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Biochemistry

अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न मैक्रोफेज से छोटे बाह्य कोशिकीय पुटिकाओं के पेप्टाइड्स की पहचान

Published: June 30, 2023 doi: 10.3791/65521
Automatic Translation
1,2, 1,2, 2,3, 2,3, 2, 2, 2, 1,2
1School of Basic Medical Sciences, Anhui Medical University, 2State Key Laboratory of Proteomics, Beijing Proteome Research Center, National Center for Protein Sciences (Beijing), Beijing Institute of Lifeomics, 3School of Life Sciences, Hebei University

Summary

यह प्रोटोकॉल अंतर अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा मैक्रोफेज से छोटे बाह्य पुटिकाओं को अलग करने और मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा पहचान के लिए पेप्टिडोम निकालने की प्रक्रिया का वर्णन करता है।

Abstract

छोटे बाह्य कोशिकीय पुटिकाओं (एसईवी) को आमतौर पर मल्टीवेसिकुलर बॉडी (एमवीबी) के एक्सोसाइटोसिस द्वारा स्रावित किया जाता है। <200 एनएम के व्यास वाले ये नैनोवेसिकल्स शरीर के विभिन्न तरल पदार्थों में मौजूद होते हैं। ये एसईवी विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं जैसे जीन प्रतिलेखन और अनुवाद, सेल प्रसार और अस्तित्व, प्रतिरक्षा और सूजन को उनके कार्गो, जैसे प्रोटीन, डीएनए, आरएनए और मेटाबोलाइट्स के माध्यम से नियंत्रित करते हैं। वर्तमान में, एसईवी अलगाव के लिए विभिन्न तकनीकों का विकास किया गया है। उनमें से, अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन-आधारित विधि को सोने का मानक माना जाता है और एसईवी अलगाव के लिए व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। पेप्टाइड्स स्वाभाविक रूप से लंबाई में 50 से कम अमीनो एसिड के साथ बायोमैक्रोमोलेक्यूल होते हैं। ये पेप्टाइड्स जैविक गतिविधि के साथ विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं में भाग लेते हैं, जैसे हार्मोन, न्यूरोट्रांसमीटर और सेल विकास कारक। पेप्टिडोम का उद्देश्य तरल क्रोमैटोग्राफी-टेंडम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस / एमएस) द्वारा विशिष्ट जैविक नमूनों में अंतर्जात पेप्टाइड्स का व्यवस्थित रूप से विश्लेषण करना है। यहां, हमने अंतर अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा एसईवी को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश किया और एलसी-एमएस / एमएस द्वारा पहचान के लिए पेप्टिडोम निकाला। इस विधि ने अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न मैक्रोफेज से सैकड़ों एसईवी-व्युत्पन्न पेप्टाइड्स की पहचान की।

Introduction

200 एनएम से कम व्यास वाले छोटे बाह्य कोशिकीय पुटिकाएं (एसईवी) लगभग सभी प्रकार के शरीर के तरल पदार्थों में मौजूद होती हैं और मूत्र, पसीना, आँसू, मस्तिष्कमेरु द्रव और एमनियोटिक द्रवसहित सभी प्रकार की कोशिकाओं द्वारा स्रावित होती हैं। प्रारंभ में, एसईवी को सेलुलर कचरे के निपटान के लिए सेप्टेकल्स के रूप में माना जाता था, जिसके कारण बाद के दशक2 में न्यूनतम शोध हुआ। हाल ही में, बढ़ते सबूत इंगित करते हैं कि एसईवी में विशिष्ट प्रोटीन, लिपिड, न्यूक्लिक एसिड और अन्य मेटाबोलाइट्स होते हैं। इन अणुओं को लक्षित कोशिकाओं3 में ले जाया जाता है, जो अंतरकोशिकीय संचार में योगदान करते हैं, जिसके माध्यम से वे विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं में भाग लेते हैं, जैसे ऊतक की मरम्मत, एंजियोजेनेसिस, प्रतिरक्षा4 और सूजन5,6, ट्यूमर विकास और मेटास्टेसिस 7,8,9, आदि।

एसईवी के अध्ययन को सुविधाजनक बनाने के लिए, जटिल नमूनों से एसईवी को अलग करना अनिवार्य है। एसईवी के भौतिक और रासायनिक गुणों के आधार पर विभिन्न एसईवी अलगाव विधियों को विकसित किया गया है, जैसे कि उनका घनत्व, कण आकार और सतह मार्कर प्रोटीन। इन तकनीकों में अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन-आधारित विधियां, कण आकार-आधारित विधियां, इम्यूनोफिनिटी कैप्चर-आधारित विधियां, एसईवी वर्षा-आधारित विधियां और माइक्रोफ्लुइडिक्स-आधारित विधियां10,11,12 शामिल हैं। इन तकनीकों में, अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन-आधारित विधि को व्यापक रूप से एसईवी अलगाव के लिए स्वर्ण मानक के रूप में मान्यता प्राप्त है और यह सबसे अधिक इस्तेमाल की जाने वाली तकनीकहै।

सबूतों की बढ़ती मात्रा विभिन्न जीवों के पेप्टिडोम में अज्ञात जैविक रूप से सक्रिय पेप्टाइड्स की एक भीड़ की उपस्थिति का सुझाव देती है। ये पेप्टाइड्स विकास, विकास, तनाव प्रतिक्रिया14,15 और सिग्नल ट्रांसडक्शन16 को विनियमित करके कई शारीरिक प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण योगदान देते हैं। एसईवी के पेप्टिडोम का उद्देश्य इन एसईवी द्वारा किए गए पेप्टाइड्स को उजागर करना और उनके जैविक कार्यों के लिए सुराग प्रदान करना है। यहां, हम अंतर अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन के माध्यम से एसईवी को अलग करने का एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, इसके बाद उनके पेप्टिडोम के आगे के विश्लेषण के लिए इन एसईवी से पेप्टाइड्स का निष्कर्षण होता है।

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Protocol

1. छोटे बाह्य पुटिकाओं का अलगाव

नोट: 4 डिग्री सेल्सियस पर चरण 1.1-1.11 में सभी सेंट्रीफ्यूजेशन करें।

  1. एसईवी-मुक्त भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) की तैयारी: अंतर्जात एसईवी को हटाने के लिए अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज (सामग्री की तालिका देखें) के माध्यम से 4 डिग्री सेल्सियस पर 110,000 × ग्राम पर रात भर सेंट्रीफ्यूज एफबीएस। सतह पर तैरने वाले को इकट्ठा करें, इसे फ़िल्टर करें, इसे 0.2 μm अल्ट्राफिल्ट्रेशन झिल्ली के साथ निष्फल करें, और इसे -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. 150 मिमी कल्चर डिश पर लगभग 3 x 107 अमर अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न मैक्रोफेज (आईबीएमडीएम) प्लेट करें और डीएमईएम कल्चर माध्यम के 20 एमएल जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  3. एसईवी एकत्र करने से पहले, माध्यम को छोड़ दें। पीबीएस (फॉस्फेट-बफर्ड खारा) के साथ एक बार कोशिकाओं को धो लें; सामग्री की तालिका) और इसे 10% एसईवी-मुक्त एफबीएस युक्त माध्यम से बदलें।
  4. प्रयोग की जरूरतों के अनुसार, सेल सुपरनैटेंट इकट्ठा करें और इसे 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
  5. कोशिकाओं को हटाने, गोली को त्यागने और सतह पर तैरनेवाले को नए 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करने के लिए 10 मिनट के लिए 300 × ग्राम पर सेल सुपरनैटेंट को सेंट्रीफ्यूज करें।
  6. मृत कोशिकाओं को हटाने, गोली को त्यागने और सुपरनैटेंट को नए हाई-स्पीड सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करने के लिए 10 मिनट के लिए 2000 × ग्राम पर सतह पर तैरनेवाला को सेंट्रीफ्यूज करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  7. सेल मलबे और माइक्रोवेसिकल्स को हटाने, गोली को त्यागने और सुपरनैटेंट को नए अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करने के लिए एक उच्च गति सेंट्रीफ्यूज के माध्यम से 30 मिनट के लिए 10,000 × ग्राम पर सतह पर तैरनेवाला को सेंट्रीफ्यूज करें (सामग्री की तालिका देखें)। खुले अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूबों की मात्रा 38.6 एमएल है; प्रत्येक ट्यूब में 35 एमएल सेल सुपरनैटेंट रखें।
  8. कच्चे एसईवी गोली प्राप्त करने के लिए एक स्विंगिंग-बाल्टी रोटर सेंट्रीफ्यूज (सामग्री की तालिका देखें) में 70 मिनट के लिए 110,000 × ग्राम पर सतह पर तैरनेवाला को सेंट्रीफ्यूज करें।
  9. सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें, और 1 एमएल पीबीएस के साथ एसईवी-समृद्ध गोली को धो लें। टेबलटॉप अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज पर 70 मिनट के लिए 110,000 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज ( सामग्री की तालिका देखें)। सुपरनैटेंट को त्याग दें और एक अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूब में पीबीएस के 1 एमएल जोड़ें।
  10. फिर अवक्षेप को लगातार पिपेट करें, पीबीएस के 1 एमएल को दूसरे अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें, और इसी तरह, जब तक कि सभी अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूब पाइपिंग द्वारा मिश्रित न हों।
  11. सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें, और पीबीएस के 100 μL में गोली को फिर से निलंबित करें, जो एसईवी है।
  12. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए बिसिनकोनिनिक एसिड (बीसीए) विधि का उपयोग करके एसईवी के कुल प्रोटीन को मापें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    1. प्रोटीन मानक की तैयारी: प्रोटीन मानक समाधान (25 मिलीग्राम / एमएल) तैयार करने के लिए इसे पूरी तरह से भंग करने के लिए एक मानक प्रोटीन ट्यूब (बीएसए के 30 मिलीग्राम) में 1.2 मिलीलीटर प्रोटीन तैयारी समाधान जोड़ें। फिर इसे पीबीएस के साथ 0.5 मिलीग्राम / एमएल की अंतिम एकाग्रता तक पतला करें।
    2. 96-वेल प्लेट में प्रोटीन मानक के 0 μL, 1 μL, 2 μL, 4 μL, 8 μL, 12 μL, 16 μL, और 20 μL जोड़ें, और 20 μL बनाने के लिए PBS जोड़ें। इसी समय, परीक्षण किए जाने वाले नमूना कुओं में एचईपीईएस लाइसिस बफर के 18 μL (20 mM HEPES, 50 mM NaCl, 1 mM NaF, 0.5% Triton X-100) और एसईवी नमूनों के 2 μL जोड़ें।
    3. निर्माता के निर्देशों के अनुसार आवश्यक बीसीए वर्किंग सॉल्यूशन तैयार करें, प्रत्येक कुएं में बीसीए वर्किंग सॉल्यूशन के 200 μL जोड़ें, और 20-30 मिनट के लिए कमरे के तापमान (RT) पर रखें।
    4. माइक्रोप्लेट रीडर के साथ 562 एनएम तरंग दैर्ध्य पर अवशोषण को मापें, और मानक वक्र और कमजोर पड़ने वाले कारक के अनुसार एसईवी की कुल प्रोटीन एकाग्रता की गणना करें।
      नोट: इस प्रोटोकॉल द्वारा सतह पर तैरनेवाले के 40 मिलीलीटर से निकाले गए एसईवी का उपयोग प्रोटीन मार्करों (पश्चिमी धब्बा) की बाद की पहचान के लिए किया जा सकता है। हालांकि, सेल सुपरनैटेंट के 200 एमएल से निकाले गए एसईवी का उपयोग रूपात्मक अवलोकन (ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, टीईएम) और कण आकार विश्लेषण (नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण, एनटीए) दोनों के लिए किया जा सकता है। विशेष रूप से, चरण 1.11 में काटे गए एसईवी के लिए, पीबीएस के 100 μL के साथ पुन: निलंबित करें। आकृति विज्ञान अवलोकन (टीईएम) के लिए 20-30 μL लें और कण आकार विश्लेषण (NTA) के लिए 1 mL PBS में शेष नमूने को फिर से निलंबित करें। सभी सेंट्रीफ्यूज को पहले से ठंडा किया जाता है। चरण 1.8 के लिए, इन अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूबों को सख्ती से संतुलित और कम से कम तीन-चौथाई भरा होना चाहिए। यदि नहीं, तो मेकअप में माध्यम जोड़ें। चरण 1.11 के लिए, एसईवी को अल्पावधि (12 घंटे) के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है; अन्यथा, उन्हें प्रोटीन क्षरण से बचने के लिए -20 या -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए जो पेप्टाइड्स के निष्कर्षण में हस्तक्षेप करता है। हालांकि, आकृति विज्ञान का निरीक्षण करने और कण आकार को मापने के लिए उपयोग किए जाने वाले नमूनों के लिए, केवल अल्पकालिक (12 घंटे) के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करने की सिफारिश की जाती है।

2. ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा एसईवी की आकृति विज्ञान का अवलोकन

  1. पैराफिल्म पर ताजा एसईवी नमूने (लगभग 20-30 μL) की एक बूंद रखें, एसईवी की बूंद पर तांबे की जाली की संख्या पक्ष रखें, और इसे 3 मिनट के लिए अवशोषित होने दें।
  2. फिल्टर पेपर के साथ अतिरिक्त तरल को अवशोषित करें, और फिर आसुत पानी की एक बूंद पर कॉपर ग्रिड रखें और इसे दो बार धो लें।
  3. फिल्टर पेपर के साथ अतिरिक्त तरल को अवशोषित करें। फिर कॉपर ग्रिड को 5 सेकंड के लिए नकारात्मक धुंधलापन के लिए 0.5% यूरिनल एसीटेट बूंद पर रखें।
  4. चरण 2.2 दोहराएँ।
  5. तैयार तांबे की जाली को नमूना रॉड पर रखें और इसे नमूना चरण में डालें।
    1. परीक्षण किए जाने वाले नमूने को खोजने के लिए आवर्धन को 20,000x-25,000x तक समायोजित करें। फिर आवर्धन को 100,000x तक समायोजित करें और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (टीईएम) के तहत निरीक्षण करने के लिए उपयुक्त स्थिति और ग्रेस्केल को समायोजित करें; सामग्री की तालिका)। छवियों को प्राप्त करने के लिए त्वरित वोल्टेज 80 केवी पर सेट किया गया है।
      नोट: चरण 2.1 के लिए, यदि एसईवी नमूनों की एकाग्रता कम है (<50 μg / μL), तो सोखना समय 5 मिनट या उससे भी अधिक समय तक बढ़ाया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, चरण 1.10 के लिए, पीबीएस (50 μL) की एक छोटी मात्रा का उपयोग पुन: निलंबन के लिए किया जा सकता है। चरण 2.3 के लिए, नकारात्मक धुंधला समय बहुत लंबा नहीं होना चाहिए; अन्यथा, एसईवी की त्रि-आयामी (3 डी) संरचना का निरीक्षण करना मुश्किल है।

3. नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण द्वारा कण आकार वितरण और एसईवी की एकाग्रता का माप।

  1. चरण 1.11 में काटे गए एसईवी के लिए, नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण (एनटीए) के लिए समाधान को 1 एमएल तक पतला करें। सबसे पहले, उपकरण को आसुत जल से साफ करें जब तक कि दृष्टि के क्षेत्र में कोई अशुद्धियां न हों। फिर नमूने को धीरे-धीरे धक्का देने के लिए 1 एमएल बाँझ सिरिंज का उपयोग करें (इंजेक्शन वॉल्यूम: 0.5-1 एमएल)।
  2. सहायक सॉफ्टवेयर के माध्यम से नमूने का विश्लेषण करें ( सामग्री की तालिका देखें)। विशेष रूप से, कैमरा प्रारंभ करें पर क्लिक करें और कैमरा स्तर को उपयुक्त आकार (आमतौर पर 14-16 इकाइयों की तीव्रता) में समायोजित करें, फिर माप विधि, मानक माप (3 या 5 बार) का चयन करें, और कणों को इकट्ठा करने के लिए चलाएँ पर क्लिक करें।
  3. कणों को इकट्ठा करने के बाद, कंप्यूटर चलती एसईवी कणों का निरीक्षण कर सकता है। उसी समय, कण आकार वितरण का विश्लेषण करने के लिए पहचान सीमा (आमतौर पर 5) निर्धारित करें ताकि अंतिम गणना किए गए कण पृष्ठभूमि के बजाय सभी गतिशील एसईवी हों। कणों का विश्लेषण करने के बाद, विश्लेषण परिणामों को सहेजें और निर्यात करें।
  4. उपयोग के बाद, उपकरण को आसुत जल से धो लें जब तक कि दृष्टि के क्षेत्र में कोई स्पष्ट कण न हों, और लेजर बंद कर दें।
    नोट: टीईएम के लिए एसईवी नमूनों के विपरीत, एनटीए के लिए एसईवी नमूने बहुत केंद्रित नहीं होने चाहिए और बड़े नमूना वॉल्यूम (कम से कम 1 एमएल) की आवश्यकता होती है। इसके अतिरिक्त, एसईवी के आकार वितरण का विश्लेषण करने के लिए वैकल्पिक तरीकों का उपयोग किया जा सकता है, जैसे कि फ्लो साइटोमेट्री और टेनेबल प्रतिरोधक पल्स सेंसिंग (टीआरपीएस), आदि। एनटीए माप (नैनोसाइट एलएम 10) के लिए कणों/फ्रेम की अनुशंसित संख्या 40 है।

4. वेस्टर्न ब्लॉट द्वारा एसईवी के प्रोटीन मार्करों का पता लगाना

नोट: बाह्य पुटिकाओं (एमआईएसईवी) 2018 दिशानिर्देशों के अध्ययन के लिए न्यूनतम जानकारी के अनुसार17,18, एसईवी के लक्षण वर्णन के लिए प्रोटीन की 5 श्रेणियों की सिफारिश की जाती है। एसईवी की तैयारी के लिए प्रत्येक श्रेणी 1 से 4 के कम से कम एक प्रोटीन मार्कर का मूल्यांकन करें।

  1. चरण 1.9 में काटे गए एसईवी के लिए, सतह पर तैरने वाले को सावधानीपूर्वक पाइप करें, और 5 मिनट के लिए एचईपीईएस लाइसिस बफर के 15 μL जोड़ें। फिर लोडिंग बफर की एक समान मात्रा जोड़ें और 15 मिनट के लिए उबलते पानी में पकाएं।
  2. इस प्रोटोकॉल में, एसईवी के प्रोटीन का लोडिंग 8-10 μg था। 80 वोल्ट (लगभग 30 मिनट) के निरंतर वोल्टेज पर 10% जैल में प्रोटीन को इलेक्ट्रोफोरस करें।
    1. जब नमूना अलग करने वाले जेल में प्रवेश करता है, तो वोल्टेज को 120 वी (लगभग 45 मिनट) तक समायोजित करें। नमूना ग्लास प्लेट के नीचे से 2-3 सेमी दूर होने के बाद, बिजली की आपूर्ति को डिस्कनेक्ट करें और इलेक्ट्रोपोरेशन के लिए नमूना पट्टी काट दें। वैद्युतकणसंचलन समाधान की संरचना उप-चरण 4.2.1.1 में वर्णित है।
      1. 5x वैद्युतकणसंचलन समाधान तैयार करने के लिए, क्रमशः ट्रिस, एसडीएस और ग्लाइसिन के 15.1 ग्राम, 5 ग्राम और 94 ग्राम वजन करें, और विआयनीकृत पानी के साथ 1 एल तक पतला करें। जब इसका उपयोग किया जाता है, तो इसे पानी के साथ 5 बार पतला करने की आवश्यकता होती है।
  3. इलेक्ट्रोपोरेशन डिवाइस को इकट्ठा करें और पर्याप्त इलेक्ट्रोपोरेशन समाधान (लगभग 1 एल) में डालें, और नाइट्रोसेल्यूलोज (एनसी) झिल्ली पर प्रोटीन को 3.5 घंटे के लिए बर्फ पर 90 एमए के निरंतर प्रवाह के साथ इलेक्ट्रोपोरेट करें।
    नोट: 10x इलेक्ट्रोपोरेशन समाधान तैयार करने के लिए, क्रमशः 30.25 ग्राम और 144.1 ग्राम ट्रिस और ग्लाइसिन का वजन करें, और विआयनीकृत पानी के साथ 1 एल तक पतला करें। जब इसका उपयोग किया जाता है, तो इसे विआयनीकृत पानी के 7: 2: 1 के अनुपात में तैयार करने की आवश्यकता होती है: मेथनॉल: इलेक्ट्रोपोरेशन समाधान।
  4. इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद, एनसी झिल्ली को ब्लॉकिंग घोल में रखें (50 मिलीलीटर ट्रिस-बफर्ड सेलाइन में 2.5 ग्राम स्किम्ड मिल्क पाउडर 0.1% ट्वीन 20 (टीबीएसटी) के साथ आरटी पर 1-2 घंटे के लिए या रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर। TBST की संरचना उप-चरण 4.4.1 में वर्णित है।
    1. 10x TBST तैयार करने के लिए, क्रमशः Tris और NaCl के 60.56 ग्राम और 175.32 ग्राम वजन करें, और फिर 10 मिलीलीटर ट्वीन -20 और 34 मिलीलीटर केंद्रित हाइड्रोक्लोरिक एसिड जोड़ें। पीएच = 7.6 को केंद्रित हाइड्रोक्लोरिक एसिड के साथ समायोजित करें और विआयनीकृत पानी के साथ मेकअप 2 एल करें। जब इसका उपयोग किया जाता है, तो इसे पानी से दस बार पतला करने की आवश्यकता होती है।
  5. प्रोटीन मार्करों को तीन एसईवी मार्करों (विभेदन 9 [सीडी 9]; β-एक्टिन; ट्यूमर संवेदनशीलता जीन [टीएसजी 101]) और एक गैर-एसईवी मार्कर (ग्लूकोज-विनियमित प्रोटीन 94 [जीआरपी 94] का समूह) द्वारा पहचानें।
    1. उपरोक्त एंटीबॉडी के पिपेट 2 μL और 1:500 पर पतला करें, फिर 3 घंटे के लिए आरटी पर एनसी झिल्ली को 3 घंटे या 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें। चरण 4.4 में डिल्यूएंट ब्लॉकिंग समाधान है।
    2. प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेशन के बाद, हर बार 10 मिनट के लिए शेकर पर 1x TBST के साथ 3 बार धोएं।
  6. एनसी झिल्ली को पतला द्वितीयक एंटीबॉडी (1:500) में रखें और 45-50 मिनट के लिए आरटी पर शेकर पर धीरे-धीरे हिलाएं। हर बार 10 मिनट के लिए शेकर पर 1x TBST के साथ इसे 3 बार धोएं।
  7. 1: 1 पर केमिल्यूमिनेसेंट सब्सट्रेट्स ए और बी (सामग्री की तालिका देखें) को मिलाएं, मिश्रित अभिकर्मक को एनसी झिल्ली में जोड़ें, और 5 मिनट के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें।
  8. ब्लॉट इमेजर का उपयोग करके एनसी झिल्ली की छवि बनाएं ( सामग्री की तालिका देखें)।
    1. छवि लैब सॉफ़्टवेयर खोलें, और नया प्रायोगिक प्रोटोकॉल का चयन करें।
    2. एप्लिकेशन ब्लोटिंग-कलरमेट्रिक का चयन करें, हाइलाइट रद्द करें, प्रायोगिक प्रोटोकॉल चलाएँ पर क्लिक करें, मार्कर प्राप्त करें, और इसे सहेजें।
    3. फिर एप्लिकेशन प्रोग्राम ब्लोटिंग-केमी का फिर से चयन करें, और छवियों की कुल संख्या और एक्सपोज़र समय क्रमशः 30 एस और 300 एस पर सेट करें।
    4. प्रायोगिक प्रोटोकॉल चलाएँ पर क्लिक करें, छवियों को प्राप्त करें, और इसे सहेजें। अंत में, एनसी झिल्ली को हटा दें और कंप्यूटर को बंद कर दें।
      नोट: चरण 4.6 के लिए, द्वितीयक एंटीबॉडी का इनक्यूबेशन समय 50 मिनट से अधिक नहीं होना चाहिए; अन्यथा, पृष्ठभूमि बहुत अंधेरी होगी।

5. एसईवी के पेप्टाइड्स का निष्कर्षण

  1. 70 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 110,000 × ग्राम पर अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा एसईवी को दो बार धोएं, और उन्हें फिर से निलंबित करने के लिए पीबीएस के 500 μL (सामग्री की तालिका देखें) जोड़ें, और 100x प्रोटीज अवरोधक के 5 μL जोड़ें (सामग्री की तालिका देखें)।
  2. अल्ट्रासोनिक क्रशिंग के लिए नमूना रखें ( सामग्री की तालिका देखें)। अल्ट्रासोनिक होमोजेनाइजेशन के लिए सेटिंग्स निम्नानुसार हैं: शक्ति: 40 डब्ल्यू, कुल समय: 10 मिनट, अल्ट्रासोनिक समय: 3 एस, और अंतराल समय: 5 एस।
  3. कुचल मिश्रण को 13,700 × ग्राम पर 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  4. सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, डिथियोथ्रेइटोल (डीटीटी) जोड़ें; सामग्री की तालिका) सतह पर तैरनेवाला को 50 mmol / L की अंतिम सांद्रता तक, और 30 मिनट के लिए 56 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में इनक्यूबेट करें।
  5. इसके बाद, आयोडोसिटामाइड (आईएए) के 50 μL जोड़ें; सामग्री की तालिका) 1 मोल / एल की एकाग्रता पर सतह पर तैरने वाला और इसे अंधेरे में 20 मिनट के लिए आरटी पर प्रतिक्रिया करने के लिए छोड़ दें।
  6. 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 13,700 × ग्राम पर मिश्रण को सेंट्रीफ्यूज करें, और सुपरनैटेंट, क्रूड पेप्टाइड्स अर्क एकत्र करें। बाद में उपयोग के लिए इसे -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  7. प्रोटीन को हटाने के लिए प्राप्त पेप्टाइड्स क्रूड एक्सट्रैक्ट को 10 केडीए अल्ट्राफिल्ट्रेशन ट्यूब19 ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ अल्ट्राफ़िल्टर करें, और 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 13,700 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें। बहिस्त्राव को इकट्ठा करें और इसे 45 डिग्री सेल्सियस पर वैक्यूम केन्द्रापसारक ( सामग्री की तालिका देखें) में सुखाएं।
  8. 5.8.1-5.8.8 चरणों का पालन करते हुए सूखे नमूनों को हटा दें। अभिकर्मकों के लिए विलायक के रूप में मास स्पेक्ट्रोमेट्री-ग्रेड शुद्ध पानी का उपयोग करें।
    1. सूखे पेप्टाइड्स को पूरी तरह से भंग करने के लिए प्रत्येक नमूने में 0.1% ट्राइफ्लोरोएसेटिक एसिड (टीएफए) के 100 μL जोड़ें।
    2. प्रत्येक डीसाल्टिंग कॉलम में 100% एसिटोनिट्राइल (एसीएन) के 100 μL जोड़ें, आरटी पर 3 मिनट के लिए 400 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें, और बहिस्त्राव को छोड़ दें। फिर 50% एसीएन के 100 μL जोड़ें, 3 मिनट के लिए 400 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें, और बहिस्त्राव को छोड़ दें।
    3. प्रत्येक डीसाल्टिंग कॉलम में 0.1% टीएफए के 100 μL जोड़ें, 3 मिनट के लिए 400 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें, और बहिस्त्राव को छोड़ दें।
    4. चरण 5.8.3 दोहराएँ।
    5. पेप्टाइड्स को चरण 5.8.1 में डिसाल्टिंग कॉलम में घोलदिया जाता है, 3 मिनट के लिए 400 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज किया जाता है, और अपशिष्ट को पुनर्प्राप्त किया जाता है। पेप्टाइड नमूने को डीसाल्टिंग कॉलम में अधिशोषित करने के लिए नमूना लोडिंग चरण को दोहराएं।
    6. चरण 5.8.3 को दो बार दोहराएँ।
    7. डीसाल्टिंग कॉलम में 50% एसीएन (जिसमें 0.1% टीएफए होता है) के 50 μL जोड़ें, 3 मिनट के लिए 400 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें, और एक नए मास स्पेक्ट्रोमेट्री-ग्रेड सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में बहिस्त्राव (पेप्टाइड्स) एकत्र करें।

6. डीसाल्टेड पेप्टाइड्स को सुखाना

  1. एक वैक्यूम केन्द्रापसारक (सेटिंग्स: वी-एक्यू मोड, तापमान: 45 डिग्री सेल्सियस, और समय: 50 मिनट) में डिसाल्टेड पेप्टाइड्स को सुखाएं और बाद में मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए उनका उपयोग करें।
    नोट: प्रोटीन क्षरण से बचने के लिए एसईवी के पेप्टाइड्स की निष्कर्षण प्रक्रिया को बर्फ पर जितना संभव हो उतना किया जाना चाहिए। प्लास्टिक संदूषण से बचने के लिए उपयोग किए जाने वाले सभी अभिकर्मकों को मास स्पेक्ट्रोमेट्री-ग्रेड पानी के साथ तैयार किया गया था। चरण 5.8 के लिए, डीसाल्टिंग के परिणामस्वरूप पेप्टाइड नमूनों का अपरिहार्य नुकसान होता है। इस हानि को चरण 5.8.5 और 5.8.7 को दोहराकर कम किया जा सकता है।

7. तरल क्रोमैटोग्राफी-टेंडम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस / एमएस) विश्लेषण

नोट: तरल क्रोमैटोग्राफी-टेंडम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस / एमएस) द्वारा पेप्टाइड्स के नमूने का विश्लेषण करें, विशेष रूप से ऑर्बिटरैप क्यू एक्सएक्टिव एचएफ-एक्स मास स्पेक्ट्रोमीटर एक ईजी-एनएलसी 1000 नैनो-उच्च प्रदर्शन एलसी सिस्टम से जुड़ा हुआ है ( सामग्री की तालिका देखें)।

  1. C18 विश्लेषणात्मक स्तंभ (1.9 μm अनाज व्यास, 15 सेमी लंबाई x 150 μm आंतरिक व्यास) पर नमूने को 65 मिनट ढाल के साथ 60 nL/min की प्रवाह दर पर अलग करें: 4 मिनट के लिए 4% -15%, 28 मिनट के लिए 15% -28%, 10 मिनट के लिए 28% -40%, 10 मिनट के लिए 40% -69%, 7 मिनट के लिए 95% स्थिर। 95% 1 मिनट के लिए 6% तक कम हो गया, और 5 मिनट के लिए स्थिर (विलायक ए, 0.1% फॉर्मिक एसिड युक्त पानी [एफए]; विलायक बी, 80% एसिटोनिट्राइल जिसमें 0.1% एफए, वी / वी होता है)।
  2. 320 डिग्री सेल्सियस केशिका तापमान और 2.2 केवी के स्प्रे वोल्टेज पर नैनो-इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण (नैनो-ईएसआई) स्प्रेयर में इल्यूटेड पेप्टाइड्स को आयनित करें।
  3. पूर्ण-स्कैन मोड के लिए 120,000 और एमएस / एमएस मोड पर 15,000 की समाधान शक्ति के साथ डेटा-निर्भर अधिग्रहण मोड का उपयोग करके मास स्पेक्ट्रल डेटा एकत्र करें।
    1. स्कैन रेंज 250 मीटर / जेड से 1800 मीटर / जेड और 1.6 मीटर / जेड के साथ अलगाव खिड़की से ऑर्बिटरैप में पूर्ण स्कैन करें।
    2. 29% की सामान्यीकृत टकराव ऊर्जा के साथ उच्च-ऊर्जा टकराव पृथक्करण (एचसीडी) विखंडन के लिए शीर्ष 20 तीव्र आयनों का चयन करें और आयन विभाजक में माप लें।
      नोट: विशिष्ट मास स्पेक्ट्रोमेट्रिक स्थितियां निम्नानुसार थीं: स्वचालित लाभ नियंत्रण (एजीसी) लक्ष्य पूर्ण स्कैन के लिए 3 x 106 आयन और एमएस / एमएस स्कैन के लिए 2 x 105 थे; पूर्ण स्कैन के लिए अधिकतम इंजेक्शन समय 80 एमएस और एमएस / एमएस स्कैन के लिए 19 एमएस था; और गतिशील बहिष्करण का उपयोग 13 सेकंड के लिए किया गया था।

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Representative Results

अंतर अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन (चित्रा 1) द्वारा पृथक एसईवी के लिए, हमने इंटरनेशनल सोसाइटी फॉर एक्स्ट्रासेल्युलर वेसिकल्स (आईएसईवी) 17 के अनुसार उनकी आकृति विज्ञान, कण आकार वितरण और प्रोटीन मार्करों का मूल्यांकन किया।

सबसे पहले, एसईवी की आकृति विज्ञान को टीईएम द्वारा देखा गया था, जो एक विशिष्ट कप जैसी संरचना दिखाता है (चित्रा 2 ए)। एनटीए ने दिखाया कि पृथक एसईवी ज्यादातर 136 एनएम (चित्रा 2 बी) पर केंद्रित थे, जो रिपोर्ट किए गए आकार (30-150 एनएम) 1 के अनुरूप था। अंत में, एसईवी के प्रोटीन मार्करों को पश्चिमी धब्बा द्वारा पहचाना गया था। परिणामों से पता चला कि अलग-थलग एसईवी सीडी 9, β-एक्टिन और टीएसजी 101 सहित एसईवी के मार्करों से काफी समृद्ध थे। एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम मार्कर, जीआरपी 94, केवल पूरे सेल लाइसेट (चित्रा 2 सी) में पाया गया था। इन परिणामों ने संकेत दिया कि नियोजित तरीकों के परिणामस्वरूप पृथक एसईवी के लिए उच्च स्तर की शुद्धता हुई।

Figure 1
चित्रा 1: अंतर अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा एसईवी को अलग करने का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। 4 डिग्री सेल्सियस पर सभी सेंट्रीफ्यूजेशन करें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: आईबीएमडीएम-व्युत्पन्न एसईवी का लक्षण वर्णन। (ए) ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा देखे गए पृथक एसईवी। स्केल बार: 200 एनएम। (बी) नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण द्वारा पृथक एसईवी का कण आकार। (ग) वेस्टर्न ब्लॉट द्वारा एसईवी के एसईवी और गैर-एसईवी मार्करों की पहचान। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

एसईवी के कार्य की जांच करते समय, किसी भी संभावित संदूषण से बचने के लिए जटिल जैविक नमूनों से उच्च शुद्धता वाले एसईवी प्राप्त करना अनिवार्य है। एसईवी अलगाव के लिए विभिन्न तरीकोंको विकसित किया गया है, और इन तरीकों के बीच, अंतर अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन-आधारित विधियों ने एसईवी की अपेक्षाकृत उच्च शुद्धता दिखाई है। इस अध्ययन में, 6 घंटे के लिए 200 एमएल सेल सुपरनैटेंट एकत्र किया गया था, और अंतर अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा लगभग 200-300 μg एसईवी प्राप्त किए गए थे। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन (चरण 1.8) के दौरान एसईवी गोली दिखाई नहीं दे सकती है। इसलिए, ट्यूबों के तल को जितना संभव हो उतना पिपेट करने की सिफारिश की जाती है। यह कदम महत्वपूर्ण है और एसईवी की उपज को सीधे प्रभावित करेगा। इसके अतिरिक्त, उपज में सुधार के लिए प्रोटोकॉल के और अनुकूलन की आवश्यकता होती है, जैसे कि सेंट्रीफ्यूजेशन समय या सेल सुपरनैटेंट संग्रह अवधि का विस्तार करना जब एसईवी को 110,000 × ग्राम (चरण 1.8 और 1.9) पर अवक्षेपित किया जाता है। हालांकि अंतर अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा पृथक एसईवी में उच्च शुद्धता होती है, लेकिन इसमें भी लंबा समय लगता है।

आधुनिक मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रौद्योगिकी और आनुवंशिक डेटाबेस में प्रगति के साथ, विभिन्न जीवों के ऊतकों और शरीर के तरल पदार्थों में हजारों पेप्टाइड्स की पहचान की गई है, जो स्रोत, बहुतायत और जैविक कार्यमें काफी भिन्न हैं। एमएस-आधारित पेप्टिडोम एसईवी पेप्टिडोम की संरचना, गतिशील परिवर्तन और कार्य की जांच के लिए एक व्यापक दृष्टिकोण प्रदान करते हैं। हालांकि, एसईवी में पेप्टाइड्स की कम प्रचुरता एसईवी पेप्टिडोम की पहचान को अस्थिर बनाती है। इसके अतिरिक्त, पेप्टाइड पहचान में हस्तक्षेप करने वाले प्रोटीन क्षरण से बचने के लिए बर्फ पर पेप्टाइड निष्कर्षण किया जाना चाहिए। इस अध्ययन में, पेप्टाइड्स के 2-4 μg को पेप्टिडोम विश्लेषण के लिए लगभग 1 मिलीग्राम एसईवी की आवश्यकता होती है। इसके लिए एसईवी के प्रोटिओमिक्स की तुलना में एक बड़े नमूना आकार की आवश्यकता होती है। इसी समय, एसईवी में बेहद कम पेप्टाइड एकाग्रता के कारण, प्रोटिओमिक्स की तुलना में प्लास्टिक प्रदूषण पर अधिक ध्यान दिया जाना चाहिए। चाहे वह सेल कल्चर हो या अभिकर्मक तैयारी, जितना संभव हो मास स्पेक्ट्रोमेट्री-ग्रेड उपभोग्य सामग्रियों का उपयोग करें। इसलिए, एसईवी में पहचाने गए पेप्टाइड्स की संख्या बढ़ाने के लिए अधिक अनुकूलित पेप्टाइड निष्कर्षण विधियों की आवश्यकता होती है। इसके अतिरिक्त, पेप्टिडोम डेटाबेस पूरा नहीं है, जो एसईवी पेप्टिडोम अनुसंधान की प्रगति को सीमित करता है।

वर्तमान में, एसईवी पर अधिकांश अध्ययन प्रोटीन और माइक्रोआरएनए पर ध्यान केंद्रित करते हैं जो वे ले जाते हैं, उनके पेप्टाइड घटकों 4,21,22 के बारे में बहुत कम जानकारी है। यह लेख पेप्टिडोम के परिप्रेक्ष्य से एसईवी के जैविक कार्य को और अधिक उजागर करने के लिए एसईवी के पेप्टाइड्स के अध्ययन के लिए एक सीधा और आसान-से-पालन प्रोटोकॉल प्रदान करता है।

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं हैं।

Acknowledgments

यह अध्ययन चीन के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (3157270) के अनुदान द्वारा समर्थित था। हम आईबीएमडीएम प्रदान करने के लिए डॉ फेंग शाओ (नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ बायोलॉजिकल साइंसेज, चीन) को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BCA Protein Assay Kit Beyotime Technology P0012
CD9 Beyotime Technology AF1192
Centrifugal filter tube Millipore UFC5010BK
Centrifuge bottles polypropylene Beckman Coulter 357003 High-speed centrifuge
Chemiluminescent substrate Thermo Fisher Scientific 34580
Dithiothreitol Solarbio D8220 100 g
DMEM culture medium Cell World N?A
GRP94 Cell Signaling Technology 20292
High-speed centrifuge Beckman Coulter Avanti JXN-26 Centrifuge rotor (JA-25.50)
Immortalized bone marrow-derived macrophages (iBMDM) National Institute of Biological Sciences, China Provided by Dr. Feng Shao (National Institute of Biological Sciences, China)
Iodoacetamide Sigma l1149 5 g
Microfuge tube polypropylene Beckman Coulter 357448 1.5 mL, Tabletop ultracentrifuge 
nano-high-performance LC system Thermo Fisher Scientific EASY-nLC 1000
Nanoparticle tracking analysis  Malvern Panalytical NanoSight LM10 NanoSight NTA3.4
Orbitrap Q Exactive HF-X mass spectrometer Thermo Fisher Scientific N/A
Phosphate-buffered saline Solarbio P1020
Polyallomer centrifuge tubes Beckman Coulter 326823 Ultracentrifuge
Protease inhibitor Bimake B14002
SpeedVac vacuum concentrator Eppendorf Concentrator plus
Tabletop ultracentrifuge Beckman Coulter Optima MAX-XP Ultracentrifuge rotor (TLA 55)
Transmission electron microscope HITACHI H-7650B
TSG101 Sigma AF8258
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima XPN-100 Ultracentrifuge rotor (SW32 Ti)
Ultrasonic cell disruptor Scientz SCIENTZ-IID
Western Blot imager Bio-Rad ChemiDocXRs Image lab 4.0 (beta 7)
β-actin Sigma A3853

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References

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जैव रसायन अंक 196 छोटे बाह्य पुटिकाओं पेप्टिडोम अलगाव
अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न मैक्रोफेज से छोटे बाह्य कोशिकीय पुटिकाओं के पेप्टाइड्स की पहचान
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Cheng, J., Zhu, J., Liu, Y., Yang, C., Zhang, Y., Liu, Y., Jin, C., Wang, J. Identification of Peptides of Small Extracellular Vesicles from Bone Marrow-Derived Macrophages. J. Vis. Exp. (196), e65521, doi:10.3791/65521 (2023).

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