Summary
우리는 많은 Caenorhabditis elegans 벌레의 유연한 화학적 및 다중 모드 자극과 동시 신경 활동의 기록 방법을 제시합니다. 이 방법은 미세 유체 공학, 오픈 소스 하드웨어 및 소프트웨어, 감독 자동화 데이터 분석을 사용하여 적응, 시간적 억제 및 자극 누화와 같은 신경 현상을 측정할 수 있습니다.
Abstract
형광 유전적으로 인코딩된 칼슘 지표는 개별 뉴런 수준에서 전체 뇌 회로에 이르기까지 신경 역학에 대한 우리의 이해에 크게 기여했습니다. 그러나 신경 반응은 이전 경험, 내부 상태 또는 확률적 요인으로 인해 달라질 수 있으므로 한 번에 많은 개인의 신경 기능을 평가할 수 있는 방법이 필요합니다. 대부분의 기록 기술은 한 번에 한 마리의 동물을 검사하는 반면, 우리는 광시야 현미경을 사용하여 한 번에 수십 개의 예쁜꼬마선충 또는 기타 서브밀리미터 규모의 유기체로 신경 기록을 확장하는 방법을 설명합니다. 오픈 소스 하드웨어 및 소프트웨어는 화학적, 광학적, 기계적, 열적 및 전자기 자극을 포함한 다양한 자극 유형의 강도와 타이밍을 제어하는 완전 자동화된 실험을 프로그래밍하는 데 뛰어난 유연성을 제공합니다. 특히, 미세유체 유동 장치는 초 미만의 시간 분해능으로 화학감각 자극의 정밀하고 반복 가능하며 정량적인 제어를 제공합니다. 그런 다음 NeuroTracker 반자동 데이터 분석 파이프라인은 개별 및 인구 전체의 신경 반응을 추출하여 신경 흥분성 및 역학의 기능적 변화를 발견합니다. 이 논문은 뉴런 적응, 시간적 억제 및 자극 누화를 측정하는 예를 제시합니다. 이러한 기술은 자극의 정밀도와 반복성을 높이고, 개체군 변동성을 탐색할 수 있으며, 세포 및 오가노이드에서 전체 유기체 및 식물에 이르기까지 소규모 생물 시스템의 다른 동적 형광 신호로 일반화할 수 있습니다.
Introduction
칼슘 이미징 기술은 형광 현미경 및 표적 세포에서 발현된 유전적으로 인코딩된 칼슘 지표를 사용하여 실시간으로 생체 내 신경 역학을 비침습적으로 기록할 수 있게 해주었다 1,2,3. 이러한 센서는 일반적으로 GFP-칼모듈린-M13 펩타이드(GCaMP) 패밀리와 같은 녹색 형광 단백질(GFP)을 사용하여 신경 활성화 및 세포 내 칼슘 수치 상승 시 형광 강도를 증가시킵니다. 칼슘 이미징은 선충 C. elegans에서 뉴런과 신경 회로가 살아 있고 행동하는 동물 4,5,6,7,8,9,10에서 어떻게 기능하는지 조사하는 데 특히 강력했습니다. 이러한 기술은 종종 작은 물리적 규모에서 생물학적, 화학적, 물리적 현상을 연구하기 위해 정밀하게 제어된 환경을 제공하는 미세유체 장치를 사용한다11,12. 신경 활동을 측정하기 위한 미세 유체 장치는 풍부하며 새로운 디자인이 지속적으로 개발 중이며 연구실에서 쉽게 제작할 수 있습니다. 그러나 많은 설계가 한 번에 한 마리의 동물을 가두어 실험 처리량을 7,9,13으로 제한합니다. 신경 반응은 종종 이전 경험의 차이, 스트레스 또는 배고픔과 같은 내부 상태 또는 유전자 발현 수준과 같은 확률적 요인으로 인해 동물마다 크게 다릅니다. 이러한 차이로 인해 많은 동물을 자극하고 관찰하는 동시에 개체로부터 정보를 추출할 수 있는 방법이 필요합니다4.
또한, 특정 신경조절 현상은 자극이 빠르게 연속적으로 발생할 때 반응의 짧은 억제를 의미하는 시간적 억제(temporal inhibition)14와 같은 특정 자극 조건에서만 명백해진다. 전기생리학적 시스템은 이러한 목적을 위해 광범위한 자극 공간에서 신경 활동을 유도할 수 있으며, 예를 들어 주기적 자극 트레인의 전기 펄스 전류, 전압, 주파수, 파형, 듀티 사이클 및 타이밍을 변조할 수 있습니다. 자연적으로 감지된 자극 또는 광유전학적 시스템에 의한 간접 자극은 유사한 범위의 제어 메커니즘으로부터 이익을 얻을 것입니다. 현재, 많은 자연적 자극은 유연성을 추가하는 데 느린 상용 시스템을 사용하여 냄새 표현 및 제거와 같은 간단한 "온-오프" 방식으로 제공됩니다. 그러나 저렴한 마이크로 컨트롤러는 이제 연구원의 요구에 맞게 사용자 정의 할 수있는 방식으로 여러 유형의 자극 전달을 자동화 할 수 있습니다. 미세 유체 공학과 결합 된이 시스템은 실험 처리량과 유연성을 증가시켜 많은 동물에서 다양한 정밀 자극에 대한 신경 반응을 동시에 측정 할 수 있도록하는 목표를 달성했습니다 4,6. 멀티모달 자극(multimodal stimulation)은 약물 노출과 같은 직교 섭동 전, 도중, 후에 지속적으로 자극할 때 신경 흥분성의 변화를 모니터링하는 것과 같이 신경 회로를 추가로 조사하는 데 사용할 수 있다4. 저렴한 개방형 현미경 시스템의 이점은 과학 연구를 발전시키는 데 분명하지만 실제로는 부품 소싱, 구성 및 성능 검증의 필요성이 이러한 기술의 채택을 방해할 수 있습니다.
이 프로토콜은 이러한 기술적 문제 중 일부를 완화하는 것을 목표로 합니다. 이전 프로토콜은 미세유체 장치 사용 및 기본 자극에 초점을 맞추었지만 9,15,17, 여기서는 이전에 설명한 미세유체 장치 4를 사용하는 예쁜꼬마선충 또는 기타 작은 유기체의 신경 이미징을 위한 유연하고 자동화된 다중 모드 자극 전달 시스템의 구성 및 사용을 설명합니다. 오픈 소스 시스템은 실험을 정의하기 위해 간단한 텍스트 파일을 통해 프로그래밍되며 NeuroTracker 데이터 분석 프로그램은 현미경 비디오에서 신경 활동 데이터를 반자동으로 추출합니다. 우리는 광유전학적 빛에 민감한 이온 채널을 발현할 때 다양한 음식 냄새에 반응하거나 빛에 반응하여 탈분극하는 화학감각 뉴런 AWA를 사용하여 시간적 억제, 탈억제 및 자극 누화를 평가하는 예를 통해 이 시스템을 보여줍니다 5,6.
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Protocol
1. 신경 영상 장비
참고: 현미경 조명 타이밍, 이미지 획득 및 자극 전달을 제어하는 이미징 및 자극 시스템 구축에 대한 자세한 지침은 Lawler 및 Albrecht15를 참조하십시오(그림 1). 저렴한 Arduino Nano 자극 컨트롤러는 디지털 신호를 통해 밸브 컨트롤러에 대한 유체 밸브를 작동시키고 LED 컨트롤러에 대한 아날로그 전압 신호를 통해 광유전학적 조명을 제어합니다. 진동 모터 및 열 히터와 같은 다른 자극은 디지털 또는 아날로그 신호를 사용하여 제어할 수 있습니다. 자극 컨트롤러는 오픈 소스 Micro-Manager 현미경 제어 소프트웨어(μManager)16에 의해 지정된 대로 카메라 신호를 통해 자극 및 이미지 기록을 동기화합니다. 이 프로토콜에 사용된 모든 재료, 시약, 장비 및 유기체와 관련된 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
- GFP 광학을 갖는 epifluorescence 현미경, 디지털 노출 출력 신호를 갖는 sCMOS 카메라, 및 자극 제어기(15)를 포함하는 신경 이미징 장비를 설정한다.
- 디지털 또는 아날로그 신호를 통해 자극 컨트롤러를 원하는 시스템에 연결합니다. 아래 제시된 예에는 다음 시스템이 사용됩니다.
- 화학적 자극을 위해 밸브 컨트롤러를 사용하십시오. 밸브 컨트롤러를 유체 솔레노이드 또는 핀치 밸브에 연결합니다(그림 1)15.
- 현미경 단계 위에 장착된 광유전학적 자극을 위해 615nm 적색 LED와 컨트롤러를 사용합니다.
- 현미경 제어 소프트웨어로 컴퓨터를 설정하고, 장비 설정으로 구성 사전 설정을 만들고, 자극 제어15의 적절한 작동을 확인하십시오.
2. 미세 유체 장치 제작
참고: 마스터 몰드를 얻거나 제작하고 미세 유체 장치의 생산, 사용 및 청소에 대한 자세한 정보는 Lagoy et al.17 을 참조하십시오. 이러한 단계는 아래에 요약되어 있습니다.
- 제공된 미세유체 설계 파일(albrechtlab.github.io/microfluidics)17을 사용하여 마스터 몰드를 얻거나 제작합니다. 젊은 성인 예쁜꼬마선충의 경우 채널 높이가 55-70μm인지 확인하십시오.
- PDMS 베이스와 경화제를 중량 기준으로 10:1 비율로 혼합하고 이송 피펫으로 완전히 혼합합니다.
- 기포가 사라질 때까지 진공 데시케이터에서 30-60분 동안 가스를 제거합니다.
- 마스터 몰드를 대형(직경 150mm) 페트리 접시에 놓고 탈기된 PDMS를 4-5mm(~100g) 깊이까지 붓습니다. 이송 파이펫으로 먼지나 기포를 검사하고 제거합니다.
- 평평한 오븐 선반에서 65°C에서 3시간에서 밤새 굽습니다.
- 경화되면 메스를 사용하여 PDMS를 금형에서 절단하고 직선 면도날을 사용하여 장치를 분리합니다.
- 1mm 진피 펀치를 사용하여 입구 및 출구 구멍을 펀칭하고 dH 2 O, 에탄올 및 dH2O로 다시 청소하고 공기 흐름에서 장치를건조시킵니다(그림 2A 참조).
- 접착 테이프로 PDMS 장치의 양면을 청소하고 먼지나 부스러기를 제거합니다.
- 유리 슬라이드를 준비하여 설명된 바와 같이 미세유체 장치를 완성한다17. 다이아몬드 비트를 사용하여 상단 슬라이드에 입구 구멍을 뚫고 TFOCS 증기에 노출되거나 발수성 유리 처리를 적용하여 하단 슬라이드를 소수성으로 만듭니다(그림 2B).
- 유리-PDMS 장치 샌드위치를 클램프에 조립합니다(그림 2C).
3. 동물 준비
- 관심 뉴런에서 발현되는 유전적으로 암호화된 칼슘 지표를 가진 동물을 얻거나 만듭니다.
참고: 예를 들어, 라인 NZ1091(kyIs587 [gpa-6p::GCaMP2.2b; unc-122p::d sRed]; kyIs5662 [odr-7p::Chrimson:SL2:mCherry; elt-2p::mCherry]) AWA 감각 뉴런 쌍6에서 GCaMP 및 적색광에 민감한 양이온 채널 Chrimson을 표현합니다. 두 이식유전자 모두 모든 동물에서 안정적인 발현을 위해 게놈에 통합됩니다. - 실험 하루 전에 OP50 E. coli 잔디밭으로 파종된 선충 성장 배지(NGM) 한천 플레이트에 실험당 최소 20개의 L4 유충 단계 C. elegans를 놓습니다. 20°C로 유지될 때, 이것은 다음날 젊은 성충 단계에서 야생형 동물을 동기화할 것이다.
참고: 어레이 이식유전자의 경우 형광 입체경을 사용하여 동물을 선택하여 선택한 동물에서 이식유전자 발현을 보장합니다.
4. 용액 준비
- 1x 원액으로부터 1x S 기초 완충액(100 mM NaCl 및 0.05 M KPO4, pH 6.0)을 준비한다.
- 1x S Basal에 1M 스톡을 희석하여 1mM 테트라미솔 완충액을 준비합니다. 이 마비 완충액을 사용하여 모든 자극을 준비하십시오. 실험에는 일반적으로 약 150mL가 사용됩니다.
- 0.1-1 μg/mL 플루오레세인을 "대조군" 버퍼 저장소에 추가하여 유량을 시각화합니다.
- 원하는 최종 농도로 연속 희석하여 자극 용액을 만듭니다. 예를 들어, 먼저 10-3 스톡을 생성하여 디아세틸 유인제의 10-7 희석을 생성합니다.
참고: 자극 타이밍을 확인하기 위해 자극 또는 완충액에 소량의 플루오레세인(0.1–1μg/mL)을 첨가할 수 있지만 신경 형광의 인공물을 피하기 위해 농도를 최소화해야 합니다.
5. 미세 유체 장치 준비
참고: Reilly et al.9 에서 저수지 생성, 장치 설정 및 동물 로딩을 보여주는 비디오 프로토콜을 참조하십시오. Lagoy et al.17 참조: 많은 유용한 팁이 포함된 서면 프로토콜에 대해.
- 3 개 이상의 유체 저장소를 준비하십시오. 각각에 대해 30mL 또는 60mL 주사기 저장소, 3mL 프라이밍 주사기 및 바늘 스텁을 3방향 루어 밸브에 연결합니다(그림 2D). 끝에 금속 튜브가 장착된 마이크로보어 튜브에 바늘을 연결합니다. 저장소에 라벨을 붙이고 링 스탠드에 부착된 랙에 장착한 다음 해당 버퍼 또는 자극 유체로 채웁니다(그림 2E).
- 조립된 미세유체 장치를 진공 데시케이터에서 ~1시간 동안 탈기합니다.
- 프라이밍 주사기를 사용하여 저장소 튜브에서 기포를 채우고 제거합니다. 유출 튜브에 버퍼를 채웁니다.
- 진공에서 미세 유체 장치를 제거하고 출구 튜브를 빠르게 삽입하고 하나의 입구에서 물방울이 나올 때까지 장치를 통해 유체를 주입합니다.
- 이 입구에서 "drop-to-drop" 연결부(17 )를 사용하여 해당 유체 주입구 튜브를 삽입합니다(그림 2F). 기포가 유입되지 않도록 흡입 튜브와 장치 포트 구멍 모두에 액체 방울이 있는지 확인하십시오.
- 배출구에서 더 많은 유체를 주입하고 다음 흡입구를 연결한 다음 모든 흡입구가 채워질 때까지 반복합니다. 사용하지 않는 입구와 웜 로딩 포트에 단단한 차단 핀을 삽입합니다.
- 입구 및 출구 Luer 밸브를 열어 흐름을 시작합니다. 입구와 유리 바닥에서 누출이 있는지 장치를 검사하십시오. 라이브 모드에서 현미경 이미지 캡처 소프트웨어를 사용하여 유동 채널 또는 입구 내에 기포가 있는지 장치를 검사합니다.
알림: 기포가 있는 경우 기포가 PDMS 재료에 흡수될 때까지 기다리십시오.
6. 동물 적재
참고: Lagoy et al.17 참조.
- 어린 성인 동물을 와이어 팁 "픽"을 사용하여 씨를 뿌리지 않은 NGM 한천 플레이트에 옮깁니다.
- 동물이 헤엄칠 수 있도록 약 5mL의 1x S 기초 완충액으로 플레이트를 채웁니다.
- 웜을 로딩 주사기(1x S Basal로 미리 채워진 튜브가 부착된 1mL 또는 3mL 주사기)에 넣습니다.
- 입체경을 사용하여 한 손으로 튜브 끝을 액체 표면 아래로 원하는 각 동물에게 이동하고 다른 손에 든 주사기를 사용하여 튜브로 그립니다.
- 웜을 주사기가 아닌 튜브에만 끌어들입니다.
참고: 튜브는 일반적으로 약 100μL만 수용합니다. 동물들은 지역으로 추방 된 다음 작은 부피로 튜브로 다시 끌어 들일 수 있습니다.
- 출구 라인을 닫고 웜 로딩 핀을 제거한 다음 드롭 투 드롭 연결을 사용하여 웜 로딩 주사기를 장치에 연결합니다.
- 동물을 경기장으로 부드럽게 흐르게 하고, 완충 흐름을 설정하고, 테트라미솔에 의한 고정을 위해 최대 1시간을 허용합니다.
알림: 고정 기간 동안 완충액만 경기장에 들어가도록 하십시오. 이 기간 동안 자극 및 제어 저장소를 끌 수 있지만 자극 시험을 실행하기 전에 열고 올바른 흐름을 확인하십시오.
7. 자동 자극 및 신경 기록
- 자동 이미지 획득을 위한 자극 설정이 포함된 텍스트 편집기(예: 메모장)를 사용하여 "User Defined Acquisition Settings.txt"라는 자극 정의 텍스트 파일을 만듭니다( 그림 3의 예 참조). 설정은 두 섹션으로 나뉩니다.
- 현미경 획득 설정: 실험 유형(단일 자극 또는 다중 패턴), 노출 및 여기 타이밍, 시험 기간 및 간격을 정의하고 디렉토리를 저장합니다.
- 자극 설정: 자극 제어 파라미터를 정의합니다. "자극 명령"은 구문<문자 코드><프레임 번호>을 사용하여 특정 비디오 프레임에서 발생하는 동작을 지정하며, 여기서 문자 코드는 A = 밸브1, B = 밸브2, C = 밸브3, L = LED 조명입니다. 또한 대문자 = 켜기 및 소문자 = 끄기입니다. LED 강도는 문자 코드 "i"와 0(꺼짐)에서 255(최대 밝기)까지의 값으로 설정됩니다.
알림: 0에서 255까지의 LED 강도 값은 출력 아날로그 전압을 0V에서 5V로 설정합니다. 여기에 사용된 전류 컨트롤러에는 선형 강도 스케일링이 있으며 다른 컨트롤러는 라이트 파워 미터로 보정해야 합니다.- 반복되는 자극 명령이 하나만 있는 단일 자극 실험의 경우 그림 3A의 형식을 사용합니다.
- 다중 자극 명령을 사용한 다중 패턴 실험의 경우 그림 3B의 형식을 사용합니다. 자극 패턴의 순서를 나타내는 숫자의 "패턴 시퀀스"를 포함합니다. 각 패턴에 대해 별도의 줄에 자극 명령을 입력합니다.
참고: 의사 난수 시퀀스 또는 m-시퀀스는 자극 이력 의존성을 조사하는 데 유용할 수 있습니다.
- 현미경 제어 소프트웨어를 실행합니다. 모든 유체 유입구가 열려 있는지, 경기장 내에서 흐름이 원하는 대로( 그림 2H 참조), 관심 있는 뉴런이 라이브 창 내에서 초점이 맞춰져 있는지 확인합니다.
- 라이브 창을 닫고 소프트웨어 내에서 스크립트 "MultiPattern_RunScript.bsh"를 실행합니다.
참고: 적절한 흐름과 자극을 확인하기 위해 동물 없이 테스트 실험을 실행하는 것이 유용합니다. 각 자극액에 대해 다른 플루오레세인 농도를 대체하면 새로운 자극 패턴을 시각화하고 문서화하는 데 도움이 될 수 있습니다. - 실험 후 미세 유체 장치를 분해하고 모든 표면, 튜브 및 저장소를 물로 헹굽니다.
알림: 모든 구성 요소는 깨끗하게 유지하면 수십 번 재사용할 수 있습니다. 저장소, 튜브 및 미세 유체 장치가 막힐 수 있고 제거하기 어려운 염 결정화를 방지하기 위해 공기 흐름에서 젖거나 완전히 건조된 상태로 유지되도록 하십시오. 장치는 살균을 위해 에탄올에 보관할 수 있지만 재사용하기 전에 완전히 건조시켜야 합니다(65°C에서 >1시간)17.
8. NeuroTracker를 이용한 데이터 분석
참고: NeuroTracker 4,18,19는 시험 중에 움직이는 여러 뉴런과 동물의 형광 강도를 추적하기 위한 ImageJ/FIJI 20 소프트웨어 플러그인입니다. 이 플러그인은 각 뉴런의 위치와 배경 보정 형광 강도(F)가 포함된 텍스트 파일로 데이터를 저장합니다. 형광 데이터는 기준선 형광(F0), 예를 들어 자극 전 몇 초의 평균으로ΔF/F 0 = (F -F 0)/F 0으로 정규화되며, 이는 모집단에 걸쳐 평균화될 수 있습니다.
- 지시에 따라 NeuroTracker 스크립트를 설치합니다(github.com/albrechtLab/Neurotracker).
- Plugins | 추적 | 뉴로트래커.
- 가 포함된 폴더를 선택합니다. 추적할 TIF 비디오 파일을 선택하고 원하는 설정을 선택합니다.
참고: 비디오 파일의 하위 집합만 추적해야 하는 경우 프롬프트에서 분석할 파일의 숫자 범위를 선택합니다. 기본 추적 설정은 250pix/mm 해상도에서 운동성이 없는 동물에 적합합니다. 다른 해상도에 대해 매개변수를 비례적으로 조정합니다. 자세한 설정 정보는 사용 설명서19 를 참조하십시오. - 선택을 위해 뉴런을 볼 수 있도록 강도 임계값을 설정합니다(그림 4).
- Image를 사용하여 Brightness/Contrast (B/C) 및 Threshold 컨트롤 창을 엽니다 . 메뉴를 조정합니다 .
- B/C 창에서 뉴런을 명확하게 구분할 수 있을 때까지 최소값 및 최대값 슬라이더를 조정합니다(그림 4A).
- 임계값(Threshold) 창에서 어두운 배경(Dark background) 및 범위를 재설정하지 않음(Don't Reset Range)을 선택합니다.
- 프레임 슬라이더를 밀어 뉴런의 움직임과 강도 변화를 관찰하고, 다른 동물과의 겹침 등 추적에서 제외해야 할 동물을 확인합니다.
- 추적할 뉴런을 식별합니다.
- 각 동물에 대해 자극 전, 자극 중 및 자극 후의 모든 프레임에서 뉴런 위의 빨간색 임계값 영역이 보이도록 임계값 수준을 조정합니다.
- 뉴런을 클릭하여 위치와 임계값 수준을 기록합니다.
- 추적할 각 동물과 뉴런에 대해 임계값 조정 및 선택을 반복합니다. 좋은 임계값 수준 예는 그림 4C를 참조하고, 임계값 초과 및 임계값 미만 예는 그림 4D,E를 참조하십시오. 이전에 선택된 뉴런은 작은 상자로 표시됩니다.
- 모든 뉴런이 선택되면 스페이스바 를 눌러 추적을 시작합니다.
참고: 추가 NeuroTracker 예제는 이전 참고 문헌 4,19를 참조하십시오. - 각 동물에 대한 추적 프로세스를 모니터링하고 필요한 수정을 수행합니다.
- NeuroTracker가 일시 중지되면 뉴런이 손실된 것입니다. 뉴런을 다시 클릭하고 필요에 따라 임계값 수준을 조정합니다.
- 통합 상자가 근처의 다른 동물 또는 비뉴런 구조로 이동하면 스페이스바 를 눌러 일시 중지하고 슬라이더 를 첫 번째 잘못된 프레임으로 다시 이동한 다음 올바른 뉴런 위치를 다시 클릭합니다.
9. 데이터 탐색 및 시각화
참고: MATLAB 분석 스크립트는 데이터 처리 및 시각화에 사용되며 각 분석에 대한 요약 PDF를 생성하는 데 사용됩니다.
- MATLAB에서 "NeuroTrackerSummary_pdf.m" 파일을 실행하고, NeuroTracker 데이터 텍스트 파일이 들어 있는 폴더를 선택합니다.
- 요약 PDF가 생성될 때까지 기다렸다가 추적 프로세스를 확인할 수 있습니다(그림 5). 동물은 숫자로 식별되며(그림 5A), 개체군 변동성을 평가하기 위해 각 동물 및 시험의 신경 반응을 볼 수 있습니다(그림 5B).
- "databrowse.m" 함수를 사용하여 시험 번호(그림 5C), 동물 수(그림 5D), 자극 패턴 또는 다른 범주별로 그룹화하는 등 신경망 데이터를 탐색할 수 있습니다.
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Representative Results
우리는 시간적 억제, 적응 및 탈억제를 포함하여 다양한 신경 현상을 평가하는 자극 패턴의 몇 가지 예를 제시합니다. 시간적 억제는 초기 발현 직후에 발생하는 두 번째 자극 제시에 대한 신경 반응의 일시적인 억제이다14. 이 현상을 테스트하기 위해 쌍 펄스 실험에서 0초에서 20초 범위의 간격으로 분리된 두 개의 1초 냄새 펄스로 구성된 8개의 패턴이 제시되었습니다(그림 6B, 해당 자극 제어 파일은 그림 3B 참조). 경기장은 단일 자극 유체(1.1μM 디아세틸), 완충액 및 제어 흐름 튜브로 설정되었으며 사용되지 않은 입구 포트는 단단한 핀으로 막혔습니다(그림 6A). 밸브 1을 켜면 제어 유체가 ctrl1 입구로 들어가 자극이 경기장으로 들어가도록 유체 흐름을 이동시킵니다. 밸브 1이 꺼지면 제어 유체가 ctrl2 입구로 들어가고 버퍼가 경기장을 통해 흐릅니다( 그림 2G, H 참조). 처음 1초의 냄새 펄스는 디아세틸 검출 AWA 뉴런에서 동일한 반응 크기를 유도한 반면, 두 번째 펄스에 대한 반응은 자극 간격에 따라 다양했습니다(그림 6D). 펄스 간격이 10초 미만인 경우 두 번째 반응이 약하여 시간적 억제 현상을 나타냅니다. 이 실험 설정을 사용하여 dynein 성분 CHE-3의 파괴가 시간적 억제를 방지하는 것으로 나타났으며, 이는 이 현상5에서 축삭 수송을 암시합니다.
적응은 동일한 자극의 반복적인 표현에 대한 신경 반응의 점진적인 감소입니다. 이 현상은 빠르게 역전될 수 있는 능동적 억제 또는 역전이 느린 다른 과정과 같은 다른 과정으로 인해 발생할 수 있습니다. 빠른 가역성을 평가하기 위한 한 가지 실험은 적응을 확립하기 위해 하나의 자극을 반복한 다음 "일탈" 또는 새로운 자극을 한 다음 원래 자극으로 돌아가는 "캐치" 시도입니다. 탈억제는 새로운 "탈억제" 자극 후에 신경 반응이 증가하는 경우 관찰됩니다. 그림 7은 서로 다른 수용체를 통해 AWA 화학감각 뉴런에 의해 검출되는 두 가지 냄새 물질인 디아세틸과 2-메틸피라진(2-MP)을 사용한 예를 보여줍니다4. 두 개의 자극 저장소와 튜브가 미세 유체 장치에 연결되었으며, 어떤 자극이 경기장으로 유입되는지 결정하기 위해 추가 3방향 핀치 밸브가 있었습니다(그림 7A). 자극 패턴은 30번의 시도 모두에 대해 밸브 1을 통해 4초 동안 화학 펄스를 제시하고 25번째 시도 후에 켜지고 26번째 시도 후에 꺼진 밸브 3을 통해 자극 S1 또는 S2 중에서 선택하도록 정의되었습니다(그림 7B). 이러한 배열은 동물에게 제시하기 전에 상이한 자극 유체가 미세유체 장치를 통해 흐를 수 있는 충분한 시간을 보장하였다. 디아세틸 자극에 대한 적응이 관찰되었지만 새로운 2-MP 자극의 제시는 강력한 탈억제 효과를 이끌어내지 못했습니다(그림 7C).
광유전학적 자극은 빛을 사용하여 빛에 민감한 이온 채널을 통해 뉴런을 활성화합니다. 사용하기 편리하지만 광유전학적 활성화는 감각 수용체와 일부 조절 경로를 우회하므로 일부 신경 현상은 자연 자극에 의한 활성화와 다를 수 있습니다. 이러한 차이점을 테스트하기 위해 다중 모드 실험은 단일 실험 내에서 다양한 유형의 자극을 제시하는 데 유용합니다. 채널로돕신 변이체 크림슨(Chrimson)을 발현하는 뉴런은 적색광 노출에 의해 활성화된다5. AWA 뉴런이 화학적 및 광유전학적 자극에 유사하게 적응하는지 여부를 평가하기 위해 AWA 뉴런에서 Chrimson과 GCaMP를 모두 발현하는 NZ1091 균주를 보조인자 all-trans-retinal(ATR, 100μM)이 포함된 플레이트에 14-28시간 동안 유지했습니다. 615nm 적색 LED가 위에서 미세유체 영역을 비췄고(그림 8A), 동일한 시험 내에서 디아세틸, 적색광 또는 둘 다의 5초 펄스를 제공하여 일련의 다중 모드 자극 패턴이 생성되었습니다(그림 8B). 화학적 자극만으로는 적응이 가능했지만 광학 자극만으로는 적응이 일어나지 않았습니다(그림 8C). 그러나 결합된 다중 모드 자극 패턴은 광유전학적 반응이 화학적으로 유도된 적응에 취약하다는 것을 보여주었습니다(그림 8C, D). 이 실험은 적응이 감각 수용체 또는 수지상 과정에서 시작되지만 그 효과가 뉴런 전체에 퍼진다는 것을 시사합니다.
그림 1: 신경 칼슘 기록 및 자극 장비의 개략도. 현미경 이미지 캡처, 형광 여기광 및 자극은 컴퓨터와 오픈 소스 Arduino 마이크로 컨트롤러에 의해 제어됩니다. 미세유체 영역의 화학적 자극은 제어 유체 흐름 C를 통해 버퍼 B와 자극 S 용액 사이를 전환합니다. 선택적 시스템 요소는 별표(*)로 표시되며, 예를 들어 추가 밸브 및 광학 또는 기타 자극 양식이 있습니다. 형광 현미경 이미지는 예를 들어 칼슘 지표 GCaMP를 사용하여 칼슘 과도 현상을 통해 신경 활동을 측정하는 데 사용됩니다. 점선은 전기 연결(디지털 또는 아날로그)을 나타내고, 곡선은 유체 튜브, 직선 실선 화살표는 광학 광 경로를 나타냅니다. 약어: LED = 발광 다이오드. 이 그림은 Lawler와 Albrecht15에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 미세 유체 장치 조립 및 설정. 미세유체 장치는 (A) 천공된 유리 상부와 소수성 유리 베이스 사이에 끼워진 (A) 미세패턴 PDMS 장치와 (C) 클램핑된 장치로 구성됩니다. (D) 저장소는 (E) 튜빙 랙 스탠드가 있는 장치 위에 위치합니다. 저장소의 튜브는 장치에 직접 연결되거나 유체 제어를 위해 작동식 밸브를 통해 연결됩니다. 장치는 현미경의 대물렌즈 위에 위치합니다. (F) 입구, 웜 로딩 포트 및 출구에 부착된 모든 튜브가 있는 미세유체 장치의 클로즈업 이미지. (G) 20mm x 20mm 미세유체 장치의 개략도. 검은색 선은 55-70μm 높이의 유체 채널을 나타냅니다. 이 기하학은 동물을 경기장과 현미경 시야 내에 유지하면서 흐름에 수직인 자극 전면으로 정밀한 시공간 제어를 허용하도록 설계되었습니다. 버퍼 스트림과 하나의 자극 스트림(또는 사용되는 경우 선택적으로 Stim2)은 연속적으로 흐르는 반면, 한 번에 하나의 제어 유체 입구만 흐르면서 어떤 유체가 경기장으로 유입되는지 이동합니다. (H) 밸브 1에 전원이 공급되면 제어 유체가 상시 폐쇄된 포트에서 제어 1 입구로 흐르고 자극이 켜지고 경기장을 통해 흐릅니다. 밸브 1이 꺼지면 유체가 상시 개방 포트에서 control2 입구로 흐르고 버퍼가 경기장으로 들어갑니다. 자극 유체로 사용되는 플루오레세인 염료와 함께 적절한 흐름 균형이 표시됩니다. 경기장으로 들어가는 유체 중 일부는 상부 및 하부 곡선 채널을 통해서도 우회합니다. 이 스트림은 좁아야하며 상부 및 하부 채널에서 동일한 너비를 가져야합니다. 저수지 높이는 필요에 따라 조정할 수 있습니다. 약어: PDMS = 폴리디메틸실록산; WL = 웜 로딩; Buf = 버퍼; Stim1 = 첫 번째 자극; 자극2 = 두 번째 자극; NC = 평상시 닫힘; NO = 평상시 열림. 이 그림은 Lawler와 Albrecht15에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 자극 정의 파일의 예. (A) 단일 반복 자극 실험의 예: 2초에서 7초(프레임 20에서 70)까지의 강도 200에서 5초 광 펄스. (B) 그림 6에 해당하는 8개의 서로 다른 자극 패턴을 사용한 다중 패턴 자극 실험의 예. 두 개의 1초 화학 펄스가 0초에서 20초 간격으로 제공됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: NeuroTracker에서 뉴런 및 임계값 수준 선택 . (A) AWA 뉴런을 명확하게 볼 수 있도록 밝기와 대비가 조정된 전체 현미경 시야. (B) 형광 강도가 계산되는 적분 상자와 배경 빼기를 위한 배경 고리를 묘사한 동물의 머리 영역의 확대도. (C) 강력한 신경 반응을 보여주는 통합 강도 플롯. (D) 임계값을 잘 선택하면 이미지 스택의 모든 프레임에 대해 최소 크기 매개변수보다 높고 최대 크기 매개변수보다 낮은 빨간색 임계값 영역이 생성되며 장 자가형광과 같은 주변 영역이 포함되지 않습니다(패널 B 참조). (E) 임계값이 너무 높게 설정되면 뉴런이 활성화될 때 양호하게 보일 수 있지만, 비활성 상태일 때는 뉴런이 손실될 수 있습니다. 따라서 임계값을 선택할 때 자극 전 프레임과 자극 후 프레임을 모두 확인하는 것이 중요합니다. (F) 임계값이 너무 낮게 설정되면 다른 비신경 구조가 강조될 수 있습니다. 임계값 초과 또는 임계값 미만 선택으로 인해 NeuroTracker가 뉴런을 잃고 임계값 및 뉴런 위치를 수정하기 위해 사용자 피드백을 위해 일시 중지될 수 있습니다. 약어: B&C = 밝기 및 대비. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 데이터 분석의 예. 분당 한 번 5초 동안 광유전학적 자극을 10회 반복하는 15마리의 동물의 신경 반응. (A) 추적된 동물과 시험 내 뉴런의 움직임을 나타내는 요약 이미지(빨간색 상자). 동물 2는 재판 중에 움직였습니다. (B) 시간 경과에 따른 개별 동물 반응은 적색광 자극에 대해 비교적 일관된 반응을 보여줍니다. (C) databrowse 함수를 사용한 데이터 탐색 출력. 추적은 시행 반복(위)별로 그룹화되며 사용자가 선택할 수 있는 시행에 대한 평균이 아래에 표시됩니다. (D) 개별 동물 수로 그룹화되고 반복된 시험에서 평균을 낸 데이터. 이 데이터 세트는 동물 간 변동성을 최소화하여 모집단에 대한 평균 응답을 정당화합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 시간적 억제를 평가하기 위해 가변 자극 간격을 사용한 쌍 펄스 실험 . (A) 미세 유체 장치 입구 연결. 사용하지 않는 입구는 실선 핀(X)으로 막혀 있습니다. 제어 유체 저장소와 밸브1은 c1 및 c2 입구에 연결되며 명확성을 위해 여기에서 생략됩니다. (B) 여덟 가지 패턴에 대한 자극 타이밍. 펄스는 지속 시간이 1초이고 0-20초로 구분됩니다. 패턴의 순서는 아래에 설명되어 있습니다. 각 패턴은 6 회 또는 7 회 제시되었습니다. (C) 50건의 시험과 9마리의 동물에서 얻은 AWA 신경 활동. 자극 패턴별로 정렬된 반응의 히트맵이 위에 나와 있습니다. 각 패턴에 대한 평균 신경 활동(n=56-63 반응)은 다음과 같습니다. 시간적 억제는 초기 펄스 후 ~10초 동안 발생합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 탈억제를 평가하기 위한 캐치 시험 실험 . (A) 미세 유체 장치 입구 연결. 3방향 핀치 밸브는 정지 상태에서는 자극 S1만 통과하고 전원이 공급될 때는 S2만 통과하도록 합니다. (B) 반복되는 디아세틸 냄새 펄스를 전달하는 데 사용되는 세 가지 패턴 시퀀스의 다이어그램, 26번째 시험에서 제시된 새로운 자극 2-메틸피라진. (C) 20마리의 동물에 대한 평균 AWA 신경 활동 반응. 약어: DA = 디아세틸; 2-MP = 2-메틸피라진. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: 다중 모드 자극의 예 . (A) 사용하지 않는 입구가 단단한 핀으로 막힌 미세 유체 장치 입구 연결. 빨간색 LED가 위에서 경기장을 비춥니다. (B) 광학적, 화학적 또는 다중 모드 자극을 위한 패턴. (C) 광유전학 및 화학감각(위), 광유전학만(중간) 및 화학감각만(아래) 자극을 한 30회 반복 시험에 대한 평균 AWA 신경 활성(n = 11마리). (D) 위의 광유전학적 펄스와 아래의 화학적 펄스에 대한 각 시험의 피크 신경 반응 평균. 광유전학적 맥박은 직접적으로 적응을 일으키지 않지만, 그들의 반응은 화학감각 적응에 취약합니다. 약어: DA = 디아세틸. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜에서 우리는 다양한 자극 패턴의 시간적으로 정확한 전달을 사용하여 신경 활동 현상을 평가하기 위한 개방형 현미경 시스템을 설명합니다. 미세 유체 플랫폼은 수십 마리의 동물을 현미경 시야에 유지하면서 반복 가능한 자극을 전달합니다. 다양한 자극 타이밍 패턴을 쉽게 프로그래밍할 수 있는 상용 현미경 소프트웨어 패키지는 거의 없으며, 각 패턴 또는 독점 파일 형식을 수동으로 입력해야 하는 경우가 많습니다. 대조적으로, 실험은 이 시스템에서 텍스트 파일로 정의되며, 이는 컴퓨터로 생성될 수 있고 분석 소프트웨어에서 읽을 수 있습니다. 여기에서 우리는 다중 모드 자극 동안 시간적 억제, 적응 및 누화와 같은 신경 현상을 평가하기 위해 가변 자극 패턴을 사용하는 유용성을 보여줍니다. 데이터 분석 파이프라인은 대규모 현미경 비디오 파일을 인구 변동성(그림 5B), 시간 경과에 따른 변화(그림 7C 및 그림 8C, D) 및 섭동 후의 변화(그림 7C)에 대해 시각화 및 분석할 수 있는 신경 활동 데이터로 줄입니다.
자동화의 주요 이점은 시험 반복 및 실험 간 자극의 재현성이며, 미세유체 경기장 형식은 이전의 단일 동물 방법에 비해 처리량을 최소 20배 증가시킬 수 있습니다 7,9,13. 동물 집단을 동일한 자극 및 환경 조건에 노출시키면 데이터를 비교할 수 있고 용액 준비, 온도, 동물 공급원 또는 기타 요인의 잠재적인 일상적인 변화를 피할 수 있습니다. 그러나 이 접근 방식의 한계는 모든 동물을 시야에 유지하는 저배율, 저해상도 현미경입니다. 추적 오류를 최소화하기 위해 동물당 하나의 뉴런만 모니터링해야 하지만 원칙적으로 최소 50μm 떨어진 뉴런을 구별할 수 있습니다. 양측 뉴런 쌍은 반응이 대칭일 것으로 예상되는 경우 함께 이미지화할 수 있습니다. 먼저 어떤 특정 뉴런이 전뇌 영상7과 같은 관심 신경 과정에 관여하는지 파악한 다음, 처리량 증가를 위해 관련 뉴런에서만 GCaMP를 발현시키는 것이 중요하다.
뉴런 칼슘 반응은 리포터 발현 수준 또는 기타 개인 간 차이로 인해 동물에 따라 다릅니다. 예를 들어, 정규화된 AWA GCaMP 반응은 칼슘 리포터가 게놈4에 안정적으로 통합된 동종 야생형 동물에서도 피크 크기가 두 배로 다양하다. 일부 자극은 집단 전체에 걸쳐 다양한 반응을 나타내며(예: 부틸 아세테이트4), 다양한 수용체 발현을 시사합니다. 실제로, 개체군 변동성을 결정하기 위해 최소 20마리의 개별 동물을 평가해야 합니다. 섭동 전후에 쌍을 이루는 개별 신경 반응의 통계적 비교와 같이 반응 변화를 결정할 때 통계적 검정력을 높이기 위해 개별 동물 데이터를 사용하는 것이 좋습니다.
대규모 데이터 세트와 자동화된 실험을 통해 특히 무인 단계의 경우 적절한 실험 기능, 추적 및 데이터 축소를 검증하고 검증하는 것이 중요합니다. 흐름 패턴은 형광 용액(그림 2H와 같이)으로 녹화된 비디오에서 경기장에 기포나 제어 유체가 들어오지 않는 것을 관찰하여 확인해야 합니다. 예를 들어, 데이터 세트는 동물의 움직임을 기록하고(그림 5A에서와 같이) 부드러운 신경 반응을 확인하여(그림 4C 및 그림 5B에서와 같이) 검증해야 합니다. 문제가 있는 데이터는 제외해야 합니다. 또한 "databrowse" 함수를 사용하여 평균을 구하기 전에 데이터 그룹화를 확인하여 평균 반응이 개별 반응을 반영하는지 확인하는 것이 중요합니다.
오픈 소스 자극 제어 시스템은 디지털 또는 아날로그 신호 또는 직렬 통신 명령을 통해 다른 자극으로 쉽게 확장할 수 있습니다. 등급이 매겨진 자극은 일반적으로 LED 광도 또는 신경 자극기 펄스 크기와 같은 아날로그 전압(0-5V) 입력으로 제어할 수 있습니다. 온-오프 자극은 일반적으로 전기 자극기 타이밍과 같은 디지털(TTL) 신호로 제어됩니다. 이러한 디지털 신호는 또한 릴레이 스위치를 작동시켜 기계 감각 자극을 위한 진동 모터와 같은 다른 전기 시스템을 활성화할 수 있습니다. 다른 장비는 USB 연결과 같은 직렬 통신을 사용하여 특정 문자 명령을 전송하여 작업을 정의합니다. 예를 들어, 용량-반응 실험은 USB 제어 회전 밸브(5 ) 또는 멀티웰 플레이트 시스템(6)을 사용하여 여러 화학 물질 농도를 자동으로 제시할 수 있다. 이러한 명령은 오픈 소스 현미경 제어 스크립트에 추가하여 특정 시험 번호로 보낼 수 있습니다. 시간 지연도 유사하게 통합될 수 있습니다. 예를 들어, 두 번의 30번의 시험 자극 시합 사이에 1시간 동안 테스트를 일시 중지하려면 60번의 시험 실험을 지정하고 시험 횟수가 31에 도달할 때 1시간 동안 일시 중지하는 한 줄의 코드를 추가합니다.
실험의 복잡성은 사실상 무한하며 "폐쇄 루프" 시스템의 실시간 피드백을 기반으로 하는 실험 중에도 변경될 수 있습니다. 예를 들어, 자극은 신경 활동, 동물 행동 또는 다른 정량화 가능한 매개변수에 따라 실시간으로 달라질 수 있습니다. 우리는 최근에 행동변화 8,15의 변화 후 자극과 신경 기록을 유발하여 수면 동물과 깨어있는 동물의 감각 신경 반응을 평가하기 위해 이러한 시스템을 사용했습니다. NeuroTracker의 동작 추적 기능을 사용하면 행동 출력과의 상관 관계를 위해 자유롭게 움직이는 동물의 신경 활동을 분석할 수 있습니다. 그러나 개별 움직이는 동물을 추적하려면 경로를 건널 때와 같이 세심한 주의가 필요하므로 이러한 상호 작용을 최소화하기 위해 경기장당 더 적은 수의 동물(약 5마리)을 적재하는 것이 좋습니다.
전반적으로, 이러한 기술은 자극의 정밀도와 인구 변동성 및 특정 신경 현상을 탐색하는 실험 처리량을 증가시킵니다. 뉴런 활성을 측정하는 것 외에도, 이러한 방법은 칼슘 신호(21), 신경 세포 배양 및 뇌 오가노이드(22)를 통해 통신하는 식물을 포함한 다른 생물계뿐만 아니라 시냅스 활동을 위한 센서, 신경전달물질 방출(23) 및 전사(24)와 같은 다른 동적 형광 신호에도 일반화할 수 있다.
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Disclosures
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이러한 프로토콜을 테스트하고 원고를 검토해 주신 Fox Avery와 프로그래밍 지원을 요청해 주신 Eric Hall에게 감사드립니다. 본원에 제시된 방법에 대한 자금은 미국 국립과학재단(National Science Foundation 1724026, D.R.A.)에 의해 부분적으로 제공되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacterial strains | |||
| E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Cat# OP50 | |
| Experimental models: Organisms/strains | |||
| C. elegans strains expressing GCaMP (and optionally, Chrimson) in desired neurons | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) or corresponding authors of published work | NZ1091, for example | |
| Chemicals, Treatments, and Worm Preparation Supplies | |||
| 2,3-Butanedione | Sigma-Aldrich | Cat# B85307 | diacetyl, example chemical stimulus |
| Calcium chloride, CaCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# C3881 | |
| Fluorescein, Sodium salt | Sigma-Aldrich | Cat# F6377 | |
| Glass water repellant | Rain-X | Cat #800002250 | glass hydrophobic treatment (single-use) |
| Magnesium chloride, MgCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# M2393 | |
| Nematode Growth Medium (NGM) agar | Genesee | Cat #: 20-273NGM | |
| Petri dishes (60 mm) | Tritech | Cat #T3305 | |
| Poly(dimethyl siloxane) (PDMS): Sylgard 184 | Dow Chemical | Cat# 1673921 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | Cat# P5655 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | Cat# P8281 | |
| Sodium chloride, NaCl | Sigma-Aldrich | Cat# S7653 | |
| (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane (TFOCS) | Gelest | CAS# 78560-45-9 | glass hydrophobic treatment (durable) |
| Software and algorithms | |||
| Arduino IDE | Arduino | https://www.arduino.cc/en/software | |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| Micro-manager | Micro-manager | https://micro-manager.org/ | |
| Microscope control software | Albrecht Lab | https://github.com/albrechtLab/MicroscopeControl | |
| Neurotracker data analysis software | Albrecht Lab | https://github.com/albrechtLab/Neurotracker | |
| Automated Microscope and Stimulation System | |||
| Axio Observer.A1 inverted microscope set up for epifluorescence (GFP filter cubes, 5× objective or similar) | Zeiss | Cat #491237-0012-000 | |
| Excelitas X-cite XYLIS LED illuminator | Excelitas | Cat #XYLIS | |
| Orca Flash 4.0 Digital sCMOS camera | Hamamatsu | Cat #C11440-22CU | |
| Arduino nano | Arduino | Cat #A000005 | |
| 3-way Miniature Diapragm Isolation Valve (LQX12) | Parker | Cat #LQX12-3W24FF48-000 | Valve 1: Control |
| 2-way normally-closed (NC) Pinch Valve | Bio-Chem Valve Inc | Cat #075P2-S432 | Valve 2: Outflow |
| 3-way Pinch Valve | NResearch | Cat #161P091 | Valve 3: Stimulus selection |
| Optogenetic stimulation LED and controller (615 nm) | Mightex | Cat #PLS-0625-030-S and #SLA-1200-2 | |
| ValveLink 8.2 digital/manual valve controller | AutoMate Scientific | Cat #01-18 | |
| Wires and connectors | various | See Fig. 2 of Cell STARS Protocol (Lawler, 2021) | |
| Microfluidic Device Preparation | |||
| Dremel variable speed rotary cutter 4000 | Dremel | Cat #F0134000AB | Set speed to 5k RPM for cutting glass |
| Dremel drill press rotary tool workstation | Dremel | Cat #220-01 | |
| Diamond drill bit | Dremel | Cat #7134 | |
| Glass slide, 1 mm thick | VWR | Cat #75799-268 | |
| Glass scribe (Diamond scriber) | Ted Pella | Cat #54468 | |
| Luer 3-way stopcock | Cole-Parmer | Cat #EW-30600-07 | |
| Luer 23 G blunt needle | VWR | Cat #89134-100 | |
| Microfluidic device | Corresponing author or fabricate from CAD files associated with this article | N/A | |
| Microfluidic device clamp | Warner Instruments (or machine shop) | P-2 | |
| Microfluidic tubing, 0.02″ ID | Cole-Parmer | Cat #EW-06419-01 | |
| Tube 19 G, 0.5″ | New England Small Tube | Cat #NE-1027-12 |
References
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