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Neuroscience

कई छोटे जीवों से स्वचालित मल्टीमॉडल उत्तेजना और एक साथ न्यूरोनल रिकॉर्डिंग

Published: March 3, 2023 doi: 10.3791/65042
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1,3
1Department of Biomedical Engineering, Worcester Polytechnic Institute, 2Graduate School of Biomedical Sciences, UMass Chan Medical School, 3Department of Biology and Biotechnology, Worcester Polytechnic Institute

Summary

हम लचीले रासायनिक और मल्टीमॉडल उत्तेजना और कई केनोरहाब्डिस एलिगेंस कीड़े से एक साथ तंत्रिका गतिविधि की रिकॉर्डिंग के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं। यह विधि माइक्रोफ्लुइडिक्स, ओपन-सोर्स हार्डवेयर और सॉफ्टवेयर का उपयोग करती है, और अनुकूलन, अस्थायी निषेध और उत्तेजना क्रॉसस्टॉक जैसे न्यूरोनल घटनाओं के माप को सक्षम करने के लिए स्वचालित डेटा विश्लेषण की देखरेख करती है।

Abstract

फ्लोरोसेंट आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतकों ने व्यक्तिगत न्यूरॉन्स के स्तर से पूरे मस्तिष्क सर्किट तक तंत्रिका गतिशीलता की हमारी समझ में बहुत योगदान दिया है। हालांकि, तंत्रिका प्रतिक्रियाएं पूर्व अनुभव, आंतरिक अवस्थाओं, या स्टोकेस्टिक कारकों के कारण भिन्न हो सकती हैं, इस प्रकार उन तरीकों की आवश्यकता उत्पन्न होती है जो एक बार में कई व्यक्तियों में तंत्रिका समारोह का आकलन कर सकते हैं। जबकि अधिकांश रिकॉर्डिंग तकनीक एक समय में एक ही जानवर की जांच करती है, हम एक बार में दर्जनों केनोरहाब्डिस एलिगेंस या अन्य उप-मिलीमीटर-स्केल जीवों को न्यूरोनल रिकॉर्डिंग को स्केल करने के लिए वाइड-फील्ड माइक्रोस्कोपी के उपयोग का वर्णन करते हैं। ओपन-सोर्स हार्डवेयर और सॉफ्टवेयर प्रोग्रामिंग में पूरी तरह से स्वचालित प्रयोगों में बहुत लचीलापन देते हैं जो रासायनिक, ऑप्टिकल, यांत्रिक, थर्मल और विद्युत चुम्बकीय उत्तेजनाओं सहित विभिन्न उत्तेजना प्रकारों की तीव्रता और समय को नियंत्रित करते हैं। विशेष रूप से, माइक्रोफ्लुइडिक प्रवाह उपकरण उप-सेकंड समय संकल्प के साथ केमोसेंसरी उत्तेजनाओं का सटीक, दोहराने योग्य और मात्रात्मक नियंत्रण प्रदान करते हैं। न्यूरोट्रैकर अर्ध-स्वचालित डेटा विश्लेषण पाइपलाइन तब तंत्रिका उत्तेजना और गतिशीलता में कार्यात्मक परिवर्तनों को उजागर करने के लिए व्यक्तिगत और जनसंख्या-व्यापी तंत्रिका प्रतिक्रियाओं को निकालती है। यह पेपर न्यूरोनल अनुकूलन, अस्थायी निषेध और उत्तेजना क्रॉसस्टॉक को मापने के उदाहरण प्रस्तुत करता है। ये तकनीकें उत्तेजना की सटीकता और पुनरावृत्ति को बढ़ाती हैं, जनसंख्या परिवर्तनशीलता की खोज की अनुमति देती हैं, और कोशिकाओं और ऑर्गेनोइड्स से पूरे जीवों और पौधों तक छोटे बायोसिस्टम में अन्य गतिशील फ्लोरोसेंट संकेतों के लिए सामान्य हैं।

Introduction

कैल्शियम इमेजिंग तकनीकों ने प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतकों का उपयोग करके वास्तविक समय में विवो तंत्रिका गतिशीलता में गैर-आक्रामक रिकॉर्डिंग की अनुमति दी है जो लक्ष्य कोशिकाओं 1,2,3 में व्यक्त किए गए हैं। ये सेंसर आमतौर पर एक हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) का उपयोग करते हैं, जैसे जीएफपी-शांतोडुलिन-एम 13 पेप्टाइड (जीसीएएमपी) परिवार, न्यूरोनल सक्रियण और ऊंचा इंट्रासेल्युलर कैल्शियम के स्तर पर प्रतिदीप्ति तीव्रता बढ़ाने के लिए। कैल्शियम इमेजिंग नेमाटोड सी एलिगेंस में विशेष रूप से शक्तिशाली रही है ताकि यह जांचा जा सके कि न्यूरॉन्स और तंत्रिका सर्किट जीवित रहने में कैसे कार्य करते हैं, जानवरों को 4,5,6,7,8,9,10, क्योंकि उनकी पारदर्शी प्रकृति का मतलब है कि ऑप्टिकल पहुंच के लिए कोई शल्य चिकित्सा प्रक्रिया की आवश्यकता नहीं है, और सेल-विशिष्ट जीन प्रमोटर रुचि की कोशिकाओं को लक्षित करते हैं। ये तकनीकें अक्सर माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों का उपयोग करती हैं, जो11,12 के छोटे भौतिक पैमाने पर जैविक, रासायनिक और भौतिक घटनाओं का अध्ययन करने के लिए सटीक नियंत्रित वातावरण प्रदान करती हैं। माइक्रोफ्लुइडिक उपकरण तंत्रिका गतिविधि को मापने के लिए प्रचुर मात्रा में हैं, नए डिजाइन लगातार विकास के अधीन हैं, और वे अनुसंधान प्रयोगशाला में आसानी से निर्मित हैं। हालांकि, कई डिजाइन एक समय में एक ही जानवर को फंसाते हैं, प्रयोगात्मक थ्रूपुट 7,9,13 को सीमित करते हैं। तंत्रिका प्रतिक्रियाएं अक्सर पूर्व अनुभव, तनाव या भूख जैसी आंतरिक अवस्थाओं या जीन अभिव्यक्ति स्तर जैसे स्टोकेस्टिक कारकों में अंतर के कारण जानवरों में काफी भिन्न होती हैं। ये अंतर उन तरीकों की आवश्यकता को स्थापित करते हैं जो एक साथ कई जानवरों को उत्तेजित और निरीक्षण कर सकते हैंऔर व्यक्तियों से जानकारी निकाल सकते हैं।

इसके अलावा, कुछ न्यूरोमोडुलेटरी घटनाएं केवल विशिष्ट उत्तेजना स्थितियों के तहत स्पष्ट हो जाती हैं, जैसे कि अस्थायी निषेध14, जो प्रतिक्रियाओं के संक्षिप्त दमन को संदर्भित करता है जब उत्तेजना तेजी से होती है। इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल सिस्टम इस उद्देश्य के लिए एक व्यापक उत्तेजना स्थान में तंत्रिका गतिविधि को चला सकते हैं, उदाहरण के लिए, विद्युत पल्स वर्तमान, वोल्टेज, आवृत्ति, तरंग, ड्यूटी चक्र और आवधिक उत्तेजना ट्रेनों के समय को संशोधित कर सकते हैं। स्वाभाविक रूप से पता लगाए गए उत्तेजनाओं या ऑप्टोजेनेटिक सिस्टम द्वारा अप्रत्यक्ष उत्तेजना नियंत्रण तंत्र की एक समान चौड़ाई से लाभान्वित होगी। वर्तमान में, कई प्राकृतिक उत्तेजनाओं को एक सरल "ऑन-ऑफ" तरीके से प्रस्तुत किया जाता है, जैसे कि गंध प्रस्तुति और हटाने, वाणिज्यिक प्रणालियों का उपयोग करके जो लचीलापन जोड़ने के लिए धीमा रहे हैं। हालांकि, सस्ती माइक्रोकंट्रोलर अब कई प्रकार की उत्तेजनाओं के वितरण को इस तरह से स्वचालित कर सकते हैं जो शोधकर्ताओं की आवश्यकताओं के लिए अनुकूलन योग्य है। माइक्रोफ्लुइडिक्स के साथ संयुक्त, इन प्रणालियों ने प्रयोगात्मक थ्रूपुट और लचीलेपन में वृद्धि के लक्ष्य को प्राप्त किया है, जिससेकई जानवरों में एक साथ विभिन्न सटीक उत्तेजनाओं के लिए तंत्रिका प्रतिक्रियाओं को मापा जा सकता है। मल्टीमॉडल उत्तेजना का उपयोग न्यूरोनल सर्किटरी से पूछताछ करने के लिए किया जा सकता है, जैसे कि ड्रग एक्सपोजर4 जैसे ऑर्थोगोनल गड़बड़ी से पहले, दौरान और बाद में लगातार उत्तेजित होने पर तंत्रिका उत्तेजना में परिवर्तन की निगरानी करके। वैज्ञानिक अनुसंधान को आगे बढ़ाने के लिए सस्ती, खुली माइक्रोस्कोपी प्रणालियों के लाभ स्पष्ट हैं, फिर भी व्यवहार में, पार्ट सोर्सिंग, निर्माण और प्रदर्शन सत्यापन की आवश्यकता इन तकनीकों को अपनाने में बाधा डाल सकती है।

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य इन तकनीकी चुनौतियों में से कुछ को कम करना है। जबकि पिछले प्रोटोकॉल ने माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस उपयोग और बुनियादी उत्तेजना9,15,17 पर ध्यान केंद्रित किया है, हम यहां सी एलिगेंस या अन्य छोटे जीवों में तंत्रिका इमेजिंग के लिए एक लचीली, स्वचालित, मल्टीमॉडल उत्तेजना वितरण प्रणाली के निर्माण और उपयोग का वर्णन करते हैं। ओपन-सोर्स सिस्टम को प्रयोगों को परिभाषित करने के लिए सरल टेक्स्ट फ़ाइलों के माध्यम से प्रोग्राम किया जाता है, और न्यूरोट्रैकर डेटा विश्लेषण प्रोग्राम अर्ध-स्वचालित रूप से माइक्रोस्कोप वीडियो से तंत्रिका गतिविधि डेटा निकालता है। हम इस प्रणाली को केमोसेंसरी न्यूरॉन एडब्ल्यूए का उपयोग करके अस्थायी निषेध, विघटन और उत्तेजना क्रॉसस्टॉक का आकलन करने के उदाहरणों के साथ प्रदर्शित करते हैं, जो ऑप्टोजेनेटिक प्रकाश-संवेदनशील आयन चैनल 5,6 को व्यक्त करते समय विभिन्न खाद्य गंधों के जवाब में या प्रकाश के जवाब में विध्रुवीकृत होता है।

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Protocol

1. तंत्रिका इमेजिंग उपकरण

नोट: इमेजिंग और उत्तेजना प्रणाली के निर्माण पर विस्तृत निर्देशों के लिए लॉलर और अल्ब्रेक्ट15 देखें, जो माइक्रोस्कोप रोशनी के समय, छवि अधिग्रहण और उत्तेजना वितरण को नियंत्रित करता है (चित्रा 1)। एक सस्ता Arduino नैनो उत्तेजना नियंत्रक एक वाल्व नियंत्रक को डिजिटल संकेतों के माध्यम से द्रव वाल्व को सक्रिय करता है और एक एलईडी नियंत्रक को एनालॉग वोल्टेज संकेतों के माध्यम से ऑप्टोजेनेटिक रोशनी को नियंत्रित करता है। अन्य उत्तेजनाओं, जैसे कंपन मोटर्स और थर्मल हीटर, को डिजिटल या एनालॉग संकेतों का उपयोग करके नियंत्रित किया जा सकता है। उत्तेजना नियंत्रक कैमरा सिग्नल के माध्यम से उत्तेजना और छवि रिकॉर्डिंग को सिंक्रनाइज़ करता है, जैसा कि ओपन-सोर्स माइक्रो-मैनेजर माइक्रोस्कोप कंट्रोल सॉफ्टवेयर (μManager)16 द्वारा निर्दिष्ट किया गया है। इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सभी सामग्रियों, अभिकर्मकों, उपकरणों और जीवों से संबंधित विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें।

  1. तंत्रिका इमेजिंग उपकरण स्थापित करें, जिसमें जीएफपी ऑप्टिक्स के साथ एक एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप, डिजिटल एक्सपोज़र आउटपुट सिग्नल के साथ एक एससीएमओएस कैमरा और एक उत्तेजना नियंत्रक15 शामिल हैं।
  2. डिजिटल या एनालॉग सिग्नल के माध्यम से उत्तेजना नियंत्रक को वांछित सिस्टम से कनेक्ट करें। नीचे प्रस्तुत उदाहरणों के लिए, निम्नलिखित प्रणालियों का उपयोग किया जाता है:
    1. रासायनिक उत्तेजना के लिए वाल्व नियंत्रक का उपयोग करें। वाल्व नियंत्रक को द्रव सोलनॉइड या चुटकी वाल्व से कनेक्ट करें (चित्रा 1)15)।
    2. माइक्रोस्कोप चरण के ऊपर लगाए गए ऑप्टोजेनेटिक उत्तेजना के लिए 615 एनएम लाल एलईडी और नियंत्रक का उपयोग करें।
  3. माइक्रोस्कोप नियंत्रण सॉफ्टवेयर के साथ कंप्यूटर सेट करें, उपकरण सेटिंग्स के साथ एक कॉन्फ़िगरेशन प्रीसेट बनाएं, और उत्तेजना नियंत्रण15 का उचित संचालन सुनिश्चित करें।

2. माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस निर्माण

नोट: मास्टर मोल्डों को प्राप्त करने या बनाने और माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों के उत्पादन, उपयोग और सफाई के बारे में विस्तृत जानकारी के लिए लैगोय एट अल .17 देखें। इन चरणों को नीचे संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है।

  1. प्रदान की गई माइक्रोफ्लुइडिक डिज़ाइन फ़ाइल का उपयोग करके एक मास्टर मोल्ड प्राप्त करें या गढ़ें (albrechtlab.github.io/microfluidics)17. एलिगेंस के लिए, सुनिश्चित करें कि चैनल की ऊंचाई 55-70 μm है।
  2. पीडीएमएस बेस और इलाज एजेंट को वजन से 10: 1 अनुपात में मिलाएं और ट्रांसफर पिपेट के साथ अच्छी तरह मिलाएं।
  3. 30-60 मिनट के लिए एक वैक्यूम डेसिकेटर में रखें जब तक कि बुलबुले गायब न हो जाएं।
  4. मास्टर मोल्ड को एक बड़े (150 मिमी व्यास) पेट्री डिश में रखें, और डिगैस्ड पीडीएमएस को 4-5 मिमी (~ 100 ग्राम) की गहराई तक डालें। स्थानांतरण पिपेट के साथ किसी भी धूल या बुलबुले का निरीक्षण करें और निकालें।
  5. 3 घंटे से रात भर के लिए लेवल ओवन शेल्फ पर 65 डिग्री सेल्सियस पर बेक करें।
  6. एक बार ठीक हो जाने के बाद, मोल्ड से पीडीएमएस को काटने के लिए स्केलपेल का उपयोग करें और उपकरणों को अलग करने के लिए एक सीधा रेजर ब्लेड का उपयोग करें।
  7. 1 मिमी त्वचीय पंच का उपयोग करके इनलेट और आउटलेट छेद को पंच करें, और उन्हें डीएच 2 ओ, इथेनॉल और फिर डीएच 2ओ के साथ साफ करें।
  8. किसी भी धूल या मलबे को हटाते हुए, चिपकने वाले टेप के साथ पीडीएमएस डिवाइस के दोनों किनारों को साफ करें।
  9. 17 के रूप में वर्णित माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस को पूरा करने के लिए ग्लास स्लाइड तैयार करें। डायमंड बिट का उपयोग करके शीर्ष स्लाइड में इनलेट छेद ड्रिल करें, और टीएफओसीएस वाष्प के संपर्क में या पानी-रिपेलेंट ग्लास उपचार लागू करके नीचे स्लाइड हाइड्रोफोबिक प्रस्तुत करें (चित्रा 2 बी)।
  10. ग्लास-पीडीएमएस डिवाइस सैंडविच को क्लैंप में इकट्ठा करें (चित्रा 2 सी)।

3. पशु तैयारी

  1. रुचि के न्यूरॉन्स में व्यक्त आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतक वाले जानवरों को प्राप्त करें या बनाएं।
    नोट: उदाहरण के लिए, लाइन NZ1091 (kyIs587 [gpa-6p:: GCaMP2.2b; unc-122p::d sRed]; kyIs5662 [odr-7p::Chrimson:SL2:mChery; elt-2p::mChery]) जीसीएएमपी और लाल प्रकाश-संवेदनशील केशन चैनल क्रिमसन को एडब्ल्यूए संवेदी न्यूरॉन जोड़ी6 में व्यक्त करता है। दोनों ट्रांसजेन हर जानवर में स्थिर अभिव्यक्ति के लिए जीनोम में एकीकृत होते हैं।
  2. प्रयोग से एक दिन पहले, ओपी 50 ई कोलाई लॉन के साथ बीजित नेमाटोड ग्रोथ मीडियम (एनजीएम) एगर प्लेट पर प्रति प्रयोग कम से कम 20 एल 4 लार्वा स्टेज सी एलिगेंस रखें। जब 20 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा जाता है, तो यह अगले दिन युवा वयस्क चरण में जंगली प्रकार के जानवरों को सिंक्रनाइज़ करेगा।
    नोट: सरणी ट्रांसजेन के लिए, चुने हुए जानवरों में ट्रांसजेन अभिव्यक्ति सुनिश्चित करने के लिए प्रतिदीप्ति स्टीरियोस्कोप का उपयोग करके जानवरों को चुनें।

4. समाधान की तैयारी

  1. 1x S बेसल बफर (100 mM NaCl और 0.05 M KPO4, pH 6.0) को 10x स्टॉक समाधान से तैयार करें।
  2. 1x S बेसल में 1 M स्टॉक को पतला करके 1 mM टेट्रामिसोल बफर तैयार करें। सभी उत्तेजनाओं को तैयार करने के लिए इस लकवाग्रस्त बफर का उपयोग करें। एक प्रयोग आमतौर पर लगभग 150 एमएल का उपयोग करता है।
  3. प्रवाह की कल्पना करने के लिए "नियंत्रण" बफर जलाशयों में 0.1-1 μg / mL फ्लोरेसिन जोड़ें।
  4. वांछित अंतिम एकाग्रता के लिए क्रमिक कमजोर पड़ने से उत्तेजना समाधान बनाएं। उदाहरण के लिए, पहले 10−3 स्टॉक बनाकर डायसिटाइल आकर्षित करने वाले का 10-7 कमजोर पड़ने का निर्माण करें।
    नोट: उत्तेजना के समय को सत्यापित करने के लिए उत्तेजना या बफर समाधान में फ्लोरेसिन (0.1-1 μg / mL) की एक छोटी मात्रा को जोड़ा जा सकता है, लेकिन तंत्रिका प्रतिदीप्ति में कलाकृतियों से बचने के लिए एकाग्रता न्यूनतम होनी चाहिए।

5. माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस की तैयारी

नोट: जलाशय उत्पादन, डिवाइस सेटअप और जानवरों के लोडिंग को दिखाने वाले वीडियो प्रोटोकॉल के लिए रेली एट अल.9 देखें। कई उपयोगी युक्तियों सहित एक लिखित प्रोटोकॉल के लिए Lagoy et al.17 भी देखें।

  1. तीन या अधिक द्रव जलाशय तैयार करें। प्रत्येक के लिए, एक 30 एमएल या 60 एमएल सिरिंज जलाशय, एक 3 एमएल प्राइमिंग सिरिंज और एक सुई स्टब को तीन-तरफा ल्यूर वाल्व (चित्रा 2 डी) से संलग्न करें। सुई को अंत में धातु ट्यूब के साथ फिट माइक्रोबोर ट्यूबिंग से कनेक्ट करें। जलाशयों को लेबल करें, उन्हें रिंग स्टैंड से जुड़े रैक पर माउंट करें, और उन्हें संबंधित बफर या उत्तेजना तरल पदार्थ से भरें (चित्रा 2 ई)।
  2. इकट्ठे माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस को ~ 1 घंटे के लिए वैक्यूम डेसिकेटर में रखें।
  3. प्राइमिंग सिरिंज का उपयोग करके जलाशय ट्यूबिंग से हवा के बुलबुले भरें और निकालें। बफर के साथ बहिर्वाह ट्यूबिंग भरें।
  4. वैक्यूम से माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस को हटा दें, और जल्दी से आउटलेट टयूबिंग डालें और डिवाइस के माध्यम से तरल पदार्थ को तब तक इंजेक्ट करें जब तक कि एक इनलेट से एक बूंद न निकल जाए।
  5. इस इनलेट पर, संबंधित फ्लूडिक इनलेट ट्यूब (चित्रा 2 एफ) डालने के लिए "ड्रॉप-टू-ड्रॉप" कनेक्शन17 का उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि बुलबुले को पेश करने से बचने के लिए इनलेट ट्यूबिंग और डिवाइस पोर्ट छेद दोनों पर तरल बूंदें मौजूद हैं।
  6. आउटलेट से अधिक तरल पदार्थ इंजेक्ट करें, अगली इनलेट ट्यूब को कनेक्ट करें, और तब तक दोहराएं जब तक कि सभी इनलेट भर न जाएं। किसी भी अप्रयुक्त इनलेट और वर्म लोडिंग पोर्ट पर एक ठोस ब्लॉकिंग पिन डालें।
  7. इनलेट और आउटलेट लुअर वाल्व खोलकर प्रवाह शुरू करें। इनलेट्स और ग्लास बेस पर लीक के लिए डिवाइस का निरीक्षण करें। लाइव मोड में माइक्रोस्कोप इमेज कैप्चर सॉफ्टवेयर का उपयोग करके प्रवाह चैनलों या इनलेट्स के भीतर किसी भी बुलबुले के लिए डिवाइस का निरीक्षण करें।
    नोट: यदि बुलबुले मौजूद हैं, तो उन्हें पीडीएमएस सामग्री में अवशोषित करने के लिए प्रतीक्षा करें।

6. पशु लोडिंग

नोट: देखें लैगोय एट अल.17.

  1. युवा वयस्क जानवरों को एक तार-युक्त "पिक" का उपयोग करके एक बिना बीज वाले एनजीएम एगर प्लेट पर स्थानांतरित करें।
  2. प्लेट को लगभग 5 मिलीलीटर 1x एस बेसल बफर के साथ भर दें ताकि जानवर तैर रहे हों।
  3. कीड़े को लोडिंग सिरिंज में खींचें (संलग्न टयूबिंग के साथ 1 एमएल या 3 एमएल सिरिंज जिसे 1एक्स एस बेसल के साथ प्रीफिल किया गया है)।
    1. स्टीरियोस्कोप का उपयोग करके, टयूबिंग छोर को तरल सतह के नीचे एक हाथ से प्रत्येक वांछित जानवर तक ले जाएं, और दूसरे हाथ में आयोजित सिरिंज का उपयोग करके इसे टयूबिंग में खींचें।
    2. कीड़े को केवल टयूबिंग में खींचें, सिरिंज में नहीं।
      नोट: टयूबिंग आमतौर पर केवल 100 μL रखती है। जानवरों को एक स्थानीय क्षेत्र में निष्कासित किया जा सकता है और फिर एक छोटी मात्रा के साथ टयूबिंग में फिर से खींचा जा सकता है।
  4. आउटलेट लाइन को बंद करें, वर्म लोडिंग पिन को हटा दें, और ड्रॉप-टू-ड्रॉप कनेक्शन का उपयोग करके डिवाइस से वर्म लोडिंग सिरिंज को कनेक्ट करें।
  5. धीरे से जानवरों को अखाड़े में प्रवाहित करें, बफर प्रवाह स्थापित करें, और टेट्रामिसोल द्वारा स्थिरीकरण के लिए 1 घंटे तक की अनुमति दें।
    नोट: स्थिरीकरण अवधि के दौरान, सुनिश्चित करें कि केवल बफर तरल पदार्थ क्षेत्र में प्रवेश करता है। इस अवधि के दौरान उत्तेजना और नियंत्रण जलाशयों को बंद किया जा सकता है लेकिन उन्हें खोलें और उत्तेजना परीक्षण चलाने से पहले सही प्रवाह को सत्यापित करें।

7. स्वचालित उत्तेजना और न्यूरोनल रिकॉर्डिंग

  1. स्वचालित छवि अधिग्रहण के लिए उत्तेजना सेटिंग्स वाले पाठ संपादक (जैसे, नोटपैड) के साथ "उपयोगकर्ता परिभाषित अधिग्रहण सेटिंग्स.txt" नामक एक उत्तेजना परिभाषा पाठ फ़ाइल बनाएं जिसमें स्वचालित छवि अधिग्रहण के लिए उत्तेजना सेटिंग्स हों ( चित्र 3 में उदाहरण देखें)। सेटिंग्स को दो वर्गों में विभाजित किया गया है:
    1. माइक्रोस्कोप अधिग्रहण सेटिंग्स: प्रयोग प्रकार (सिंगल-स्टिमुलस या मल्टी-पैटर्न), एक्सपोज़र और उत्तेजना समय, परीक्षण अवधि और अंतराल को परिभाषित करें, और निर्देशिका सहेजें।
    2. उत्तेजना सेटिंग्स: उत्तेजना नियंत्रण मापदंडों को परिभाषित करें। एक "उत्तेजना कमांड" सिंटैक्स <लेटर कोड><फ्रेम नंबर> के साथ कुछ वीडियो फ्रेम पर होने वाली क्रियाओं को निर्दिष्ट करता है, जहां अक्षर कोड ए = वाल्व 1, बी = वाल्व 2, सी = वाल्व 3, एल = एलईडी लाइट हैं; इसके अतिरिक्त, अपरकेस = चालू और निचला केस = बंद। एलईडी तीव्रता अक्षर कोड "आई" और 0 (बंद) से 255 (अधिकतम चमक) के मान के साथ सेट की गई है।
      नोट: 0 से 255 तक एलईडी तीव्रता मान आउटपुट एनालॉग वोल्टेज को 0 वी से 5 वी तक सेट करता है। यहां उपयोग किए जाने वाले वर्तमान नियंत्रक में एक रैखिक तीव्रता स्केलिंग है, और दूसरों को प्रकाश पावर मीटर के साथ कैलिब्रेट किया जाना चाहिए।
      1. केवल एक दोहराए गए उत्तेजना कमांड के साथ एकल-उत्तेजना प्रयोग के लिए, चित्रा 3 ए में प्रारूप का उपयोग करें।
      2. एकाधिक उत्तेजना आदेशों के साथ एक बहु-पैटर्न प्रयोग के लिए, चित्रा 3 बी में प्रारूप का उपयोग करें। अंकों का एक "पैटर्न अनुक्रम" शामिल करें जो उत्तेजना पैटर्न के क्रम का प्रतिनिधित्व करता है। प्रत्येक पैटर्न के लिए, एक अलग लाइन पर एक उत्तेजना कमांड दर्ज करें।
        नोट: एक स्यूडोरैंडम अनुक्रम या एम-अनुक्रम उत्तेजना इतिहास निर्भरता की जांच करने के लिए उपयोगी हो सकता है।
  2. माइक्रोस्कोप नियंत्रण सॉफ्टवेयर चलाएँ। सत्यापित करें कि सभी तरल इनलेट खुले हैं, प्रवाह क्षेत्र के भीतर वांछित है ( चित्रा 2 एच देखें), और रुचि के न्यूरॉन्स लाइव विंडो के भीतर फोकस में हैं।
  3. लाइव विंडो बंद करें और सॉफ़्टवेयर के भीतर स्क्रिप्ट "MultiPattern_RunScript.bsh" चलाएँ।
    नोट: उचित प्रवाह और उत्तेजना को सत्यापित करने के लिए जानवरों के बिना एक परीक्षण प्रयोग चलाना उपयोगी है। प्रत्येक उत्तेजना द्रव के लिए एक अलग फ्लोरेसिन एकाग्रता को प्रतिस्थापित करने से नए उत्तेजना पैटर्न की कल्पना और दस्तावेज करने में मदद मिल सकती है।
  4. प्रयोग के बाद, माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस को अलग करें, और पानी के साथ सभी सतहों, टयूबिंग और जलाशयों को कुल्ला करें।
    नोट: यदि साफ रखा जाए तो सभी घटकों को दर्जनों बार पुन: उपयोग किया जा सकता है। सुनिश्चित करें कि नमक क्रिस्टलीकरण से बचने के लिए जलाशय, ट्यूबिंग और माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों को हवा की धारा में गीला या पूरी तरह से सूखा रखा जाता है, जो बंद हो सकता है और निकालना मुश्किल है। उपकरणों को निष्फल करने के लिए इथेनॉल में रखा जा सकता है, लेकिन पुन: उपयोग से पहले पूरी तरह से सूख जाना चाहिए (>1 घंटे 65 डिग्री सेल्सियस पर)17।

8. न्यूरोट्रैकर का उपयोग कर डेटा विश्लेषण

नोट: न्यूरोट्रैकर 4,18,19 एक इमेजजे / फिजी20 सॉफ्टवेयर प्लगइन है जो कई न्यूरॉन्स और जानवरों की प्रतिदीप्ति तीव्रता को ट्रैक करता है, भले ही वे परीक्षणों के दौरान चलते हैं। यह प्लगइन प्रत्येक न्यूरॉन की स्थिति और पृष्ठभूमि-सही प्रतिदीप्ति तीव्रता (एफ) के साथ पाठ फ़ाइलों के रूप में डेटा सहेजता है। प्रतिदीप्ति डेटा को बेसलाइन फ्लोरेसेंस (एफ 0) में सामान्यीकृत किया जाता है, उदाहरण के लिए, उत्तेजना से पहले कई सेकंड का औसत, जैसे किएफ / एफ 0 = (एफ -एफ 0)/एफ 0, जिसे आबादी में औसत किया जा सकता है।

  1. निर्देश के अनुसार न्यूरोट्रैकर स्क्रिप्ट स्थापित करें (github.com/albrechtLab/Neurotracker).
  2. प्लगइन्स पर क्लिक करके न्यूरोट्रैकर चलाएं | ट्रैकिंग | न्यूरोट्रैकर।
  3. उस फ़ोल्डर का चयन करें जिसमें . TIF वीडियो फ़ाइलों को ट्रैक किया जाना है, और वांछित सेटिंग्स का चयन करें।
    नोट: यदि वीडियो फ़ाइलों का केवल एक उप-समूह ट्रैक किया जाना है, तो प्रॉम्प्ट पर विश्लेषण करने के लिए फ़ाइलों की संख्यात्मक सीमा का चयन करें। डिफ़ॉल्ट ट्रैकिंग सेटिंग्स 250 पिक्स / मिमी रिज़ॉल्यूशन पर नॉनमोटिल जानवरों के लिए उपयुक्त हैं। अन्य संकल्पों के लिए पैरामीटर आनुपातिक रूप से समायोजित करें। अधिक सेटिंग्स जानकारी के लिए उपयोगकर्ता मार्गदर्शिका19 देखें।
  4. तीव्रता सीमा निर्धारित करें जैसे कि न्यूरॉन्स चयन के लिए दिखाई दे रहे हैं (चित्रा 4)।
  5. छवि का उपयोग करके ब्राइटनेस /कंट्रास्ट (बी / सी) और थ्रेशोल्ड कंट्रोल विंडो खोलें | मेनू समायोजित करें .
  6. बी / सी विंडो में, न्यूनतम और अधिकतम स्लाइडर को समायोजित करें जब तक कि न्यूरॉन्स स्पष्ट रूप से अलग न हों (चित्रा 4 ए)।
  7. थ्रेशोल्ड विंडो में, डार्क पृष्ठभूमि की जांच करें और रेंज रीसेट न करें।
  8. न्यूरॉन आंदोलन और तीव्रता परिवर्तनों का निरीक्षण करने के लिए फ्रेम स्लाइडर को स्लाइड करें, किसी भी जानवर को ट्रैकिंग से बाहर करने के लिए ध्यान दें, जैसे कि अन्य जानवरों के साथ ओवरलैप के कारण।
  9. ट्रैकिंग के लिए न्यूरॉन्स की पहचान करें।
  10. प्रत्येक जानवर के लिए, थ्रेशोल्ड स्तर को समायोजित करें जैसे कि न्यूरॉन के ऊपर लाल दहलीज क्षेत्र उत्तेजना से पहले, दौरान और बाद में हर फ्रेम में दिखाई देता है।
  11. इसकी स्थिति और थ्रेशोल्ड स्तर को रिकॉर्ड करने के लिए न्यूरॉन पर क्लिक करें।
  12. ट्रैक करने के लिए प्रत्येक जानवर और न्यूरॉन के लिए थ्रेशोल्ड समायोजन और चयन दोहराएं। एक अच्छे थ्रेशोल्ड स्तर के उदाहरण के लिए चित्रा 4 सी और ओवर-थ्रेशोल्ड और अंडर-थ्रेशोल्ड उदाहरणों के लिए चित्रा 4 डी, ई देखें। पहले चयनित न्यूरॉन्स को एक छोटे बॉक्स द्वारा इंगित किया जाता है।
  13. जब सभी न्यूरॉन्स का चयन किया जाता है, तो ट्रैकिंग शुरू करने के लिए स्पेसबार दबाएं।
    नोट: अतिरिक्त न्यूरोट्रैकर उदाहरणों के लिए, पिछले संदर्भ 4,19 देखें।
  14. प्रत्येक जानवर के लिए ट्रैकिंग प्रक्रिया की निगरानी करें, और कोई भी आवश्यक सुधार करें।
  15. यदि न्यूरोट्रैकर रुक जाता है, तो यह न्यूरॉन खो चुका है। न्यूरॉन पर फिर से क्लिक करें, आवश्यकतानुसार थ्रेशोल्ड स्तर को समायोजित करें।
  16. यदि एकीकरण बॉक्स किसी अन्य पास के जानवर या गैर-न्यूरोनल संरचना में कूदता है, तो रोकने के लिए स्पेसबार दबाएं, स्लाइडर को पहले गलत फ्रेम पर वापस ले जाएं, और सही न्यूरॉन स्थान पर फिर से क्लिक करें।

9. डेटा अन्वेषण और विज़ुअलाइज़ेशन

नोट: MATLAB विश्लेषण स्क्रिप्ट का उपयोग डेटा प्रोसेसिंग और विज़ुअलाइज़ेशन के लिए और प्रत्येक विश्लेषण के लिए सारांश पीडीएफ उत्पन्न करने के लिए किया जाता है।

  1. MATLAB में "NeuroTrackerSummary_pdf.m" फ़ाइल चलाएँ, और न्यूरोट्रैकर डेटा पाठ फ़ाइलों वाले फ़ोल्डर का चयन करें।
  2. एक सारांश पीडीएफ तैयार होने की प्रतीक्षा करें, जिससे ट्रैकिंग प्रक्रिया के सत्यापन की अनुमति मिलती है (चित्रा 5)। जानवरों को एक संख्या (चित्रा 5 ए) द्वारा पहचाना जाता है, और प्रत्येक जानवर और परीक्षण से तंत्रिका प्रतिक्रियाओं को जनसंख्या परिवर्तनशीलता (चित्रा 5 बी) का आकलन करने के लिए देखा जा सकता है।
  3. तंत्रिका डेटा का पता लगाने के लिए फ़ंक्शन "databrowse.m" का उपयोग करें, उदाहरण के लिए, परीक्षण संख्या (चित्रा 5 सी), पशु संख्या (चित्रा 5 डी), उत्तेजना पैटर्न द्वारा, या किसी अन्य श्रेणी द्वारा समूहीकरण।

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Representative Results

हम उत्तेजना पैटर्न के कई उदाहरण प्रस्तुत करते हैं जो विभिन्न तंत्रिका घटनाओं का आकलन करते हैं, जिसमें अस्थायी निषेध, अनुकूलन और विघटन शामिल हैं। अस्थायी अवरोध प्रारंभिक प्रस्तुति14 के तुरंत बाद होने वाली दूसरी उत्तेजना प्रस्तुति के लिए एक तंत्रिका प्रतिक्रिया का क्षणिक दमन है। इस घटना का परीक्षण करने के लिए, एक युग्मित-पल्स प्रयोग में, 0 एस से 20 एस तक के अंतराल से अलग किए गए दो 1 एस ओडोरेंट दालों से युक्त आठ पैटर्न प्रस्तुत किए गए थे (चित्रा 6 बी; संबंधित उत्तेजना नियंत्रण फ़ाइल के लिए चित्रा 3 बी देखें)। अखाड़ा को एक एकल उत्तेजना द्रव (1.1 μM डायसिटाइल), बफर और नियंत्रण प्रवाह ट्यूबिंग के साथ स्थापित किया गया था, जिसमें अप्रयुक्त इनलेट पोर्ट को एक ठोस पिन (चित्रा 6 ए) के साथ अवरुद्ध किया गया था। वाल्व 1 को चालू करके, नियंत्रण द्रव ctrl1 इनलेट में प्रवेश करता है, द्रव धाराओं को स्थानांतरित करता है ताकि उत्तेजना क्षेत्र में प्रवेश करे; जब वाल्व 1 बंद होता है, तो नियंत्रण तरल पदार्थ CTRL2 इनलेट में प्रवेश करता है, और बफर अखाड़े के माध्यम से बहता है ( चित्रा 2 जी, एच देखें)। जबकि पहले 1 एस गंध पल्स ने डायसिटाइल-डिटेक्टिंग एडब्ल्यूए न्यूरॉन्स में एक समान प्रतिक्रिया परिमाण प्राप्त किया, दूसरी पल्स की प्रतिक्रियाएं इंटरस्टिमुलस अंतराल (चित्रा 6 डी) के साथ भिन्न थीं। 10 सेकंड से कम के पल्स अंतराल के लिए, दूसरी प्रतिक्रिया कमजोर थी, जो अस्थायी अवरोध घटना का प्रदर्शन करती थी। इस प्रयोगात्मक सेटअप का उपयोग करते हुए, डायनेन घटक सीएचई -3 का विघटन अस्थायी अवरोध को रोकने के लिए पाया गया था, जो इस घटना में अक्षीय परिवहन को दर्शाताहै।

अनुकूलन एक ही उत्तेजना की बार-बार प्रस्तुतियों के लिए तंत्रिका प्रतिक्रियाओं में क्रमिक कमी है। यह घटना विभिन्न प्रक्रियाओं के कारण हो सकती है, जैसे कि सक्रिय निषेध, जिसे तेजी से उलट किया जा सकता है, या अन्य प्रक्रियाएं जो रिवर्स करने में धीमी हैं। तेजी से रिवर्सबिलिटी का आकलन करने के लिए एक प्रयोग एक "कैच" परीक्षण है, जिसमें अनुकूलन स्थापित करने के लिए एक उत्तेजना दोहराई जाती है, इसके बाद "विचलित" या उपन्यास उत्तेजना, और फिर मूल उत्तेजना पर वापसी। यदि उपन्यास "विघटनकारी" उत्तेजना के बाद तंत्रिका प्रतिक्रियाएं बढ़ जाती हैं, तो विघटन देखा जाता है। चित्रा 7 दो ओडोरेंट्स, डायसिटाइल और 2-मिथाइलपाइराज़िन (2-एमपी) का उपयोग करके एक उदाहरण प्रदर्शित करता है, जो विभिन्न रिसेप्टर्स4 के माध्यम से एडब्ल्यूए केमोसेंसरी न्यूरॉन्स द्वारा पता लगाया जाता है। दो उत्तेजना जलाशयों और टयूबिंग को माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस से जोड़ा गया था, जिसमें एक अतिरिक्त तीन-तरफा चुटकी वाल्व था ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि कौन सी उत्तेजना क्षेत्र में प्रवेश करती है (चित्रा 7 ए)। उत्तेजना पैटर्न को सभी 30 परीक्षणों के लिए वाल्व 1 के माध्यम से 4 एस के लिए रासायनिक दालों को पेश करने और वाल्व 3 के माध्यम से उत्तेजना एस 1 या एस 2 के बीच चयन करने के लिए परिभाषित किया गया था, जिसे 25 वें परीक्षण के बाद चालू किया गया था और 26 वें के बाद बंद कर दिया गया था (चित्रा 7 बी)। इस व्यवस्था ने जानवरों को प्रस्तुति से पहले माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के माध्यम से विभिन्न उत्तेजना तरल पदार्थों के प्रवाह के लिए पर्याप्त समय सुनिश्चित किया। डायसिटाइल उत्तेजना के लिए अनुकूलन देखा गया था, लेकिन उपन्यास 2-एमपी उत्तेजना की प्रस्तुति ने एक मजबूत विघटन प्रभाव प्राप्त नहीं किया (चित्रा 7 सी)।

ऑप्टोजेनेटिक उत्तेजना प्रकाश-संवेदनशील आयन चैनलों के माध्यम से न्यूरॉन्स को सक्रिय करने के लिए प्रकाश का उपयोग करती है। उपयोग करने के लिए सुविधाजनक होने पर, ऑप्टोजेनेटिक सक्रियण संवेदी रिसेप्टर्स और कुछ नियामक मार्गों को बाईपास करता है, इसलिए कुछ तंत्रिका घटनाएं प्राकृतिक उत्तेजनाओं द्वारा सक्रियण की तुलना में भिन्न हो सकती हैं। इन अंतरों का परीक्षण करने के लिए, मल्टीमॉडल प्रयोग एक ही प्रयोग के भीतर विभिन्न प्रकार की उत्तेजना प्रस्तुत करने के लिए उपयोगी होते हैं। चैनलरोडोप्सिन संस्करण क्रिमसन को व्यक्त करने वाले न्यूरॉन्स लाल प्रकाश जोखिम5 द्वारा सक्रिय होते हैं। यह आकलन करने के लिए कि क्या एडब्ल्यूए न्यूरॉन्स रासायनिक और ऑप्टोजेनेटिक उत्तेजना के समान अनुकूलन करते हैं, एडब्ल्यूए न्यूरॉन्स में क्रिमसन और जीसीएएमपी दोनों को व्यक्त करने वाले एनजेड 1091 तनाव को 14-28 घंटे के लिए कोफ़ैक्टर ऑल-ट्रांस-रेटिना (एटीआर, 100 μM) युक्त प्लेट पर बनाए रखा गया था। एक 615 एनएम लाल एलईडी ने ऊपर से माइक्रोफ्लुइडिक क्षेत्र को रोशन किया (चित्रा 8 ए), और एक ही परीक्षण के भीतर डायसिटाइल, लाल प्रकाश, या दोनों के 5 एस दालें प्रदान करके मल्टीमॉडल उत्तेजना पैटर्न का एक सेट उत्पन्न किया गया (चित्रा 8 बी)। अकेले रासायनिक उत्तेजना ने अनुकूलन का कारण बना, जबकि ऑप्टिकल उत्तेजना अकेले नहीं थी (चित्रा 8 सी)। हालांकि, संयुक्त मल्टीमॉडल उत्तेजना पैटर्न ने प्रदर्शित किया कि ऑप्टोजेनेटिक प्रतिक्रियाएं रासायनिक रूप से प्रेरित अनुकूलन (चित्रा 8 सी, डी) के लिए अतिसंवेदनशील थीं। इन प्रयोगों से पता चलता है कि अनुकूलन संवेदी रिसेप्टर्स या डेंड्राइटिक प्रक्रियाओं पर शुरू किया जाता है, लेकिन इसके प्रभाव पूरे न्यूरॉन में फैल जाते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: तंत्रिका कैल्शियम रिकॉर्डिंग और उत्तेजना उपकरण का योजनाबद्ध। माइक्रोस्कोप छवि कैप्चर, प्रतिदीप्ति उत्तेजना प्रकाश और उत्तेजना को एक कंप्यूटर और एक ओपन-सोर्स Arduino माइक्रोकंट्रोलर द्वारा नियंत्रित किया जाता है। माइक्रोफ्लुइडिक क्षेत्र में रासायनिक उत्तेजना नियंत्रण द्रव प्रवाह सी के माध्यम से बफर बी और उत्तेजना एस समाधान के बीच स्विच करती है। वैकल्पिक सिस्टम तत्वों को तारांकन (*) द्वारा इंगित किया जाता है, जैसे कि अतिरिक्त वाल्व और ऑप्टिकल या अन्य उत्तेजना के तौर-तरीके। प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप छवियों का उपयोग कैल्शियम क्षणिकों के माध्यम से तंत्रिका गतिविधि को मापने के लिए किया जाता है, उदाहरण के लिए, कैल्शियम संकेतक जीसीएएमपी का उपयोग करके। धराशायी रेखाएं विद्युत कनेक्शन (डिजिटल या एनालॉग) का प्रतिनिधित्व करती हैं, घुमावदार रेखाएं द्रव टयूबिंग हैं, और सीधे ठोस तीर ऑप्टिकल प्रकाश पथ हैं। संक्षिप्त नाम: एलईडी = प्रकाश उत्सर्जक डायोड। यह आंकड़ा लॉलर और अल्ब्रेक्ट15 से संशोधित है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस असेंबली और सेटअप। माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस में एक (ए) माइक्रोपैटर्न पीडीएमएस डिवाइस शामिल है जो (बी) ड्रिल किए गए ग्लास टॉप और हाइड्रोफोबिक ग्लास बेस और (सी) क्लैंप के बीच स्थित है। (डी) जलाशयों को डिवाइस के ऊपर (ई) ट्यूबिंग रैक स्टैंड के साथ तैनात किया गया है। जलाशयों से टयूबिंग या तो सीधे डिवाइस में या तरल नियंत्रण के लिए सक्रिय वाल्व के माध्यम से जुड़ा हुआ है। डिवाइस माइक्रोस्कोप पर उद्देश्य के ऊपर स्थित है। (एफ) इनलेट्स, वर्म लोडिंग पोर्ट और आउटलेट में जुड़े सभी टयूबिंग के साथ माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस की क्लोज-अप छवि। (जी) 20 मिमी x 20 मिमी माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस का योजनाबद्ध। काली रेखाएं 55-70 μm लंबे द्रव चैनलों का प्रतिनिधित्व करती हैं। इस ज्यामिति को जानवरों को क्षेत्र और माइक्रोस्कोप क्षेत्र के भीतर रखते हुए प्रवाह के लंबवत एक उत्तेजना मोर्चे के साथ सटीक स्थानिक नियंत्रण की अनुमति देने के लिए डिज़ाइन किया गया है। बफर स्ट्रीम और एक स्टिमुलस स्ट्रीम (या वैकल्पिक रूप से स्टिम 2, यदि उपयोग किया जाता है) लगातार प्रवाहित होता है, जबकि एक समय में केवल एक नियंत्रण द्रव इनलेट बहता है, जिससे तरल पदार्थ अखाड़े में प्रवेश करता है। (एच) जब वाल्व 1 सक्रिय होता है, तो नियंत्रण तरल पदार्थ सामान्य रूप से बंद बंदरगाह से नियंत्रण 1 इनलेट तक बहता है, और उत्तेजना चालू हो जाती है और क्षेत्र के माध्यम से बहती है। जब वाल्व 1 बंद होता है, तो तरल पदार्थ सामान्य रूप से खुले बंदरगाह से नियंत्रण 2 इनलेट तक बहता है, और बफर क्षेत्र में प्रवेश करता है। उचित प्रवाह संतुलन दिखाया गया है, जिसमें फ्लोरेसिन डाई का उपयोग उत्तेजना द्रव के रूप में किया जाता है। ध्यान दें कि अखाड़े में प्रवेश करने वाले कुछ तरल पदार्थ भी ऊपरी और निचले घुमावदार चैनलों के माध्यम से इसे बाईपास करते हैं। ये धाराएँ संकीर्ण होनी चाहिए और ऊपरी और निचले चैनलों में समान चौड़ाई होनी चाहिए। जलाशय की ऊंचाइयों को आवश्यकतानुसार समायोजित किया जा सकता है। संक्षेप: पीडीएमएस = पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन; डब्ल्यूएल = कृमि लोडिंग; बुफ = बफर; Stim1 = पहला उत्तेजना; स्टिम 2 = दूसरा उत्तेजना; एनसी = सामान्य रूप से बंद; नहीं = सामान्य रूप से खुला। यह आंकड़ा लॉलर और अल्ब्रेक्ट15 से संशोधित है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: उदाहरण उत्तेजना परिभाषा फ़ाइलें। (ए) उदाहरण एकल दोहराई जाने वाली उत्तेजना प्रयोग: 2 एस से 7 एस (फ्रेम 20 से 70) तक 200 तीव्रता पर 5 एस प्रकाश नाड़ी। (बी) चित्र 6 के अनुरूप आठ अलग-अलग उत्तेजना पैटर्न के साथ उदाहरण बहु-पैटर्न उत्तेजना प्रयोग। दो 1 एस रासायनिक दालों को उनके बीच 0 से 20 सेकंड के अंतराल के साथ प्रस्तुत किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: न्यूरोट्रैकर में न्यूरॉन्स और थ्रेशोल्ड स्तरों का चयन । (ए) एडब्ल्यूए न्यूरॉन्स को स्पष्ट रूप से देखने के लिए चमक और कंट्रास्ट समायोजित करने के साथ दृश्य का पूर्ण माइक्रोस्कोप क्षेत्र। (बी) एक जानवर के सिर क्षेत्र का आवर्धित दृश्य एकीकरण बॉक्स को दर्शाता है जिसमें से प्रतिदीप्ति तीव्रता की गणना की जाती है और पृष्ठभूमि घटाव के लिए पृष्ठभूमि वार्षिकी। (सी) एक मजबूत तंत्रिका प्रतिक्रिया दिखाते हुए एकीकृत तीव्रता साजिश। (डी) एक अच्छे थ्रेशोल्ड चयन के परिणामस्वरूप एक लाल दहलीज क्षेत्र होगा जो छवि स्टैक में प्रत्येक फ्रेम के लिए न्यूनतम आकार पैरामीटर से ऊपर और अधिकतम आकार पैरामीटर से नीचे है और इसमें कोई आस-पास का क्षेत्र शामिल नहीं है, जैसे कि आंत ऑटोफ्लोरेसेंस (पैनल बी देखें)। (ई) न्यूरॉन के सक्रिय होने पर बहुत अधिक निर्धारित सीमा अच्छी दिखाई दे सकती है, लेकिन निष्क्रिय होने पर, न्यूरॉन खो सकता है। इसलिए, एक सीमा का चयन करते समय पूर्व-उत्तेजना और पोस्ट-उत्तेजना फ्रेम दोनों की जांच करना महत्वपूर्ण है। (एफ) बहुत कम निर्धारित एक सीमा अन्य गैर-न्यूरोनल संरचनाओं को उजागर कर सकती है। ओवर-थ्रेशोल्ड या अंडर-थ्रेशोल्ड चयन न्यूरोट्रैकर को न्यूरॉन खोने और थ्रेशोल्ड और न्यूरॉन स्थिति को सही करने के लिए उपयोगकर्ता की प्रतिक्रिया के लिए रोक सकता है। संक्षिप्त नाम: बी & सी = चमक और कंट्रास्ट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: उदाहरण डेटा विश्लेषण। प्रति मिनट एक बार 5 एस अवधि ऑप्टोजेनेटिक उत्तेजना के 10 दोहराव के संपर्क में आने वाले 15 जानवरों की तंत्रिका प्रतिक्रियाएं। (ए) परीक्षण (लाल बक्से) के भीतर ट्रैक किए गए जानवरों और न्यूरॉन्स की गति को इंगित करने वाली सारांश छवि। परीक्षण के दौरान पशु 2 चला गया। (बी) समय के साथ व्यक्तिगत पशु प्रतिक्रियाएं लाल प्रकाश उत्तेजना के लिए अपेक्षाकृत सुसंगत प्रतिक्रिया दिखाती हैं। (सी) डेटाब्राउज फ़ंक्शन का उपयोग करके डेटा अन्वेषण आउटपुट। निशान को परीक्षण दोहराव (ऊपर) द्वारा समूहीकृत किया जाता है, और उपयोगकर्ता-चयन योग्य परीक्षणों के लिए औसत नीचे दिखाए जाते हैं। (डी) डेटा को अलग-अलग पशु संख्या द्वारा समूहीकृत किया गया और बार-बार परीक्षणों में औसत निकाला गया। यह डेटासेट न्यूनतम अंतर-पशु परिवर्तनशीलता दिखाता है, जो आबादी भर में औसत प्रतिक्रियाओं को सही ठहराता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: अस्थायी अवरोध का आकलन करने के लिए एक चर इंटरस्टिमुलस अंतराल के साथ युग्मित-नाड़ी प्रयोग । (ए) माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस इनलेट कनेक्शन। अप्रयुक्त इनलेट को एक ठोस पिन (एक्स) के साथ अवरुद्ध किया जाता है। नियंत्रण द्रव जलाशय और वाल्व 1 सी 1 और सी 2 इनलेट्स से जुड़े होते हैं, जिन्हें स्पष्टता के लिए यहां छोड़ दिया जाता है। (बी) आठ पैटर्न के लिए प्रोत्साहन समय। दालें अवधि में 1 सेकंड हैं और 0-20 सेकंड से अलग हैं। पैटर्न का अनुक्रम नीचे दर्शाया गया है; प्रत्येक पैटर्न छह या सात बार प्रस्तुत किया गया था। (सी) 50 परीक्षणों और नौ जानवरों से एडब्ल्यूए तंत्रिका गतिविधि। उत्तेजना पैटर्न द्वारा क्रमबद्ध प्रतिक्रियाओं का एक हीटमैप ऊपर दिखाया गया है; प्रत्येक पैटर्न (एन = 56-63 प्रतिक्रियाओं) के लिए औसत तंत्रिका गतिविधि नीचे दिखाई गई है। प्रारंभिक नाड़ी के बाद ~ 10 सेकंड के लिए अस्थायी अवरोध होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: निषेध का आकलन करने के लिए परीक्षण प्रयोग को पकड़ें । (ए) माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस इनलेट कनेक्शन। एक तीन-तरफा चुटकी वाल्व केवल उत्तेजना एस 1 को आराम से पारित करने की अनुमति देता है और सक्रिय होने पर केवल एस 2 को पारित करने की अनुमति देता है। (बी) बार-बार डायसिटाइल गंध दालों को वितरित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले तीन पैटर्न अनुक्रमों का आरेख, 26 वें परीक्षण पर प्रस्तुत नई उत्तेजना 2-मिथाइलपाइराज़िन के साथ। (सी) 20 जानवरों में औसत एडब्ल्यूए तंत्रिका गतिविधि प्रतिक्रियाएं। संक्षेप: डीए = डायसिटाइल; 2-एमपी = 2-मिथाइलपाइराज़िन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्रा 8: मल्टीमॉडल उत्तेजना उदाहरण । (ए) माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस इनलेट कनेक्शन, एक ठोस पिन के साथ अवरुद्ध एक अप्रयुक्त इनलेट के साथ। एक लाल एलईडी ऊपर से अखाड़े को रोशन करता है। (बी) ऑप्टिकल, रासायनिक, या मल्टीमॉडल उत्तेजना के लिए पैटर्न। (सी) युग्मित ऑप्टोजेनेटिक और केमोसेंसरी (शीर्ष), ऑप्टोजेनेटिक केवल (मध्य), और केमोसेंसरी केवल (नीचे) उत्तेजना के साथ 30 दोहराए गए परीक्षणों के लिए औसत एडब्ल्यूए तंत्रिका गतिविधि (एन = 11 जानवर)। (डी) ऊपर ऑप्टोजेनेटिक दालों और नीचे रासायनिक दालों के लिए प्रत्येक परीक्षण के लिए पीक न्यूरल रिस्पांस औसत। ऑप्टोजेनेटिक दालें सीधे अनुकूलन का कारण नहीं बनती हैं, लेकिन उनकी प्रतिक्रियाएं केमोसेंसरी अनुकूलन के लिए अतिसंवेदनशील होती हैं। संक्षेप: डीए = डायसिटाइल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इस प्रोटोकॉल में, हम विभिन्न उत्तेजना पैटर्न के अस्थायी रूप से सटीक वितरण का उपयोग करके तंत्रिका गतिविधि की घटनाओं के मूल्यांकन के लिए एक ओपन-एक्सेस माइक्रोस्कोपी प्रणाली का वर्णन करते हैं। माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म माइक्रोस्कोप क्षेत्र में दसियों जानवरों को रखते हुए दोहराने योग्य उत्तेजना प्रदान करता है। कुछ वाणिज्यिक माइक्रोस्कोपी सॉफ्टवेयर पैकेज विभिन्न उत्तेजना समय पैटर्न की आसान प्रोग्रामिंग की अनुमति देते हैं, और जिन्हें अक्सर प्रत्येक पैटर्न या मालिकाना फ़ाइल प्रारूपों की मैन्युअल प्रविष्टि की आवश्यकता होती है। इसके विपरीत, इस प्रणाली में प्रयोगों को पाठ फ़ाइलों द्वारा परिभाषित किया जाता है, जो कंप्यूटर-जनित हो सकते हैं और विश्लेषण सॉफ्टवेयर द्वारा पठनीय होते हैं। यहां, हम मल्टीमॉडल उत्तेजना के दौरान अस्थायी निषेध, अनुकूलन और क्रॉसस्टॉक जैसी न्यूरोनल घटनाओं का आकलन करने के लिए परिवर्तनीय उत्तेजना पैटर्न को नियोजित करने की उपयोगिता का प्रदर्शन करते हैं। डेटा विश्लेषण पाइपलाइन बड़ी माइक्रोस्कोपी वीडियो फ़ाइलों को तंत्रिका गतिविधि डेटा में कम कर देती है जिसे जनसंख्या परिवर्तनशीलता (चित्रा 5 बी), समय के साथ परिवर्तन (चित्रा 7 सी और चित्रा 8 सी, डी), और गड़बड़ी के बाद परिवर्तन (चित्रा 7 सी) के लिए कल्पना और विश्लेषण किया जा सकता है।

स्वचालन का एक महत्वपूर्ण लाभ परीक्षण दोहराव और प्रयोगों के बीच उत्तेजना की प्रजनन क्षमता है, और माइक्रोफ्लुइडिक क्षेत्र प्रारूप पिछले एकल-पशुविधियों 7,9,13 की तुलना में थ्रूपुट में कम से कम 20 गुना वृद्धि की अनुमति देता है। जानवरों की आबादी को एक ही उत्तेजना और पर्यावरणीय परिस्थितियों के अधीन करना यह सुनिश्चित करता है कि डेटा तुलनीय हैं और समाधान की तैयारी, तापमान, पशु स्रोतों या अन्य कारकों में संभावित दिन-प्रतिदिन की भिन्नताओं से बचते हैं। हालांकि, इस दृष्टिकोण की एक सीमा कम-आवर्धन, कम-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी है जो सभी जानवरों को दृश्य के क्षेत्र में रखती है। ट्रैकिंग त्रुटियों को कम करने के लिए प्रति जानवर केवल एक न्यूरॉन की निगरानी की जानी चाहिए, हालांकि कम से कम 50 μm द्वारा अलग किए गए न्यूरॉन्स को सिद्धांत रूप में अलग किया जा सकता है। द्विपक्षीय न्यूरॉन जोड़े को एक साथ चित्रित किया जा सकता है यदि प्रतिक्रियाएं सममित होने की उम्मीद है। पहले यह पहचानना महत्वपूर्ण है कि कौन से विशिष्ट न्यूरॉन्स रुचि की तंत्रिका प्रक्रिया में शामिल हैं, जैसे कि पूरे मस्तिष्क इमेजिंग7 द्वारा, और फिर बढ़े हुए थ्रूपुट के लिए केवल प्रासंगिक न्यूरॉन्स में जीसीएएमपी व्यक्त करना।

रिपोर्टर अभिव्यक्ति स्तर या अन्य अंतर-व्यक्तिगत मतभेदों के कारण न्यूरोनल कैल्शियम प्रतिक्रियाएं जानवरों द्वारा भिन्न होती हैं। उदाहरण के लिए, सामान्यीकृत एडब्ल्यूए जीसीएएमपी प्रतिक्रियाएं चरम परिमाण में दो गुना भिन्न होती हैं, यहां तक कि इसोजेनिक जंगली-प्रकार के जानवरों में भी कैल्शियम रिपोर्टर जीनोम4 में स्थिर रूप से एकीकृत होता है। कुछ उत्तेजनाएं आबादी में परिवर्तनीय प्रतिक्रियाएं दिखाती हैं (जैसे, ब्यूटाइल एसीटेट4), परिवर्तनीय रिसेप्टर अभिव्यक्ति का सुझाव देती हैं। व्यवहार में, जनसंख्या परिवर्तनशीलता निर्धारित करने के लिए कम से कम 20 व्यक्तिगत जानवरों का मूल्यांकन किया जाना चाहिए। प्रतिक्रिया परिवर्तनों को निर्धारित करने में सांख्यिकीय शक्ति बढ़ाने के लिए व्यक्तिगत पशु डेटा का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है, जैसे कि गड़बड़ी से पहले और बाद में जोड़े गए व्यक्तिगत तंत्रिका प्रतिक्रियाओं की सांख्यिकीय तुलना द्वारा।

बड़े डेटासेट और स्वचालित प्रयोग के साथ, उचित प्रयोग फ़ंक्शन, ट्रैकिंग और डेटा में कमी को मान्य और सत्यापित करना महत्वपूर्ण है, खासकर अनदेखे चरणों के लिए। फ्लो पैटर्न को फ्लोरोसेंट समाधान (जैसा कि चित्रा 2 एच में) के साथ सत्यापित किया जाना चाहिए, रिकॉर्ड किए गए वीडियो में क्षेत्र में प्रवेश करने वाले बुलबुले या नियंत्रण तरल पदार्थ को देखकर नहीं। डेटासेट को मान्य किया जाना चाहिए, उदाहरण के लिए, किसी भी पशु आंदोलन (जैसा कि चित्रा 5 ए में) को नोट करना और चिकनी तंत्रिका प्रतिक्रियाओं को सत्यापित करना (जैसा कि चित्रा 4 सी और चित्रा 5 बी में)। किसी भी समस्याग्रस्त डेटा को बाहर रखा जाना चाहिए। यह सुनिश्चित करने के लिए कि औसत प्रतिक्रिया व्यक्तिगत प्रतिक्रियाओं को दर्शाती है, "डेटाब्राउज़" फ़ंक्शन का उपयोग करने से पहले डेटा समूहीकरण को सत्यापित करना भी महत्वपूर्ण है।

ओपन-सोर्स उत्तेजना नियंत्रण प्रणाली डिजिटल या एनालॉग सिग्नल या सीरियल संचार आदेशों के माध्यम से अन्य उत्तेजनाओं के लिए आसानी से विस्तार योग्य है। वर्गीकृत उत्तेजनाएं आमतौर पर एनालॉग वोल्टेज (0-5 वी) इनपुट द्वारा नियंत्रित होती हैं, जैसे एलईडी प्रकाश तीव्रता या तंत्रिका उत्तेजक पल्स परिमाण। ऑन-ऑफ उत्तेजनाओं को आमतौर पर डिजिटल (टीटीएल) संकेतों के साथ नियंत्रित किया जाता है, जैसे कि विद्युत उत्तेजक समय। ये डिजिटल सिग्नल अन्य विद्युत प्रणालियों को सक्रिय करने के लिए रिले स्विच को भी सक्रिय कर सकते हैं, जैसे कि मेकेनोसेंसरी उत्तेजना के लिए कंपन मोटर्स। अन्य उपकरण सीरियल संचार का उपयोग करते हैं, जैसे कि यूएसबी कनेक्शन द्वारा, क्रियाओं को परिभाषित करने के लिए प्रेषित विशिष्ट वर्ण आदेशों के साथ। उदाहरण के लिए, खुराक-प्रतिक्रिया प्रयोग यूएसबी-नियंत्रित घूर्णी वाल्व5 या मल्टी-वेल प्लेट सिस्टम6 का उपयोग करके स्वचालित रूप से कई रासायनिक सांद्रता पेश कर सकते हैं। इन आदेशों को विशिष्ट परीक्षण संख्याओं पर भेजे जाने के लिए ओपन-सोर्स माइक्रोस्कोप नियंत्रण स्क्रिप्ट में जोड़ा जा सकता है। समय की देरी को इसी तरह शामिल किया जा सकता है; उदाहरण के लिए, दो 30 परीक्षण उत्तेजना मुकाबलों के बीच 1 घंटे के लिए परीक्षण को रोकने के लिए, एक 60 परीक्षण प्रयोग निर्दिष्ट करेगा और परीक्षण संख्या 31 तक पहुंचने पर 1 घंटे के लिए रोकने के लिए कोड की एक पंक्ति जोड़ देगा।

प्रयोगात्मक जटिलता लगभग असीम है और "बंद-लूप" प्रणाली में लाइव प्रतिक्रिया के आधार पर एक प्रयोग के दौरान भी बदल सकती है। उदाहरण के लिए, उत्तेजना तंत्रिका गतिविधि, पशु व्यवहार या किसी अन्य मात्रात्मक पैरामीटर के आधार पर वास्तविक समय में भिन्न हो सकती है। हमने हाल ही में व्यवहार 8,15 में बदलाव के बाद उत्तेजना और तंत्रिका रिकॉर्डिंग को ट्रिगर करके नींद बनाम जागृत जानवरों में संवेदी तंत्रिका प्रतिक्रियाओं का आकलन करने के लिए ऐसी प्रणाली का उपयोग किया। न्यूरोट्रैकर की गति ट्रैकिंग सुविधा व्यवहार आउटपुट के सहसंबंध के लिए स्वतंत्र रूप से चलने वाले जानवरों में तंत्रिका गतिविधि के विश्लेषण को सक्षम बनाती है। हालांकि, अलग-अलग चलती जानवरों को ट्रैक करने के लिए बारीकी से ध्यान देने की आवश्यकता होती है, जैसे कि जब वे पथ पार करते हैं, और इसलिए, इन इंटरैक्शन को कम करने के लिए प्रति क्षेत्र (लगभग पांच) कम जानवरों को लोड करने की सिफारिश की जाती है।

कुल मिलाकर, ये तकनीक ें जनसंख्या परिवर्तनशीलता और विशिष्ट तंत्रिका घटनाओं की खोज में उत्तेजना और प्रयोगात्मक थ्रूपुट की सटीकता को बढ़ाती हैं। न्यूरोनल गतिविधि को मापने के अलावा, ये विधियां पौधों सहित अन्य बायोसिस्टम के लिए सामान्य हैं, जो कैल्शियम सिग्नल21, न्यूरल सेल कल्चर और ब्रेन ऑर्गेनोइड्स 22 के साथ-साथ अन्य गतिशील फ्लोरोसेंट संकेतों के माध्यम से भी संवाद करती हैं, जैसे कि सिनैप्टिक गतिविधि के लिए सेंसर, न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज 23, और ट्रांसक्रिप्शन 24।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

हम इन प्रोटोकॉल का परीक्षण करने और पांडुलिपि की समीक्षा करने और प्रोग्रामिंग सहायता के लिए एरिक हॉल के लिए फॉक्स एवरी को धन्यवाद देते हैं। यहां प्रस्तुत विधियों के लिए वित्त पोषण राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन 1724026 (डीआरए) द्वारा प्रदान किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bacterial strains
E. coli (OP50) Caenorhabditis Genetics Center (CGC) Cat# OP50
Experimental models: Organisms/strains
C. elegans strains expressing GCaMP (and optionally, Chrimson) in desired neurons Caenorhabditis Genetics Center (CGC) or corresponding authors of published work NZ1091, for example
Chemicals, Treatments, and Worm Preparation Supplies
2,3-Butanedione Sigma-Aldrich Cat# B85307 diacetyl, example chemical stimulus
Calcium chloride, CaCl2 Sigma-Aldrich Cat# C3881
Fluorescein, Sodium salt Sigma-Aldrich Cat# F6377
Glass water repellant Rain-X Cat #800002250 glass hydrophobic treatment (single-use)
Magnesium chloride, MgCl2 Sigma-Aldrich Cat# M2393
Nematode Growth Medium (NGM) agar Genesee Cat #: 20-273NGM
Petri dishes (60 mm) Tritech Cat #T3305
Poly(dimethyl siloxane) (PDMS): Sylgard 184 Dow Chemical Cat# 1673921
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich Cat# P5655
Potassium phosphate dibasic Sigma-Aldrich Cat# P8281
Sodium chloride, NaCl Sigma-Aldrich Cat# S7653
(tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane (TFOCS) Gelest CAS# 78560-45-9 glass hydrophobic treatment (durable)
Software and algorithms
Arduino IDE Arduino https://www.arduino.cc/en/software
ImageJ NIH https://imagej.nih.gov/ij/
MATLAB MathWorks https://www.mathworks.com/products/matlab.html
Micro-manager Micro-manager https://micro-manager.org/
Microscope control software Albrecht Lab https://github.com/albrechtLab/MicroscopeControl
Neurotracker data analysis software Albrecht Lab https://github.com/albrechtLab/Neurotracker
Automated Microscope and Stimulation System
Axio Observer.A1 inverted microscope set up for epifluorescence (GFP filter cubes, 5× objective or similar) Zeiss Cat #491237-0012-000
Excelitas X-cite XYLIS LED illuminator Excelitas Cat #XYLIS
Orca Flash 4.0 Digital sCMOS camera Hamamatsu Cat #C11440-22CU
Arduino nano Arduino Cat #A000005
3-way Miniature Diapragm Isolation Valve (LQX12) Parker Cat #LQX12-3W24FF48-000 Valve 1: Control
2-way normally-closed (NC) Pinch Valve Bio-Chem Valve Inc Cat #075P2-S432 Valve 2: Outflow
3-way Pinch Valve NResearch Cat #161P091 Valve 3: Stimulus selection
Optogenetic stimulation LED and controller (615 nm) Mightex Cat #PLS-0625-030-S and #SLA-1200-2
ValveLink 8.2 digital/manual valve controller AutoMate Scientific Cat #01-18
Wires and connectors various See Fig. 2 of Cell STARS Protocol (Lawler, 2021)
Microfluidic Device Preparation
Dremel variable speed rotary cutter 4000  Dremel Cat #F0134000AB Set speed to 5k RPM for cutting glass
Dremel drill press rotary tool workstation Dremel Cat #220-01
Diamond drill bit Dremel Cat #7134
Glass slide, 1 mm thick VWR Cat #75799-268
Glass scribe (Diamond scriber) Ted Pella Cat #54468
Luer 3-way stopcock Cole-Parmer Cat #EW-30600-07
Luer 23 G blunt needle VWR Cat #89134-100
Microfluidic device Corresponing author or fabricate from CAD files associated with this article N/A
Microfluidic device clamp Warner Instruments (or machine shop) P-2
Microfluidic tubing, 0.02″ ID Cole-Parmer Cat #EW-06419-01
Tube 19 G, 0.5″ New England Small Tube Cat #NE-1027-12

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 193
कई छोटे जीवों से स्वचालित मल्टीमॉडल उत्तेजना और एक साथ न्यूरोनल रिकॉर्डिंग
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White, H., Kamara, V., Gorski, V., Busby, M., Albrecht, D. R. Automated Multimodal Stimulation and Simultaneous Neuronal Recording from Multiple Small Organisms. J. Vis. Exp. (193), e65042, doi:10.3791/65042 (2023).

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