Automatiserad multimodal stimulering och samtidig neuronal inspelning från flera små organismer

Summary

Vi presenterar en metod för flexibel kemisk och multimodal stimulering och registrering av samtidig neural aktivitet från många Caenorhabditis elegans-maskar . Denna metod använder mikrofluidik, hårdvara och mjukvara med öppen källkod och övervakad automatiserad dataanalys för att möjliggöra mätning av neuronala fenomen som anpassning, tidshämning och stimulusöverhörning.

Abstract

Fluorescerande genetiskt kodade kalciumindikatorer har bidragit starkt till vår förståelse av neural dynamik från nivån av enskilda neuroner till hela hjärnkretsar. Neurala svar kan dock variera beroende på tidigare erfarenhet, interna tillstånd eller stokastiska faktorer, vilket genererar behovet av metoder som kan bedöma neural funktion hos många individer samtidigt. Medan de flesta inspelningstekniker undersöker ett enda djur åt gången, beskriver vi användningen av bredfältmikroskopi för att skala upp neuronala inspelningar till dussintals Caenorhabditis elegans eller andra submillimeterskaliga organismer samtidigt. Hårdvara och programvara med öppen källkod möjliggör stor flexibilitet vid programmering av helautomatiska experiment som styr intensiteten och tidpunkten för olika stimulanstyper, inklusive kemiska, optiska, mekaniska, termiska och elektromagnetiska stimuli. I synnerhet ger mikrofluidiska flödesanordningar exakt, repeterbar och kvantitativ kontroll av kemosensoriska stimuli med tidsupplösning under en sekund. NeuroTrackers halvautomatiserade dataanalyspipeline extraherar sedan individuella och populationsomfattande neurala svar för att avslöja funktionella förändringar i neural excitabilitet och dynamik. Denna uppsats presenterar exempel på mätning av neuronal anpassning, temporal hämning och stimulansöverhörning. Dessa tekniker ökar precisionen och repeterbarheten av stimulering, möjliggör utforskning av populationsvariationer och är generaliserbara till andra dynamiska fluorescerande signaler i små biosystem från celler och organoider till hela organismer och växter.

Introduction

Kalciumavbildningstekniker har möjliggjort icke-invasiv registrering av in vivo neural dynamik i realtid med hjälp av fluorescensmikroskopi och genetiskt kodade kalciumindikatorer uttryckta i målcellerna 1,2,3. Dessa sensorer använder vanligtvis ett grönt fluorescerande protein (GFP), såsom GFP-kalmodulin-M13-peptidfamiljen (GCaMP), för att öka fluorescensintensiteten vid neuronal aktivering och förhöjda intracellulära kalciumnivåer. Kalciumavbildning har varit särskilt kraftfull i nematoden C. elegans för att undersöka hur neuroner och neurala kretsar fungerar i levande, beter sig djur 4,5,6,7,8,9,10, eftersom deras transparenta natur innebär att ingen kirurgisk process krävs för optisk åtkomst^, och cellspecifika genpromotorer riktar uttryck till cellerna av intresse. Dessa tekniker använder ofta mikrofluidiska anordningar, som ger exakt kontrollerade miljöer för att studera biologiska, kemiska och fysiska fenomen i liten fysisk skala^11,12. Mikrofluidiska enheter finns i överflöd för att mäta neural aktivitet, med nya konstruktioner som kontinuerligt utvecklas, och de tillverkas lätt i forskningslaboratoriet. Men många mönster fångar ett enda djur åt gången, vilket begränsar experimentell genomströmning ^7,9,13. Neurala svar varierar ofta väsentligt mellan djur på grund av skillnader i tidigare erfarenhet, interna tillstånd som stress eller hunger eller stokastiska faktorer som genuttrycksnivåer. Dessa skillnader skapar ett behov av metoder som samtidigt kan stimulera och observera många djur och extrahera information från individer⁴.

Dessutom blir vissa neuromodulerande fenomen uppenbara endast under specifika stimuleringsförhållanden, såsom temporal hämning¹⁴, som hänvisar till den korta undertryckningen av svar när stimulering sker i snabb följd. Elektrofysiologiska system kan driva neural aktivitet över ett brett stimulansutrymme för detta ändamål, modulera till exempel den elektriska pulsströmmen, spänningen, frekvensen, vågformen, arbetscykeln och tidpunkten för periodiska stimulanståg. Indirekt stimulering av naturligt detekterade stimuli eller optogenetiska system skulle dra nytta av en liknande bredd av kontrollmekanismer. För närvarande presenteras många naturliga stimuli på ett enkelt "on-off" -sätt, såsom luktpresentation och borttagning, med hjälp av kommersiella system som har varit långsamma för att lägga till flexibilitet. Men billiga mikrokontroller kan nu automatisera leveransen av flera typer av stimuli på ett sätt som är anpassningsbart till forskarnas behov. I kombination med mikrofluidik har dessa system uppnått målet om ökad experimentell genomströmning och flexibilitet, vilket gör att neurala svar på en mängd exakta stimuli kan mätas samtidigt hos många djur ^4,6. Multimodal stimulering kan användas för att ytterligare förhöra neuronkretsarna, såsom genom att övervaka förändringar i neural excitabilitet vid konsekvent stimulering före, under och efter en ortogonal störning såsom läkemedelsexponering⁴. Fördelarna med billiga, öppna mikroskopisystem är tydliga för att främja vetenskaplig forskning, men i praktiken kan behovet av inköp av delar, konstruktion och prestandavalidering hindra antagandet av dessa tekniker.

Detta protokoll syftar till att lindra några av dessa tekniska utmaningar. Medan tidigare protokoll har fokuserat på användning av mikrofluidiska enheter och grundläggande stimulering 9,15,17, beskriver vi här konstruktionen och användningen av ett flexibelt, automatiserat^, multimodalt stimulansleveranssystem för neural avbildning i C. elegans eller andra små organismer som använder tidigare beskrivna mikrofluidiska enheter⁴. Systemet med öppen källkod programmeras via enkla textfiler för att definiera experimenten, och dataanalysprogrammet NeuroTracker extraherar halvautomatiskt neurala aktivitetsdata från mikroskopvideorna. Vi demonstrerar detta system med exempel på bedömning av temporal hämning, disinhibition och stimulus crosstalk med hjälp av den kemosensoriska neuronen AWA, som depolariserar som svar på olika matlukter eller som svar på ljus när man uttrycker optogenetiska ljuskänsliga jonkanaler ^5,6.

Protocol

1. Utrustning för neural avbildning

OBS: Se Lawler och Albrecht¹⁵ för detaljerade instruktioner om hur man bygger bild- och stimuleringssystemet, som styr mikroskopbelysningstiden, bildförvärv och stimulansleverans (figur 1). En billig Arduino Nano stimulansregulator aktiverar fluidventilerna genom digitala signaler till en ventilstyrenhet och styr den optogenetiska belysningen genom analoga spänningssignaler till en LED-styrenhet. Andra stimuli, såsom vibrationsmotorer och termiska värmare, kan styras med hjälp av digitala eller analoga signaler. Stimulusstyrenheten synkroniserar stimulering och bildinspelning via kamerasignaler, enligt specifikationen i Micro-Manager Micro-Manager mikroskopkontrollprogramvara (μManager)¹⁶. Se materialförteckningen för detaljer relaterade till alla material, reagenser, utrustning och organismer som används i detta protokoll.

1. Ställ in neural bildutrustning, inklusive ett epifluorescensmikroskop med GFP-optik, en sCMOS-kamera med en digital exponeringsutgångssignal och en stimulanskontroll¹⁵.
2. Anslut stimulansregulatorn till önskade system via digitala eller analoga signaler. För exemplen nedan används följande system:
   1. Använd en ventilregulator för kemisk stimulering. Anslut ventilstyrenheten till magnetventil eller klämventiler (bild 1)¹⁵.
   2. Använd en 615 nm röd lysdiod och styrenhet för optogenetisk stimulering, monterad ovanför mikroskopsteget.
3. Ställ in datorn med programvaran för mikroskopkontroll, skapa en konfigurationsförinställning med utrustningsinställningar och se till att stimulanskontrollen^{fungerar korrekt 15}.

2. Tillverkning av mikrofluidiska enheter

OBS: Se Lagoy et ^al.17 för detaljerad information om att erhålla eller tillverka huvudformarna och produktion, användning och rengöring av mikrofluidiska enheter. Dessa steg sammanfattas nedan.

1. Skaffa eller tillverka en huvudform med hjälp av den medföljande mikrofluidiska designfilen (albrechtlab.github.io/microfluidics)¹⁷. För unga vuxna C. elegans, se till att kanalhöjden är 55-70 μm.
2. Kombinera PDMS-basen och härdningsmedlet i förhållandet 10:1 i viktprocent och blanda noggrant med överföringspipetter.
3. Avgasa i 30-60 min i en vakuumexsickator tills bubblorna försvinner.
4. Placera huvudformen i en stor (150 mm diameter) petriskål och häll det avgasade PDMS upp till ett djup av 4-5 mm (~ 100 g). Kontrollera och ta bort damm eller bubblor med en överföringspipett.
5. Grädda vid 65 ° C på en plan ugnshylla i 3 timmar för att över natten.
6. När du har härdat, använd en skalpell för att skära PDMS från formen och ett rakt rakblad för att separera enheterna.
7. Stansa inlopps- och utloppshålen med en 1 mm dermal stans och rengör dem meddH 2 O, etanol och igen med dH₂O. Torka enheten i en luftström (se figur 2A).
8. Rengör båda sidorna av PDMS-enheten med tejp och ta bort damm eller skräp.
9. Förbered glasskivorna för att slutföra mikrofluidanordningen enligt beskrivningen¹⁷. Borra inloppshålen i den övre bilden med en diamantbit och gör bottenglidet hydrofobt genom exponering för TFOCS-ångor eller genom att applicera vattenavvisande glasbehandling (figur 2B).
10. Montera glas-PDMS-enhetens smörgås i en klämma (figur 2C).

3. Beredning av djur

1. Skaffa eller skapa djur med genetiskt kodade kalciumindikatorer uttryckta i neuronerna av intresse.
   OBS: Till exempel rad NZ1091 (kyIs587 [gpa-6p::GCaMP2.2b; unc-122p::d sRed]; kyIs5662 [odr-7p::Chrimson:SL2:mCherry; elt-2p::mCherry]) uttrycker GCaMP och den röda ljuskänsliga katjonkanalen Chrimson i AWA:s sensoriska neuronpar⁶. Båda transgenerna är integrerade i genomet för stabilt uttryck i varje djur.
2. En dag före försöket, placera minst 20 L4 larvstadium C. elegans per experiment på en agarplatta med nematodtillväxtmedium (NGM) sådd med en OP50 E. coli-gräsmatta . När den hålls vid 20 °C synkroniserar den vildtypsdjuren i den unga vuxna fasen nästa dag.
   OBS: För matristransgener, välj djur med hjälp av ett fluorescensstereoskop för att säkerställa transgenuttryck hos de valda djuren.

4. Beredning av lösning

1. Bered 1x S basalbuffert (100 mM NaCl och 0,05 M KPO₄, pH 6,0) från en 10x stamlösning.
2. Bered 1 mM tetramisol buffert genom att späda 1 M lager i 1x S Basal. Använd denna paralytiska buffert för att förbereda alla stimuli. Ett experiment använder vanligtvis cirka 150 ml.
3. Tillsätt 0,1-1 μg/ml fluorescein till "kontroll" buffertreservoarerna för att visualisera flödet.
4. Skapa stimuluslösningar genom serieutspädning till önskad slutkoncentration. Skapa till exempel en 10−⁷ utspädning av diacetyl attraherande genom att först skapa en 10⁻³ stock.
   OBS: En liten mängd fluorescein (0,1-1 μg / ml) kan tillsättas till stimulans- eller buffertlösningen för att verifiera stimulustiming, men koncentrationen bör vara minimal för att undvika artefakter i neural fluorescens.

5. Förberedelse av mikrofluidisk anordning

OBS: Se Reilly et ^al.9 för ett videoprotokoll som visar reservoargenerering, enhetsinställning och lastning av djuren. Se även Lagoy et ^al.17 för ett skriftligt protokoll som innehåller många användbara tips.

1. Förbered tre eller flera vätskebehållare. För varje, fäst en 30 ml eller 60 ml sprutbehållare, en 3 ml primingspruta och en nålstub på en trevägs Luerventil (figur 2D). Anslut nålen till mikroborrslang försedd med ett metallrör i änden. Märk behållarna, montera dem på ett ställ fäst vid ett ringstativ och fyll dem med motsvarande buffert- eller stimulansvätskor (figur 2E).
2. Avgasa den monterade mikrofluidiska anordningen i en vakuumexsickator i ~ 1 timmar.
3. Fyll och ta bort luftbubblorna från behållarslangen med hjälp av primingsprutan. Fyll utflödesslangen med buffert.
4. Ta bort mikrofluidanordningen från vakuumet och sätt snabbt in utloppsslangen och injicera vätskan genom enheten tills en droppe kommer ut från ett inlopp.
5. Vid detta inlopp använder du en "drop-to-drop"-anslutning¹⁷ för att sätta in motsvarande fluidiska inloppsrör (bild 2F). Se till att vätskedroppar finns på både inloppsslangen och enhetens porthål för att undvika att införa en bubbla.
6. Injicera mer vätska från utloppet, anslut nästa inloppsrör och upprepa tills alla inlopp är fyllda. Sätt i en solid blockeringsstift vid eventuella oanvända inlopp och maskladdningsporten.
7. Starta flödet genom att öppna inlopps- och utloppsventilerna för Luer. Kontrollera enheten för läckor vid inloppen och glasbasen. Kontrollera enheten för eventuella bubblor i flödeskanalerna eller inloppen med hjälp av programvaran för mikroskopbildtagning i live-läge.
   OBS: Om bubblor är närvarande, vänta tills de absorberas i PDMS-materialet.

6. Lastning av djur

OBS: Se Lagoy ^{m.fl. 17}.

1. Överför unga vuxna djur till en osådd NGM-agarplatta med hjälp av en trådspetsad "hacka".
2. Översvämma plattan med cirka 5 ml 1x S basalbuffert så att djuren simmar.
3. Dra maskarna i en laddningsspruta (1 ml eller 3 ml spruta med bifogad slang som har förfyllts med 1x S Basal).
   1. Använd ett stereoskop, flytta slangänden under vätskeytan med ena handen till varje önskat djur och dra in den i slangen med sprutan som hålls i den andra handen.
   2. Dra maskarna endast i slangen, inte i sprutan.
      OBS: Slangen rymmer vanligtvis endast cirka 100 μL. Djuren kan utvisas till ett lokalt område och sedan dras igen in i slangen med en liten volym.
4. Stäng utloppsledningen, ta bort maskladdningsstiftet och anslut maskladdningssprutan till enheten med en drop-to-drop-anslutning.
5. Flöda försiktigt djuren in i arenan, upprätta buffertflöde och låt upp till 1 h för immobilisering med tetramisol.
   OBS: Under immobiliseringsperioden, se till att endast buffertvätska kommer in i arenan. Stimulans- och kontrollbehållarna kan stängas av under denna period, men öppna dem och verifiera rätt flöde innan stimuleringsförsöken körs.

7. Automatiserad stimulering och neuronal inspelning

1. Skapa en stimulusdefinitionstextfil som heter "User Defined Acquisition Settings.txt" med en textredigerare (t.ex. Anteckningar) som innehåller stimuleringsinställningarna för den automatiska bildinsamlingen (se exempel i figur 3). Inställningarna är indelade i två avsnitt:
   1. Inställningar för mikroskopförvärv: Definiera experimenttypen (Single-Stimulus eller Multi-Pattern), exponerings- och excitationstid, provperiod och intervall och spara katalogen.
   2. Inställningar för stimulering: Definiera stimuluskontrollparametrarna. Ett "stimuleringskommando" anger de åtgärder som inträffar vid vissa videoramar med syntaxen , där bokstavskoderna är A = ventil1, B = ventil2, C = ventil3, L = LED-ljus; Dessutom versaler = på och gemener = av. LED-intensiteten ställs in med bokstavskoden "i" och ett värde på 0 (av) till 255 (maximal ljusstyrka).
      OBS: LED-intensitetsvärdet från 0 till 255 ställer in den analoga utgångsspänningen från 0 V till 5 V. Den nuvarande styrenheten som används här har en linjär intensitetsskalning, och andra bör kalibreras med en ljusmätare.
      1. För ett enkelstimulusexperiment med endast ett upprepat stimuleringskommando använder du formatet i figur 3A.
      2. För ett experiment med flera mönster med flera stimuleringskommandon använder du formatet i figur 3B. Inkludera en "mönstersekvens" av siffror som representerar ordningen på stimulansmönstren. För varje mönster anger du ett stimuleringskommando på en separat rad.
         OBS: En pseudoslumpmässig sekvens eller m-sekvens kan vara användbar för att undersöka stimulushistorikberoende.
2. Kör programvaran för mikroskopkontroll. Kontrollera att alla fluidiska inlopp är öppna, att flödet är som önskat inom arenan (se figur 2H) och att neuronerna av intresse är i fokus i livefönstret.
3. Stäng live-fönstret och kör skriptet "MultiPattern_RunScript.bsh" i programvaran.
   OBS: Det är användbart att köra ett testexperiment utan djur för att verifiera korrekt flöde och stimulering. Att ersätta en annan fluoresceinkoncentration för varje stimulansvätska kan hjälpa till att visualisera och dokumentera nya stimulansmönster.
4. Efter experiment, demontera mikrofluidanordningen och skölj alla ytor, slangar och reservoarer med vatten.
   OBS: Alla komponenter kan återanvändas dussintals gånger om de hålls rena. Se till att reservoarer, slangar och mikrofluidiska anordningar hålls våta eller helt torkade i en luftström för att undvika saltkristallisering, som kan täppa till och är svår att ta bort. Apparaterna kan förvaras i etanol för sterilisering men bör torkas helt innan de återanvänds (>1 timme vid 65 °C)¹⁷.

8. Dataanalys med NeuroTracker

OBS: NeuroTracker 4,18,19 är en ImageJ / FIJI²⁰ programvara plugin för att spåra fluorescensintensiteten hos flera nervceller och djur^, även när de rör sig under försök. Detta plugin sparar data som textfiler med varje neurons position och bakgrundskorrigerad fluorescensintensitet (F). Fluorescensdata normaliseras till baslinjens fluorescens (F 0), till exempel genomsnittet av flera sekunder före stimulering, som Δ F / F 0 = (F -F 0) / F ₀, som kan beräknas i genomsnitt över populationer.

1. Installera NeuroTracker skript enligt instruktionerna (github.com/albrechtLab/Neurotracker).
2. Kör NeuroTracker genom att klicka på Plugins | Spåra Paket | NeuroTracker.
3. Välj mappen som innehåller . TIF-videofiler som ska spåras och välj önskade inställningar.
   Om endast en delmängd av videofilerna ska spåras väljer du det numeriska intervallet för filerna som ska analyseras vid prompten. Standardinställningarna för spårning är lämpliga för icke-rörliga djur med en upplösning på 250 pixlar/mm. Justera parametrarna proportionellt för andra upplösningar. Se användarhandboken¹⁹ för ytterligare inställningsinformation.
4. Ställ in intensitetströskeln så att neuronerna är synliga för val (figur 4).
5. Öppna fönstren Ljusstyrka/kontrast (B/C) och Tröskelkontroll med hjälp av Bild | Justera menyn.
6. I B/C-fönstret justerar du skjutreglagen Minimum och Maximum tills neuronerna är tydligt urskiljbara (Figur 4A).
7. I tröskelfönstret markerar du Mörk bakgrund och Återställ inte intervall.
8. Skjut ramreglaget för att observera neuronrörelsen och intensitetsförändringarna, notera alla djur som ska uteslutas från spårning, till exempel på grund av överlappning med andra djur.
9. Identifiera neuronerna för spårning.
10. För varje djur, justera tröskelnivån så att det röda tröskelområdet ovanför neuronen är synligt i varje ram före, under och efter stimulering.
11. Klicka på neuronen för att registrera dess position och tröskelnivå.
12. Upprepa tröskeljusteringen och urvalet för varje djur och neuron att spåra. Se figur 4C för ett bra exempel på tröskelnivå och figur 4D,E för exempel över tröskelvärde och under tröskelvärde. Tidigare valda neuroner indikeras av en liten låda.
13. När alla neuroner är markerade trycker du på mellanslagstangenten för att börja spåra.
    OBS: För ytterligare NeuroTracker-exempel, se tidigare referenser ^4,19.
14. Övervaka spårningsprocessen för varje djur och gör nödvändiga korrigeringar.
15. Om NeuroTracker pausar har den förlorat neuronen. Klicka på neuronen igen och justera tröskelnivån efter behov.
16. Om integrationsrutan hoppar till ett annat djur i närheten eller icke-neuronal struktur trycker du på mellanslagstangenten för att pausa, flyttar skjutreglaget tillbaka till den första felaktiga ramen och klickar på rätt neuronplats igen.

9. Datautforskning och visualisering

MATLAB-analysskriptet används för databehandling och visualisering och för att generera sammanfattande PDF-filer för varje analys.

1. Kör filen "NeuroTrackerSummary_pdf.m" i MATLAB och välj mappen som innehåller NeuroTracker-datatextfilerna.
2. Vänta tills en sammanfattande PDF har producerats, vilket gör det möjligt att verifiera spårningsprocessen (bild 5). Djur identifieras med ett nummer (figur 5A), och de neurala svaren från varje djur och försök kan ses för att bedöma populationsvariationen (figur 5B).
3. Använd funktionen "databrowse.m" för att utforska neurala data, till exempel gruppering efter försöksnummer (figur 5C), efter djurnummer (figur 5D), efter stimuleringsmönster eller efter en annan kategori.

Representative Results

Vi presenterar flera exempel på stimulusmönster som bedömer olika neurala fenomen, inklusive temporal hämning, anpassning och disinhibition. Temporal hämning är den momentana undertryckningen av ett neuralt svar på en andra stimulanspresentation som inträffar strax efter den första presentationen¹⁴. För att testa detta fenomen, i ett parat pulsexperiment, presenterades åtta mönster bestående av två 1 s luktpulser åtskilda av ett intervall som sträckte sig från 0 s till 20 s (figur 6B; se figur 3B för motsvarande stimulanskontrollfil). Arenan sattes upp med en enda stimulansvätska (1,1 μM diacetyl), buffert och kontrollflödesslang, med den oanvända inloppsporten blockerad med en fast stift (figur 6A). Genom att slå på ventil 1 kommer styrvätskan in i ctrl1-inloppet och förskjuter vätskeströmmarna så att stimulansen kommer in i arenan; när ventil 1 är avstängd kommer styrvätskan in i ctrl2-inloppet och bufferten strömmar genom arenan (se figur 2G,H). Medan den första 1 s luktpulsen framkallade en lika responsstorlek i de diacetyldetekterande AWA-neuronerna, varierade svaren på den andra pulsen med interstimulusintervallet (figur 6D). För pulsintervall på mindre än 10 s var det andra svaret svagare, vilket visade fenomenet temporal hämning. Med hjälp av denna experimentella uppställning befanns störningen av dyneinkomponenten CHE-3 förhindra tidsmässig hämning, vilket involverade axonal transport i detta fenomen⁵.

Anpassning är den gradvisa minskningen av neurala svar på upprepade presentationer av samma stimulans. Detta fenomen kan orsakas av olika processer, såsom aktiv hämning, som snabbt kan vändas, eller andra processer som är långsamma att vända. Ett experiment för att bedöma snabb reversibilitet är en "fångst" -försök, där en stimulans upprepas för att upprätta anpassning, följt av en "avvikande" eller ny stimulans och sedan en återgång till den ursprungliga stimulansen. Disinhibition observeras om de neurala svaren ökar efter den nya "disinhibiting" stimulansen. Figur 7 visar ett exempel med två luktämnen, diacetyl och 2-metylpyrazin (2-MP), detekterade av AWA kemosensoriska neuroner via olika receptorer⁴. Två stimulansreservoarer och slangar var anslutna till den mikrofluidiska anordningen, med en ytterligare trevägs klämventil för att bestämma vilken stimulans som kommer in i arenan (figur 7A). Stimulusmönstren definierades för att presentera kemiska pulser för 4 s via ventil 1 för alla 30 försök och att välja mellan stimulans S1 eller S2 via ventil 3, som slogs på efter den 25: e försöket och av efter den 26: e (figur 7B). Detta arrangemang säkerställde tillräckligt med tid för de olika stimulansvätskorna att strömma genom den mikrofluidiska anordningen innan de presenterades för djuren. Anpassning observerades till diacetylstimulansen, men presentationen av den nya 2-MP-stimulansen framkallade inte en stark disinhibitionseffekt (figur 7C).

Optogenetisk stimulering använder ljus för att aktivera neuroner via ljuskänsliga jonkanaler. Även om det är bekvämt att använda, kringgår optogenetisk aktivering sensoriska receptorer och vissa regleringsvägar, så vissa neurala fenomen kan skilja sig jämfört med aktivering av naturliga stimuli. För att testa dessa skillnader är multimodala experiment användbara för att presentera olika typer av stimulering inom ett enda experiment. Neuroner som uttrycker kanalenrhodopsinvarianten Chrimson aktiveras av exponering för rött ljus⁵. För att bedöma om AWA-neuronerna anpassar sig på samma sätt till kemisk och optogenetisk stimulering upprätthölls NZ1091-stammen som uttrycker både Chrimson och GCaMP i AWA-neuronerna på en platta innehållande kofaktorn all-trans-retinal (ATR, 100 μM) i 14-28 timmar. En 615 nm röd LED belyste den mikrofluidiska arenan ovanifrån (figur 8A), och en uppsättning multimodala stimulansmönster genererades genom att tillhandahålla 5 s pulser av diacetyl, rött ljus, eller båda inom samma försök (Figur 8B). Enbart kemisk stimulering orsakade anpassning, medan enbart optisk stimulering inte gjorde det (figur 8C). Det kombinerade multimodala stimulansmönstret visade dock att optogenetiska svar var känsliga för kemiskt inducerad anpassning (figur 8C,D). Dessa experiment tyder på att anpassning initieras vid sensoriska receptorer eller dendritiska processer, men dess effekter sprids genom neuronen.

Figur 1: Schematisk bild av utrustning för registrering och stimulering av neuralt kalcium. Mikroskopbildtagning, fluorescensexcitationsljus och stimulering styrs av en dator och en öppen källkod Arduino-mikrokontroller. Den kemiska stimuleringen i mikrofluidikarenan växlar mellan buffert B och stimulus S-lösningar via kontrollvätskeflöde C. De valfria systemelementen indikeras med en asterisk (*), såsom ytterligare ventiler och optiska eller andra stimuleringsmodaliteter. Fluorescensmikroskopbilderna används för att mäta den neurala aktiviteten via kalciumtransienter, till exempel med hjälp av kalciumindikatorn GCaMP. De streckade linjerna representerar de elektriska anslutningarna (digitala eller analoga), de böjda linjerna är vätskeslangen och de raka solida pilarna är de optiska ljusvägarna. Förkortning: LED = lysdiod. Denna siffra är modifierad från Lawler och Albrecht¹⁵. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 2: Montering och installation av mikrofluidiska enheter. Den mikrofluidiska anordningen består av en (A) mikromönstrad PDMS-anordning inklämd mellan en (B) borrad glasskiva och hydrofob glasbas och (C) fastspänd. (D) Behållarna är placerade ovanför anordningen med ett (E) slangställ. Slangen från behållarna är ansluten antingen direkt till anordningen eller genom manövrerade ventiler för fluidstyrning. Enheten är placerad ovanför målet på mikroskopet. (F) Närbild av mikrofluidanordningen med alla slangar fästa i inloppen, maskladdningsporten och utloppet. g) Skiss över mikrofluidisationsanordningen 20 mm x 20 mm. De svarta linjerna representerar de 55-70 μm höga vätskekanalerna. Denna geometri är utformad för att möjliggöra exakt spatiotemporal kontroll med en stimulansfront vinkelrätt mot flödet samtidigt som djuren hålls inom arenan och mikroskopets synfält. Buffertströmmen och en stimulansström (eller valfritt Stim2, om den används) flyter kontinuerligt, medan endast ett kontrollvätskeinlopp strömmar åt gången och förskjuter vilken vätska som kommer in i arenan. (H) När ventil 1 är strömförande strömmar styrvätska från den normalt stängda porten till kontroll1-inloppet, och stimulansen slås på och strömmar genom arenan. När ventil 1 är avstängd strömmar vätska från den normalt öppna porten till control2-inloppet och bufferten kommer in i arenan. Den korrekta flödesbalansen visas, med fluoresceinfärg som används som stimulansvätska. Observera att en del av vätskan som kommer in i arenan också kringgår den via de övre och nedre böjda kanalerna. Dessa strömmar ska vara smala och ha samma bredd i de övre och nedre kanalerna. Reservoarhöjderna kan justeras efter behov. Förkortningar: PDMS = polydimetylsiloxan; WL = maskbelastning; Buf = buffert; Stim1 = första stimulans; Stim2 = andra stimulans; NC = normalt stängd; NEJ = normalt öppen. Denna siffra är modifierad från Lawler och Albrecht¹⁵. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Bild 3: Exempel på definitionsfiler för stimulans. (A) Exempel på enstaka upprepande stimulansexperiment: en 5 s ljuspuls vid intensitet 200 från 2 s till 7 s (ram 20 till 70). (B) Exempel på multimönsterstimulansexperiment med åtta olika stimulansmönster, motsvarande figur 6. Två 1 s kemiska pulser presenteras med ett intervall på 0 s till 20 s mellan dem. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 4: Val av neuroner och tröskelnivåer i NeuroTracker . (A) Fullt mikroskopsynfält, med ljusstyrka och kontrast justerad för att tydligt se AWA-neuronerna. (B) Förstorad bild av ett djurs huvudregion som visar integrationsrutan från vilken fluorescensintensiteten beräknas och bakgrundsringen för bakgrundssubtraktion. (C) Integrerat intensitetsdiagram som visar ett robust neuralt svar. (D) Ett bra tröskelvärdesval resulterar i ett rött tröskelvärdesområde som ligger över parametern Min storlek och under parametern Max storlek för varje bildruta i bildstapeln och inte innehåller några närliggande regioner, till exempel autofluorescens i tarmen (se panel B). (E) En tröskel som är för hög kan verka bra när neuronen är aktiv, men när den är inaktiv kan neuronen gå förlorad. Det är därför viktigt att kontrollera både pre-stimulering och post-stimulering ramar när du väljer en tröskel. (F) Ett för lågt tröskelvärde kan framhäva andra icke-neuronala strukturer. Val över tröskel eller under tröskel kan leda till att NeuroTracker förlorar neuronen och pausar för användarfeedback för att korrigera tröskeln och neuronpositionen. Förkortning: B&C = ljusstyrka och kontrast. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Bild 5: Exempel på dataanalys. Neurala svar hos 15 djur exponerade för 10 upprepningar av en 5 s varaktighet optogenetisk stimulering en gång per minut. (A) Sammanfattande bild som visar de djur som spåras och neuronernas rörelse inom försöket (röda rutor). Djur 2 rörde sig under försöket. (B) De enskilda djurens svar över tid visar ett relativt konsekvent svar på stimulering av rött ljus. (C) Utdata för datautforskning med hjälp av databläddringsfunktionen . Spårningarna grupperas efter upprepning av utvärderingsversionen (ovan) och medelvärden visas nedan för användarvalbara prövningar. d) Data grupperade efter antal enskilda djur och medelvärde för upprepade försök. Den här datauppsättningen visar minimal variation mellan djur, vilket motiverar genomsnittliga svar i hela populationen. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 6: Parat pulsexperiment med ett variabelt interstimulusintervall för att bedöma temporal hämning . (A) Inloppsanslutningar för mikrofluidiska enheter. Det oanvända inloppet blockeras med en solid stift (X). Styrvätskebehållaren och ventilen1 är anslutna till c1- och c2-inloppen, utelämnade här för tydlighetens skull. (B) Stimulus timing för åtta mönster. Pulserna är 1 s långa och separerade med 0-20 s. Sekvensen av mönster visas nedan; Varje mönster presenterades sex eller sju gånger. c) AWA:s neurala aktivitet från 50 försök och nio djur. En värmekarta över svar sorterade efter stimuleringsmönster visas ovan; Den genomsnittliga neurala aktiviteten för varje mönster (n = 56-63 svar) visas nedan. Temporal hämning sker i ~ 10 s efter den initiala pulsen. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 7: Fånga försöksexperiment för att bedöma disinhibition . a) Inloppsanslutningar för mikrofluidiska anordningar. En trevägs klämventil tillåter endast stimulans S1 att passera i vila och endast S2 att passera när den är aktiverad. (B) Diagram över de tre mönstersekvenser som används för att leverera de upprepade diacetylluktpulserna, med den nya stimulansen 2-metylpyrazin presenterad på plats vid den 26: e studien. (C) Genomsnittlig AWA neural aktivitetsrespons över 20 djur. Förkortningar: DA = diacetyl; 2-MP = 2-metylpyrazin. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 8: Exempel på multimodal stimulering . (A) Inloppsanslutningar för mikrofluidik, med ett oanvänt inlopp blockerat med en fast stift. En röd lysdiod lyser upp arenan ovanifrån. (B) Mönster för optisk, kemisk eller multimodal stimulering. (C) Genomsnittlig AWA neural aktivitet (n = 11 djur) för 30 upprepade studier med parad optogenetisk och kemosensorisk (överst), endast optogenetisk (mitten) och kemosensorisk (botten) stimulering. (D) Maximalt neuralt responsmedelvärde för varje prövning för optogenetiska pulser ovan och kemiska pulser nedan. De optogenetiska pulserna orsakar inte direkt anpassning, men deras svar är mottagliga för kemosensorisk anpassning. Förkortningar: DA = diacetyl. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Discussion

I detta protokoll beskriver vi ett öppet mikroskopisystem för bedömning av neurala aktivitetsfenomen med hjälp av tidsmässigt exakt leverans av olika stimulansmönster. Den mikrofluidiska plattformen levererar repeterbara stimuli samtidigt som tiotals djur hålls i mikroskopets synfält. Få kommersiella mikroskopiprogramvarupaket möjliggör enkel programmering av olika stimulustidsmönster, och de som gör det kräver ofta manuell inmatning av varje mönster eller proprietära filformat. Däremot definieras experiment i detta system av textfiler, som kan vara datorgenererade och läsbara av analysprogramvara. Här demonstrerar vi nyttan av att använda variabla stimulansmönster för att bedöma neuronala fenomen som temporal hämning, anpassning och överhörning under multimodal stimulering. Dataanalyspipelinen reducerar stora mikroskopivideofiler till neurala aktivitetsdata som kan visualiseras och analyseras för populationsvariabilitet (figur 5B), förändringar över tid (figur 7C och figur 8C, D) och förändringar efter störning (figur 7C).

En viktig fördel med automatisering är reproducerbarheten av stimulering över försöksupprepningar och mellan experiment, och det mikrofluidiska arenaformatet möjliggör minst en 20-faldig ökning av genomströmningen jämfört med tidigare metoder för ett djur ^7,9,13. Att utsätta en population av djur för samma stimulans- och miljöförhållanden säkerställer att data är jämförbara och undviker potentiella dagliga variationer i lösningsberedning, temperatur, animaliska källor eller andra faktorer. En begränsning av detta tillvägagångssätt är dock mikroskopin med låg förstoring och låg upplösning som håller alla djur i synfältet. Endast en neuron bör övervakas per djur för att minimera spårningsfel, även om neuroner separerade med minst 50 μm i princip kan särskiljas. Bilaterala neuronpar kan avbildas tillsammans om svaren förväntas vara symmetriska. Det är viktigt att först identifiera vilka specifika neuroner som är involverade i en neural process av intresse, såsom genom helhjärnavbildning⁷, och sedan uttrycka GCaMP endast i relevanta neuroner för ökad genomströmning.

Neuronala kalciumsvar varierar beroende på djur på grund av rapportöruttrycksnivåer eller andra interindividuella skillnader. Till exempel varierar normaliserade AWA GCaMP-svar dubbelt i toppstorlek, även hos isogena vildtypsdjur med kalciumreportern stabilt integrerad i genomet⁴. Vissa stimuli visar varierande svar över hela befolkningen (t.ex. butylacetat⁴), vilket tyder på variabelt receptoruttryck. I praktiken bör minst 20 enskilda djur bedömas för att bestämma populationsvariationen. Det rekommenderas att använda individuella djurdata för att öka den statistiska styrkan för att bestämma responsförändringar, till exempel genom statistisk jämförelse av individuella neurala svar parade före och efter en störning.

Med stora datamängder och automatiserade experiment är det viktigt att validera och verifiera korrekt experimentfunktion, spårning och datareduktion, särskilt för obevakade steg. Flödesmönster bör verifieras med fluorescerande lösningar (som i figur 2H) genom att observera inga bubblor eller kontrollvätska som kommer in i arenan i de inspelade videorna. Dataset bör valideras genom att till exempel notera eventuella djurförflyttningar (som i figur 5A) och verifiera smidiga neurala svar (som i figur 4C och figur 5B). Alla problematiska uppgifter bör uteslutas. Det är också viktigt att verifiera datagruppering före medelvärdet med funktionen "databrowse" för att säkerställa att det genomsnittliga svaret återspeglar enskilda svar.

Stimuleringskontrollsystemet med öppen källkod kan enkelt utökas till andra stimuli via digitala eller analoga signaler eller seriella kommunikationskommandon. Graderade stimuli kan vanligtvis styras av analoga spänningsingångar (0-5 V), såsom LED-ljusintensitet eller nervstimulatorpulsstorlek. På-av-stimuli styrs vanligtvis med digitala (TTL) signaler, såsom elektrisk stimulatortiming. Dessa digitala signaler kan också aktivera reläbrytare för att aktivera andra elektriska system, som vibrationsmotorer för mekanosensorisk stimulering. Annan utrustning använder seriell kommunikation, till exempel via USB-anslutning, med specifika teckenkommandon som överförs för att definiera åtgärder. Till exempel kan dos-responsexperiment presentera flera kemiska koncentrationer automatiskt med hjälp av en USB-styrd rotationsventil⁵ eller flerbrunnsplattsystem⁶. Dessa kommandon kan läggas till i mikroskopkontrollskript med öppen källkod som ska skickas vid specifika försöksnummer. Tidsfördröjningar kan införlivas på liknande sätt; Till exempel, för att pausa testningen i 1 timme mellan två 30 försöksstimuleringsanfall, skulle man ange ett 60-försöksexperiment och lägga till en enda kodrad för att pausa i 1 timme när försöksnumret når 31.

Den experimentella komplexiteten är praktiskt taget obegränsad och kan till och med förändras under ett experiment baserat på live-feedback i ett "slutet loop" -system. Till exempel kan stimuleringen variera i realtid baserat på neural aktivitet, djurbeteende eller annan kvantifierbar parameter. Vi använde nyligen ett sådant system för att bedöma de sensoriska neurala svaren i sovande kontra vakna djur genom att utlösa stimulering och neural inspelning efter en förändring i beteende ^8,15. Funktionen för rörelsespårning i NeuroTracker möjliggör analys av neural aktivitet hos fritt rörliga djur för korrelation med beteendeproduktion. Att spåra enskilda rörliga djur kräver dock noggrann uppmärksamhet, till exempel när de korsar vägar, och det rekommenderas därför att ladda färre djur per arena (cirka fem) för att minimera dessa interaktioner.

Sammantaget ökar dessa tekniker precisionen av stimulering och den experimentella genomströmningen för att utforska populationsvariationer och specifika neurala fenomen. Förutom att mäta neuronaktivitet är dessa metoder generaliserbara till andra biosystem, inklusive växter, som också kommunicerar via kalciumsignaler 21, neural cellodling och hjärnorganoider²², liksom till andra dynamiska fluorescerande signaler, såsom sensorer för synaptisk aktivitet, neurotransmittorfrisättning 23 och transkription²⁴.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bacterial strains
E. coli (OP50)	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	Cat# OP50
Experimental models: Organisms/strains
C. elegans strains expressing GCaMP (and optionally, Chrimson) in desired neurons	Caenorhabditis Genetics Center (CGC) or corresponding authors of published work	NZ1091, for example
Chemicals, Treatments, and Worm Preparation Supplies
2,3-Butanedione	Sigma-Aldrich	Cat# B85307	diacetyl, example chemical stimulus
Calcium chloride, CaCl2	Sigma-Aldrich	Cat# C3881
Fluorescein, Sodium salt	Sigma-Aldrich	Cat# F6377
Glass water repellant	Rain-X	Cat #800002250	glass hydrophobic treatment (single-use)
Magnesium chloride, MgCl2	Sigma-Aldrich	Cat# M2393
Nematode Growth Medium (NGM) agar	Genesee	Cat #: 20-273NGM
Petri dishes (60 mm)	Tritech	Cat #T3305
Poly(dimethyl siloxane) (PDMS): Sylgard 184	Dow Chemical	Cat# 1673921
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	Cat# P5655
Potassium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	Cat# P8281
Sodium chloride, NaCl	Sigma-Aldrich	Cat# S7653
(tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane (TFOCS)	Gelest	CAS# 78560-45-9	glass hydrophobic treatment (durable)
Software and algorithms
Arduino IDE	Arduino	https://www.arduino.cc/en/software
ImageJ	NIH	https://imagej.nih.gov/ij/
MATLAB	MathWorks	https://www.mathworks.com/products/matlab.html
Micro-manager	Micro-manager	https://micro-manager.org/
Microscope control software	Albrecht Lab	https://github.com/albrechtLab/MicroscopeControl
Neurotracker data analysis software	Albrecht Lab	https://github.com/albrechtLab/Neurotracker
Automated Microscope and Stimulation System
Axio Observer.A1 inverted microscope set up for epifluorescence (GFP filter cubes, 5× objective or similar)	Zeiss	Cat #491237-0012-000
Excelitas X-cite XYLIS LED illuminator	Excelitas	Cat #XYLIS
Orca Flash 4.0 Digital sCMOS camera	Hamamatsu	Cat #C11440-22CU
Arduino nano	Arduino	Cat #A000005
3-way Miniature Diapragm Isolation Valve (LQX12)	Parker	Cat #LQX12-3W24FF48-000	Valve 1: Control
2-way normally-closed (NC) Pinch Valve	Bio-Chem Valve Inc	Cat #075P2-S432	Valve 2: Outflow
3-way Pinch Valve	NResearch	Cat #161P091	Valve 3: Stimulus selection
Optogenetic stimulation LED and controller (615 nm)	Mightex	Cat #PLS-0625-030-S and #SLA-1200-2
ValveLink 8.2 digital/manual valve controller	AutoMate Scientific	Cat #01-18
Wires and connectors	various	See Fig. 2 of Cell STARS Protocol (Lawler, 2021)
Microfluidic Device Preparation
Dremel variable speed rotary cutter 4000	Dremel	Cat #F0134000AB	Set speed to 5k RPM for cutting glass
Dremel drill press rotary tool workstation	Dremel	Cat #220-01
Diamond drill bit	Dremel	Cat #7134
Glass slide, 1 mm thick	VWR	Cat #75799-268
Glass scribe (Diamond scriber)	Ted Pella	Cat #54468
Luer 3-way stopcock	Cole-Parmer	Cat #EW-30600-07
Luer 23 G blunt needle	VWR	Cat #89134-100
Microfluidic device	Corresponing author or fabricate from CAD files associated with this article	N/A
Microfluidic device clamp	Warner Instruments (or machine shop)	P-2
Microfluidic tubing, 0.02″ ID	Cole-Parmer	Cat #EW-06419-01
Tube 19 G, 0.5″	New England Small Tube	Cat #NE-1027-12