Summary
Este protocolo describe un procedimiento para aislar pequeñas vesículas extracelulares de macrófagos mediante ultracentrifugación diferencial y extraer el peptidomo para su identificación por espectrometría de masas.
Abstract
Las pequeñas vesículas extracelulares (sEV) suelen ser secretadas por la exocitosis de los cuerpos multivesiculares (MVB). Estas nanovesículas con un diámetro de <200 nm están presentes en diversos fluidos corporales. Estos sEV regulan diversos procesos biológicos como la transcripción y traducción de genes, la proliferación y supervivencia celular, la inmunidad y la inflamación a través de sus cargas, como proteínas, ADN, ARN y metabolitos. En la actualidad, se han desarrollado diversas técnicas para el aislamiento de los sEV. Entre ellos, el método basado en ultracentrifugación se considera el estándar de oro y se usa ampliamente para el aislamiento de vehículos eléctricos. Los péptidos son naturalmente biomacromoléculas con menos de 50 aminoácidos de longitud. Estos péptidos participan en una variedad de procesos biológicos con actividad biológica, como hormonas, neurotransmisores y factores de crecimiento celular. El peptidomo está destinado a analizar sistemáticamente péptidos endógenos en muestras biológicas específicas mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS). Aquí, introdujimos un protocolo para aislar sEVs por ultracentrifugación diferencial y extrajimos peptidoma para su identificación por LC-MS/MS. Este método identificó cientos de péptidos derivados de sEVs de macrófagos derivados de la médula ósea.
Introduction
Las pequeñas vesículas extracelulares (sEV) con un diámetro inferior a 200 nm están presentes en casi todos los tipos de fluidos corporales y son secretadas por todo tipo de células, incluyendo la orina, el sudor, las lágrimas, el líquido cefalorraquídeo y el líquido amniótico1. Inicialmente, los vehículos eléctricos se consideraron como receptáculos para la eliminación de desechos celulares, lo que llevó a una investigación mínima en la década siguiente2. Recientemente, cada vez hay más pruebas de que los sEV contienen proteínas, lípidos, ácidos nucleicos y otros metabolitos específicos. Estas moléculas son transportadas a las células diana3, contribuyendo a la comunicación intercelular, a través de la cual participan en diversos procesos biológicos, como la reparación de tejidos, la angiogénesis, la inmunidad4 y la inflamación 5,6, el desarrollo tumoral y la metástasis 7,8,9, etc.
Para facilitar el estudio de los sEV, es imperativo aislarlos de muestras complejas. Se han desarrollado diferentes métodos de aislamiento de sEVs basados en las propiedades físicas y químicas de los sEVs, como su densidad, tamaño de partícula y proteínas marcadoras de superficie. Estas técnicas incluyen métodos basados en ultracentrifugación, métodos basados en el tamaño de partículas, métodos basados en captura de inmunoafinidad, métodos basados en precipitación de sEVs y métodos basados en microfluídica10,11,12. Entre estas técnicas, el método basado en la ultracentrifugación es ampliamente reconocido como el estándar de oro para el aislamiento de sEV y es la técnica más utilizada13.
Una cantidad creciente de evidencia sugiere la presencia de una multitud de péptidos biológicamente activos no descubiertos en los peptidomos de varios organismos. Estos péptidos contribuyen significativamente a numerosos procesos fisiológicos mediante la regulación del crecimiento, el desarrollo, la respuesta al estrés 14,15 y la transducción de señales16. El objetivo del peptidomo de los sEV es descubrir los péptidos transportados por estos sEV y proporcionar pistas sobre sus funciones biológicas. Aquí, presentamos un protocolo de aislamiento de sEVs a través de ultracentrifugación diferencial, seguido de la extracción de péptidos de estos sEVs para un análisis más detallado de su peptidoma.
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Protocol
1. Aislamiento de pequeñas vesículas extracelulares
NOTA: Realice toda la centrifugación en los pasos 1.1-1.11 a 4 °C.
- Preparación de suero fetal bovino (FBS) libre de sEVs: Centrifugar FBS durante la noche a 110.000 × g a 4 °C a través de una ultracentrífuga (ver Tabla de Materiales) para eliminar los sEVs endógenos. Recoja el sobrenadante, filtre, esterilícelo con una membrana de ultrafiltración de 0,2 μm y guárdelo a -20 °C.
- Coloque aproximadamente 3 x 107 macrófagos inmortalizados derivados de la médula ósea (iBMDM) en una placa de cultivo de 150 mm y agregue 20 ml de medio de cultivo DMEM (consulte la Tabla de materiales).
- Antes de recolectar los sEV, deseche el medio. Lave las células una vez con PBS (solución salina tamponada con fosfato; Tabla de Materiales) y reemplácelo con un medio que contenga un 10% de FBS libre de sEV.
- De acuerdo con las necesidades del experimento, recoja el sobrenadante celular y transfiéralo a tubos de centrífuga de 50 ml.
- Centrifugue el sobrenadante celular a 300 × g durante 10 minutos para eliminar las células, deseche el gránulo y transfiera el sobrenadante a nuevos tubos de centrífuga de 50 ml.
- Centrifugue el sobrenadante a 2000 × g durante 10 minutos para eliminar las células muertas, deseche el gránulo y transfiera el sobrenadante a nuevos tubos de centrífuga de alta velocidad (consulte la Tabla de materiales).
- Centrifugar el sobrenadante a 10.000 × g durante 30 min a través de una centrífuga de alta velocidad para eliminar los restos celulares y las microvesículas, desechar el gránulo y transferir el sobrenadante a nuevos tubos de ultracentrífuga (ver Tabla de materiales). El volumen de los tubos de ultracentrífuga abiertos es de 38,6 mL; coloque 35 ml de sobrenadante celular en cada tubo.
- Centrifugar el sobrenadante a 110.000 × g durante 70 min en una centrífuga de rotor de cubo oscilante (ver Tabla de Materiales) para obtener pellet crudo de sEV.
- Deseche el sobrenadante y lave el gránulo enriquecido con sEV con 1 ml de PBS. Centrifugar a 110.000 × g durante 70 min en una ultracentrífuga de sobremesa (ver Tabla de Materiales). Deseche el sobrenadante y agregue 1 ml de PBS a un tubo de ultracentrífuga.
- Luego pipetee el precipitado continuamente, transfiera 1 mL de PBS a otro tubo de ultracentrífuga, y así sucesivamente, hasta que todos los tubos de ultracentrífuga se mezclen mediante pipeteo.
- Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo en 100 μL de PBS, que es sEV.
- Mida la proteína total de los sEV utilizando el método del ácido bicinconínico (BCA), siguiendo los pasos a continuación (ver Tabla de materiales).
- Preparación del patrón de proteína: Agregue 1,2 ml de solución de preparación de proteína en un tubo de proteína estándar (30 mg de BSA) para disolverlo completamente y preparar la solución estándar de proteína (25 mg/ml). A continuación, dilúyalo con PBS hasta una concentración final de 0,5 mg/ml.
- Agregue 0 μL, 1 μL, 2 μL, 4 μL, 8 μL, 12 μL, 16 μL y 20 μL del estándar de proteína en la placa de 96 pocillos, y agregue PBS para completar 20 μL. Al mismo tiempo, agregue 18 μL de tampón de lisis HEPES (20 mM de HEPES, 50 mM de NaCl, 1 mM de NaF, 0,5% de Triton X-100) y 2 μL de muestras de sEVs a los pocillos de muestra que se van a analizar.
- Prepare la solución de trabajo de BCA requerida según las instrucciones del fabricante, agregue 200 μL de solución de trabajo de BCA a cada pocillo y colóquela a temperatura ambiente (RT) durante 20-30 min.
- Mida la absorbancia a una longitud de onda de 562 nm con un lector de microplacas y calcule la concentración total de proteínas de los sEV de acuerdo con la curva estándar y el factor de dilución.
NOTA: Los sEVs extraídos de 40 mL de sobrenadante por este protocolo pueden ser utilizados para la posterior identificación de marcadores proteicos (western blot). Sin embargo, los sEV extraídos de 200 mL de sobrenadante celular se pueden utilizar tanto para la observación morfológica (microscopía electrónica de transmisión, TEM) como para el análisis del tamaño de partícula (análisis de seguimiento de nanopartículas, NTA). En concreto, en el caso de los sEV cosechados en el paso 1.11, vuelva a suspender con 100 μL de PBS. Tome 20-30 μL para la observación morfológica (TEM) y vuelva a suspender la muestra restante en 1 mL PBS para el análisis del tamaño de partícula (NTA). Todas las centrífugas se enfrían previamente por adelantado. Para el paso 1.8, estos tubos de ultracentrífuga deben estar estrictamente equilibrados y llenos al menos en tres cuartas partes. Si no es así, añade medio al maquillaje. Para el paso 1.11, los sEV pueden almacenarse a 4 °C durante un corto período (12 h); de lo contrario, deben almacenarse a -20 u -80 °C para evitar la degradación de proteínas que interfiere con la extracción de péptidos. Sin embargo, para las muestras utilizadas para observar la morfología y medir el tamaño de partícula, solo se recomienda almacenar a 4 °C durante un corto período (12 h).
2. Observación de la morfología de los sEV mediante microscopía electrónica de transmisión
- Coloque una gota de muestra fresca de sEVs (aproximadamente 20-30 μL) en el parafilm, coloque el lado numérico de la malla de cobre sobre la gota de sEVs y deje que se absorba durante 3 min.
- Absorbe el exceso de líquido con papel de filtro, y luego coloca la rejilla de cobre sobre una gota de agua destilada y lávala dos veces.
- Absorbe el exceso de líquido con papel de filtro. A continuación, coloque la rejilla de cobre sobre la gota de acetato de uranilo al 0,5% para una tinción negativa durante 5 s.
- Repita el paso 2.2.
- Coloque la malla de cobre preparada en la varilla de muestra e insértela en la etapa de muestra.
- Ajuste el aumento a 20.000x-25.000x para encontrar la muestra que se va a analizar. A continuación, ajuste el aumento a 100.000x y ajuste la posición y la escala de grises adecuadas para observar bajo un microscopio electrónico de transmisión (TEM; Tabla de Materiales). La tensión de aceleración para la adquisición de imágenes se establece en 80 kV.
NOTA: Para el paso 2.1, si la concentración de muestras de sEVs es baja (<50 μg/μL), el tiempo de adsorción puede extenderse a 5 min o incluso más. Alternativamente, para el paso 1.10, se puede utilizar un volumen menor de PBS (50 μL) para la resuspensión. Para el paso 2.3, el tiempo de tinción negativa no debe ser demasiado largo; de lo contrario, es difícil observar la estructura tridimensional (3D) de los vehículos eléctricos.
- Ajuste el aumento a 20.000x-25.000x para encontrar la muestra que se va a analizar. A continuación, ajuste el aumento a 100.000x y ajuste la posición y la escala de grises adecuadas para observar bajo un microscopio electrónico de transmisión (TEM; Tabla de Materiales). La tensión de aceleración para la adquisición de imágenes se establece en 80 kV.
3. Mediciones de la distribución del tamaño de partícula y la concentración de sEV mediante análisis de seguimiento de nanopartículas
- En el caso de los sEV cosechados en el paso 1.11, diluir la solución a 1 ml para el análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA). Primero, limpie el instrumento con agua destilada hasta que no haya impurezas en el campo de visión. A continuación, utilice una jeringa estéril de 1 ml para empujar la muestra lentamente (volumen de inyección: 0,5-1 ml).
- Analice las muestras a través de un software de soporte (consulte la tabla de materiales). En concreto, haga clic en Iniciar cámara y ajuste el nivel de la cámara a un tamaño adecuado (generalmente una intensidad de 14-16 unidades), luego seleccione el método de medición, Medición estándar (3 o 5 veces), y haga clic en Ejecutar para recoger las partículas.
- Después de recolectar las partículas, la computadora puede observar las partículas de sEV en movimiento. Al mismo tiempo, establezca el umbral de detección (generalmente 5) para analizar la distribución del tamaño de partícula, de modo que las partículas contadas finales sean todas sEV en movimiento en lugar del fondo. Después de analizar las partículas, guarde y exporte los resultados del análisis.
- Después de su uso, lave el instrumento con agua destilada hasta que no haya partículas obvias en el campo de visión y apague el láser.
NOTA: A diferencia de las muestras de sEV para TEM, las muestras de sEV para NTA no deben estar demasiado concentradas y requerir volúmenes de muestra más grandes (al menos 1 ml). Además, se pueden utilizar métodos alternativos para analizar la distribución de tamaño de los sEV, como la citometría de flujo y la detección de pulsos resistivos sintonizables (TRPS), etc. El número recomendado de partículas/fotogramas para las mediciones de NTA (NanoSight LM10) es de 40.
4. Detección de marcadores proteicos de sEVs mediante Western blot
NOTA: De acuerdo con las guías de Información mínima para estudios de vesículas extracelulares (MISEV) 201817,18, se recomiendan 5 categorías de proteínas para la caracterización de las sEV. Evalúe al menos un marcador proteico de cada categoría 1 a 4 para la preparación de sEVs.
- Para los sEV cosechados en el paso 1.9, pipetear cuidadosamente el sobrenadante y añadir 15 μL de tampón de lisis HEPES durante 5 min. Luego agregue una cantidad igual de tampón de carga y cocine en agua hirviendo durante 15 minutos.
- En este protocolo, la carga de la proteína de los sEVs fue de 8-10 μg. Electroforesar las proteínas en geles al 10% a un voltaje constante de 80 V (unos 30 min).
- Cuando la muestra entre en el gel separador, ajuste el voltaje a 120 V (unos 45 min). Después de que la muestra esté a 2-3 cm de distancia del fondo de la placa de vidrio, desconecte la fuente de alimentación y corte la tira de muestra para la electroporación. La composición de la solución de electroforesis se describe en el subpaso 4.2.1.1.
- Para preparar una solución de electroforesis 5x, pesar 15,1 g, 5 g y 94 g de Tris, SDS y glicina, respectivamente, y diluir a 1 L con agua desionizada. Cuando se usa, debe diluirse 5 veces con agua.
- Cuando la muestra entre en el gel separador, ajuste el voltaje a 120 V (unos 45 min). Después de que la muestra esté a 2-3 cm de distancia del fondo de la placa de vidrio, desconecte la fuente de alimentación y corte la tira de muestra para la electroporación. La composición de la solución de electroforesis se describe en el subpaso 4.2.1.1.
- Ensamble el dispositivo de electroporación y colóquelo en una solución de electroporación suficiente (aproximadamente 1 L) y electropore la proteína en la membrana de nitrocelulosa (NC) con una corriente constante de 90 mA en hielo durante 3,5 h.
NOTA: Para preparar 10 soluciones de electroporación, pesar 30,25 g y 144,1 g de Tris y glicina, respectivamente, y diluir a 1 L con agua desionizada. Cuando se utiliza, debe prepararse en una proporción de 7:2:1 de agua desionizada: metanol: solución de electroporación. - Después de la electroporación, colocar la membrana NC en solución de bloqueo (2,5 g de leche desnatada en polvo en 50 ml de solución salina tamponada con Tris con 0,1% Tween 20 (TBST) durante 1-2 h a RT o durante la noche a 4 °C. La composición del TBST se describe en el subpaso 4.4.1.
- Para preparar 10x TBST, pesar 60,56 g y 175,32 g de Tris y NaCl, respectivamente, y luego agregar 10 mL de Tween-20 y 34 mL de ácido clorhídrico concentrado. Ajustar pH = 7,6 con ácido clorhídrico concentrado y reponer a 2 L con agua desionizada. Cuando se usa, debe diluirse diez veces con agua.
- Identificar los marcadores proteicos mediante tres marcadores de sEVs (cluster de diferenciación 9 [CD9]; β-actina; gen de susceptibilidad tumoral [TSG101]) y un marcador no sEVs (proteína 94 regulada por glucosa [GRP94]).
- Pipetear 2 μL de los anticuerpos anteriores y diluir a 1:500, luego incubar las membranas NC a RT durante 3 h o durante la noche a 4 °C. El diluyente es la solución de bloqueo en el paso 4.4.
- Después de la incubación con el anticuerpo primario, lavar 3 veces con 1x TBST en un agitador durante 10 minutos cada vez.
- Colocar la membrana NC en el anticuerpo secundario diluido (1:500) y agitar lentamente en un agitador a temperatura media durante 45-50 min. Lávelo 3 veces con 1x TBST en una coctelera durante 10 minutos cada vez.
- Mezclar los sustratos quimioluminiscentes A y B (ver Tabla de Materiales) a 1:1, añadir el reactivo mezclado a la membrana NC e incubar a RT durante 5 min.
- Obtener imágenes de la membrana NC utilizando un generador de imágenes de transferencia (consulte la Tabla de materiales)
- Abra el software Image Lab y seleccione Nuevo protocolo experimental.
- Seleccione la aplicación Blotting-colorimetric, cancele Resaltar, haga clic en Ejecutar protocolo experimental, adquiera el marcador y guárdelo.
- A continuación, vuelva a seleccionar el programa de aplicación Blotting-chemi, y ajuste el número total de imágenes y el tiempo de exposición a 30 s y 300 s, respectivamente.
- Haga clic en Ejecutar protocolo experimental, adquiera las imágenes y guárdelas. Finalmente, retire la membrana NC y apague la computadora.
NOTA: Para el paso 4.6, el tiempo de incubación del anticuerpo secundario no debe exceder los 50 min; de lo contrario, el fondo será demasiado oscuro.
5. Extracción de péptidos de sEVs
- Lavar los sEV dos veces por ultracentrifugación a 110.000 × g a 4 °C durante 70 min, y añadir 500 μL de PBS (ver Tabla de Materiales) para resuspenderlos, y añadir 5 μL de inhibidor de la proteasa 100x (ver Tabla de Materiales).
- Coloque la muestra para la trituración ultrasónica (consulte la Tabla de materiales). Los ajustes para la homogeneización ultrasónica son los siguientes: potencia: 40 W, tiempo total: 10 min, tiempo ultrasónico: 3 s y tiempo de intervalo: 5 s.
- Centrifugar la mezcla triturada a 13.700 × g durante 15 min a 4 °C.
- Después de la centrifugación, agregue ditiotreitol (DTT; Tabla de Materiales) al sobrenadante hasta una concentración final de 50 mmol/L, e incubar en baño maría a 56 °C durante 30 min.
- Posteriormente, añadir 50 μL de yodoacetamida (IAA; Tabla de Materiales) al sobrenadante a una concentración de 1 mol/L y dejarlo reaccionar a RT durante 20 min en la oscuridad.
- Centrifugar la mezcla a 13.700 × g a 4 °C durante 15 min, y recoger el sobrenadante, el extracto de péptidos crudos. Guárdelo a -20 °C para su uso posterior.
- Ultrafiltrar los péptidos obtenidos del extracto crudo con tubos de ultrafiltración de10 kDa 19 (ver Tabla de Materiales) para eliminar las proteínas, y centrifugar a 13.700 × g a 4 °C durante 1 h. Recoger el efluente y secarlo en un concentrador centrífugo al vacío (ver Tabla de Materiales) a 45 °C.
- Desalar las muestras secas siguiendo los pasos 5.8.1-5.8.8. Utilice agua pura de grado de espectrometría de masas como disolvente para los reactivos.
- Añadir 100 μL de ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1% a cada muestra para disolver completamente los péptidos secos.
- Agregue 100 μL de acetonitrilo al 100% (ACN) a cada columna de desalinización, centrifugue a 400 × g durante 3 min a RT y deseche el efluente. A continuación, añadir 100 μL de ACN al 50%, centrifugar a 400 × g durante 3 min, y desechar el efluente.
- Añadir 100 μL de AGT al 0,1% a cada columna de desalinización, centrifugar a 400 × g durante 3 min y desechar el efluente.
- Repita el paso 5.8.3.
- Pipetear los péptidos disueltos en el paso 5.8.1 en la columna de desalinización, centrifugar a 400 × g durante 3 min y recuperar el efluente. Repita el paso de carga de la muestra para permitir que la muestra peptídica se adsorba en la columna de desalinización.
- Repita el paso 5.8.3 dos veces.
- Añadir 50 μL de ACN al 50% (que contenga 0,1% de AGT) a la columna de desalinización, centrifugar a 400 × g durante 3 min y recoger el efluente (péptidos) en un nuevo tubo de centrífuga de grado de espectrometría de masas.
6. Secado de los péptidos desalados
- Secar los péptidos desalados en un concentrador centrífugo al vacío (Ajustes: modo V-AQ , temperatura: 45 °C y tiempo: 50 min) y utilizarlos para el posterior análisis de espectrometría de masas.
NOTA: El proceso de extracción de los péptidos de los sEV debe realizarse en hielo tanto como sea posible para evitar la degradación de las proteínas. Todos los reactivos utilizados se prepararon con agua de grado de espectrometría de masas para evitar la contaminación plástica. Para el paso 5.8, la desalinización da como resultado la pérdida inevitable de las muestras de péptidos. Esta pérdida puede reducirse repitiendo los pasos 5.8.5 y 5.8.7.
7. Análisis de cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS)
NOTA: Analice la muestra de los péptidos mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS), específicamente el espectrómetro de masas Orbitrap Q Exactive HF-X conectado con un sistema de LC de nano-alto rendimiento EASY-nLC 1000 (consulte la Tabla de materiales).
- Separar las muestras en una columna analítica C18 (1,9 μm de diámetro de grano, 15 cm de longitud x 150 μm de diámetro interior) a un caudal de 60 nL/min con un gradiente de 65 min: 4%-15% durante 4 min, 15%-28% durante 28 min, 28%-40% durante 10 min, 40%-69% durante 10 min, 95% constante durante 7 min, 95% disminuido a 6% durante 1 min, y constante durante 5 min (disolvente A, agua que contiene 0,1% de ácido fórmico [AG]; disolvente B, 80% de acetonitrilo que contiene 0,1% de FA, v/v).
- Ionizar los péptidos eluidos en un pulverizador de ionización por nano-electrospray (nano-ESI) a una temperatura capilar de 320 °C y una tensión de pulverización de 2,2 kV.
- Recopile los datos espectrales de masas utilizando el modo de adquisición dependiente de datos con una potencia de resolución de 120.000 para el modo de escaneo completo y 15.000 en el modo MS /MS .
- Realice escaneos completos en el orbitrap desde un rango de escaneo de 250 m/z a 1800 m/z y una ventana de aislamiento con 1,6 m/z.
- Seleccione los 20 iones más intensos para la fragmentación de disociación colisional (HCD) de mayor energía con una energía de colisión normalizada del 29% y mida en el separador de iones.
NOTA: Las condiciones típicas de espectrometría de masas fueron las siguientes: Los objetivos de control automático de ganancia (AGC) fueron 3 x 106 iones para escaneos completos y 2 x 105 para escaneos MS/MS; el tiempo máximo de inyección fue de 80 ms para las exploraciones completas y de 19 ms para las exploraciones MS/MS; y se utilizó la exclusión dinámica durante 13 s.
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Representative Results
Para los sEVs aislados por ultracentrifugación diferencial (Figura 1), se evaluó su morfología, distribución granulométrica y marcadores proteicos según la Sociedad Internacional de Vesículas Extracelulares (ISEV)17.
En primer lugar, la morfología de los sEV fue observada por TEM, mostrando una estructura típica en forma de copa (Figura 2A). La NTA mostró que los sEV aislados se concentraban principalmente a 136 nm (Figura 2B), lo que era consistente con el tamaño reportado (30-150 nm)1. Finalmente, los marcadores proteicos de los sEVs se identificaron mediante Western blot. Los resultados mostraron que los sEV aislados estaban significativamente enriquecidos con los marcadores de los sEV, incluidos CD9, β-actina y TSG101. El marcador del retículo endoplásmico, GRP94, solo se detectó en el lisado de toda la célula (Figura 2C). Estos resultados indicaron que los métodos empleados dieron como resultado un alto nivel de pureza para los sEV aislados.
Figura 1: Representación esquemática del aislamiento de sEV mediante ultracentrifugación diferencial. Realice todas las centrifugaciones a 4 °C. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Caracterización de los sEV derivados de iBMDM. (A) SEVs aislados observados por microscopía electrónica de transmisión. Barra de escala: 200 nm. (B) Tamaño de partícula de los sEV aislados mediante análisis de seguimiento de nanopartículas. (C) Identificación de los marcadores de sEVs y no sEVs de sEVs por Western blot. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Al investigar la función de los sEV, es imperativo obtener sEV de alta pureza a partir de muestras biológicas complejas para evitar cualquier contaminación potencial. Se han desarrollado una variedad de métodos para el aislamiento de los sEV13, y entre estos métodos, los métodos basados en la ultracentrifugación diferencial han demostrado una pureza relativamente alta de los sEV. En este estudio, se recolectaron 200 mL de sobrenadante celular durante 6 h, y se obtuvieron alrededor de 200-300 μg de sEVs por ultracentrifugación diferencial. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que el gránulo de sEV puede no ser visible durante la ultracentrifugación (paso 1.8). Por lo tanto, se recomienda pipetear el fondo de los tubos tanto como sea posible. Este paso es fundamental y afectará directamente al rendimiento de los vehículos eléctricos. Además, se requiere una mayor optimización del protocolo para mejorar el rendimiento, como extender el tiempo de centrifugación o el período de recolección del sobrenadante celular cuando los sEV se precipitan a 110.000 × g (pasos 1.8 y 1.9). Aunque los sEV aislados por ultracentrifugación diferencial tienen una alta pureza, también lleva mucho tiempo.
Con los avances en la tecnología moderna de espectrometría de masas y las bases de datos genéticos, se han identificado decenas de miles de péptidos en los tejidos y fluidos corporales de varios organismos, que difieren significativamente en la fuente, la abundancia yla función biológica. Los peptidomas basados en LC-MS/MS proporcionan un enfoque integral para investigar la composición, el cambio dinámico y la función del peptidomo sEV. Sin embargo, la baja abundancia de péptidos en los sEV hace que la identificación del peptidoma de los sEV sea inestable. Además, la extracción de péptidos debe realizarse en hielo para evitar que la degradación de las proteínas interfiera con la identificación de los péptidos. En este estudio, 2-4 μg de péptidos requirieron casi 1 mg de sEV para el análisis de peptidomas. Esto requiere un tamaño de muestra mayor que la proteómica de los sEV. Al mismo tiempo, debido a la concentración extremadamente baja de péptidos en los sEV, se debe prestar más atención a la contaminación plástica que a la proteómica. Tanto si se trata de un cultivo celular como de una preparación de reactivos, utilice consumibles de grado de espectrometría de masas en la medida de lo posible. Por lo tanto, se necesitan métodos de extracción de péptidos más optimizados para aumentar el número de péptidos identificados en los sEV. Además, la base de datos de peptidoma no está completa, lo que limita el progreso de la investigación de peptidoma de sEV.
En la actualidad, la mayoría de los estudios sobre los sEV se centran en las proteínas y microARN que transportan, y se sabe poco sobre sus componentes peptídicos 4,21,22. Este artículo proporciona un protocolo sencillo y fácil de seguir para el estudio de los péptidos de los sEV con el fin de desentrañar aún más la función biológica de los sEV desde la perspectiva del peptidomo.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Acknowledgments
Este estudio contó con el apoyo de subvenciones de la Fundación de Ciencias Naturales de China (3157270). Agradecemos al Dr. Feng Shao (Instituto Nacional de Ciencias Biológicas, China) por proporcionar iBMDM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BCA Protein Assay Kit | Beyotime Technology | P0012 | |
| CD9 | Beyotime Technology | AF1192 | |
| Centrifugal filter tube | Millipore | UFC5010BK | |
| Centrifuge bottles polypropylene | Beckman Coulter | 357003 | High-speed centrifuge |
| Chemiluminescent substrate | Thermo Fisher Scientific | 34580 | |
| Dithiothreitol | Solarbio | D8220 | 100 g |
| DMEM culture medium | Cell World | N?A | |
| GRP94 | Cell Signaling Technology | 20292 | |
| High-speed centrifuge | Beckman Coulter | Avanti JXN-26 | Centrifuge rotor (JA-25.50) |
| Immortalized bone marrow-derived macrophages (iBMDM) | National Institute of Biological Sciences, China | Provided by Dr. Feng Shao (National Institute of Biological Sciences, China) | |
| Iodoacetamide | Sigma | l1149 | 5 g |
| Microfuge tube polypropylene | Beckman Coulter | 357448 | 1.5 mL, Tabletop ultracentrifuge |
| nano-high-performance LC system | Thermo Fisher Scientific | EASY-nLC 1000 | |
| Nanoparticle tracking analysis | Malvern Panalytical | NanoSight LM10 | NanoSight NTA3.4 |
| Orbitrap Q Exactive HF-X mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Phosphate-buffered saline | Solarbio | P1020 | |
| Polyallomer centrifuge tubes | Beckman Coulter | 326823 | Ultracentrifuge |
| Protease inhibitor | Bimake | B14002 | |
| SpeedVac vacuum concentrator | Eppendorf | Concentrator plus | |
| Tabletop ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima MAX-XP | Ultracentrifuge rotor (TLA 55) |
| Transmission electron microscope | HITACHI | H-7650B | |
| TSG101 | Sigma | AF8258 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima XPN-100 | Ultracentrifuge rotor (SW32 Ti) |
| Ultrasonic cell disruptor | Scientz | SCIENTZ-IID | |
| Western Blot imager | Bio-Rad | ChemiDocXRs | Image lab 4.0 (beta 7) |
| β-actin | Sigma | A3853 |
References
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