Summary
我々は、多くの カエノラブディティス・エレガンス 線虫からの同時神経活動の柔軟な化学的およびマルチモーダル刺激および記録のための方法を提示する。この方法は、マイクロフルイディクス、オープンソースのハードウェアとソフトウェア、および教師ありの自動データ分析を使用して、適応、時間的抑制、刺激クロストークなどの神経現象の測定を可能にします。
Abstract
蛍光遺伝暗号カルシウム指標は、個々の神経細胞レベルから脳回路全体までの神経動態の理解に大きく貢献しています。しかし、神経反応は、以前の経験、内部状態、または確率的要因によって異なる可能性があるため、一度に多くの個人の神経機能を評価できる方法が必要になります。ほとんどの記録技術は一度に1匹の動物を調べますが、広視野顕微鏡を使用して、ニューロンの記録を数十の カエノラブディティスエレガンス または他のサブミリメートルスケールの生物に一度にスケールアップすることについて説明します。オープンソースのハードウェアとソフトウェアにより、化学的、光学的、機械的、熱的、電磁的刺激など、さまざまな刺激タイプの強度とタイミングを制御する完全に自動化された実験をプログラミングする柔軟性が大幅に向上します。特に、マイクロ流体フローデバイスは、秒未満の時間分解能で化学感覚刺激の正確で再現性のある定量的制御を提供します。次に、NeuroTrackerの半自動データ分析パイプラインは、個人および集団全体の神経反応を抽出して、神経の興奮性とダイナミクスの機能的変化を明らかにします。本論文では、神経細胞の適応、時間的抑制、刺激クロストークの測定例を紹介します。これらの技術は、刺激の精度と再現性を高め、集団の多様性の探索を可能にし、細胞やオルガノイドから生物や植物全体に至るまで、小さな生物系における他の動的蛍光シグナルに一般化できます。
Introduction
カルシウムイメージング技術は、蛍光顕微鏡および標的細胞で発現される遺伝的にコードされたカルシウム指示薬を使用して、in vivo神経ダイナミクスの非侵襲的記録を可能にしました1,2,3。これらのセンサーは通常、GFP-カルモジュリン-M13ペプチド(GCaMP)ファミリーなどの緑色蛍光タンパク質(GFP)を使用して、ニューロンの活性化と細胞内カルシウムレベルの上昇時に蛍光強度を増加させます。カルシウムイメージングは、線虫C.エレガンスにおいて、ニューロンおよび神経回路が生きた行動動物4,5,6,7,8,9,10においてどのように機能するかを調べるために特に強力であり、その透明な性質は光学的アクセスのための外科的プロセスが不要であり、細胞特異的遺伝子プロモーターは目的の細胞への発現を標的とする。これらの技術は、多くの場合、マイクロ流体デバイスを利用し、正確に制御された環境を提供して、生物学的、化学的、および物理的現象を小さな物理的スケールで研究します11,12。神経活動を測定するためのマイクロ流体デバイスは豊富にあり、新しいデザインが継続的に開発されており、研究室で容易に製造できます。ただし、多くの設計では一度に1匹の動物をトラップするため、実験スループットが制限されます7、9、13。神経反応は、以前の経験、ストレスや空腹などの内部状態、または遺伝子発現レベルなどの確率的要因の違いにより、動物によって大きく異なることがよくあります。これらの違いは、多くの動物を同時に刺激して観察し、個体から情報を抽出することができる方法の必要性を確立します4。
さらに、特定の神経調節現象は、刺激が急速に連続して発生したときの応答の短時間の抑制を指す時間的抑制14などの特定の刺激条件下でのみ明らかになる。電気生理学的システムは、この目的のために、例えば、電気パルス電流、電圧、周波数、波形、デューティサイクル、および周期的な刺激列のタイミングを変調して、広い刺激空間にわたって神経活動を駆動することができる。自然に検出された刺激または光遺伝学的システムによる間接刺激は、同様の幅の制御メカニズムの恩恵を受けるでしょう。現在、多くの自然な刺激は、柔軟性を追加するのが遅い商用システムを使用して、匂いの提示や除去などの単純な「オンオフ」の方法で提示されます。しかし、安価なマイクロコントローラは、研究者のニーズに合わせてカスタマイズ可能な方法で、いくつかのタイプの刺激の送達を自動化できるようになりました。マイクロフルイディクスと組み合わせることで、これらのシステムは実験スループットと柔軟性の向上という目標を達成し、さまざまな正確な刺激に対する神経応答を多くの動物で同時に測定できるようになりました4,6。マルチモーダル刺激は、薬物曝露などの直交摂動の前、最中、および後に一貫して刺激するときの神経興奮性の変化を監視することなどによって、ニューロン回路をさらに調べるために使用することができる4。安価でオープンな顕微鏡システムの利点は、科学研究を進める上で明らかですが、実際には、部品の調達、構築、および性能検証の必要性がこれらの技術の採用を妨げる可能性があります。
このプロトコルは、これらの技術的課題のいくつかを軽減することを目的としています。以前のプロトコルはマイクロ流体デバイスの使用と基本的な刺激に焦点を当てていました9、15、17、ここでは、前述のマイクロ流体デバイスを利用するC.エレガンスまたは他の小さな生物における神経イメージングのための柔軟で自動化されたマルチモーダル刺激送達システムの構築と使用について説明します4。オープンソースシステムは、実験を定義するために単純なテキストファイルを介してプログラムされ、NeuroTrackerデータ分析プログラムは、顕微鏡ビデオから神経活動データを半自動的に抽出します。光遺伝学的光感受性イオンチャネル5,6を発現する際に、異なる食品の匂いに応答して、または光に応答して脱分極する化学感覚ニューロンAWAを使用して、時間的抑制、脱抑制、および刺激クロストークを評価する例を使用して、このシステムを実証します。
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Protocol
1. 神経画像機器
注:顕微鏡の照明タイミング、画像取得、および刺激の送達を制御するイメージングおよび刺激システムの構築に関する詳細な手順については、LawlerおよびAlbrecht15を参照してください(図1)。安価なArduino Nano刺激コントローラーは、バルブコントローラーへのデジタル信号を介して流体バルブを作動させ、LEDコントローラーへのアナログ電圧信号を介して光遺伝学的照明を制御します。振動モーターやサーマルヒーターなどの他の刺激は、デジタル信号またはアナログ信号を使用して制御できます。刺激コントローラは、オープンソースのMicro-Manager顕微鏡制御ソフトウェア(μManager)16で指定されているように、カメラ信号を介して刺激と画像記録を同期させます。このプロトコルで使用されるすべての材料、試薬、機器、および生物に関連する詳細については、材料の表を参照してください。
- GFP光学系を備えた落射蛍光顕微鏡、デジタル露光出力信号を備えたsCMOSカメラ、および刺激制御器15を含むニューラルイメージング機器をセットアップする。
- 刺激コントローラをデジタルまたはアナログ信号 を介して 目的のシステムに接続します。以下に示す例では、次のシステムが使用されます。
- 化学刺激にはバルブコントローラーを使用してください。バルブコントローラを流体ソレノイドまたはピンチバルブに接続します(図1)15。
- 615 nmの赤色LEDと光遺伝学的刺激用のコントローラーを使用し、顕微鏡ステージの上に取り付けます。
- 顕微鏡制御ソフトウェアを使用してコンピュータをセットアップし、機器設定を含む構成プリセットを作成し、刺激制御15の適切な動作を確認します。
2. マイクロ流体デバイスの作製
注:マスターモールドの入手または製造、およびマイクロ流体デバイスの製造、使用、および洗浄の詳細については、Lagoy et al.17 を参照してください。これらの手順を以下にまとめます。
- 提供されたマイクロ流体設計ファイル(albrechtlab.github.io/microfluidics)17を使用してマスターモールドを取得または製作します。若年成人 の場合 C.エレガンス、チャネルの高さが55〜70μmであることを確認してください。
- PDMSベースと硬化剤を重量比10:1で混合し、トランスファーピペットで十分に混合します。
- 気泡が消えるまで真空デシケーターで30〜60分間脱気します。
- マスターモールドを大きな(直径150 mm)ペトリ皿に入れ、脱気したPDMSを深さ4〜5 mm(~100 g)まで注ぎます。トランスファーピペットでほこりや気泡を検査して取り除きます。
- 水平なオーブン棚で65°Cで3時間から一晩焼きます。
- 硬化したら、メスを使用してPDMSを型から切り取り、まっすぐなかみそりの刃を使用してデバイスを分離します。
- 1 mmの皮膚パンチを使用して入口と出口の穴を開け、dH 2 O、エタノール、および再びdH2Oで洗浄します。 気流でデバイスを乾燥させます(図2Aを参照)。
- PDMSデバイスの両面を粘着テープで清掃し、ほこりや破片を取り除きます。
- スライドガラスを準備して、17に記載のマイクロ流体デバイスを完成させる。ダイヤモンドビットを使用して上部スライドに入口穴を開け、TFOCS蒸気にさらすか、撥水性ガラス処理を適用して下部スライドを疎水性にします(図2B)。
- ガラス-PDMSデバイスサンドイッチをクランプに組み立てます(図2C)。
3.動物の準備
- 目的のニューロンに発現する遺伝的にコードされたカルシウムインジケーターを持つ動物を取得または作成します。
注: たとえば、行 NZ1091 (kyIs587 [gpa-6p::GCaMP2.2b; unc-122p::d sRed]; kyIs5662 [odr-7p::Chrimson:SL2:mCherry; elt-2p::mCherry])GCaMPと赤色光感受性陽イオンチャネルクリムゾンをAWA感覚ニューロン対6で発現する。両方の導入遺伝子は、すべての動物で安定した発現のためにゲノムに組み込まれています。 - 実験の1日前に、実験ごとに少なくとも20匹のL4幼虫期 C.エレガンス を、OP50大腸 菌 芝生を播種した線虫増殖培地(NGM)寒天プレートに置きます。20°Cに維持すると、翌日の若年成体段階で野生型動物を同期させます。
注:アレイ導入遺伝子の場合は、蛍光ステレオスコープを使用して動物を選び、選択した動物で導入遺伝子を確実に発現させます。
4. 溶液調製
- 10x ストック溶液から 1x S 基礎バッファー (100 mM NaCl および 0.05 M KPO4, pH 6.0) を調製します。
- 1 Mストックを1x Sバサルで希釈することにより、1 mMテトラミソールバッファーを調製します。この麻痺バッファーを使用して、すべての刺激を準備します。実験では通常、約150mLを使用します。
- 0.1-1 μg/mLのフルオレセインを「コントロール」バッファーリザーバーに追加して、流れを視覚化します。
- 所望の最終濃度に段階希釈することにより、刺激溶液を作成します。たとえば、最初に10−3ストックを作成することにより、ジアセチル誘引剤の10−7希釈を作成します。
注:刺激のタイミングを確認するために、少量のフルオレセイン(0.1〜1 μg / mL)を刺激または緩衝液に追加できますが、神経蛍光のアーティファクトを避けるために濃度を最小限に抑える必要があります。
5. マイクロ流体デバイスの作製
注:貯水池の生成、デバイスのセットアップ、および動物の負荷を示すビデオプロトコルについては、 Reillyら9を参照してください。多くの役立つヒントを含む書面によるプロトコルについては、Lagoy et al.17 も参照してください。
- 3つ以上の液体リザーバーを準備します。それぞれについて、30 mLまたは60 mLのシリンジリザーバー、3 mLのプライミングシリンジ、およびニードルスタブを三方ルアーバルブに取り付けます(図2D)。最後に金属チューブが取り付けられたマイクロボアチューブに針を接続します。リザーバーにラベルを付け、リングスタンドに取り付けられたラックに取り付け、対応するバッファーまたは刺激液で満たします(図2E)。
- 組み立てたマイクロ流体デバイスを真空デシケーターで~1時間脱気します。
- プライミングシリンジを使用して、リザーバーチューブから気泡を満たして取り除きます。流出チューブにバッファーを充填します。
- マイクロ流体デバイスを真空から取り出し、出口チューブをすばやく挿入し、液滴が1つの入口から出てくるまでデバイスを通して流体を注入します。
- この入口で、「ドロップツードロップ」接続17 を使用して、対応する流体入口チューブを挿入します(図2F)。気泡が発生しないように、インレットチューブとデバイスポート穴の両方に液滴が存在することを確認してください。
- 出口からさらに液体を注入し、次の入口チューブを接続し、すべての入口が満たされるまで繰り返します。未使用のインレットとウォームローディングポートに固体ブロッキングピンを挿入します。
- 入口と出口のルアーバルブを開いて流れを開始します。インレットとガラスベースに漏れがないかデバイスを検査します。ライブモードで顕微鏡画像キャプチャソフトウェアを使用して、流路または入口内の気泡がないかデバイスを検査します。
注意: 気泡が存在する場合は、気泡がPDMS材料に吸収されるのを待ちます。
6.動物の積載
注:Lagoyら17を参照してください。
- ワイヤー先端の「ピック」を使用して、播種されていないNGM寒天プレートに若年成体動物を移します。
- 動物が泳ぐように、プレートに約5 mLの1x S基礎バッファーを浸します。.
- ワームをローディングシリンジ(1x Sバサルが事前に充填されたチューブが取り付けられた1 mLまたは3 mLシリンジ)に引き込みます。
- ステレオスコープを使用して、片手でチューブの端を液面の下に移動して、目的の動物にそれぞれ移動し、もう一方の手に保持されたシリンジを使用してチューブに引き込みます。
- ワームをチューブにのみ引き込み、シリンジには引き込みません。
注:チューブは通常約100μLしか保持しません。動物は局所的に排出され、その後、少量でチューブに再び引き込まれます。
- アウトレットラインを閉じ、ウォームローディングピンを取り外し、ドロップツードロップ接続を使用してウォームローディングシリンジをデバイスに接続します。
- 動物をアリーナに静かに流し込み、バッファーフローを確立し、テトラミソールによる固定化に最大1時間待ちます。
注意: 固定期間中は、緩衝液のみがアリーナに入るようにしてください。この期間中は刺激リザーバーとコントロールリザーバーをオフにすることができますが、刺激試験を実行する前に、それらを開いて正しい流れを確認してください。
7.自動刺激とニューロン記録
- 自動画像取得の刺激設定を含むテキストエディタ(メモ帳など)を使用して、「ユーザー定義の画像取得設定.txtという刺激定義テキストファイルを作成します( 図3の例を参照)。設定は、次の 2 つのセクションに分かれています。
- 顕微鏡取得設定: 実験タイプ(単一刺激またはマルチパターン)、露光と励起のタイミング、試行期間と間隔を定義し、ディレクトリを保存します。
- 刺激設定: 刺激制御パラメータを定義します。「刺激コマンド」は、特定のビデオフレームで発生するアクションを構文<文字コード><フレーム番号>で指定し、文字コードはA =バルブ1、B =バルブ2、C =バルブ3、L = LEDライトです。さらに、大文字 = オン、小文字 = オフです。LED強度は、文字コード「i」と0(オフ)から255(最大輝度)の値で設定されます。
注意: 0〜255のLED強度値は、出力アナログ電圧を0V〜5Vに設定します。ここで使用される電流コントローラーには線形強度スケーリングがあり、他のコントローラーはライトパワーメーターで校正する必要があります。- 刺激コマンドを1回だけ繰り返す単一刺激実験の場合は、 図3Aの形式を使用します。
- 複数の刺激コマンドを使用したマルチパターン実験の場合は、 図3Bの形式を使用します。刺激パターンの順序を表す数字の「パターンシーケンス」を含めます。パターンごとに、刺激コマンドを別々の行に入力します。
注:擬似ランダムシーケンスまたはmシーケンスは、刺激履歴依存性を調査するのに役立ちます。
- 顕微鏡制御ソフトウェアを実行します。すべての流体入口が開いていること、アリーナ内で流れが希望どおりであること( 図2Hを参照)、および対象のニューロンがライブウィンドウ内で焦点を合わせていることを確認します。
- ライブウィンドウを閉じ、ソフトウェア内でスクリプト「MultiPattern_RunScript.bsh」を実行します。
注:適切な流れと刺激を確認するために、動物なしでテスト実験を実行すると便利です。刺激液ごとに異なるフルオレセイン濃度に置き換えると、新しい刺激パターンを視覚化して文書化するのに役立ちます。 - 実験後、マイクロ流体デバイスを分解し、すべての表面、チューブ、およびリザーバーを水ですすいでください。
注意: すべてのコンポーネントは、清潔に保たれていれば何十回も再利用できます。リザーバー、チューブ、およびマイクロ流体デバイスが空気流中で湿潤または完全に乾燥状態に保たれていることを確認して、詰まりや除去が困難な塩の結晶化を防ぎます。デバイスはエタノールで滅菌することができますが、再利用する前に完全に乾燥させる必要があります(65°Cで>1時間)17。
8. ニューロトラッカーを用いたデータ解析
注:NeuroTracker 4,18,19は、試験中に複数のニューロンや動物の蛍光強度を追跡するためのImageJ/FIJI 20ソフトウェアプラグインです。このプラグインは、各ニューロンの位置とバックグラウンド補正された蛍光強度(F)を含むデータをテキストファイルとして保存します。蛍光データは、ベースライン蛍光(F0)、例えば刺激前の数秒の平均をΔF/F0=(F−F0)/F0として正規化し、集団間で平均化することができる。
- 指示に従ってニューロトラッカースクリプトをインストールします(github.com/albrechtLab/Neurotracker)。
- プラグインをクリックしてニューロトラッカーを実行する |トラッキング |ニューロトラッカー。
- を含むフォルダを選択します。追跡するTIFビデオファイルを選択し、目的の設定を選択します。
注: ビデオ ファイルのサブセットのみを追跡する場合は、プロンプトで分析するファイルの数値範囲を選択します。デフォルトのトラッキング設定は、250 pix/mmの解像度の非運動動物に適しています。他の解像度に合わせてパラメータを調整します。設定の詳細については、ユーザーガイド19 を参照してください。 - ニューロンが選択のために見えるように強度のしきい値を設定します(図4)。
- 画像を使用して 明るさ/コントラスト(B / C) および しきい値 コントロールウィンドウを開きます |メニューを調整します 。
- [B/C] ウィンドウで、ニューロンが明確に区別できるまで [最小] スライダーと [最大] スライダーを調整します (図 4A)。
- [しきい値]ウィンドウで、[暗い背景]と[範囲をリセットしない]をオンにします。
- フレームスライダーをスライドさせてニューロンの動きと強度の変化を観察し、他の動物との重複など、追跡から除外する動物に注意を払います。
- 追跡するニューロンを特定します。
- 各動物について、ニューロンの上の赤い閾値領域が刺激前、刺激中、および刺激後のすべてのフレームで見えるように閾値レベルを調整します。
- ニューロンをクリックして、その位置としきい値レベルを記録します。
- 追跡する動物およびニューロンごとに閾値調整および選択を繰り返す。適切なしきい値レベルの例については図 4C を、しきい値超過としきい値不足の例については 図4D,E を参照してください。以前に選択されたニューロンは小さなボックスで示されます。
- すべてのニューロンを選択したら、 スペースバー を押して追跡を開始します。
注: その他の NeuroTracker の例については、以前のリファレンス 4,19 を参照してください。 - 各動物の追跡プロセスを監視し、必要な修正を行います。
- ニューロトラッカーが一時停止すると、ニューロンが失われます。ニューロンを再度クリックし、必要に応じてしきい値レベルを調整します。
- 統合ボックスが近くの別の動物または非ニューロン構造にジャンプする場合は、 スペースバー を押して一時停止し、 スライダー を最初の誤ったフレームに戻し、正しいニューロンの位置を再度クリックします。
9.データの探索と視覚化
注: MATLAB 分析スクリプトは、データ処理と視覚化、および各分析の要約 PDF の生成に使用されます。
- MATLAB で "NeuroTrackerSummary_pdf.m" ファイルを実行し、NeuroTracker データ テキスト ファイルを含むフォルダーを選択します。
- 概要PDFが作成され、追跡プロセスの検証が可能になるまで待ちます(図5)。動物は番号で識別され(図5A)、各動物および試験からの神経応答を表示して、集団変動性を評価することができます(図5B)。
- 関数「databrowse.m」を使用して、たとえば、試行番号(図5C)、動物番号(図5D)、刺激パターン、または別のカテゴリによるグループ化など、ニューラルデータを探索します。
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Representative Results
時間的抑制、適応、脱抑制など、さまざまな神経現象を評価する刺激パターンの例をいくつか紹介します。 時間的抑制 は、最初の提示の直後に起こる第2の刺激呈示に対する神経応答の瞬間的な抑制である14。この現象をテストするために、ペアパルス実験では、0秒から20秒の範囲の間隔で分離された2つの1秒の匂いパルスからなる8つのパターンが提示されました(図6B;対応する刺激制御ファイルについては 図3B を参照)。アリーナは、単一の刺激液(1.1 μMジアセチル)、バッファー、および制御フローチューブでセットアップされ、未使用の入口ポートは固体ピンでブロックされました(図6A)。バルブ1をオンにすると、制御流体が ctrl1 入口に入り、刺激がアリーナに入るように流体の流れをシフトします。バルブ1がオフの場合、制御液は Ctrl2 インレットに入り、バッファーがアリーナを流れます( 図2G、Hを参照)。最初の1秒の匂いパルスは、ジアセチルを検出するAWAニューロンで等しい応答の大きさを誘発しましたが、2番目のパルスに対する応答は刺激間間隔によって変化しました(図6D)。パルス間隔が10秒未満の場合、第2の応答は弱く、時間的抑制現象が実証された。この実験セットアップを使用して、ダイニン成分CHE-3の破壊が時間的阻害を妨げることが見出され、この現象に軸索輸送が関与していることがわかりました5。
適応は、同じ刺激の繰り返しの提示に対する神経応答の漸進的な減少です。この現象は、急速に逆転する可能性のある能動的阻害、または逆転が遅い他のプロセスなど、さまざまなプロセスによって引き起こされる可能性があります。急速な可逆性を評価するための1つの実験は、「キャッチ」試験であり、適応を確立するために1つの刺激が繰り返され、続いて「逸脱した」または新しい刺激が続き、その後元の刺激に戻ります。神経応答が新しい「脱抑制」刺激に続いて増加する場合、脱抑制が観察されます。図7は、異なる受容体4を介してAWA化学感覚ニューロンによって検出された2つの匂い物質、ジアセチルおよび2−メチルピラジン(2−MP)を用いた例を示す。2つの刺激リザーバーとチューブがマイクロ流体デバイスに接続され、どの刺激がアリーナに入るかを決定するための追加の3方向ピンチバルブがありました(図7A)。刺激パターンは、30回の試行すべてでバルブ1を介して4秒間化学パルスを提示し、25回目の試行後にオンになり、26回目の試行後にオフになったバルブ3を介して刺激S1またはS2を選択するように定義されました(図7B)。この配置により、動物に提示する前に、さまざまな刺激流体がマイクロ流体デバイスを通過するのに十分な時間が確保されました。ジアセチル刺激への適応が観察されたが、新規な2-MP刺激の提示は強い脱抑制効果を誘発しなかった(図7C)。
光遺伝学的刺激は、光を使用して、光感受性イオンチャネル を介して ニューロンを活性化します。光遺伝学的活性化は使いやすいですが、感覚受容体や一部の調節経路を迂回するため、一部の神経現象は自然刺激による活性化と比較して異なる場合があります。これらの違いをテストするために、マルチモーダル実験は、単一の実験内で異なるタイプの刺激を提示するのに役立ちます。チャネルロドプシン変異体クリムゾンを発現するニューロンは、赤色光曝露により活性化される5。AWAニューロンが化学的および光遺伝学的刺激に同様に適応するかどうかを評価するために、AWAニューロンでクリムゾンとGCaMPの両方を発現するNZ1091株を、補因子オールトランスレチナール(ATR、100μM)を含むプレート上で14〜28時間維持しました。615 nmの赤色LEDがマイクロ流体アリーナを上から照らし(図8A)、同じ試行内でジアセチル、赤色光、またはその両方の5秒パルスを提供することにより、一連のマルチモーダル刺激パターンが生成されました(図8B)。化学刺激のみが適応を引き起こしたのに対し、光刺激のみでは適応しませんでした(図8C)。しかし、組み合わせたマルチモーダル刺激パターンは、光遺伝学的応答が化学的に誘発された適応の影響を受けやすいことを示しました(図8C、D)。これらの実験は、適応が感覚受容体または樹状突起突起で開始されることを示唆しているが、その効果はニューロン全体に広がっている。
図1:神経カルシウム記録および刺激装置の概略図。顕微鏡の画像キャプチャ、蛍光励起光、および刺激は、コンピューターとオープンソースのArduinoマイクロコントローラーによって制御されます。マイクロ流体分野での化学刺激は、制御流体の流れCを介してバッファーBと刺激S溶液を切り替えます。オプションのシステム要素は、追加のバルブや光学的またはその他の刺激モダリティなどのアスタリスク(*)で示されます。蛍光顕微鏡画像は、例えばカルシウム指示薬GCaMPを用いて、カルシウム過渡現象を介して神経活動を測定するために使用されます。破線は電気接続(デジタルまたはアナログ)、曲線は流体チューブ、直線の実線矢印は光路を表します。略称:LED =発光ダイオード。この図は、ローラーとアルブレヒト15から変更されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:マイクロ流体デバイスの組み立てとセットアップ。 マイクロ流体デバイスは、(A)(B)ドリルガラストップと疎水性ガラスベースとの間に挟まれたマイクロパターン化されたPDMSデバイスと、(C)クランプとから構成される。(D)リザーバーは、(E)チューブラックスタンドを備えたデバイスの上に配置されます。リザーバからのチューブは、装置に直接接続されるか、流体制御のために作動するバルブを介して接続されます。デバイスは、顕微鏡上の対物レンズの上に配置されています。(F)入口、ウォームローディングポート、および出口にすべてのチューブが取り付けられたマイクロ流体デバイスのクローズアップ画像。(G)20mm×20mmのマイクロ流体デバイスの概略図。黒い線は、高さ55〜70μmの流体チャネルを表します。このジオメトリは、動物をアリーナと顕微鏡の視野内に保ちながら、流れに垂直な刺激正面による正確な時空間制御を可能にするように設計されています。バッファストリームと1つの刺激ストリーム(または使用する場合はオプションでStim2)は連続的に流れますが、一度に1つの制御流体入口のみが流れ、どの流体がアリーナに入るかをシフトします。(H)バルブ1に通電すると、通常閉のポートから制御液が制御1の入口に流れ、刺激がオンになってアリーナを流れます。バルブ1がオフの場合、流体は通常開いているポートからcontrol2インレットに流れ、バッファーはアリーナに入ります。フルオレセイン色素を刺激液として使用し、適切な流量バランスを示します。アリーナに入る流体の一部は、上下の湾曲したチャネル を介して アリーナをバイパスすることに注意してください。これらのストリームは狭く、上部チャネルと下部チャネルの幅が等しい必要があります。リザーバーの高さは必要に応じて調整できます。略語:PDMS =ポリジメチルシロキサン;WL =ウォームローディング。バフ=バッファ;Stim1 = 最初の刺激;Stim2 = 第2刺激;NC = ノーマルクローズ;NO = 通常オープン。この図は、ローラーとアルブレヒト15から変更されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:刺激定義ファイルの例。 (A)単一繰り返し刺激実験の例:2秒から7秒までの強度200で5秒の光パルス(フレーム20〜70)。(B) 図6に対応する8つの異なる刺激パターンを用いたマルチパターン刺激実験の例。2つの1秒の化学パルスが、それらの間に0秒から20秒の間隔で提示されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:ニューロトラッカーにおけるニューロンと閾値レベルの選択 。 (A)AWAニューロンをはっきりと見えるように明るさとコントラストを調整した完全な顕微鏡視野。(B)蛍光強度を計算する積分ボックスとバックグラウンド減算のためのバックグラウンドアニュラスを描いた動物の頭部領域の拡大図。(C)ロバストな神経応答を示す積分強度プロット。(D)適切な閾値を選択すると、画像スタック内のすべてのフレームの [最小 サイズ]パラメータの上と [最大サイズ ]パラメータの下にある赤色の閾値領域が得られ、腸の自家蛍光などの近くの領域は含まれません(パネル Bを参照)。(E)しきい値の設定が高すぎると、ニューロンがアクティブなときは良好に見える場合がありますが、非アクティブの場合、ニューロンが失われる可能性があります。したがって、閾値を選択する際には、刺激前フレームと刺激後フレームの両方を確認することが重要です。(F)閾値が低すぎると、他の非ニューロン構造が強調される可能性があります。閾値超過または閾値不足の選択により、NeuroTrackerはニューロンを失い、閾値とニューロンの位置を修正するためにユーザーフィードバックを一時停止する可能性があります。略称: B&C = 明るさとコントラスト。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:データ分析の例。 1分間に1回、5秒間の光遺伝学的刺激を10回繰り返した15匹の動物の神経応答。(A)追跡した動物と試験内のニューロンの動きを示す要約画像(赤いボックス)。動物2は試験中に動いた。(B)経時的な個々の動物の応答は、赤色光刺激に対して比較的一貫した応答を示す。(C) データブラウズ機能を使用した データ 探索出力。トレースは試行の繰り返しごとにグループ化され(上記)、ユーザーが選択可能な試行の平均を以下に示します。(D)個々の動物数でグループ化し、繰り返し試行で平均したデータ。このデータセットは、動物間の変動が最小限であり、母集団全体の平均応答を正当化します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:時間的阻害を評価するための可変刺激間隔を用いたペアパルス実験 。 (A)マイクロ流体デバイスの入口接続。未使用のインレットは、実線のピン(X)で塞がれています。制御流体リザーバーとバルブ1はc1とc2の入口に接続されていますが、わかりやすくするためにここでは省略しています。(B) 8パターンの刺激タイミングパルスの持続時間は1秒で、0〜20秒離れています。パターンのシーケンスを以下に示します。各パターンは6〜7回提示されました。(C)50件の試験および9匹の動物からのAWA神経活動。刺激パターンでソートされた応答のヒートマップが上に示されています。各パターンの平均神経活動(n=56-63応答)を以下に示します。時間的抑制は、最初のパルス後~10秒間発生します。. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図7:脱抑制を評価するためのキャッチトライアル実験 。 (A)マイクロ流体デバイスのインレット接続。三方ピンチバルブは、静止時に刺激S1のみを通過させ、通電時にS2のみを通過させます。(B)繰り返されるジアセチル臭パルスを送達するために使用された3つのパターン配列の図と、26回目の試行で提示された新しい刺激2-メチルピラジン。(C)20匹の動物にわたる平均AWA神経活動応答。略語:DA =ジアセチル;2-MP = 2-メチルピラジン。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図8:マルチモーダル刺激の例 。 (A)マイクロ流体デバイスのインレット接続、未使用のインレットが実線ピンでブロックされています。赤いLEDがアリーナを上から照らします。(B)光学的、化学的、またはマルチモーダル刺激のパターン。(C)光遺伝学と化学感覚のペア(上)、光遺伝学のみ(中央)、および化学感覚のみ(下)の刺激を使用した30回の反復試験の平均AWA神経活動(n = 11匹)。(D)上記の光遺伝学的パルスと以下の化学パルスの各試行のピーク神経反応平均。光遺伝学的パルスは直接適応を引き起こさないが、それらの反応は化学感覚適応の影響を受けやすい。略語:DA =ジアセチル。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルでは、さまざまな刺激パターンの時間的に正確な配信を使用して神経活動現象を評価するためのオープンアクセス顕微鏡システムについて説明します。マイクロ流体プラットフォームは、数十匹の動物を顕微鏡の視野に保ちながら、再現性のある刺激を提供します。さまざまな刺激タイミングパターンを簡単にプログラミングできる市販の顕微鏡ソフトウェアパッケージはほとんどなく、各パターンや独自のファイル形式を手動で入力する必要があることがよくあります。対照的に、実験は、コンピュータ生成することができ、分析ソフトウェアによって読み取ることができるテキストファイルによってこのシステムで定義される。ここでは、マルチモーダル刺激中の時間的抑制、適応、クロストークなどの神経現象を評価するために、可変刺激パターンを採用することの有用性を示します。データ分析パイプラインは、大規模な顕微鏡ビデオファイルを、集団変動(図5B)、経時的な変化(図7Cおよび図8C、D)、および摂動後の変化(図7C)について視覚化および分析できる神経活動データに縮小します。
自動化の主な利点は、試験の繰り返し間および実験間の刺激の再現性であり、マイクロ流体アリーナフォーマットは、以前の単一動物メソッドと比較してスループットを少なくとも20倍向上させることができます7,9,13。動物の集団を同じ刺激と環境条件にさらすことで、データが比較可能になり、溶液調製、温度、動物源、またはその他の要因の潜在的な日々の変動を回避できます。ただし、このアプローチの制限は、すべての動物を視野に入れる低倍率、低解像度の顕微鏡です。追跡誤差を最小限に抑えるために、動物ごとに1つのニューロンのみを監視する必要がありますが、原則として、少なくとも50μm離れたニューロンを区別することができます。両側ニューロンペアは、応答が対称であると予想される場合、一緒に画像化することができる。まず、全脳イメージング7などによって、関心のある神経プロセスに関与する特定のニューロンを特定し、次にスループットを向上させるために関連するニューロンでのみGCaMPを発現させることが重要です。
ニューロンのカルシウム応答は、レポーターの発現レベルやその他の個人間差により、動物によって異なります。例えば、正規化されたAWA GCaMP応答は、カルシウムレポーターがゲノム4に安定に組み込まれている同質遺伝子野生型動物においても、ピークの大きさが2倍変化する。いくつかの刺激は、集団全体で変動する応答を示し(例えば、酢酸ブチル4)、可変受容体発現を示唆する。実際には、個体群の変動性を判断するために、少なくとも20匹の個々の動物を評価する必要があります。摂動の前後にペアになった個々の神経応答の統計的比較など、応答の変化を決定する際の統計的検出力を高めるために、個々の動物データを利用することが推奨されます。
大規模なデータセットと自動化された実験では、特に無人ステップの場合、適切な実験機能、追跡、およびデータ削減を検証および検証することが重要です。フローパターンは、記録されたビデオでアリーナに入る気泡や制御液がないことを観察することにより、蛍光溶液(図2Hのように)で検証する必要があります。データセットは、たとえば、動物の動き(図5Aのように)に注意し、滑らかな神経応答を検証する(図4Cおよび図5Bのように)ことによって検証する必要があります。問題のあるデータは除外する必要があります。また、「databrowse」機能を使用して平均化する前にデータのグループ化を検証し、平均応答が個々の応答を反映していることを確認することも重要です。
オープンソースの刺激制御システムは、デジタルまたはアナログ信号またはシリアル通信コマンド を介して 他の刺激に容易に拡張できます。段階的な刺激は、通常、LED光強度や神経刺激装置のパルス振幅などのアナログ電圧(0〜5 V)入力によって制御できます。オン/オフ刺激は通常、電気刺激装置のタイミングなどのデジタル(TTL)信号で制御されます。これらのデジタル信号は、リレースイッチを作動させて、機械感覚刺激用の振動モーターなどの他の電気システムを作動させることもできます。他の機器は、USB接続などのシリアル通信を使用し、特定の文字コマンドを送信してアクションを定義します。例えば、用量反応実験は、USB制御回転バルブ5 またはマルチウェルプレートシステム6を使用して、いくつかの化学物質濃度を自動的に提示することができる。これらのコマンドは、オープンソースの顕微鏡制御スクリプトに追加して、特定のトライアル番号で送信することができます。時間遅延も同様に組み込むことができます。たとえば、2回の30回の試行刺激発作の間に1時間テストを一時停止するには、60回の試行実験を指定し、試行番号が31に達したときに1時間一時停止する1行のコードを追加します。
実験の複雑さは事実上無限であり、「閉ループ」システムでのライブフィードバックに基づく実験中に変化することさえあります。例えば、刺激は、神経活動、動物の行動、または別の定量化可能なパラメータに基づいてリアルタイムで変化し得る。私たちは最近、このようなシステムを使用して、行動の変化後に刺激と神経記録をトリガーすることにより、睡眠中の動物と覚醒している動物の感覚神経反応を評価しました8,15。NeuroTrackerのモーショントラッキング機能により、自由に動く動物の神経活動を分析して、行動出力と相関させることができます。ただし、個々の移動動物を追跡するには、パスを交差させる場合など、細心の注意を払う必要があるため、これらの相互作用を最小限に抑えるために、アリーナごとにロードする動物の数を減らすことをお勧めします(約5匹)。
全体として、これらの技術は、集団変動と特定の神経現象を調査する際の刺激の精度と実験スループットを向上させます。神経活動の測定に加えて、これらの方法は、カルシウムシグナル21、神経細胞培養、および脳オルガノイド22を介して通信する植物を含む他の生物系、ならびにシナプス活動、神経伝達物質放出23、および転写24のセンサーなどの他の動的蛍光シグナルにも一般化可能である。
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Disclosures
著者は開示する利益相反を持っていません。
Acknowledgments
これらのプロトコルをテストし、原稿をレビューしてくれたFox Avery と、プログラミングの支援をしてくれた Eric Hall に感謝します。ここに提示された方法のための資金は、全米科学財団1724026(D.R.A.)によって部分的に提供された。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacterial strains | |||
| E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Cat# OP50 | |
| Experimental models: Organisms/strains | |||
| C. elegans strains expressing GCaMP (and optionally, Chrimson) in desired neurons | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) or corresponding authors of published work | NZ1091, for example | |
| Chemicals, Treatments, and Worm Preparation Supplies | |||
| 2,3-Butanedione | Sigma-Aldrich | Cat# B85307 | diacetyl, example chemical stimulus |
| Calcium chloride, CaCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# C3881 | |
| Fluorescein, Sodium salt | Sigma-Aldrich | Cat# F6377 | |
| Glass water repellant | Rain-X | Cat #800002250 | glass hydrophobic treatment (single-use) |
| Magnesium chloride, MgCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# M2393 | |
| Nematode Growth Medium (NGM) agar | Genesee | Cat #: 20-273NGM | |
| Petri dishes (60 mm) | Tritech | Cat #T3305 | |
| Poly(dimethyl siloxane) (PDMS): Sylgard 184 | Dow Chemical | Cat# 1673921 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | Cat# P5655 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | Cat# P8281 | |
| Sodium chloride, NaCl | Sigma-Aldrich | Cat# S7653 | |
| (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane (TFOCS) | Gelest | CAS# 78560-45-9 | glass hydrophobic treatment (durable) |
| Software and algorithms | |||
| Arduino IDE | Arduino | https://www.arduino.cc/en/software | |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| Micro-manager | Micro-manager | https://micro-manager.org/ | |
| Microscope control software | Albrecht Lab | https://github.com/albrechtLab/MicroscopeControl | |
| Neurotracker data analysis software | Albrecht Lab | https://github.com/albrechtLab/Neurotracker | |
| Automated Microscope and Stimulation System | |||
| Axio Observer.A1 inverted microscope set up for epifluorescence (GFP filter cubes, 5× objective or similar) | Zeiss | Cat #491237-0012-000 | |
| Excelitas X-cite XYLIS LED illuminator | Excelitas | Cat #XYLIS | |
| Orca Flash 4.0 Digital sCMOS camera | Hamamatsu | Cat #C11440-22CU | |
| Arduino nano | Arduino | Cat #A000005 | |
| 3-way Miniature Diapragm Isolation Valve (LQX12) | Parker | Cat #LQX12-3W24FF48-000 | Valve 1: Control |
| 2-way normally-closed (NC) Pinch Valve | Bio-Chem Valve Inc | Cat #075P2-S432 | Valve 2: Outflow |
| 3-way Pinch Valve | NResearch | Cat #161P091 | Valve 3: Stimulus selection |
| Optogenetic stimulation LED and controller (615 nm) | Mightex | Cat #PLS-0625-030-S and #SLA-1200-2 | |
| ValveLink 8.2 digital/manual valve controller | AutoMate Scientific | Cat #01-18 | |
| Wires and connectors | various | See Fig. 2 of Cell STARS Protocol (Lawler, 2021) | |
| Microfluidic Device Preparation | |||
| Dremel variable speed rotary cutter 4000 | Dremel | Cat #F0134000AB | Set speed to 5k RPM for cutting glass |
| Dremel drill press rotary tool workstation | Dremel | Cat #220-01 | |
| Diamond drill bit | Dremel | Cat #7134 | |
| Glass slide, 1 mm thick | VWR | Cat #75799-268 | |
| Glass scribe (Diamond scriber) | Ted Pella | Cat #54468 | |
| Luer 3-way stopcock | Cole-Parmer | Cat #EW-30600-07 | |
| Luer 23 G blunt needle | VWR | Cat #89134-100 | |
| Microfluidic device | Corresponing author or fabricate from CAD files associated with this article | N/A | |
| Microfluidic device clamp | Warner Instruments (or machine shop) | P-2 | |
| Microfluidic tubing, 0.02″ ID | Cole-Parmer | Cat #EW-06419-01 | |
| Tube 19 G, 0.5″ | New England Small Tube | Cat #NE-1027-12 |
References
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