos utilizando la función de exploración de datos . Las trazas se agrupan por repetición de prueba (arriba), y los promedios se muestran a continuación para las pruebas seleccionables por el usuario. (D) Datos agrupados por número de animales individuales y promediados a través de ensayos repetidos. Este conjunto de datos muestra una variabilidad mínima entre animales, lo que justifica promediar las respuestas en toda la población. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Experimento de pulso pareado con un intervalo interestímulo variable para evaluar la inhibición temporal . (A) Conexiones de entrada de dispositivos microfluídicos. La entrada no utilizada se bloquea con un pasador sólido (X). El depósito de fluido de control y la válvula1 están conectados a las entradas c1 y c2, omitidas aquí para mayor claridad. (B) Tiempo de estímulo para ocho patrones. Los pulsos son de 1 s de duración y están separados por 0-20 s. La secuencia de patrones se representa a continuación; Cada patrón se presentó seis o siete veces. (C) Actividad neuronal AWA de 50 ensayos y nueve animales. Un mapa de calor de las respuestas ordenadas por patrón de estimulación se muestra arriba; La actividad neuronal media para cada patrón (n = 56-63 respuestas) se muestra a continuación. La inhibición temporal ocurre durante ~ 10 s después del pulso inicial. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Experimento de prueba de captura para evaluar la desinhibición . (A) Conexiones de entrada de dispositivos microfluídicos. Una válvula de pellizco de tres vías permite que solo el estímulo S1 pase en reposo y solo S2 pase cuando está energizado. (B) Diagrama de las tres secuencias de patrones utilizadas para administrar los pulsos repetidos de olor a diacetil, con el nuevo estímulo 2-metilpirazina presentado en el 26º ensayo. (C) Respuestas medias de actividad neuronal AWA en 20 animales. Abreviaturas: DA = diacetilo; 2-MP = 2-metilpirazina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: Ejemplo de estimulación multimodal . (A) Conexiones de entrada de dispositivos microfluídicos, con una entrada no utilizada bloqueada con un pin sólido. Un LED rojo ilumina la arena desde arriba. (B) Patrones para la estimulación óptica, química o multimodal. (C) Actividad neuronal media de AWA (n = 11 animales) para 30 ensayos repetidos con estimulación optogenética y quimiosensorial pareada (arriba), optogenética solo (media) y quimiosensorial solo (abajo). (D) Promedio de respuesta neuronal máxima para cada ensayo para pulsos optogenéticos por encima y pulsos químicos por debajo. Los pulsos optogenéticos no causan directamente adaptación, pero sus respuestas son susceptibles a la adaptación quimiosensorial. Abreviaturas: DA = diacetilo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En este protocolo, describimos un sistema de microscopía de acceso abierto para la evaluación de fenómenos de actividad neuronal utilizando la entrega temporalmente precisa de diferentes patrones de estímulo. La plataforma microfluídica ofrece estímulos repetibles mientras mantiene a decenas de animales en el campo de visión del microscopio. Pocos paquetes de software de microscopía comerciales permiten la fácil programación de varios patrones de sincronización de estímulos, y los que lo hacen a menudo requieren la entrada manual de cada patrón o formatos de archivo propietarios. En contraste, los experimentos se definen en este sistema por archivos de texto, que pueden ser generados por computadora y son legibles por software de análisis. Aquí, demostramos la utilidad de emplear patrones de estímulo variables para evaluar fenómenos neuronales como la inhibición temporal, la adaptación y la diafonía durante la estimulación multimodal. La canalización de análisis de datos reduce los archivos de video de microscopía grandes a datos de actividad neuronal que se pueden visualizar y analizar para determinar la variabilidad de la población (Figura 5B), los cambios a lo largo del tiempo (Figura 7C y la Figura 8C, D) y los cambios después de la perturbación (Figura 7C).
Un beneficio clave de la automatización es la reproducibilidad de la estimulación a través de repeticiones de ensayo y entre experimentos, y el formato de arena microfluídica permite al menos un aumento de 20 veces en el rendimiento en comparación con los métodos anteriores de un solo animal 7,9,13. Someter a una población de animales a las mismas condiciones ambientales y de estímulo garantiza que los datos sean comparables y evita posibles variaciones diarias en la preparación de la solución, la temperatura, las fuentes animales u otros factores. Sin embargo, una limitación de este enfoque es la microscopía de baja ampliación y baja resolución que mantiene a todos los animales en el campo de visión. Solo se debe controlar una neurona por animal para minimizar los errores de seguimiento, aunque las neuronas separadas por al menos 50 μm pueden, en principio, distinguirse. Los pares de neuronas bilaterales se pueden visualizar juntos si se espera que las respuestas sean simétricas. Es importante identificar primero qué neuronas específicas están involucradas en un proceso neuronal de interés, como por imágenes de todo el cerebro7, y luego expresar GCaMP solo en las neuronas relevantes para un mayor rendimiento.
Las respuestas neuronales al calcio varían según el animal debido a los niveles de expresión del informante u otras diferencias interindividuales. Por ejemplo, las respuestas normalizadas de AWA GCaMP varían dos veces en magnitud máxima, incluso en animales isogénicos de tipo salvaje con el reportero de calcio integrado de manera estable en el genoma4. Algunos estímulos muestran respuestas variables en toda la población (por ejemplo, acetato de butilo4), lo que sugiere una expresión variable del receptor. En la práctica, deben evaluarse al menos 20 animales individuales para determinar la variabilidad de la población. Se recomienda hacer uso de datos de animales individuales para aumentar el poder estadístico en la determinación de los cambios de respuesta, como mediante la comparación estadística de respuestas neuronales individuales emparejadas antes y después de una perturbación.
Con grandes conjuntos de datos y experimentación automatizada, es importante validar y verificar la función adecuada del experimento, el seguimiento y la reducción de datos, especialmente para los pasos desatendidos. Los patrones de flujo deben verificarse con soluciones fluorescentes (como en la Figura 2H) observando que no hay burbujas o fluido de control que ingrese a la arena en los videos grabados. Los conjuntos de datos deben validarse, por ejemplo, observando cualquier movimiento animal (como en la Figura 5A) y verificando respuestas neuronales suaves (como en la Figura 4C y la Figura 5B). Cualquier dato problemático debe ser excluido. También es importante verificar la agrupación de datos antes de promediar el uso de la función "databrowse" para garantizar que la respuesta promedio refleje las respuestas individuales.
El sistema de control de estimulación de código abierto es fácilmente extensible a otros estímulos a través de señales digitales o analógicas o comandos de comunicación en serie. Los estímulos graduales suelen ser controlables mediante entradas de voltaje analógico (0-5 V), como la intensidad de la luz LED o la magnitud del pulso del estimulador nervioso. Los estímulos de encendido y apagado generalmente se controlan con señales digitales (TTL), como la sincronización del estimulador eléctrico. Estas señales digitales también pueden accionar interruptores de relé para activar otros sistemas eléctricos, como motores de vibración para la estimulación mecanosensorial. Otros equipos utilizan comunicación en serie, como por ejemplo mediante conexión USB, con comandos de caracteres específicos transmitidos para definir acciones. Por ejemplo, los experimentos de dosis-respuesta pueden presentar varias concentraciones químicas automáticamente utilizando una válvula rotacional5 controlada por USB o un sistema de placas de pocillosmúltiples 6. Estos comandos se pueden agregar a los scripts de control de microscopio de código abierto para enviarlos a números de prueba específicos. Los retrasos de tiempo pueden incorporarse de manera similar; Por ejemplo, para pausar la prueba durante 1 h entre dos 30 episodios de estimulación de prueba, uno especificaría un experimento de prueba de 60 y agregaría una sola línea de código para pausar durante 1 h cuando el número de prueba llegue a 31.
La complejidad experimental es prácticamente ilimitada e incluso puede cambiar durante un experimento basado en la retroalimentación en vivo en un sistema de "circuito cerrado". Por ejemplo, la estimulación podría variar en tiempo real en función de la actividad neuronal, el comportamiento animal u otro parámetro cuantificable. Recientemente utilizamos un sistema de este tipo para evaluar las respuestas neuronales sensoriales en animales dormidos versus despiertos mediante la activación de la estimulación y el registro neuronal después de un cambio en el comportamiento 8,15. La función de seguimiento de movimiento de NeuroTracker permite el análisis de la actividad neuronal en animales que se mueven libremente para la correlación con la salida del comportamiento. Sin embargo, el seguimiento de animales individuales en movimiento requiere mucha atención, como cuando se cruzan, y, por lo tanto, se recomienda cargar menos animales por arena (alrededor de cinco) para minimizar estas interacciones.
En general, estas técnicas aumentan la precisión de la estimulación y el rendimiento experimental en la exploración de la variabilidad de la población y fenómenos neuronales específicos. Además de medir la actividad neuronal, estos métodos son generalizables a otros biosistemas, incluidas las plantas, que también se comunican a través de señales de calcio 21, cultivo de células neuronales y organoides cerebrales 22, así como a otras señales fluorescentes dinámicas, como sensores para actividad sináptica, liberación de neurotransmisores 23 y transcripción 24.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Fox Avery por probar estos protocolos y revisar el manuscrito y a Eric Hall por la asistencia de programación. El financiamiento para los métodos presentados en este documento fue proporcionado en parte por la National Science Foundation 1724026 (D.R.A.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacterial strains | |||
| E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Cat# OP50 | |
| Experimental models: Organisms/strains | |||
| C. elegans strains expressing GCaMP (and optionally, Chrimson) in desired neurons | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) or corresponding authors of published work | NZ1091, for example | |
| Chemicals, Treatments, and Worm Preparation Supplies | |||
| 2,3-Butanedione | Sigma-Aldrich | Cat# B85307 | diacetyl, example chemical stimulus |
| Calcium chloride, CaCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# C3881 | |
| Fluorescein, Sodium salt | Sigma-Aldrich | Cat# F6377 | |
| Glass water repellant | Rain-X | Cat #800002250 | glass hydrophobic treatment (single-use) |
| Magnesium chloride, MgCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# M2393 | |
| Nematode Growth Medium (NGM) agar | Genesee | Cat #: 20-273NGM | |
| Petri dishes (60 mm) | Tritech | Cat #T3305 | |
| Poly(dimethyl siloxane) (PDMS): Sylgard 184 | Dow Chemical | Cat# 1673921 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | Cat# P5655 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | Cat# P8281 | |
| Sodium chloride, NaCl | Sigma-Aldrich | Cat# S7653 | |
| (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane (TFOCS) | Gelest | CAS# 78560-45-9 | glass hydrophobic treatment (durable) |
| Software and algorithms | |||
| Arduino IDE | Arduino | https://www.arduino.cc/en/software | |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| Micro-manager | Micro-manager | https://micro-manager.org/ | |
| Microscope control software | Albrecht Lab | https://github.com/albrechtLab/MicroscopeControl | |
| Neurotracker data analysis software | Albrecht Lab | https://github.com/albrechtLab/Neurotracker | |
| Automated Microscope and Stimulation System | |||
| Axio Observer.A1 inverted microscope set up for epifluorescence (GFP filter cubes, 5× objective or similar) | Zeiss | Cat #491237-0012-000 | |
| Excelitas X-cite XYLIS LED illuminator | Excelitas | Cat #XYLIS | |
| Orca Flash 4.0 Digital sCMOS camera | Hamamatsu | Cat #C11440-22CU | |
| Arduino nano | Arduino | Cat #A000005 | |
| 3-way Miniature Diapragm Isolation Valve (LQX12) | Parker | Cat #LQX12-3W24FF48-000 | Valve 1: Control |
| 2-way normally-closed (NC) Pinch Valve | Bio-Chem Valve Inc | Cat #075P2-S432 | Valve 2: Outflow |
| 3-way Pinch Valve | NResearch | Cat #161P091 | Valve 3: Stimulus selection |
| Optogenetic stimulation LED and controller (615 nm) | Mightex | Cat #PLS-0625-030-S and #SLA-1200-2 | |
| ValveLink 8.2 digital/manual valve controller | AutoMate Scientific | Cat #01-18 | |
| Wires and connectors | various | See Fig. 2 of Cell STARS Protocol (Lawler, 2021) | |
| Microfluidic Device Preparation | |||
| Dremel variable speed rotary cutter 4000 | Dremel | Cat #F0134000AB | Set speed to 5k RPM for cutting glass |
| Dremel drill press rotary tool workstation | Dremel | Cat #220-01 | |
| Diamond drill bit | Dremel | Cat #7134 | |
| Glass slide, 1 mm thick | VWR | Cat #75799-268 | |
| Glass scribe (Diamond scriber) | Ted Pella | Cat #54468 | |
| Luer 3-way stopcock | Cole-Parmer | Cat #EW-30600-07 | |
| Luer 23 G blunt needle | VWR | Cat #89134-100 | |
| Microfluidic device | Corresponing author or fabricate from CAD files associated with this article | N/A | |
| Microfluidic device clamp | Warner Instruments (or machine shop) | P-2 | |
| Microfluidic tubing, 0.02″ ID | Cole-Parmer | Cat #EW-06419-01 | |
| Tube 19 G, 0.5″ | New England Small Tube | Cat #NE-1027-12 |
References
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