Summary
Presentiamo un metodo per la stimolazione chimica e multimodale flessibile e la registrazione dell'attività neurale simultanea da molti vermi Caenorhabditis elegans . Questo metodo utilizza microfluidica, hardware e software open source e analisi automatizzata dei dati supervisionata per consentire la misurazione di fenomeni neuronali come l'adattamento, l'inibizione temporale e la diafonia dello stimolo.
Abstract
Gli indicatori di calcio fluorescenti geneticamente codificati hanno contribuito notevolmente alla nostra comprensione delle dinamiche neurali dal livello dei singoli neuroni a interi circuiti cerebrali. Tuttavia, le risposte neurali possono variare a causa dell'esperienza precedente, degli stati interni o dei fattori stocastici, generando così la necessità di metodi in grado di valutare la funzione neurale in molti individui contemporaneamente. Mentre la maggior parte delle tecniche di registrazione esamina un singolo animale alla volta, descriviamo l'uso della microscopia a campo largo per scalare le registrazioni neuronali a dozzine di Caenorhabditis elegans o altri organismi su scala sub-millimetrica contemporaneamente. L'hardware e il software open source consentono una grande flessibilità nella programmazione di esperimenti completamente automatizzati che controllano l'intensità e la tempistica di vari tipi di stimolo, inclusi stimoli chimici, ottici, meccanici, termici ed elettromagnetici. In particolare, i dispositivi di flusso microfluidico forniscono un controllo preciso, ripetibile e quantitativo degli stimoli chemiosensoriali con risoluzione temporale inferiore al secondo. La pipeline di analisi dei dati semi-automatizzata NeuroTracker estrae quindi le risposte neurali individuali e a livello di popolazione per scoprire cambiamenti funzionali nell'eccitabilità e nella dinamica neurale. Questo articolo presenta esempi di misurazione dell'adattamento neuronale, dell'inibizione temporale e della diafonia dello stimolo. Queste tecniche aumentano la precisione e la ripetibilità della stimolazione, consentono l'esplorazione della variabilità della popolazione e sono generalizzabili ad altri segnali fluorescenti dinamici in piccoli biosistemi da cellule e organoidi a interi organismi e piante.
Introduction
Le tecniche di imaging del calcio hanno permesso la registrazione non invasiva delle dinamiche neurali in vivo in tempo reale utilizzando la microscopia a fluorescenza e indicatori di calcio geneticamente codificati espressi nelle cellule bersaglio 1,2,3. Questi sensori utilizzano tipicamente una proteina fluorescente verde (GFP), come la famiglia di peptidi GFP-calmodulina-M13 (GCaMP), per aumentare l'intensità della fluorescenza dopo l'attivazione neuronale e livelli elevati di calcio intracellulare. L'imaging del calcio è stato particolarmente potente nel nematode C. elegans per esaminare come funzionano i neuroni e i circuiti neurali negli animali viventi e comportamentali 4,5,6,7,8,9,10, poiché la loro natura trasparente significa che non è richiesto alcun processo chirurgico per l'accesso ottico e i promotori genici specifici delle cellule indirizzano l'espressione alle cellule di interesse. Queste tecniche fanno spesso uso di dispositivi microfluidici, che forniscono ambienti controllati con precisione per studiare fenomeni biologici, chimici e fisici su piccola scala fisica11,12. I dispositivi microfluidici abbondano per misurare l'attività neurale, con nuovi progetti continuamente in fase di sviluppo e sono prontamente fabbricati nel laboratorio di ricerca. Tuttavia, molti progetti intrappolano un singolo animale alla volta, limitando il throughput sperimentale 7,9,13. Le risposte neurali spesso variano sostanzialmente tra gli animali a causa di differenze nell'esperienza precedente, stati interni come stress o fame o fattori stocastici come i livelli di espressione genica. Queste differenze stabiliscono la necessità di metodi in grado di stimolare e osservare simultaneamente molti animali ed estrarre informazioni dagli individui4.
Inoltre, alcuni fenomeni neuromodulatori diventano evidenti solo in specifiche condizioni di stimolazione, come l'inibizione temporale14, che si riferisce alla breve soppressione delle risposte quando la stimolazione avviene in rapida successione. I sistemi elettrofisiologici possono guidare l'attività neurale attraverso un ampio spazio di stimolo per questo scopo, modulando, ad esempio, la corrente dell'impulso elettrico, la tensione, la frequenza, la forma d'onda, il ciclo di lavoro e la temporizzazione dei treni di stimolo periodici. La stimolazione indiretta da parte di stimoli rilevati naturalmente o sistemi optogenetici trarrebbe beneficio da una simile ampiezza di meccanismi di controllo. Attualmente, molti stimoli naturali sono presentati in modo semplice "on-off", come la presentazione e la rimozione degli odori, utilizzando sistemi commerciali che sono stati lenti ad aggiungere flessibilità. Tuttavia, i microcontrollori economici possono ora automatizzare la consegna di diversi tipi di stimoli in modo personalizzabile in base alle esigenze dei ricercatori. In combinazione con la microfluidica, questi sistemi hanno raggiunto l'obiettivo di aumentare la produttività sperimentale e la flessibilità, consentendo di misurare simultaneamente le risposte neurali a una varietà di stimoli precisi in molti animali 4,6. La stimolazione multimodale può essere utilizzata per interrogare ulteriormente i circuiti neuronali, ad esempio monitorando i cambiamenti nell'eccitabilità neurale quando stimolano costantemente prima, durante e dopo una perturbazione ortogonale come l'esposizione al farmaco4. I vantaggi dei sistemi di microscopia aperti ed economici sono chiari per far progredire la ricerca scientifica, ma in pratica, la necessità di approvvigionamento delle parti, costruzione e convalida delle prestazioni può impedire l'adozione di queste tecniche.
Questo protocollo mira ad alleviare alcune di queste sfide tecniche. Mentre i protocolli precedenti si sono concentrati sull'uso di dispositivi microfluidici e sulla stimolazione di base 9,15,17, descriviamo qui la costruzione e l'uso di un sistema di somministrazione di stimoli flessibile, automatizzato e multimodale per l'imaging neurale in C. elegans o altri piccoli organismi che utilizzano dispositivi microfluidici precedentemente descritti 4. Il sistema open source è programmato tramite semplici file di testo per definire gli esperimenti e il programma di analisi dei dati NeuroTracker estrae semi-automaticamente i dati dell'attività neurale dai video del microscopio. Dimostriamo questo sistema con esempi di valutazione dell'inibizione temporale, della disinibizione e della diafonia dello stimolo usando il neurone chemiosensoriale AWA, che depolarizza in risposta a diversi odori alimentari o in risposta alla luce quando esprime i canali ionici optogenetici sensibili alla luce 5,6.
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Protocol
1. Apparecchiature di imaging neurale
NOTA: Vedere Lawler e Albrecht15 per istruzioni dettagliate sulla costruzione del sistema di imaging e stimolazione, che controlla i tempi di illuminazione del microscopio, l'acquisizione delle immagini e l'erogazione dello stimolo (Figura 1). Un economico controller di stimolo Arduino Nano aziona le valvole fluidiche attraverso segnali digitali a un controller della valvola e controlla l'illuminazione optogenetica attraverso segnali di tensione analogici a un controller LED. Altri stimoli, come motori a vibrazione e riscaldatori termici, possono essere controllati utilizzando segnali digitali o analogici. Il controller dello stimolo sincronizza la stimolazione e la registrazione delle immagini tramite i segnali della telecamera, come specificato dal software di controllo del microscopio Micro-Manager open source (μManager)16. Vedere la tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali, i reagenti, le attrezzature e gli organismi utilizzati in questo protocollo.
- Configurare l'apparecchiatura di imaging neurale, tra cui un microscopio a epifluorescenza con ottica GFP, una fotocamera sCMOS con un segnale di uscita di esposizione digitale e un controller di stimolo15.
- Collegare il controller di stimolo ai sistemi desiderati tramite segnali digitali o analogici. Per gli esempi presentati di seguito, vengono utilizzati i seguenti sistemi:
- Utilizzare un controller della valvola per la stimolazione chimica. Collegare il controller della valvola a elettrovalvole fluidiche o a manicotto (Figura 1)15.
- Utilizzare un LED rosso da 615 nm e un controller per la stimolazione optogenetica, montato sopra lo stadio del microscopio.
- Configurare il computer con il software di controllo del microscopio, creare un preset di configurazione con le impostazioni dell'apparecchiatura e garantire il corretto funzionamento del controllo dello stimolo15.
2. Fabbricazione di dispositivi microfluidici
NOTA: Vedere Lagoy et al.17 per informazioni dettagliate su come ottenere o fabbricare gli stampi master e la produzione, l'uso e la pulizia dei dispositivi microfluidici. Questi passaggi sono riepilogati di seguito.
- Ottenere o fabbricare uno stampo master utilizzando il file di progettazione microfluidica fornito (albrechtlab.github.io/microfluidics)17. Per i giovani adulti C. elegans, assicurarsi che l'altezza del canale sia 55-70 μm.
- Combinare la base PDMS e l'agente di polimerizzazione con un rapporto di 10:1 in peso e mescolare accuratamente con pipette di trasferimento.
- Degasare per 30-60 minuti in un essiccatore sottovuoto fino a quando le bolle scompaiono.
- Posizionare lo stampo principale in una grande capsula di Petri (150 mm di diametro) e versare il PDMS degassato fino a una profondità di 4-5 mm (~100 g). Ispezionare e rimuovere eventuali polvere o bolle con una pipetta di trasferimento.
- Cuocere in forno a 65 °C su un piano del forno per 3 ore fino a una notte.
- Una volta polimerizzato, utilizzare un bisturi per tagliare il PDMS dallo stampo e una lama di rasoio dritta per separare i dispositivi.
- Perforare i fori di ingresso e di uscita usando un punzone dermico da 1 mm e pulirli con dH 2 O, etanolo e di nuovo condH2O. Asciugare il dispositivo in un flusso d'aria (vedere Figura 2A).
- Pulire entrambi i lati del dispositivo PDMS con nastro adesivo, rimuovendo polvere o detriti.
- Preparare i vetrini per completare il dispositivo microfluidico come descritto17. Praticare i fori di ingresso nella slitta superiore utilizzando una punta diamantata e rendere idrofoba la slitta inferiore mediante esposizione ai vapori TFOCS o applicando un trattamento con vetro idrorepellente (Figura 2B).
- Assemblare il sandwich del dispositivo PDMS in vetro in un morsetto (Figura 2C).
3. Preparazione degli animali
- Ottenere o creare animali con indicatori di calcio geneticamente codificati espressi nei neuroni di interesse.
NOTA: ad esempio, la linea NZ1091 (kyIs587 [gpa-6p::GCaMP2.2b; unc-122p::d sRed]; kyIs5662 [odr-7p::Chrimson:SL2:mCherry; elt-2p::mCherry]) esprime GCaMP e il canale cationico sensibile alla luce rossa Chrimson nella coppia di neuroni sensoriali AWA6. Entrambi i transgeni sono integrati nel genoma per un'espressione stabile in ogni animale. - Un giorno prima della sperimentazione, posizionare almeno 20 L4 stadio larvale C. elegans per esperimento su una piastra di agar terreno di crescita nematode (NGM) seminata con un prato OP50 E. coli. Se mantenuto a 20 °C, questo sincronizzerà gli animali selvatici nella fase di giovane adulto il giorno successivo.
NOTA: Per i transgeni array, scegliere gli animali utilizzando uno stereoscopio a fluorescenza per garantire l'espressione del transgene negli animali scelti.
4. Preparazione della soluzione
- Preparare 1x tampone basale S (100 mM NaCl e 0,05 M KPO4, pH 6,0) da una soluzione madre 10x.
- Preparare tampone tetramisolo 1 mM diluendo 1 M di brodo in 1x S Basal. Usa questo tampone paralitico per preparare tutti gli stimoli. Un esperimento utilizza in genere circa 150 ml.
- Aggiungere 0,1-1 μg/mL di fluoresceina ai serbatoi tampone di "controllo" per visualizzare il flusso.
- Creare soluzioni di stimolo mediante diluizione seriale alla concentrazione finale desiderata. Ad esempio, creare una diluizione 10−7 di attrattivo diacetile creando prima uno stock 10−3 .
NOTA: Una piccola quantità di fluoresceina (0,1-1 μg/ml) può essere aggiunta allo stimolo o alla soluzione tampone per verificare i tempi dello stimolo, ma la concentrazione dovrebbe essere minima per evitare artefatti nella fluorescenza neurale.
5. Preparazione del dispositivo microfluidico
NOTA: Vedi Reilly et al.9 per un protocollo video che mostra la generazione del serbatoio, la configurazione del dispositivo e il carico degli animali. Vedi anche Lagoy et al.17 per un protocollo scritto che include molti suggerimenti utili.
- Preparare tre o più serbatoi di liquido. Per ciascuno, collegare un serbatoio della siringa da 30 ml o 60 ml, una siringa di adescamento da 3 ml e un mozzicone dell'ago a una valvola Luer a tre vie (Figura 2D). Collegare l'ago a un tubo microforo dotato di un tubo metallico all'estremità. Etichettare i serbatoi, montarli su un rack collegato a un supporto ad anello e riempirli con il tampone corrispondente o i fluidi di stimolo (Figura 2E).
- Degasare il dispositivo microfluidico assemblato in un essiccatore sottovuoto per ~ 1 ora.
- Riempire e rimuovere le bolle d'aria dal tubo del serbatoio utilizzando la siringa di adescamento. Riempire il tubo di deflusso con buffer.
- Rimuovere il dispositivo microfluidico dal vuoto, inserire rapidamente il tubo di uscita e iniettare il fluido attraverso il dispositivo fino a quando una goccia emerge da un ingresso.
- A questo ingresso, utilizzare una connessione "drop-to-drop"17 per inserire il tubo di ingresso fluidico corrispondente (Figura 2F). Assicurarsi che siano presenti gocce di liquido sia sul tubo di ingresso che sul foro della porta del dispositivo per evitare di introdurre una bolla.
- Iniettare più fluido dall'uscita, collegare il tubo di ingresso successivo e ripetere fino a riempire tutti gli ingressi. Inserire un perno di bloccaggio solido in corrispondenza di eventuali ingressi non utilizzati e della porta di caricamento della vite senza fine.
- Avviare il flusso aprendo le valvole Luer di ingresso e uscita. Ispezionare il dispositivo per rilevare perdite negli ingressi e nella base di vetro. Ispezionare il dispositivo per eventuali bolle all'interno dei canali di flusso o degli ingressi utilizzando il software di acquisizione delle immagini del microscopio in modalità live.
NOTA: se sono presenti bolle, attendere che vengano assorbite nel materiale PDMS.
6. Carico degli animali
NOTA: Vedi Lagoy et al.17.
- Trasferire i giovani animali adulti su una piastra di agar NGM non seminata usando un "piccone" con punta metallica.
- Inondare la piastra con circa 5 ml di tampone basale 1x S in modo che gli animali nuotino.
- Aspirare i vermi in una siringa di caricamento (siringa da 1 mL o 3 mL con tubo collegato preriempito con 1x S Basal).
- Utilizzando uno stereoscopio, spostare l'estremità del tubo sotto la superficie liquida con una mano per ciascun animale desiderato e disegnarlo nel tubo usando la siringa tenuta nell'altra mano.
- Aspirare i vermi solo nel tubo, non nella siringa.
NOTA: il tubo contiene in genere solo circa 100 μL. Gli animali possono essere espulsi in un'area locale e poi attirati di nuovo nel tubo con un piccolo volume.
- Chiudere la linea di uscita, rimuovere il perno di caricamento del worm e collegare la siringa caricatrice a vite senza fine al dispositivo utilizzando una connessione drop-to-drop.
- Far fluire delicatamente gli animali nell'arena, stabilire un flusso tampone e consentire fino a 1 ora per l'immobilizzazione da parte del tetramisolo.
NOTA: Durante il periodo di immobilizzazione, assicurarsi che solo il fluido tampone entri nell'arena. I serbatoi di stimolo e controllo possono essere spenti durante questo periodo, ma aprirli e verificare il flusso corretto prima di eseguire le prove di stimolazione.
7. Stimolazione automatica e registrazione neuronale
- Creare un file di testo per la definizione dello stimolo denominato "Impostazioni di acquisizione definite dall'utente.txt" con un editor di testo (ad esempio, Blocco note) contenente le impostazioni di stimolazione per l'acquisizione automatica delle immagini (vedere esempi in Figura 3). Le impostazioni sono divise in due sezioni:
- Impostazioni di acquisizione del microscopio: Definire il tipo di esperimento (Single-Stimulus o Multi-Pattern), i tempi di esposizione ed eccitazione, la durata e gli intervalli della prova e salvare la directory.
- Impostazioni di stimolazione: Definire i parametri di controllo dello stimolo. Un "comando di stimolazione" specifica le azioni che si verificano in determinati fotogrammi video con la sintassi
, dove i codici lettera sono A = valvola1, B = valvola2, C = valvola3, L = luce LED; Inoltre, maiuscole = On e minuscole = Off. L'intensità del LED è impostata con il codice lettera "i" e un valore da 0 (off) a 255 (luminosità massima).
NOTA: il valore di intensità del LED da 0 a 255 imposta la tensione analogica di uscita da 0 V a 5 V. Il controller di corrente utilizzato qui ha una scala di intensità lineare e altri dovrebbero essere calibrati con un misuratore di potenza della luce.- Per un esperimento a stimolo singolo con un solo comando di stimolazione ripetuto, utilizzare il formato illustrato nella Figura 3A.
- Per un esperimento Multi-Pattern con più comandi di stimolazione, utilizzare il formato illustrato nella Figura 3B. Includi una "sequenza di pattern" di cifre che rappresenti l'ordine dei modelli di stimolo. Per ogni modello, inserisci un comando di stimolazione su una riga separata.
NOTA: Una sequenza pseudocasuale o una sequenza m può essere utile per indagare la dipendenza dalla storia dello stimolo.
- Eseguire il software di controllo del microscopio. Verificare che tutte le prese fluidiche siano aperte, che il flusso sia come desiderato all'interno dell'arena (vedi Figura 2H) e che i neuroni di interesse siano a fuoco all'interno della finestra live.
- Chiudere la finestra live ed eseguire lo script "MultiPattern_RunScript.bsh" all'interno del software.
NOTA: È utile eseguire un esperimento di prova senza animali per verificare il corretto flusso e stimolazione. La sostituzione di una diversa concentrazione di fluoresceina per ciascun fluido di stimolo può aiutare a visualizzare e documentare nuovi modelli di stimolo. - Dopo la sperimentazione, smontare il dispositivo microfluidico e sciacquare tutte le superfici, i tubi e i serbatoi con acqua.
NOTA: Tutti i componenti possono essere riutilizzati decine di volte se tenuti puliti. Assicurarsi che i serbatoi, i tubi e i dispositivi microfluidici siano mantenuti umidi o completamente asciutti in un flusso d'aria per evitare la cristallizzazione del sale, che può ostruirsi ed è difficile da rimuovere. I dispositivi possono essere conservati in etanolo per sterilizzare, ma devono essere completamente asciugati prima del riutilizzo (>1 h a 65 °C)17.
8. Analisi dei dati utilizzando NeuroTracker
NOTA: NeuroTracker 4,18,19 è un plugin software ImageJ/FIJI20 per tracciare l'intensità della fluorescenza di più neuroni e animali, anche mentre si muovono durante le prove. Questo plugin salva i dati come file di testo con la posizione di ciascun neurone e l'intensità di fluorescenza (F) corretta dallo sfondo. I dati di fluorescenza sono normalizzati alla fluorescenza basale (F 0), ad esempio, la media di diversi secondi prima della stimolazione, come Δ F / F 0 = (F -F 0) / F 0, che può essere mediata tra le popolazioni.
- Installare gli script di NeuroTracker come indicato (github.com/albrechtLab/Neurotracker).
- Esegui NeuroTracker cliccando su Plugin | Monitoraggio | NeuroTracker.
- Selezionare la cartella contenente . File video TIF da tracciare e selezionare le impostazioni desiderate.
NOTA: se è necessario tenere traccia solo di un sottoinsieme dei file video, selezionare l'intervallo numerico dei file da analizzare al prompt. Le impostazioni di tracciamento predefinite sono appropriate per gli animali non mobili con una risoluzione di 250 pix/mm. Regolare i parametri proporzionalmente per le altre risoluzioni. Vedere la Guida dell'utente19 per ulteriori informazioni sulle impostazioni. - Impostare la soglia di intensità in modo tale che i neuroni siano visibili per la selezione (Figura 4).
- Aprire le finestre di controllo Luminosità/Contrasto (B/C) e Soglia utilizzando le finestre di controllo Immagine | Menu di regolazione .
- Nella finestra B/C , regolare i cursori Minimo e Massimo fino a quando i neuroni sono chiaramente distinguibili (Figura 4A).
- Nella finestra Soglia , seleziona Sfondo scuro e Non ripristinare l'intervallo.
- Fai scorrere il cursore del fotogramma per osservare il movimento dei neuroni e i cambiamenti di intensità, notando eventuali animali da escludere dal monitoraggio, ad esempio a causa della sovrapposizione con altri animali.
- Identificare i neuroni per il monitoraggio.
- Per ogni animale, regolare il livello di soglia in modo tale che l'area di soglia rossa sopra il neurone sia visibile in ogni fotogramma prima, durante e dopo la stimolazione.
- Fare clic sul neurone per registrare la sua posizione e il livello di soglia.
- Ripetere la regolazione della soglia e la selezione per ogni animale e neurone da tracciare. Vedere la Figura 4C per un buon esempio di livello di soglia e la Figura 4D,E per esempi di soglia eccessiva e inferiore alla soglia. I neuroni precedentemente selezionati sono indicati da una piccola scatola.
- Quando tutti i neuroni sono selezionati, premere la barra spaziatrice per iniziare il monitoraggio.
NOTA: Per ulteriori esempi di NeuroTracker, vedere i riferimenti precedenti 4,19. - Monitorare il processo di tracciamento per ogni animale e apportare le correzioni necessarie.
- Se NeuroTracker si ferma, ha perso il neurone. Fare nuovamente clic sul neurone, regolando il livello di soglia in base alle esigenze.
- Se la casella di integrazione salta a un altro animale vicino o a una struttura non neuronale, premere la barra spaziatrice per mettere in pausa, spostare nuovamente il cursore sul primo fotogramma errato e fare nuovamente clic sulla posizione corretta del neurone.
9. Esplorazione e visualizzazione dei dati
NOTA: Lo script di analisi MATLAB viene utilizzato per l'elaborazione e la visualizzazione dei dati e per generare PDF di riepilogo per ogni analisi.
- Eseguire il file "NeuroTrackerSummary_pdf.m" in MATLAB e selezionare la cartella contenente i file di testo dei dati NeuroTracker.
- Attendere la produzione di un PDF riepilogativo che consenta la verifica del processo di tracciamento (Figura 5). Gli animali sono identificati da un numero (Figura 5A) e le risposte neurali di ciascun animale e sperimentazione possono essere visualizzate per valutare la variabilità della popolazione (Figura 5B).
- Utilizzare la funzione "databrowse.m" per esplorare i dati neurali, ad esempio, raggruppando per numero di prova (Figura 5C), per numero di animali (Figura 5D), per modello di stimolazione o per un'altra categoria.
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Representative Results
Presentiamo diversi esempi di modelli di stimolo che valutano diversi fenomeni neurali, tra cui l'inibizione temporale, l'adattamento e la disinibizione. L'inibizione temporale è la soppressione momentanea di una risposta neurale a una seconda presentazione di stimolo che si verifica poco dopo la presentazione iniziale14. Per testare questo fenomeno, in un esperimento ad impulsi accoppiati, sono stati presentati otto modelli costituiti da due impulsi odoranti 1 s separati da un intervallo compreso tra 0 s e 20 s (Figura 6B; vedere la Figura 3B per il corrispondente file di controllo dello stimolo). L'arena è stata allestita con un singolo fluido di stimolo (1,1 μM di diacetile), buffer e tubo di flusso di controllo, con la porta di ingresso inutilizzata bloccata con un perno solido (Figura 6A). Accendendo la valvola 1, il fluido di controllo entra nell'ingresso ctrl1, spostando i flussi di fluido in modo tale che lo stimolo entri nell'arena; quando la valvola 1 è spenta, il fluido di controllo entra nell'ingresso ctrl2 e il buffer scorre attraverso l'arena (vedere Figura 2G,H). Mentre il primo impulso olfattivo di 1 s ha suscitato un'entità di risposta uguale nei neuroni AWA che rilevano il diacetile, le risposte al secondo impulso variavano con l'intervallo di interstimolo (Figura 6D). Per intervalli di impulsi inferiori a 10 s, la seconda risposta è stata più debole, dimostrando il fenomeno dell'inibizione temporale. Utilizzando questa configurazione sperimentale, la rottura della componente dineina CHE-3 è stata trovata per prevenire l'inibizione temporale, implicando il trasporto assonale in questo fenomeno5.
L'adattamento è la graduale diminuzione delle risposte neurali a presentazioni ripetute dello stesso stimolo. Questo fenomeno può essere causato da diversi processi, come l'inibizione attiva, che può essere rapidamente invertita, o altri processi che sono lenti a invertire. Un esperimento per valutare la reversibilità rapida è una prova "catch", in cui uno stimolo viene ripetuto per stabilire l'adattamento, seguito da uno stimolo "deviante" o nuovo, e quindi un ritorno allo stimolo originale. La disinibizione si osserva se le risposte neurali aumentano in seguito al nuovo stimolo "disinibitore". La Figura 7 mostra un esempio utilizzando due odoranti, diacetile e 2-metilpirazina (2-MP), rilevati dai neuroni chemiosensoriali AWA attraverso diversi recettori4. Due serbatoi di stimolo e tubi sono stati collegati al dispositivo microfluidico, con un'ulteriore valvola a manicotto a tre vie per determinare quale stimolo entra nell'arena (Figura 7A). I modelli di stimolo sono stati definiti per presentare impulsi chimici per 4 s tramite valvola 1 per tutti i 30 studi e per selezionare tra stimolo S1 o S2 tramite valvola 3, che è stato attivato dopo il 25 ° studio e spento dopo il 26 ° (Figura 7B). Questa disposizione ha assicurato un tempo sufficiente affinché i diversi fluidi di stimolo fluissero attraverso il dispositivo microfluidico prima della presentazione agli animali. L'adattamento è stato osservato allo stimolo diacetile, ma la presentazione del nuovo stimolo da 2 MP non ha suscitato un forte effetto di disinibizione (Figura 7C).
La stimolazione optogenetica utilizza la luce per attivare i neuroni attraverso canali ionici sensibili alla luce. Sebbene comoda da usare, l'attivazione optogenetica bypassa i recettori sensoriali e alcuni percorsi regolatori, quindi alcuni fenomeni neurali possono differire rispetto all'attivazione da parte di stimoli naturali. Per testare queste differenze, gli esperimenti multimodali sono utili per presentare diversi tipi di stimolazione all'interno di un singolo esperimento. I neuroni che esprimono la variante channelrhodopsin Chrimson sono attivati dall'esposizione alla luce rossa5. Per valutare se i neuroni AWA si adattano in modo simile alla stimolazione chimica e optogenetica, il ceppo NZ1091 che esprime sia Chrimson che GCaMP nei neuroni AWA è stato mantenuto su una piastra contenente il cofattore all-trans-retinal (ATR, 100 μM) per 14-28 ore. Un LED rosso da 615 nm ha illuminato l'arena microfluidica dall'alto (Figura 8A) e una serie di modelli di stimolo multimodali sono stati generati fornendo impulsi di 5 s di diacetile, luce rossa o entrambi all'interno dello stesso studio (Figura 8B). La stimolazione chimica da sola ha causato l'adattamento, mentre la stimolazione ottica da sola non lo ha fatto (Figura 8C). Tuttavia, il modello di stimolo multimodale combinato ha dimostrato che le risposte optogenetiche erano suscettibili all'adattamento indotto chimicamente (Figura 8C,D). Questi esperimenti suggeriscono che l'adattamento è iniziato ai recettori sensoriali o ai processi dendritici, ma i suoi effetti si diffondono in tutto il neurone.
Figura 1: Schema dell'apparecchiatura neurale di registrazione e stimolazione del calcio. L'acquisizione delle immagini del microscopio, la luce di eccitazione a fluorescenza e la stimolazione sono controllate da un computer e da un microcontrollore Arduino open source. La stimolazione chimica nell'arena microfluidica passa tra soluzioni tampone B e stimolo S tramite il flusso del fluido di controllo C. Gli elementi opzionali del sistema sono indicati da un asterisco (*), come valvole aggiuntive e modalità ottiche o di stimolazione di altro tipo. Le immagini del microscopio a fluorescenza vengono utilizzate per misurare l'attività neurale tramite transitori di calcio, ad esempio utilizzando l'indicatore di calcio GCaMP. Le linee tratteggiate rappresentano le connessioni elettriche (digitali o analogiche), le linee curve sono i tubi del fluido e le frecce solide dritte sono i percorsi ottici della luce. Abbreviazione: LED = diodo a emissione luminosa. Questa cifra è modificata da Lawler e Albrecht15. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Assemblaggio e configurazione del dispositivo microfluidico. Il dispositivo microfluidico è composto da un dispositivo PDMS micromodellato (A) inserito tra un piano in vetro forato (B) e una base di vetro idrofobo e (C) bloccato. (D) I serbatoi sono posizionati sopra il dispositivo con un supporto per rack di tubi (E). Il tubo dai serbatoi è collegato direttamente al dispositivo o attraverso valvole azionate per il controllo fluidico. Il dispositivo è posizionato sopra l'obiettivo sul microscopio. (F) Immagine ravvicinata del dispositivo microfluidico con tutti i tubi collegati agli ingressi, alla porta di caricamento della vite senza fine e all'uscita. (G) Schema del dispositivo microfluidico 20 mm x 20 mm. Le linee nere rappresentano i canali fluidi alti 55-70 μm. Questa geometria è progettata per consentire un controllo spaziotemporale preciso con uno stimolo frontale perpendicolare al flusso, mantenendo gli animali all'interno dell'arena e del campo visivo del microscopio. Il flusso tampone e un flusso di stimolo (o opzionalmente Stim2, se utilizzato) fluiscono continuamente, mentre solo un ingresso di fluido di controllo scorre alla volta, spostando il fluido che entra nell'arena. (H) Quando la valvola 1 è eccitata, il fluido di controllo fluisce dalla porta normalmente chiusa all'ingresso di controllo1 e lo stimolo si accende e scorre attraverso l'arena. Quando la valvola 1 è spenta, il fluido fluisce dalla porta normalmente aperta all'ingresso control2 e il buffer entra nell'arena. Viene mostrato il corretto equilibrio di flusso, con colorante fluoresceina utilizzato come fluido di stimolo. Si noti che parte del fluido che entra nell'arena lo bypassa anche attraverso i canali curvi superiore e inferiore. Questi flussi dovrebbero essere stretti e avere la stessa larghezza nei canali superiore e inferiore. Le altezze del serbatoio possono essere regolate secondo necessità. Abbreviazioni: PDMS = polidimetilsilossano; WL = caricamento di worm; Buf = buffer; Stim1 = primo stimolo; Stim2 = secondo stimolo; NC = normalmente chiuso; NO = normalmente aperto. Questa cifra è modificata da Lawler e Albrecht15. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: File di definizione dello stimolo di esempio. (A) Esempio di esperimento di stimolo a ripetizione singola: un impulso luminoso di 5 s a intensità 200 da 2 s a 7 s (fotogramma da 20 a 70). (B) Esempio di esperimento di stimolo multi-pattern con otto diversi modelli di stimolo, corrispondenti alla Figura 6. Due impulsi chimici 1 s sono presentati con un intervallo da 0 s a 20 s tra di loro. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Selezione dei neuroni e dei livelli di soglia in NeuroTracker . (A) Campo visivo completo del microscopio, con la luminosità e il contrasto regolati per vedere chiaramente i neuroni AWA. (B) Vista ingrandita della regione della testa di un animale raffigurante la scatola di integrazione da cui viene calcolata l'intensità della fluorescenza e l'anello di fondo per la sottrazione di fondo. (C) Grafico dell'intensità integrato che mostra una robusta risposta neurale. (D) Una buona selezione della soglia si tradurrà in una regione di soglia rossa che è al di sopra del parametro Dimensione minima e al di sotto del parametro Dimensione massima per ogni fotogramma nella pila di immagini e non include regioni vicine, come l'autofluorescenza intestinale (vedere il riquadro B). (E) Una soglia impostata troppo alta può apparire buona quando il neurone è attivo, ma quando è inattivo, il neurone può essere perso. È quindi importante controllare sia i fotogrammi di pre-stimolazione che quelli post-stimolazione quando si seleziona una soglia. (F) Una soglia impostata troppo bassa può evidenziare altre strutture non neuronali. La selezione sopra o sotto soglia può portare a NeuroTracker perdere il neurone e mettere in pausa il feedback dell'utente per correggere la soglia e la posizione del neurone. Abbreviazione: B&C = luminosità e contrasto. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Esempio di analisi dei dati. Risposte neurali di 15 animali esposti a 10 ripetizioni di una stimolazione optogenetica della durata di 5 s una volta al minuto. (A) Immagine riassuntiva indicante gli animali monitorati e il movimento dei neuroni all'interno dello studio (caselle rosse). L'animale 2 si è spostato durante il processo. (B) Le risposte individuali degli animali nel tempo mostrano una risposta relativamente coerente alla stimolazione della luce rossa. (C) Output di esplorazione dei dati utilizzando la funzione databrowsing . Le tracce sono raggruppate per ripetizione della prova (sopra) e le medie sono mostrate di seguito per le prove selezionabili dall'utente. (D) Dati raggruppati per numero di singoli animali e mediati tra prove ripetute. Questo set di dati mostra una variabilità minima tra gli animali, giustificando le risposte medie in tutta la popolazione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6: Esperimento ad impulsi accoppiati con intervallo di interstimolo variabile per valutare l'inibizione temporale . (A) Connessioni di ingresso del dispositivo microfluidico. L'ingresso inutilizzato è bloccato con un perno solido (X). Il serbatoio del fluido di controllo e la valvola1 sono collegati agli ingressi c1 e c2, omessi qui per chiarezza. (B) Tempistica dello stimolo per otto modelli. Gli impulsi hanno una durata di 1 s e sono separati da 0-20 s. La sequenza di modelli è illustrata di seguito; Ogni modello è stato presentato sei o sette volte. (C) Attività neurale AWA da 50 studi e nove animali. Una mappa termica delle risposte ordinate per modello di stimolazione è mostrata sopra; L'attività neurale media per ciascun pattern (n=56-63 risposte) è mostrata di seguito. L'inibizione temporale si verifica per ~ 10 s dopo l'impulso iniziale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 7: Esperimento di prova di cattura per valutare la disinibizione . (A) Connessioni di ingresso del dispositivo microfluidico. Una valvola a manicotto a tre vie consente solo allo stimolo S1 di passare a riposo e solo S2 di passare quando è eccitato. (B) Diagramma delle tre sequenze di pattern utilizzate per erogare gli impulsi ripetuti di odore di diacetile, con il nuovo stimolo 2-metilpirazina presentato in atto al 26° studio. (C) Risposte medie all'attività neurale AWA su 20 animali. Abbreviazioni: DA = diacetile; 2-MP = 2-metilpirazina. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 8: Esempio di stimolazione multimodale . (A) Connessioni di ingresso del dispositivo microfluidico, con un ingresso inutilizzato bloccato da un perno solido. Un LED rosso illumina l'arena dall'alto. (B) Modelli di stimolazione ottica, chimica o multimodale. (C) Attività neurale AWA media (n = 11 animali) per 30 studi ripetuti con stimolazione optogenetica e chemiosensoriale accoppiata (in alto), solo optogenetica (al centro) e solo chemiosensoriale (in basso). (D) Media di risposta neurale di picco per ogni studio per impulsi optogenetici sopra e impulsi chimici sotto. Gli impulsi optogenetici non causano direttamente l'adattamento, ma le loro risposte sono suscettibili all'adattamento chemiosensoriale. Abbreviazioni: DA = diacetile. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
In questo protocollo, descriviamo un sistema di microscopia ad accesso aperto per la valutazione dei fenomeni di attività neurale utilizzando la consegna temporalmente precisa di diversi modelli di stimolo. La piattaforma microfluidica fornisce stimoli ripetibili mantenendo decine di animali nel campo visivo del microscopio. Pochi pacchetti software di microscopia commerciale consentono la facile programmazione di vari modelli di temporizzazione dello stimolo e quelli che spesso richiedono l'inserimento manuale di ciascun modello o formati di file proprietari. Al contrario, gli esperimenti sono definiti in questo sistema da file di testo, che possono essere generati al computer e sono leggibili dal software di analisi. Qui, dimostriamo l'utilità di impiegare modelli di stimolo variabili per valutare fenomeni neuronali come l'inibizione temporale, l'adattamento e la diafonia durante la stimolazione multimodale. La pipeline di analisi dei dati riduce i file video di microscopia di grandi dimensioni a dati di attività neurale che possono essere visualizzati e analizzati per la variabilità della popolazione (Figura 5B), i cambiamenti nel tempo (Figura 7C e Figura 8C, D) e i cambiamenti dopo perturbazione (Figura 7C).
Un vantaggio chiave dell'automazione è la riproducibilità della stimolazione attraverso le ripetizioni di prova e tra gli esperimenti, e il formato dell'arena microfluidica consente un aumento di almeno 20 volte della produttività rispetto ai precedenti metodi per singolo animale 7,9,13. Sottoporre una popolazione di animali allo stesso stimolo e alle stesse condizioni ambientali garantisce che i dati siano comparabili ed evita potenziali variazioni quotidiane nella preparazione della soluzione, nella temperatura, nelle fonti animali o in altri fattori. Tuttavia, un limite di questo approccio è la microscopia a basso ingrandimento e bassa risoluzione che mantiene tutti gli animali nel campo visivo. Solo un neurone dovrebbe essere monitorato per animale per ridurre al minimo gli errori di tracciamento, sebbene i neuroni separati da almeno 50 μm possano, in linea di principio, essere distinti. Le coppie di neuroni bilaterali possono essere visualizzate insieme se ci si aspetta che le risposte siano simmetriche. È importante prima identificare quali neuroni specifici sono coinvolti in un processo neurale di interesse, ad esempio mediante imaging dell'intero cervello7, e quindi esprimere GCaMP solo nei neuroni rilevanti per aumentare la produttività.
Le risposte neuronali al calcio variano da animale a causa dei livelli di espressione del reporter o di altre differenze interindividuali. Ad esempio, le risposte normalizzate AWA GCaMP variano di due volte in magnitudine di picco, anche in animali selvatici isogeni con il reporter di calcio stabilmente integrato nel genoma4. Alcuni stimoli mostrano risposte variabili in tutta la popolazione (ad esempio, acetato di butile4), suggerendo un'espressione recettoriale variabile. In pratica, almeno 20 singoli animali dovrebbero essere valutati per determinare la variabilità della popolazione. Si raccomanda di utilizzare i dati dei singoli animali per aumentare il potere statistico nel determinare i cambiamenti di risposta, ad esempio mediante il confronto statistico delle singole risposte neurali accoppiate prima e dopo una perturbazione.
Con set di dati di grandi dimensioni e sperimentazione automatizzata, è importante convalidare e verificare la corretta funzione dell'esperimento, il monitoraggio e la riduzione dei dati, in particolare per i passaggi non presidiati. I modelli di flusso devono essere verificati con soluzioni fluorescenti (come nella Figura 2H) osservando l'assenza di bolle o fluidi di controllo che entrano nell'arena nei video registrati. I set di dati dovrebbero essere convalidati, ad esempio, osservando qualsiasi movimento animale (come nella Figura 5A) e verificando le risposte neurali lisce (come nella Figura 4C e nella Figura 5B). Qualsiasi dato problematico dovrebbe essere escluso. È inoltre importante verificare il raggruppamento dei dati prima di eseguire la media utilizzando la funzione "databrowse" per garantire che la risposta media rifletta le singole risposte.
Il sistema di controllo della stimolazione open source è facilmente estendibile ad altri stimoli tramite segnali digitali o analogici o comandi di comunicazione seriale. Gli stimoli graduati sono tipicamente controllabili da ingressi di tensione analogici (0-5 V), come l'intensità della luce LED o la magnitudine dell'impulso dello stimolatore nervoso. Gli stimoli on-off sono in genere controllati con segnali digitali (TTL), come la temporizzazione dello stimolatore elettrico. Questi segnali digitali possono anche azionare interruttori a relè per attivare altri sistemi elettrici, come i motori a vibrazione per la stimolazione meccanosensoriale. Altre apparecchiature utilizzano la comunicazione seriale, ad esempio tramite connessione USB, con comandi di caratteri specifici trasmessi per definire le azioni. Ad esempio, gli esperimenti dose-risposta possono presentare automaticamente diverse concentrazioni chimiche utilizzando una valvola rotazionale controllata da USB5 o un sistema di piastre multipozzetto6. Questi comandi possono essere aggiunti agli script di controllo del microscopio open source da inviare a numeri di prova specifici. I ritardi temporali possono essere incorporati in modo simile; Ad esempio, per sospendere il test per 1 ora tra due 30 tentativi di stimolazione, si dovrebbe specificare un esperimento di prova 60 e aggiungere una singola riga di codice per mettere in pausa per 1 ora quando il numero di prova raggiunge 31.
La complessità sperimentale è praticamente illimitata e può anche cambiare durante un esperimento basato sul feedback dal vivo in un sistema "a circuito chiuso". Ad esempio, la stimolazione potrebbe variare in tempo reale in base all'attività neurale, al comportamento animale o ad un altro parametro quantificabile. Recentemente abbiamo utilizzato un tale sistema per valutare le risposte neurali sensoriali negli animali addormentati rispetto a quelli svegli innescando la stimolazione e la registrazione neurale dopo un cambiamento nel comportamento 8,15. La funzione di tracciamento del movimento di NeuroTracker consente l'analisi dell'attività neurale negli animali che si muovono liberamente per la correlazione con l'output comportamentale. Tuttavia, il monitoraggio dei singoli animali in movimento richiede molta attenzione, ad esempio quando si incrociano, ed è quindi consigliabile caricare meno animali per arena (circa cinque) per ridurre al minimo queste interazioni.
Nel complesso, queste tecniche aumentano la precisione della stimolazione e il throughput sperimentale nell'esplorare la variabilità della popolazione e specifici fenomeni neurali. Oltre a misurare l'attività neuronale, questi metodi sono generalizzabili ad altri biosistemi, comprese le piante, che comunicano anche tramite segnali di calcio 21, coltura di cellule neurali e organoidi cerebrali22, nonché ad altri segnali fluorescenti dinamici, come sensori per l'attività sinaptica, rilascio di neurotrasmettitori 23 e trascrizione24.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo Fox Avery per aver testato questi protocolli e revisionato il manoscritto ed Eric Hall per l'assistenza alla programmazione. Il finanziamento per i metodi qui presentati è stato fornito in parte dalla National Science Foundation 1724026 (D.R.A.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacterial strains | |||
| E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Cat# OP50 | |
| Experimental models: Organisms/strains | |||
| C. elegans strains expressing GCaMP (and optionally, Chrimson) in desired neurons | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) or corresponding authors of published work | NZ1091, for example | |
| Chemicals, Treatments, and Worm Preparation Supplies | |||
| 2,3-Butanedione | Sigma-Aldrich | Cat# B85307 | diacetyl, example chemical stimulus |
| Calcium chloride, CaCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# C3881 | |
| Fluorescein, Sodium salt | Sigma-Aldrich | Cat# F6377 | |
| Glass water repellant | Rain-X | Cat #800002250 | glass hydrophobic treatment (single-use) |
| Magnesium chloride, MgCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# M2393 | |
| Nematode Growth Medium (NGM) agar | Genesee | Cat #: 20-273NGM | |
| Petri dishes (60 mm) | Tritech | Cat #T3305 | |
| Poly(dimethyl siloxane) (PDMS): Sylgard 184 | Dow Chemical | Cat# 1673921 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | Cat# P5655 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | Cat# P8281 | |
| Sodium chloride, NaCl | Sigma-Aldrich | Cat# S7653 | |
| (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane (TFOCS) | Gelest | CAS# 78560-45-9 | glass hydrophobic treatment (durable) |
| Software and algorithms | |||
| Arduino IDE | Arduino | https://www.arduino.cc/en/software | |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| Micro-manager | Micro-manager | https://micro-manager.org/ | |
| Microscope control software | Albrecht Lab | https://github.com/albrechtLab/MicroscopeControl | |
| Neurotracker data analysis software | Albrecht Lab | https://github.com/albrechtLab/Neurotracker | |
| Automated Microscope and Stimulation System | |||
| Axio Observer.A1 inverted microscope set up for epifluorescence (GFP filter cubes, 5× objective or similar) | Zeiss | Cat #491237-0012-000 | |
| Excelitas X-cite XYLIS LED illuminator | Excelitas | Cat #XYLIS | |
| Orca Flash 4.0 Digital sCMOS camera | Hamamatsu | Cat #C11440-22CU | |
| Arduino nano | Arduino | Cat #A000005 | |
| 3-way Miniature Diapragm Isolation Valve (LQX12) | Parker | Cat #LQX12-3W24FF48-000 | Valve 1: Control |
| 2-way normally-closed (NC) Pinch Valve | Bio-Chem Valve Inc | Cat #075P2-S432 | Valve 2: Outflow |
| 3-way Pinch Valve | NResearch | Cat #161P091 | Valve 3: Stimulus selection |
| Optogenetic stimulation LED and controller (615 nm) | Mightex | Cat #PLS-0625-030-S and #SLA-1200-2 | |
| ValveLink 8.2 digital/manual valve controller | AutoMate Scientific | Cat #01-18 | |
| Wires and connectors | various | See Fig. 2 of Cell STARS Protocol (Lawler, 2021) | |
| Microfluidic Device Preparation | |||
| Dremel variable speed rotary cutter 4000 | Dremel | Cat #F0134000AB | Set speed to 5k RPM for cutting glass |
| Dremel drill press rotary tool workstation | Dremel | Cat #220-01 | |
| Diamond drill bit | Dremel | Cat #7134 | |
| Glass slide, 1 mm thick | VWR | Cat #75799-268 | |
| Glass scribe (Diamond scriber) | Ted Pella | Cat #54468 | |
| Luer 3-way stopcock | Cole-Parmer | Cat #EW-30600-07 | |
| Luer 23 G blunt needle | VWR | Cat #89134-100 | |
| Microfluidic device | Corresponing author or fabricate from CAD files associated with this article | N/A | |
| Microfluidic device clamp | Warner Instruments (or machine shop) | P-2 | |
| Microfluidic tubing, 0.02″ ID | Cole-Parmer | Cat #EW-06419-01 | |
| Tube 19 G, 0.5″ | New England Small Tube | Cat #NE-1027-12 |
References
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2 (2013).
- Badura, A., Sun, X. R., Giovannucci, A., Lynch, L. A., Wang, S. S. -H. Fast calcium sensor proteins for monitoring neural activity. Neurophotonics. 1, 025008 (2014).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Larsch, J., Ventimiglia, D., Bargmann, C. I., Albrecht, D. R. High-throughput imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (45), 4266-4273 (2013).
- Larsch, J., et al. A circuit for gradient climbing in C. elegans chemotaxis. Cell Reports. 12 (11), 1748-1760 (2015).
- Lagoy, R. C., Albrecht, D. R. Automated fluid delivery from multiwell plates to microfluidic devices for high-throughput experiments and microscopy. Scientific Reports. 8, 6217 (2018).
- Schrödel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light. Nature Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).
- Lawler, D. E., et al. Sleep analysis in adult C. elegans reveals state-dependent alteration of neural and behavioral responses. The Journal of Neuroscience. 41 (9), 1892-1907 (2021).
- Reilly, D. K., Lawler, D. E., Albrecht, D. R., Srinivasan, J. Using an adapted microfluidic olfactory chip for the imaging of neuronal activity in response to pheromones in male C. elegans head neurons. Journal of Visualized Experiments. (127), e56026 (2017).
- Han, X., et al. A polymer index-matched to water enables diverse applications in fluorescence microscopy. Lab on a Chip. 21 (8), 1549-1562 (2021).
- Whitesides, G. M. The origins and the future of microfluidics. Nature. 442 (7101), 368-373 (2006).
- Albrecht, D. R., Bargmann, C. I. High-content behavioral analysis of Caenorhabditis elegans in precise spatiotemporal chemical environments. Nature Methods. 8 (7), 599-605 (2011).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
- Cohen, R. A. Temporal Inhibition. Encyclopedia of Clinical Neuropsychology. Kreutzer, J. S., DeLuca, J., Caplan, B. , Springer. New York, NY. 2480-2481 (2011).
- Lawler, D. E., Albrecht, D. R. Monitoring neural activity during sleep/wake events in adult C. elegans by automated sleep detection and stimulation. STAR Protocols. 3 (3), 101532 (2022).
- Edelstein, A. D., et al. Advanced methods of microscope control using µManager software. Journal of Biological Methods. 1 (2), 10 (2014).
- Lagoy, R. C., Larsen, E., Lawler, D., White, H., Albrecht, D. R. Microfluidic devices for behavioral analysis, microscopy, and neuronal imaging in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 2468, 293-318 (2022).
- NeuroTracker. GitHub. , Available from: https://github.com/albrechtLab/Neurotracker (2022).
- NeuroTracker User Guide. GitHub. , Available from: https://github.com/albrechtLab/Neurotracker (2022).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Galotto, G. Chitin triggers calcium-mediated immune response in the plant model Physcomitrella patens. Molecular Plant-Microbe Interactions. 33 (7), 911-920 (2020).
- Qian, X., Song, H., Ming, G. Brain organoids: Advances, applications and challenges. Development. 146 (8), 166074 (2019).
- Ventimiglia, D., Bargmann, C. I. Diverse modes of synaptic signaling, regulation, and plasticity distinguish two classes of C. elegans glutamatergic neurons. eLife. 6, 31234 (2017).
- Boulin, T.
