Summary
Atlar olağanüstü bir aerobik egzersiz kapasitesine sahiptir, bu da at iskelet kasını hem at egzersiz fizyolojisi hem de memeli mitokondriyal fizyolojisi çalışmaları için önemli bir doku haline getirir. Bu makalede, at iskelet kasında mitokondriyal fonksiyonun kapsamlı değerlendirilmesi için teknikler açıklanmaktadır.
Abstract
Mitokondriyal fonksiyon - oksidatif fosforilasyon ve reaktif oksijen türlerinin oluşumu - hem sağlık hem de hastalıkta kritik öneme sahiptir. Bu nedenle, mitokondriyal fonksiyonun ölçülmesi biyomedikal araştırmalarda esastır. İskelet kası, özellikle atlar gibi çok yüksek aerobik kapasiteye sahip hayvanlarda sağlam bir mitokondri kaynağıdır ve bu da onları mitokondriyal fizyolojiyi incelemek için ideal konular haline getirir. Bu makale, farklı mitokondriyal durumlar altında substratları oksitleme kapasitesini ölçmek ve mitokondriyal solunumun farklı elementlerinin göreceli kapasitelerini belirlemek için eşzamanlı florometri ile yüksek çözünürlüklü respirometrinin kullanımını göstermektedir. Tetrametilrhodamine metilester, eşzamanlı oksijen akışı birimi başına üretilen nispi membran potansiyelini hesaplayarak mitokondrinin nispi verimliliğinin hesaplanması da dahil olmak üzere, substrat oksidasyonundan kaynaklanan mitokondriyal membran potansiyelinin üretimini göstermek için kullanılır. ADP'nin ATP'ye dönüşümü, magnezyum için adenilatların farklı afiniteleri nedeniyle reaksiyon odasındaki magnezyum konsantrasyonunda bir değişikliğe neden olur. Bu nedenle, magnezyum yeşili, ATP sentez hızını ölçmek için kullanılabilir ve oksidatif fosforilasyon verimliliğinin daha fazla hesaplanmasına izin verir (fosforilasyonun oksidasyona oranı [P / O]). Son olarak, hidrojen peroksit ile kombine edildiğinde bir floresan ürün (resorufin) üreten Amplex UltraRed'in kullanımı, mitokondriyal solunum sırasında reaktif oksijen türlerinin üretiminin nicelleştirilmesine ve ROS üretimi ile eşzamanlı solunum arasındaki ilişkiye izin verir. Bu teknikler, mitokondriyal fizyolojinin çeşitli simüle edilmiş koşullar altında sağlam bir şekilde nicelleştirilmesine izin verir, böylece bu kritik hücresel bileşenin hem sağlığa hem de hastalığa katkısına ışık tutar.
Introduction
Ökaryotik hücrelerin mitokondrileri, hücreler tarafından iş ve bakım için kullanılan ATP'nin çoğunu üretir1. ATP'nin mitokondriyal üretiminde önemli bir adım, oksijenin suya dönüştürülmesidir ve bu nedenle mitokondri ve ilişkili hücrelerin metabolik kapasitesi, oksijen tüketiminin ölçülmesiyle sıklıkla ölçülür2. Bununla birlikte, mitokondriyal fizyoloji, basit oksijen tüketimi sürecinden daha karmaşıktır ve bu son noktaya güvenmek, mitokondriyal fonksiyonun ve işlev bozukluğunun hücresel sağlık üzerindeki etkisinin eksik bir değerlendirmesini sağlar. Mitokondriyal fonksiyonun tam karakterizasyonu, sadece oksijen tüketiminin değil, aynı zamanda ATP ve reaktif oksijen türlerinin (ROS) üretiminin de değerlendirilmesini gerektirir.
Anahtar mitokondriyal fonksiyonların ek ölçümleri, spesifik floroforların kullanımı yoluyla solunum ölçümü ile eşzamanlı olarak gerçekleştirilebilir. Tetrametilrhodamine methylester (TMRM), mitokondriyal matriste mitokondriyal transmembran voltaj potansiyeli ile orantılı olarak biriken ve bu birikim nedeniyle floresan yoğunluğunda bir azalmaya neden olankatyonik bir florofordur 3. TMRM, mitokondriyal membran potansiyelindeki göreceli değişikliklerin bir göstergesi olarak kullanılabilir veya floresan sinyalinin mV'ye dönüştürülmesine izin veren sabitleri belirlemek için ek deneylerle transmembran voltajındaki hassas değişiklikleri ölçmek için kullanılabilir. Magnezyum yeşili (MgG), Mg2 + ile bağlandığında floresan olan bir florofordur ve magnezyum iki değerli katyon4 için ADP ve ATP'nin diferansiyel afinitesine dayanan ATP sentezinin ölçümleri için kullanılır. Araştırmacılar, MgG floresanındaki değişiklikleri ATP konsantrasyonundaki bir değişikliğe dönüştürmek için spesifik analitik koşullar altında hem ADP hem de ATP için spesifik afinite / ayrışma sabitlerini (Kd) belirlemelidir. Amplex UltraRed (AmR), mitokondriyal solunum sırasında hidrojen peroksit ve diğer ROS üretimini ölçmek için kullanılan florofordur5. H2O2ve AmR (yaban turpu peroksidaz tarafından katalize edilen) arasındaki reaksiyon, 530 nM'de floresan yoluyla tespit edilebilen resorufin üretir. Bu testlerin her biri, mitokondriyal fizyolojinin ilgili yönlerinin eşzamanlı ölçümlerini sağlamak için gerçek zamanlı mitokondriyal solunum tahlillerine ayrı ayrı eklenebilir, böylece solunum ve mitokondriyal çıktı arasında doğrudan bir bağlantı sağlanır.
Atlar, kısmen at iskelet kasının çok yüksek mitokondriyal içeriğinden dolayı çok yüksek oranda kütleye özgü oksijen tüketimi yeteneğine sahiptir ve bu dokuyu mitokondriyal fizyolojiyi incelemek için oldukça alakalı hale getirir. Yüksek çözünürlüklü respirometrinin gelişmesiyle birlikte, bu yeni teknolojiyi kullanan çalışmalar, at iskelet kası mitokondrisinin hem atların olağanüstü egzersiz kapasitesine hem de iskelet kası hastalıklarının patofizyolojisine katkılarını tanımlamaya yardımcı olmuştur 6,7,8,9,10,11,12,13,14 . At iskelet kası mitokondriyal fonksiyonu üzerine yapılan çalışmalar özellikle avantajlıdır, çünkü bu dokunun büyük miktarlarının elde edilmesi terminal değildir. Bu nedenle, at denekleri sadece mitokondriyal fonksiyonun tam karakterizasyonu için yeterli doku sağlamakla kalmaz, aynı zamanda mitokondriyal fizyolojiye yüksek kaliteli, mekanik çalışmalar için uzunlamasına kontroller olarak da hizmet eder. Bu nedenle, at iskelet kasında mitokondriyal fizyolojinin daha sağlam bir karakterizasyonunu sağlamak için mitokondriyal membran potansiyelini, ATP sentezini ve bu dokudaki oksijen tüketiminin ölçümünü tamamlayan ROS üretimini ölçmek için ek testler geliştirilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışma Oklahoma Eyalet Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. Bu çalışmada temsili sonuçları üretmek için dört safkan jel (17.5 ± 1.3 yıl, 593 ± 45 kg) kullanılmıştır.
1. İskelet kası biyopsi örneğinin alınması
- Hafif sedasyon altındayken 12 G University College Hospital (UCH) biyopsi iğnesi (bakınız Malzeme Tablosu) kullanarak ve daha önce yayınlanmış bir raporu takiben lokal anestezi kullanarak, semitendinosus kasının (veya diğer ilgili kasların) merkezinden iskelet kası biyopsileri (steril tekniği izleyin) elde edin11.
- Biyopsi örneklerini derhal buz gibi soğuk biyopsi taşıma ortamı çözeltisi (2.77 mM CaK 2-EGTA, 7.23 mM K 2-EGTA, 20 mM imidazol, 20 mM taurin, 50 mM K-MES, 0.5 mM ditiyotreitol, 6.56 mM MgCl2, 5.77 mM ATP ve 15 mM fosfokreatin, pH 7.1'e ayarlanmış; bkz. Analiz için laboratuvara nakliye.
NOT: Biyopsi nakil ortamının hazırlanmasıyla ilgili özel talimatlar için Doerrier ve ark.15'e bakınız. - Mitokondrileri, üreticinin talimatlarına göre ticari bir kit kullanarak biyopsi örneklerinden izole edin (bkz. Son depolama tamponu, respirometri testinin bir parçası olan ADP, ATP ve süksinat gibi substratlar içermemelidir.
- Mitokondri izolasyonu için kullanılan 100 mg kas başına 80 μL süspansiyon ortamı (225 mM mannitol, 75 mM sakkaroz ve 1 mM EGTA; bakınız Malzeme Tablosu) kullanarak izole mitokondrinin son peletini yeniden askıya alın.
- Biyopsi prosedüründen mitokondri izolasyonuna kadar olan süreyi en aza indirin ve numuneleri yüksek çözünürlüklü respirometrelere eklenene kadar işleme adımları boyunca 0-4 ° C'de tutun.
NOT: Ön çalışmalar, izole mitokondri süspansiyonlarının 0-4 ° C'de tutulduğunda yaklaşık 2 saat sonra fonksiyonel kapasitesini kaybetmeye başladığını bulmuştur.
2. Yüksek çözünürlüklü respirometrenin kurulumu
- Yüksek çözünürlüklü respirometreler, mitokondriyal solunum ve ilişkili süreçleri ölçmek için kullanılır. Respirometreyi kontrol etmek, sensörleri kalibre etmek ve ham verileri toplamak için üretici tarafından sağlanan yazılım kontrol programını kullanın (bkz. Her test koşulu için örnekleri yinelenen olarak analiz edin.
NOT: Her durumda, bu protokolde açıklanan önerilen titrasyonlar ve nihai reaktif konsantrasyonları 2 mL'lik bir sspirometri odasına dayanmaktadır. - Üreticinin talimatlarını izleyerek ditionitin seri titrasyonuyla her 2-4 haftada birO2 sensörünün arka planınıO2 akısını ve sıfır noktasını belirleyin. Kalibrasyon tekrarlanana kadar sonraki tahliller için bu kalibrasyon sabitlerini koruyun.
NOT: O2'nin mitokondriye difüzyon sınırlamasını önlemek için hiperoksinin (250-500 μM) gerekli olduğu geçirgen kas lifleri11,12,13,16 kullanılarak daha önce yayınlanmış prosedürlerin aksine, izole mitokondri 50-200 μM O2 aralığı kullanılarak değerlendirilebilir. Bu, mitokondriyal süspansiyonu eklemeden önce (yani, günlük tek noktalı kalibrasyonu takiben) solunum ortamının oda havasıyla dengelenmesine izin vererek elde edilebilir. Benzer şekilde, solunum odasının yeniden oksijenlenmesi, oksijen konsantrasyonunu istenen seviyeye yükseltmek için yeterli ortam oksijeni respirometri ortamına çözünene kadar odayı açarak gerçekleştirilebilir. - Respirometre odalarını magnezyumsuz ortamlarla doldurun (0,5 mM EGTA, 60 mM K-laktobiyonat, 20 mM taurin, 10 mM KH2PO4, 20 mM HEPES, 110 mM sakkaroz ve 1 g/L sığır serum albümini [BSA] esas olarak yağ asidi içermez, pH 7,1'e ayarlanır; bkz.
NOT: Solunum ortamının hazırlanmasıyla ilgili özel talimatlar için Komlodi ve ark.17'ye bakınız.- At iskelet kasının bazal sıcaklığını temsil etmek için alet inkübasyon sıcaklığını 38 ° C'ye ayarlayın ve respirometre odasının dibinde dönen manyetik bir karıştırıcı kullanarak solunum ortamının karıştırılmasını 800 rpm'ye ayarlayın.
- Floresan sensörlerle etkileşimi önlemek için oda aydınlatmasını kapatın.
- Oksijen elektroduna 800 mV polarizasyon voltajı ile enerji verin ve elde edilen sinyali 1 kazanç ayarıyla yükseltin.
- Oksijen konsantrasyonunu her 2 saniyede bir kaydedin, oksijen akışını önceki 40 s (20 veri noktası) boyunca oksijen ölçümünün negatif eğimi olarak hesaplayın ve pmol x s-1 x mL inkübasyon çözeltisi olarak raporlayın.
- Ortamın oda havasıyla dengelenmesini sağlayarak oksijen sensörünü kalibre edin. Yüksek çözünürlüklü respirometre ve standart atmosferik oksijen konsantrasyonu ile ölçülen barometrik basınca dayanarak referans oksijen kısmi basıncını hesaplayın.
3. TMRM kullanılarak mitokondriyal membran potansiyelinin ölçülmesi
- Solunum odasından gelen floresan sinyalini ölçmek için "Yeşil" floresan sensörleri (530 nm baskın dalga boyu) kullanın. Sensörlere 400-500 mV'de enerji verin; Ortaya çıkan sinyal 1:1.000'lik bir kazançla güçlendirilir.
NOT: Sensörün lineer aralığında beklenen sinyali yakalamak için her bir cihaz için belirli ayarlar optimize edilmelidir. - Mitokondri ilavesinden önce TMRM (2 μM'lik nihai konsantrasyon için 4 μL 1 mM çözelti; bakınız Malzeme Tablosu) ekleyin.
- Mitokondri ilavesinden önce, eklenen florofor miktarına (mM) karşı floresan sinyalinin (voltaj) basit iki noktalı kalibrasyonunu kullanarak floresan sinyalini kalibre edin.
NOT: Bu sinyali kalibre etmek için makine kontrol yazılımındaki floresan sinyal kalibrasyon işlevini kullanın. Floresan probundan gelen ham sinyalin, kalibrasyonun ikinci noktasını kaydetmek için stabilize edilmesi 30 dakika veya daha fazla sürebilir. - Respirometri titrasyon protokolünün tamamlanmasından sonra, mitokondriyal membran potansiyelinin tamamen çöktüğünü gösteren TMRM floresan sinyalinde daha fazla artış gözlenmeyene kadar birkaç ayırma maddesi titrasyonu (karbonil siyanür m-klorofenil hidrazon; titrasyonda 2 μL) vererek TMRM sinyalinin son kalibrasyonunu gerçekleştirin (Şekil 1).
NOT: Bu floresan sinyal değeri, 0 mV transmembran potansiyeline eşit kabul edilir ve respirometri titrasyon protokolü sırasında kaydedilen bağıl membran potansiyel değerleri için referans noktası olarak kullanılır.
4. Magnezyum yeşili (MgG) kullanarak ATP üretiminin ölçülmesi
- Solunum odasından gelen floresan sinyalini ölçmek için "Mavi" floresan sensörleri (465 nm baskın dalga boyu) kullanın. Bu sensörlere, sensörün doğrusal aralığında beklenen sinyali yakalamak için ayrı ayrı cihazlar için enerji verin.
- Mitokondri ilavesinden sonra, ancak herhangi bir substrat eklenmeden önce MgG floresan sinyalinin kimyasal kurulumunu ve kalibrasyonunu gerçekleştirin. MgG'ye bağlanmak için Mg 2+ ile rekabet edebilecek katyonları (özellikle Ca2+) şelatlamak için respirometri odasına 8 μL 2 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ekleyin, ardından solunum odasına 4 μL 1 mM MgG (1.1 μM) ekleyin.
- Ham floresan sinyalini 100 mM MgCl 2'lik 10 x 2 μL sıralı titrasyonlarla kalibre ederek floresan sinyalinin stabilizasyonu için titrasyonlar arasında 1 dakika bekleyin (Şekil 2).
NOT: Tahlilin tamamlanmasının ardından ve makinenin üreticisi ve ilgili yazılım tarafından sağlanan şablonlar kullanılarak çevrimdışı olarak tamamlanan bu işlem, floresan sinyaline (beklenen r2 > 0.98) ikinci dereceden bir magnezyum konsantrasyonu eğrisi üretir ve bu eğri, respirometri odasına eklenen bilinen miktarda ADP ve karşılık gelen ATP11 konsantrasyonunu belirlemek için daha önce belirlenen Kd değerleri ile kullanılacaktır. - Protokol boyunca ATP konsantrasyonunun zaman içindeki eğimi olan ATP sentezinin hızını belirleyin (Şekil 3).
5. Amplex UltraRed (AmR) kullanarak ROS'un mitokondriyal üretiminin ölçülmesi
- Solunum odasından gelen floresan sinyalini ölçmek için "Yeşil" floresan sensörleri (530 nm baskın dalga boyu) kullanın. Sensörlere 300-400 mV'da enerji verin; Ortaya çıkan sinyal 1:1.000'lik bir kazançla güçlendirilir. Sensörün lineer aralığında beklenen sinyali yakalamak için her bir cihaz için özel ayarları optimize edin.
NOT: MgCl 2 olmadan solunum ortamı kullanılıyorsa, AmR testi için reaktifler eklenmeden önce bu eklenmelidir (1-3 μM MgCl2 üretmek için 100 mM MgCl2'nin 20-60 μL'si). - Mitokondri ilavesinden önce AmR testinin kimyasal kurulumunu ve ilk kalibrasyonunu gerçekleştirin. Reaksiyona müdahale edebilecek katyonları şelatlamak için 30 μmol DTPA (6 μL 5 mM çözeltisi) ekleyin, ardından süperoksit dismutaz (süperoksit anyonları reaktif oksijen üretiminin daha kapsamlı bir tespitiiçin H2O2'yedönüştürmek için 5.000 U / mL'lik bir stok çözeltisinin 2 μL'si), yaban turpu peroksidazı (500 U / mL stok çözeltisinin 5 μL'si), ve respirometri odasında sırasıyla 5 U/mL, 1 U/mL ve 10 μM üretmek için Amplex UltraRed (10 mM stok çözeltisinin 2 μL'si) (Malzeme Tablosuna bakınız).
- Floresan sinyalinin stabilize olmasına izin verin, ardından yaklaşık 5 dakika arayla iki kez 0,2 μmol hidrojen peroksit (günde taze yapılan 40 μM çözeltinin 5 μL'si) ekleyin.
NOT: H2O2'nin iki titrasyonundan önceki ve sonraki floresan sinyali, sistemin üç noktalı doğrusal kalibrasyon eğrisini (beklenen r2 > 0,95) sağlar ve eğimi, floresan sinyali ile H2O2'ninüretimi (veya eklenmesi) arasındaki ilişkiyi raporlamada sistemin genel tepkisini yansıtır. Bu sinyali kalibre etmek için makine kontrol yazılımındaki floresan sinyal kalibrasyon işlevini kullanın. - Tahlil boyunca ek iki noktalı kalibrasyonlar (günlük olarak taze yapılan 40 μM'lik bir çözeltinin 5 μL'si) gerçekleştirin, böylece respirometrinin kimyası tahlil boyunca değiştikçe tahlilin tepkisinin ayarlanmasına izin verin, bu kalibrasyon noktalarının spesifik zamanlaması araştırmacının takdirine bağlı olarak (Şekil 4).
6. Mitokondriyal solunum ölçümü
- Her 2 mL inkübasyon odasına 15 μL izole mitokondri süspansiyonu (adım 1.4) ekleyin, böylece sonuçlar 18.75 mg kasın mitokondriyal verimini temsil eder. Kuluçka odasını kapatın. Numunenin homojen bir süspansiyonunu korumak için numuneyi her titrasyonun arasında vorteks yapın.
- Herhangi bir substrat eklenmeden önce artık oksijen tüketimini (ROX) ölçün. Bu değeri (tipik olarak 0,2 pmol O2 x s-1 x mL-1'den az), protokolün tamamlanmasından sonra substrat/uncoupler/inhibitör titrasyon (SUIT) protokolü11'deki her adımın oksijen tüketim değerlerinden çıkarın.
NOT: Hem oksijen sensöründen hem de floresan sensöründen gelen sinyallerin en az 1 dakika boyunca stabilize olmasına izin verilmesi çok önemlidir (birincil sensör sinyallerinin kararlı hesaplanan eğimi ile değerlendirildiği gibi), çünkü genel solunum durumu titrasyonlar tarafından güvenilir sonuçlar elde etmek için değiştirilir. Bu, tüm titrasyon adımları için geçerlidir. - At iskelet kası mitokondriyal fonksiyonunun ilk karakterizasyonuna izin veren genel amaçlı bir SUIT kullanın. Nikotinamid adenin dinükleotid (NADH) üretmek ve Kompleks I (LN) yoluyla oksitlenen NADH tarafından desteklenen fosforilasyon olmayan (sızıntı) solunumu uyarmak için her odaya sırasıyla piruvat (5 μL 2 M sulu çözelti), glutamat (10 μL 2 M sulu çözelti) ve malat (10 μL 0,4 M sulu çözelti) (bkz. Şekil 3 ve Şekil 4).
- Kompleks I (PN) yoluyla fosforilasyon solunumunu uyarmak için ADP (20 μL 500 mM sulu çözelti; bakınız Malzeme Tablosu) ekleyin.
- Kompleks I ve Kompleks II (PN + S) kombinasyonu yoluyla fosforilasyon solunumu üretmek için süksinat (20 μL 1 M sulu çözelti; bakınız Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin.
NOT: Hem Kompleks I hem de Kompleks II yoluyla solunumun kombinasyonu ile, oksijen tüketimi, inkübasyon ortamında çözünen oksijenin çoğunu tüketecek kadar yüksek olabilir. O2 konsantrasyonu 50 μM'nin altına düşerse, ölçülenO2 konsantrasyonu 150 μM'nin üzerine çıkana kadar inkübasyon odasının kapağını açarak inkübasyon ortamını yeniden oksijenlendirin. mitokondriyal solunum için yeterliO2'yi korumak için bu adımı gerektiği gibi tekrarlayın. - Kompleks I'i bloke etmek için rotenon (2 μL 0.1 mM etanol çözeltisi; bakınız Malzeme Tablosu) ekleyin. Ortaya çıkan oksijen akısı, Kompleks II'nin tek başına süksinatın oksidasyonu yoluyla mitokondriyal oksijen tüketimini destekleme kapasitesini temsil eder (PS).
DİKKAT: Rotenon zehirli bir maddedir. Standart laboratuvar güvenliğini kullanın ve yutulmasından veya solunmasından kaçının. - Tek bir biyopsinin alikotlarını içeren bireysel respirometri odaları arasında belirli bir deneysel durum için ortalama değeri hesaplayın.
NOT: Akı kontrol oranları (FCR'ler) gibi türetilmiş hesaplamalar, farklı yollardaki göreli değişiklikleri tanımlamada değerlidir ve FCRSızıntısı (L N / P N), FCR N (P N / P N + S) ve FCRS (P S / P N + S) içerir. Hesaplanan oksidatif fosforilasyon verimliliği (1-LN / PN + S), toplam solunum kapasitesine göre ayarlanmış kaçak solunumun genel etkisinin bir tahminini sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Önerilen referans durumu, sağlıklı bir sedanter safkan (zorunlu egzersiz nedeniyle artan zindelik yok) ve postüral kasın merkezinden toplanan, mitokondri bakımından zengin tip I iskelet kası liflerinin yüksek bir yüzdesini içeren ve dinlenme metabolizmasına yaklaşan koşullar altında inkübe edilen taze bir kas örneğidir (yani, 38 ° C ve pH 7.0). Bu koşullar altında, araştırmacı L N değerleri 2.71 ± 0.90, PN değerleri 62.40 ± 26.22, PN+S değerleri 93.67 ± 34.76 ve PS değerleri 46.93 ± 14.58 pmol O2 x s-1 x mL-1 (Şekil 3 ve Şekil 4). TMRM ile inkübe edilen mitokondrinin solunum değerleri, floroforun inhibitör etkisinden dolayı daha düşüktür (Şekil 1). FCRSızıntısı, FCRN ve FCRS sırasıyla 0,05 ± 0,01, 0,66 ± 0,07 ve 0,51 ± 0,07'dir. Hesaplanan oksidatif fosforilasyon verimliliği 0.97 ± 0.01'dir. Bu solunum durumları için mutlak değerler, bireysel deneğe ve doku oksidatif kapasitesine bağlı olarak değişir, ancak bu değerlerin göreceli paterni, geçirgenleştirilmiş at iskelet kası liflerinden yayınlanan sonuçlarla tutarlıdır (yani, spesifik substratların eklenmesiyle solunumdaki artışlar, Kompleks I ve Kompleks II yoluyla solunumun kombinasyonu, elektron transfer sisteminin doygunluğu nedeniyle bu elektron kaynaklarının her birinden ayrı ayrı daha azdır [ETS] aşağı akış kapasitesi). İzole at iskelet kası mitokondrisinin hesaplanan etkinliği, permeabilize at iskelet kası lifleri için bildirilen karşılık gelen değerlerle tutarlıdır11.
ATP sentez hızının mitokondri izolatında kullanılan mg kaynak doku başına PN solunumunda 438.59 ± 397.10 pM x s-1, PN+S solunumunda 383.18 ± 397.19 ve PS solunumu için 172.07 ± 125.60 olması beklenmektedir. Süksinat ilavesiyle ATP sentezindeki azalma muhtemelen, ETS'nin kinon kavşağındaki iki elektron beslemesi ile rekabetten kaynaklanmaktadır; Kompleks II'den gelen besleme (mitokondriyal membran potansiyeline doğrudan katkıda bulunmayan), elektronların akışını Kompleks I yoluyla azaltmaktadır (bu, protonların iç mitokondriyal membran boyunca pompalanması yoluyla mitokondriyal membran potansiyeline doğrudan katkıda bulunur).
Mitokondri izolatında kullanılan mg kaynak doku başına H2O2 üretim hızının L N solunumunda 0,079 ±± 0,095 nmol.s-1, PN solunumunda 0,021 0,043, PN+S solunumunda 0,026 ± 0,056ve Ps solunumu için 0,237 ± 0,248 olması beklenmektedir (Şekil 4). ROS üretiminin nispi oranı, mitokondriyal membran potansiyelinin öngörülen büyüklüğü ve yüksek membran potansiyeli ile ROS üretimi arasındaki ilişki ile tutarlıdır. Bu ilişkinin istisnası, solunum sadece Kompleks II yoluyla gerçekleştiğinde, rotenon tarafından bloke edildiğinde elektronların kinon kavşağından Kompleks I'e geri akışı nedeniyle çok yüksek ROS üretimidir.
Şekil 1: At iskelet kası mitokondriyal solunumunun ve göreceli membran potansiyelinin temsili yüksek çözünürlüklü respirometri izi. Üst pencere, zaman içindeki oksijen konsantrasyonu (sol Y ekseni) ve oksijen akısıdır (sağ Y ekseni) (X ekseni); alt pencere, oda TMRM floresansı (sol Y ekseni) ve zaman içinde floresan sinyali değişim hızı (sağ Y ekseni) (X ekseni). Dikey işaretler, odaya spesifik substratların eklenmesini gösterir (mt: mitokondri süspansiyonu; P: piruvat; G: glutamat; M: malat; D: ADP; S: süksinat; R: rotenon; CCCP: Karbonil siyanür m-klorofenil hidrazon). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Magnezyum yeşili için oda floresan sinyalinin kalibrasyonunun temsili yüksek çözünürlüklü respirometri izi ve magnezyum ve adenilatlar için Kd tayini. Oda MgG floresansı (sol Y ekseni) ve floresan sinyal değişim hızı (sağ Y ekseni) zaman içinde (X ekseni). İlk dikey işaretler, odaya spesifik substratların eklendiğini gösterir (MgG: Magnezyum yeşili; mt: mitokondri süspansiyonu; P: piruvat; G: glutamat; M: malat; S: süksinat; EDTA: etilendiamintetraasetik asit). Bunu, floresan sinyalini artıran otomatik bir titrasyon pompası (TIP) kullanılarak MgCl2'nin seri titrasyonu, ardından floresan sinyalini azaltan bir adenilatın (bu durumda ATP) seri titrasyonu izler. MgCl2'nin titrasyonu, MgG sinyalini kalibre etmek için her tahlilin başında da kullanılır, ancak mitokondri ve P, G, M ve S gibi respirometri substratlarının eklenmesinden önce gerçekleştirilir .
Şekil 3: At iskelet kası mitokondriyal solunumu ve ATP sentezinin temsili yüksek çözünürlüklü respirometri izi. Üst pencere, zaman içindeki oksijen konsantrasyonu (sol Y ekseni) ve oksijen akısıdır (sağ Y ekseni) (X ekseni); alt pencere, zaman içinde (X ekseni) oda MgG floresan (sol Y ekseni) ve floresan sinyali değişim hızı (sağ Y ekseni) 'dir. Dikey işaretler, odaya spesifik substratların eklenmesini gösterir (mt: mitokondri süspansiyonu; P: piruvat; G: glutamat; M: malat; D: ADP; S: süksinat; R: rotenon). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 4: At iskelet kası mitokondriyal solunumunun temsili yüksek çözünürlüklü respirometri izi veH2O2üretimi. Üst pencere, zaman içindeki oksijen konsantrasyonu (sol Y ekseni) ve oksijen akısıdır (sağ Y ekseni) (X ekseni); alt pencere, oda resorufin floresansı (sol Y ekseni) ve zaman içinde floresan sinyali değişim hızı (sağ Y ekseni) (X ekseni). Dikey işaretler, odaya spesifik substratların eklenmesini gösterir (mt: mitokondri süspansiyonu; P: piruvat; G: glutamat; M: malat; D: ADP; S: süksinat; R: rotenon). Ayrıca, H2O2kullanılarak floresan sinyalinin üç adet tahlil içi iki noktalı kalibrasyonu dadahildir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yüksek çözünürlüklü respirometrenin standart çıkışına floresan sinyallerin eklenmesi, mitokondriyal fizyoloji hakkında değerli bilgiler sağlar, ancak floresan sinyalinin titiz kalibrasyonu kalite verileri için kritik öneme sahiptir. MgG kullanımı için orijinal protokoller, magnezyum-adenilat ayrışma sabitleri hesaplanırken üretilen kalibrasyon eğrilerinin sonraki tahlillere uygulanabileceğini düşündürmektedir4; Bununla birlikte, MgG'den gelen floresan sinyali, bu yaklaşım için tahlilden tahlilden tahlile yeterince tekrarlanamayabilir. Bu nedenle, her bir tahlil otomatik bir MgCl2 titrasyonu ve bu bireysel tahlil için ATP sentezini hesaplamak için ortaya çıkan kalibrasyon eğrisi ile kalibre edilir. Ayrıca, magnezyum ve hem ADP hem de ATP için Kd (ayrışma sabitleri), ATP sentez hızının türetilmesinin doğru olmasını sağlamak için, spesifik doku, inkübasyon koşulları ve fosforilasyon solunumu üreten substratlar dahil olmak üzere tahlilin spesifik koşulları için hesaplanmalıdır. AmR testindeki değişkenlik daha yaygın olarak tanınmaktadır15,17 ve protokol sırasında araştırmacının takdirine bağlı olarak protokole birkaç ayrı yeniden kalibrasyon noktası eklemek yaygındır. At iskelet kası kullanılarak elde edilen geçmiş veriler, tahlilin tipik yanıtının ilk kalibrasyon noktasında (numunenin eklenmesinden önce) yaklaşık 0.646 V / mMH2O2 olduğunu ve tahlil süresi boyunca% 8 -% 15 oranında azalabileceğini göstermektedir. Bu nedenle, ROS üretimindeki nispeten küçük değişikliklerin tespiti için AmR testinin sık sık yeniden kalibrasyonu gereklidir ve her titrasyon protokolü için protokol içindeki nokta kalibrasyonlarının zamanlaması belirlenmelidir.
Araştırmacılar, bir sonraki titrasyon adımına ne zaman geçileceğini belirlerken tahlil performansı boyunca dikkatli bir muhakeme kullanmalıdır. İdeal olarak, gerçek zamanlı olarak üretilen ilgili sinyaller (O2 akısı, TMRM'nin floresansı ve MgG ve resorufin floresan sinyalindeki değişim oranı) kararlı olmalı ve oda içinde kararlı bir durumu göstermelidir, ancak bu, kabul edilebilir kararlılığı neyin oluşturduğuna dair araştırmacı tarafından yapılan bir yargı çağrısıdır. Şu anda, bu karar için yaygın olarak tutulan bir standart yoktur; Bununla birlikte, araştırmacılar, hem kararlı bir durumun kurulması için yeterince uzun süre bekleyememekten (amaçlanan solunum durumunu kusurlu bir şekilde karakterize eden verilerle sonuçlanır) hem de substratların tükenmesi ve tahlilin artık güvenilir olmaması için çok uzun süre beklemekten kaynaklanan risklerin farkında olmalıdır. Yazarın deneyimlerine göre, herhangi bir substrat titrasyonundan sonraki 30 dakika içinde kararlı bir sinyal elde edememek, biyolojik olmayan bir şekilde davranan bir numunenin (veya makinenin) kanıtıdır ve tahlil atılmalıdır.
Mitokondriyal fizyolojiyi ölçmek için bu yaklaşımı kullanan sonuçlar, tipik bir varyasyon katsayısı% 30 -% 40 arasında önemli bir özneler arası değişkenlik göstermektedir. Buna karşılık, geçirgenleştirilmiş at iskelet kası liflerinin analizi,% 19 -% 20 11'lik bir CV ile sonuçlanır, bu da mitokondri izole etme sürecinin, belirgin denekler arası değişkenliğe ek olarak sonraki analize önemli değişkenlik getirdiğini düşündürmektedir. İkincisinin etkisi, mümkün olduğunda deneklerin kendi kontrolleri olarak kullanılmasıyla hafifletilebilse de, birincisi ancak izolasyon tekniğine dikkat edilerek en aza indirilebilir. Deneysel tasarım tek bir biyopsiden deneysel kopyalara izin vermiyorsa, araştırmacı respirometri verilerini farklı örneklerdeki mitokondriyal içerikteki farklılıkları yansıtan bir düzeltme faktörüne göre ifade etmeyi seçebilir. En yaygın düzeltme faktörleri, numunenin protein içeriği ve sitrat sentaz aktivitesidir. Bununla birlikte, bu alanda aktif olan bilim adamlarının yakın tarihli bir fikir birliği açıklamasında belirtildiği gibi, bu ayarlamayı gerçekleştirmek için evrensel olarak üzerinde anlaşmaya varılan tek bir yöntem yoktur18. Protein içeriği ve / veya sitrat sentaz aktivitesi için düzeltme, at iskelet kası dokusu12,13 için kullanılan en yaygın iki yaklaşımdır, ancak her ikisinin de eksiklikleri vardır. Mitokondriyal fonksiyonu yorumlamak için farklı deneysel tasarımların verileri hem iç (yani akı kontrol oranları) hem de dış (protein, enzim aktivitesi, diğer mitokondriyal belirteçler) aracılığıyla ifade etmesi gerekebilir.
Tarif edilen protokol, birkaç önemli farkla birlikte geçirgen kas liflerinin kullanımına dayanmaktadır. Permeabilize lif tahlilleri daha küçük biyopsiler gerektirir, çünkü at iskelet kası geçirgen liflerinin yüksek çözünürlüklü respirometrisi tipik olarak her odada sadece ~ 2 mg numune kütlesi ile gerçekleştirilir 6,7,8,9,10,11. Buna karşılık, burada açıklanan protokol, her odada yaklaşık 10 kat daha fazla lif kütlesine eşdeğerdir. Bu fark, taze dokudan mitokondriyal izolasyonun verimsizliğini vurgulamaktadır. Bu verimsizliğin olası bir nedeni, kontraktil protein ağı içinde bulunan iskelet kası mitokondrisinin geri kazanılmasındaki zorluktur. Bu protokolde kullanılan mitokondriyal izolasyon için ticari kit, bir proteaz ile tedaviyi ve kontraktil liflerin parçalanmasına yardımcı olmak için iyonik ortamın kullanımını içerir, ancak intermiyofibriller mitokondrinin önemli bir kısmının geri kazanılmaması muhtemeldir. Protokolün bu özelliği sadece ihtiyaç duyulan biyopsi materyali miktarının belirlenmesi için değil, aynı zamanda sonuçların yorumlanması ile de ilgilidir. İzole mitokondri, permeabilize liflere kıyasla difüzyon sınırlaması nedeniyle oksijen bağımlılığına karşı daha az hassastır15; Bu nedenle, izole mitokondri ile hiperoksiye gerek yoktur ve solunum ortamı, odayı oda havasına açarak yeterince oksijenlendirilebilir (ve tahlil sırasında yeniden oksijenlendirilebilir). Oksijen dağıtımının bu yönü, H2O2ve diğer ROS üretimini ölçerken özellikle yararlıdır, çünkü ROS üretimi hiperoksik inkübasyon sırasında fizyolojik olmayan bir şekilde artar19. Son olarak, izole mitokondri kullanımı, floroforların geçirgen kas lifleri ile floroforların kullanımına kıyasla spesifik olmayan protein bağlanmasının azalması nedeniyle daha kararlı ve tekrarlanabilir bir floresan sinyali sağlar. Her numune preparatının avantajları ve dezavantajları vardır ve hem geçirgen lifler hem de izole mitokondri ile yeterlilik, araştırmacıya mitokondriyal fizyoloji ile ilgili çeşitli soruları ele almak için sağlam bir tahlil seti sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların bu makale ile ilgili çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Yazarlar, John ve Debbie Oxley Atçılık Spor Hekimliği Kürsüsü ve Grayson Jokey Kulübü Araştırma Vakfı'nın cömert desteğini kabul etmek istiyor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADP | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | A5285 | |
| Amplex UltraRed | Life Technologies | A36006 | |
| ATP | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | A2383 | |
| BSA | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | A6003 | |
| Calcium carbonate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | C4830 | |
| CCCP | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | C2759 | |
| DatLab 7.0 | Oroboros Inc | Software to operate O2K fluororespirometer | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | D0632 | |
| DTPA | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | D1133 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | E4378 | |
| Glutamate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | G1626 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | H7523 | |
| Horseradish peroxidase | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | P8250 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | 516813 | Must be made fresh daily prior to assay |
| Imidazole | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | I2399 | |
| K-MES | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | M8250 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | M9272 | |
| Magnesium Green | Thermo Fisher Scientific | M3733 | |
| Malate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | M1000 | |
| Mannitol | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | M9647 | |
| Mitochondrial isolation kit | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | MITOISO1 | |
| O2K fluororespirometer | Oroboros Inc | Multiple units required to run full spectrum of assays concurrently. | |
| Phosphocreatine | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | P7936 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | P1767 | |
| Potassium lactobionate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | L2398 | |
| Potassium phosphate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | P0662 | |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | P2256 | Must be made fresh daily prior to assay |
| Rotenone | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | R8875 | |
| Succinate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | S2378 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | 84097 | |
| Superoxide dismutase | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | S8160 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | T0625 | |
| Titration pump | Oroboros Inc | ||
| Titration syringes | Oroboros Inc | ||
| TMRM | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | T5428 | |
| UCH biopsy needle | Millenium Surgical Corp | 72-238067 | Available in a range of sizes |
References
- Wilson, D. F. Energy metabolism in muscle approaching maximal rates of oxygen utilization. Medicine and Science in Sports and Exercise. 27 (1), 54-59 (1995).
- Gnaiger, E. Mitochondrial Pathways and Respiratory Control. An Introduction to OXPHOS Analysis. 4th edn. , Oroboros MiPNet Publications. Innsbruck. (2014).
- Ehrenberg, B., Montana, V., Wei, M. D., Wuskell, J. P., Loew, L. M. Membrane potential can be determined in individual cells from the nernstian distribution of cationic dyes. Biophysical Journal. 53 (5), 785-794 (1988).
- Chinopoulos, C., Kiss, G., Kawamata, H., Starkov, A. A. Measurement of ADP-ATP exchange in relation to mitochondrial transmembrane potential and oxygen consumption. Methods in Enzymology. 542, 333-348 (2014).
- Krumschnabel, G., et al. Simultaneous high-resolution measurement of mitochondrial respiration and hydrogen peroxide production. Methods in Molecular Biology. 1264, 245-261 (2015).
- Lemieux, H., et al. Mitochondrial function is altered in horse atypical myopathy. Mitochondrion. 30, 35-41 (2016).
- Houben, R., Leleu, C., Fraipont, A., Serteyn, D., Votion, D. M. Determination of muscle mitochondrial respiratory capacity in Standardbred racehorses as an aid to predicting exertional rhabdomyolysis. Mitochondrion. 24, 99-104 (2015).
- Votion, D. M., Gnaiger, E., Lemieux, H., Mouithys-Mickalad, A., Serteyn, D. Physical fitness and mitochondrial respiratory capacity in horse skeletal muscle. PLoS One. 7 (4), 34890 (2012).
- Votion, D. M., et al. Alterations in mitochondrial respiratory function in response to endurance training and endurance racing. Equine Veterinary Journal Supplement. (38), 268-274 (2010).
- Tosi, I., et al. Altered mitochondrial oxidative phosphorylation capacity in horses suffering from polysaccharide storage myopathy. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 50 (5), 379-390 (2018).
- Davis, M. S., Fulton, M. R., Popken, A. A. Effect of hyperthermia and acidosis on equine skeletal muscle mitochondrial oxygen consumption. Comparative Exercise Physiology. 17 (2), 171-179 (2021).
- Latham, C. M., Fenger, C. K., White, S. H. RAPID COMMUNICATION: Differential skeletal muscle mitochondrial characteristics of weanling racing-bred horses1. Journal of Animal Science. , (2019).
- White, S. H., Warren, L. K., Li, C., Wohlgemuth, S. E. Submaximal exercise training improves mitochondrial efficiency in the gluteus medius but not in the triceps brachii of young equine athletes. Scientific Reports. 7 (1), 14389 (2017).
- White, S. H., Wohlgemuth, S., Li, C., Warren, L. K. Rapid communication: Dietary selenium improves skeletal muscle mitochondrial biogenesis in young equine athletes. Journal of Animal Science. 95 (9), 4078-4084 (2017).
- Doerrier, C., et al. High-resolution FluoRespirometry and OXPHOS protocols for human cells, permeabilized fibers from small biopsies of muscle, and isolated mitochondria. Methods in Molecular Biology. 1782, 31-70 (2018).
- Li, C., White, S. H., Warren, L. K., Wohlgemuth, S. E. Effects of aging on mitochondrial function in skeletal muscle of American American Quarter Horses. Journal of Applied Physiology. 121 (1), 299-311 (2016).
- Komlodi, T., et al. Comparison of mitochondrial incubation media for measurement of respiration and hydrogen peroxide production. Methods in Molecular Biology. 1782, 137-155 (2018).
- Gnaiger, E.
- Li Puma, L. C., et al. Experimental oxygen concentration influences rates of mitochondrial hydrogen peroxide release from cardiac and skeletal muscle preparations. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrated, and Comparative Physiology. 318 (5), 972-980 (2020).
