Summary
Denne protokollen beskriver en prosedyre for å isolere små ekstracellulære vesikler fra makrofager ved differensiell ultrasentrifugering og ekstrahere peptidomet for identifisering ved massespektrometri.
Abstract
Små ekstracellulære vesikler (sEVs) utskilles vanligvis ved eksocytose av multivesikulære legemer (MVB). Disse nanovesiklene med en diameter på <200 nm er tilstede i forskjellige kroppsvæsker. Disse sEV-ene regulerer ulike biologiske prosesser som gentranskripsjon og -translasjon, celleproliferasjon og overlevelse, immunitet og betennelse gjennom lasten, som proteiner, DNA, RNA og metabolitter. For tiden er det utviklet forskjellige teknikker for isolering av sEV. Blant dem regnes den ultrasentrifugeringsbaserte metoden som gullstandarden og er mye brukt for sEV-isolasjon. Peptidene er naturlig biomakromolekyler med mindre enn 50 aminosyrer i lengde. Disse peptidene deltar i en rekke biologiske prosesser med biologisk aktivitet, som hormoner, nevrotransmittere og cellevekstfaktorer. Peptidomet er ment å systematisk analysere endogene peptider i spesifikke biologiske prøver ved væskekromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS / MS). Her introduserte vi en protokoll for å isolere sEV ved differensiell ultrasentrifugering og ekstrahert peptidom for identifisering av LC-MS / MS. Denne metoden identifiserte hundrevis av sEVs-avledede peptider fra beinmargsavledede makrofager.
Introduction
Små ekstracellulære vesikler (sEV) med en diameter på mindre enn 200 nm er tilstede i nesten alle typer kroppsvæsker og utskilles av alle slags celler, inkludert urin, svette, tårer, cerebrospinalvæske og fostervann1. I utgangspunktet ble sEV ansett som beholdere for avhending av cellulært avfall, noe som førte til minimal forskning i det påfølgende tiåret2. Nylig indikerer økende bevis at sEVs inneholder spesifikke proteiner, lipider, nukleinsyrer og andre metabolitter. Disse molekylene transporteres til målceller3, noe som bidrar til intercellulær kommunikasjon, hvorved de deltar i ulike biologiske prosesser, for eksempel vevsreparasjon, angiogenese, immunitet4 og betennelse5,6, tumorutvikling og metastase 7,8,9, etc.
For å lette studiet av sEV-er er det viktig å isolere sEV-er fra komplekse prøver. Ulike sEVs isolasjonsmetoder er utviklet basert på de fysiske og kjemiske egenskapene til sEV-er, for eksempel tetthet, partikkelstørrelse og overflatemarkørproteiner. Disse teknikkene inkluderer ultrasentrifugeringsbaserte metoder, partikkelstørrelsesbaserte metoder, immunoaffinitetsfangstbaserte metoder, sEVs utfellingsbaserte metoder og mikrofluidikkbaserte metoder10,11,12. Blant disse teknikkene er den ultrasentrifugeringsbaserte metoden anerkjent som gullstandarden for sEVs isolasjon og er den mest brukte teknikken13.
En økende mengde bevis tyder på tilstedeværelsen av en rekke uoppdagede biologisk aktive peptider i peptidomer av forskjellige organismer. Disse peptidene bidrar betydelig til mange fysiologiske prosesser ved å regulere vekst, utvikling, stressrespons 14,15 og signaltransduksjon16. Målet med sEVs peptidom er å avdekke peptidene som bæres av disse sEVene og gi ledetråder til deres biologiske funksjoner. Her presenterer vi en protokoll for å isolere sEV gjennom differensiell ultrasentrifugering, etterfulgt av ekstraksjon av peptider fra disse sEVene for videre analyse av deres peptidom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Isolering av små ekstracellulære vesikler
MERK: Utfør all sentrifugering i trinn 1.1-1.11 ved 4 °C.
- Tilberedning av sEVs-fritt føtalt bovint serum (FBS): Sentrifuge FBS over natten ved 110 000 × g ved 4 °C gjennom en ultrasentrifuge (se materialtabell) for å fjerne endogene sEV. Samle supernatanten, filtrer steriliser den med en 0,2 μm ultrafiltreringsmembran, og oppbevar den ved -20 °C.
- Plate ca 3 x 107 immortaliserte benmargsavledede makrofager (iBMDM) på en 150 mm dyrkningsskål og tilsett 20 ml DMEM kulturmedium (se materialfortegnelse).
- Før du henter sEV, må du kaste mediet. Vask cellene en gang med PBS (fosfatbufret saltvann; Tabell over materialer) og erstatt den med et medium som inneholder 10% sEVs-fri FBS.
- I henhold til forsøkets behov, samle cellesupernatanten og overfør den til 50 ml sentrifugerør.
- Sentrifuger cellesupernatanten ved 300 × g i 10 minutter for å fjerne cellene, kaste pelleten og overføre supernatanten til nye 50 ml sentrifugerør.
- Sentrifuger supernatanten ved 2000 × g i 10 minutter for å fjerne døde celler, kaste pelleten og overføre supernatanten til nye høyhastighets sentrifugerør (se materialfortegnelse).
- Sentrifuge supernatanten ved 10 000 × g i 30 minutter gjennom en høyhastighets sentrifuge for å fjerne cellerester og mikrovesikler, kaste pelleten og overføre supernatanten til nye ultrasentrifugerør (se materialfortegnelse). Volumet av de åpne ultrasentrifugerørene er 38, 6 ml; plasser 35 ml cellesupernatant i hvert rør.
- Sentrifuge supernatanten ved 110 000 × g i 70 minutter i en svingbøtte rotorsentrifuge (se materialtabell) for å oppnå rå sEV-pellet.
- Kast supernatanten, og vask den sEVs-berikede pelleten med 1 ml PBS. Sentrifuge ved 110 000 × g i 70 min på en bordplate ultrasentrifuge (se materialfortegnelse). Kast supernatanten og tilsett 1 ml PBS til et ultrasentrifugerør.
- Deretter pipetterer bunnfallet kontinuerlig, overfører 1 ml PBS til et annet ultracentrifugerør, og så videre, til alle ultracentrifugerør blandes ved pipettering.
- Kast supernatanten, og resuspender pelleten i 100 μL PBS, som er sEVs.
- Mål det totale proteinet av sEVs ved hjelp av bicinchoninsyre (BCA) -metoden, ved å følge trinnene nedenfor (se materialtabellen).
- Fremstilling av proteinstandard: Tilsett 1,2 ml proteinprepareringsoppløsning i et standard proteinrør (30 mg BSA) for å fullstendig oppløse det for å fremstille proteinstandardløsning (25 mg / ml). Fortynn den deretter med PBS til en endelig konsentrasjon på 0,5 mg/ml.
- Tilsett 0 μL, 1 μL, 2 μL, 4 μL, 8 μL, 12 μL, 16 μL og 20 μL av proteinstandarden i 96-brønnplaten, og tilsett PBS for å utgjøre 20 μL. Samtidig tilsettes 18 μL HEPES-lysebuffer (20 mM HEPES, 50 mM NaCl, 1 mM NaF, 0,5 % Triton X-100) og 2 μL sEV-prøver til prøvebrønnene som skal testes.
- Forbered den nødvendige BCA-arbeidsløsningen i henhold til produsentens instruksjoner, tilsett 200 μL BCA-arbeidsløsning til hver brønn og sett ved romtemperatur (RT) i 20-30 minutter.
- Mål absorbansen ved 562 nm bølgelengde med en mikroplateleser, og beregne den totale proteinkonsentrasjonen av sEV i henhold til standardkurven og fortynningsfaktoren.
MERK: sEVene ekstrahert fra 40 ml supernatant ved denne protokollen kan brukes til senere identifisering av proteinmarkører (western blot). Imidlertid kan sEV ekstrahert fra 200 ml cellesupernatant brukes til både morfologisk observasjon (transmisjonselektronmikroskopi, TEM) og partikkelstørrelsesanalyse (nanopartikkelsporingsanalyse, NTA). Spesielt for sEV-er høstet i trinn 1.11, resuspender med 100 μL PBS. Ta 20-30 μL for morfologiobservasjon (TEM) og resuspender den gjenværende prøven i 1 ml PBS for partikkelstørrelsesanalyse (NTA). Alle sentrifuger er forkjølt på forhånd. For trinn 1.8 må disse ultrasentrifugerørene være strengt balansert og minst tre fjerdedeler fulle. Hvis ikke, legg medium til sminke. For trinn 1.11 kan sEV-ene lagres ved 4 °C i en kort periode (12 timer); Ellers må de oppbevares ved -20 eller -80 °C for å unngå proteinnedbrytning som forstyrrer ekstraksjonen av peptider. For prøver som brukes til å observere morfologien og måle partikkelstørrelsen, anbefales det imidlertid bare å lagre ved 4 °C i kort tid (12 timer).
2. Observasjon av sEVs morfologi ved transmisjonselektronmikroskopi
- Legg en dråpe fersk sEV-prøve (ca. 20-30 μL) på parafilmen, plasser nummersiden av kobbernettet på sEV-dråpen, og la den absorbere i 3 min.
- Absorber overflødig væske med filterpapir, og legg deretter kobbergitteret på en dråpe destillert vann og vask det to ganger.
- Absorber overflødig væske med filterpapir. Legg deretter kobbergitteret på 0,5% uranylacetatdråpen for negativ farging i 5 s.
- Gjenta trinn 2.2.
- Plasser det forberedte kobbernettet på prøvestangen og sett det inn i prøvetrinnet.
- Juster forstørrelsen til 20 000 x til 25 000 x for å finne prøven som skal testes. Juster deretter forstørrelsen til 100 000x og juster riktig posisjon og gråtoner for å observere under et transmisjonselektronmikroskop (TEM; Materialfortegnelse). Akselerasjonsspenningen for anskaffelse av bilder er satt til 80 kV.
MERK: For trinn 2.1, hvis konsentrasjonen av sEV-prøver er lav (<50 μg / μL), kan adsorpsjonstiden forlenges til 5 minutter eller enda lenger. Alternativt, for trinn 1.10, kan et mindre volum PBS (50 μL) brukes til resuspensjon. For trinn 2.3 bør den negative fargetiden ikke være for lang; Ellers er det vanskelig å observere den tredimensjonale (3D) strukturen til sEV.
- Juster forstørrelsen til 20 000 x til 25 000 x for å finne prøven som skal testes. Juster deretter forstørrelsen til 100 000x og juster riktig posisjon og gråtoner for å observere under et transmisjonselektronmikroskop (TEM; Materialfortegnelse). Akselerasjonsspenningen for anskaffelse av bilder er satt til 80 kV.
3. Målinger av partikkelstørrelsesfordeling og konsentrasjon av sEVs ved nanopartikkelsporingsanalyse
- For sEV-ene som ble høstet i trinn 1.11, fortynn løsningen til 1 ml for nanopartikkelsporingsanalyse (NTA). Rengjør først instrumentet med destillert vann til det ikke er urenheter i synsfeltet. Bruk deretter en 1 ml sprøyte til å skyve prøven langsomt (injeksjonsvolum: 0,5-1 ml).
- Analyser eksemplene gjennom støttende programvare (se Materialfortegnelse). Klikk spesifikt på Start kamera og juster kameranivået til en passende størrelse (vanligvis en intensitet på 14–16 enheter), velg deretter målemetode, Standardmåling (3 eller 5 ganger), og klikk Kjør for å samle partiklene.
- Etter å ha samlet partiklene, kan datamaskinen observere de bevegelige sEV-partiklene. Sett samtidig deteksjonsterskelen (vanligvis 5) for å analysere partikkelstørrelsesfordelingen slik at de endelige telte partiklene alle beveger seg i stedet for bakgrunnen. Etter å ha analysert partiklene, lagre og eksporter analyseresultatene.
- Etter bruk, vask instrumentet med destillert vann til det ikke er noen åpenbare partikler i synsfeltet, og slå av laseren.
MERK: I motsetning til sEV-prøver for TEM, bør sEV-prøver for NTA ikke være for konsentrerte og kreve større prøvevolumer (minst 1 ml). I tillegg kan alternative metoder brukes til å analysere størrelsesfordelingen av sEVs, for eksempel flowcytometri og justerbar resistiv puls sensing (TRPS), etc. Anbefalt antall partikler/rammer for NTA-målinger (NanoSight LM10) er 40.
4. Påvisning av proteinmarkører for sEVs av western blot
MERK: I henhold til Minimal informasjon for studier av ekstracellulære vesikler (MISEV) 2018 retningslinjer17,18, anbefales 5 kategorier proteiner for karakterisering av sEV. Evaluer minst en proteinmarkør for hver kategori 1 til 4 for tilberedning av sEV.
- For sEV-ene som høstes i trinn 1.9, pipetter supernatanten forsiktig og tilsett 15 μL HEPES lysisbuffer i 5 minutter. Tilsett deretter like mye lastbuffer og kok i kokende vann i 15 minutter.
- I denne protokollen var belastningen av sEVs protein 8-10 μg. Elektroforese proteinene i 10% geler ved en konstant spenning på 80 V (ca. 30 min).
- Når prøven kommer inn i separasjonsgelen, juster spenningen til 120 V (ca. 45 min). Etter at prøven er 2-3 cm fra bunnen av glassplaten, kobler du fra strømforsyningen og kutter av prøvestrimmelen for elektroporering. Sammensetningen av elektroforeseoppløsning er beskrevet i undertrinn 4.2.1.1.
- For å forberede 5x elektroforeseoppløsning, vei henholdsvis 15,1 g, 5 g og 94 g Tris, SDS og glycin og fortynn til 1 L med avionisert vann. Når den brukes, må den fortynnes 5 ganger med vann.
- Når prøven kommer inn i separasjonsgelen, juster spenningen til 120 V (ca. 45 min). Etter at prøven er 2-3 cm fra bunnen av glassplaten, kobler du fra strømforsyningen og kutter av prøvestrimmelen for elektroporering. Sammensetningen av elektroforeseoppløsning er beskrevet i undertrinn 4.2.1.1.
- Monter elektroporeringsenheten og sett inn tilstrekkelig elektroporeringsløsning (ca. 1 L), og elektroporer proteinet på nitrocellulosemembranen (NC) med en konstant strøm på 90 mA på is i 3,5 timer.
MERK: For å forberede 10x elektroporasjonsløsning, vei henholdsvis 30,25 g og 144,1 g Tris og glycin og fortynn til 1 L med avionisert vann. Når den brukes, må den fremstilles i forholdet 7: 2: 1 av avionisert vann: metanol: elektroporasjonsløsning. - Etter elektroporering, plasser NC-membranen i blokkeringsløsning (2,5 g skummetmelkpulver i 50 ml Tris-bufret saltvann med 0,1% Tween 20 (TBST) i 1-2 timer ved RT eller over natten ved 4 ° C. Sammensetningen av TBST er beskrevet i deltrinn 4.4.1.
- For å forberede 10x TBST, vei henholdsvis 60,56 g og 175,32 g Tris og NaCl, og tilsett deretter 10 ml Tween-20 og 34 ml konsentrert saltsyre. Juster pH = 7,6 med konsentrert saltsyre og sminke til 2 L med avionisert vann. Når den brukes, må den fortynnes ti ganger med vann.
- Identifiser proteinmarkørene ved hjelp av tre sEVs markører (klynge av differensiering 9 [CD9]; β-aktin; tumorfølsomhetsgen [TSG101]) og en ikke-sEVs markør (glukoseregulert protein 94 [GRP94]).
- Pipett 2 μL av de ovennevnte antistoffene og fortynn ved 1:500, inkuber deretter NC-membranene ved RT i 3 timer eller over natten ved 4 °C. Fortynningsvæsken er den blokkerende løsningen i trinn 4.4.
- Etter inkubering med det primære antistoffet, vask 3 ganger med 1x TBST på en shaker i 10 minutter hver gang.
- Plasser NC-membranen i det fortynnede sekundære antistoffet (1:500) og rist sakte på en shaker ved RT i 45-50 min. Vask den 3 ganger med 1x TBST på en shaker i 10 min hver gang.
- Bland de kjemiluminescerende substratene A og B (se materialfortegnelse) ved 1: 1, tilsett det blandede reagenset til NC-membranen, og inkuber ved RT i 5 minutter.
- Avbilde NC-membranen ved hjelp av en blot-avbildning (se materialfortegnelse)
- Åpne Image Lab-programvaren , og velg New Experimental Protocol.
- Velg applikasjonen Blotting-colorimetric, avbryt Highlight, klikk Run Experimental Protocol, hent markøren og lagre den.
- Velg deretter applikasjonsprogrammet Blotting-chemi på nytt, og sett Totalt antall bilder og Eksponeringstid til henholdsvis 30 s og 300 s.
- Klikk Kjør eksperimentell protokoll, hent bildene og lagre dem. Til slutt fjerner du NC-membranen og slår av datamaskinen.
MERK: For trinn 4.6 bør inkubasjonstiden til det sekundære antistoffet ikke overstige 50 minutter; Ellers blir bakgrunnen for mørk.
5. Ekstraksjon av sEVs peptider
- Vask sEVene to ganger ved ultrasentrifugering ved 110 000 × g ved 4 °C i 70 minutter, og tilsett 500 μL PBS (se materialfortegnelse) for å resuspendere dem, og tilsett 5 μL 100x proteasehemmer (se materialfortegnelse).
- Plasser prøven for ultralydknusing (se Materialfortegnelse). Innstillinger for ultralyd homogenisering er som følger: effekt: 40 W, total tid: 10 min, ultralydstid: 3 s, og intervalltid: 5 s.
- Sentrifuger den knuste blandingen ved 13 700 × g i 15 minutter ved 4 °C.
- Etter sentrifugering, tilsett dithiothreitol (DTT; Tabell over materialer) til supernatanten til en endelig konsentrasjon på 50 mmol/l, og ruges i vannbad ved 56 °C i 30 minutter.
- Deretter tilsettes 50 μL iodoacetamid (IAA; Tabell over materialer) til supernatanten i en konsentrasjon på 1 mol/l og la den reagere ved RT i 20 minutter i mørket.
- Sentrifuger blandingen ved 13 700 × g ved 4 °C i 15 minutter, og samle supernatanten, ekstraktet av råpeptider. Oppbevares ved -20 °C for senere bruk.
- Ultrafiltrer de oppnådde peptidene råekstrakt med et 10 kDa ultrafiltreringsrør 19 (se materialtabell) for å fjerne proteiner, og sentrifuge ved13 700 × g ved 4 ° C i 1 time. Samle opp avløpsvannet og tørk det i en vakuumsentrifugalkonsentrator (se materialfortegnelse) ved 45 °C.
- Desalt de tørkede prøvene ved å følge trinn 5.8.1-5.8.8. Bruk massespektrometri-klasse rent vann som løsemiddel for reagensene.
- Tilsett 100 μL 0,1% trifluoreddiksyre (TFA) til hver prøve for å fullstendig oppløse de tørkede peptidene.
- Tilsett 100 μL 100 % acetonitril (ACN) til hver avsaltingskolonne, sentrifuge ved 400 × g i 3 minutter ved RT, og kast avløpsvannet. Tilsett deretter 100 μL 50 % ACN, sentrifuge ved 400 × g i 3 minutter, og kast avløpsvannet.
- Tilsett 100 μL 0,1 % TFA til hver avsaltingskolonne, sentrifuge ved 400 × g i 3 minutter, og kast avløpsvannet.
- Gjenta trinn 5.8.3.
- Pipetter peptidene oppløst i trinn 5.8.1 i avsaltingskolonnen, sentrifuge ved 400 × g i 3 minutter, og gjenvinn avløpsvannet. Gjenta prøvelastingstrinnet for å la peptidprøven adsorbere i avsaltingskolonnen.
- Gjenta trinn 5.8.3 to ganger.
- Tilsett 50 μL 50 % ACN (inneholdende 0,1 % TFA) til avsaltingskolonnen, sentrifuge ved 400 × g i 3 minutter, og samle avløpsvannet (peptidene) i et nytt sentrifugerør av massespektrometrikvalitet.
6. Tørking av avsaltede peptider
- Tørk de avsaltede peptidene i en vakuumsentrifugalkonsentrator (Innstillinger: V-AQ-modus , temperatur: 45 °C og tid: 50 min) og bruk dem til påfølgende massespektrometrianalyse.
MERK: Ekstraksjonsprosessen av sEVs peptider bør utføres på is så mye som mulig for å unngå proteinnedbrytning. Alle reagenser som ble brukt ble fremstilt med vann av massespektrometrikvalitet for å unngå plastforurensning. For trinn 5.8 resulterer avsalting i uunngåelig tap av peptidprøvene. Dette tapet kan reduseres ved å gjenta trinn 5.8.5 og 5.8.7.
7. Væskekromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS / MS) analyse
MERK: Analyser peptidenes prøve ved væskekromatografi-tandemmassespektrometri (LC-MS / MS), spesielt Orbitrap Q Exactive HF-X massespektrometer koblet til et EASY-nLC 1000 nano-høyytelses LC-system (se materialfortegnelse).
- Separer prøvene på en C18 analytisk kolonne (1,9 μm korndiameter, 15 cm lengde x 150 μm indre diameter) med en strømningshastighet på 60 nL / min med en 65 min gradient: 4% -15% i 4 min, 15% -28% i 28 min, 28% -40% i 10 min, 40% -69% i 10 min, 95% konstant i 7 minutter, 95 % ble redusert til 6 % i 1 min, og konstant i 5 minutter (oppløsningsmiddel A, vann inneholdende 0,1 % maursyre [FA]; oppløsningsmiddel B, 80 % acetonitril inneholdende 0,1 % FA, v/v).
- Ioniser de eluerte peptidene i en nano-elektrospray ionisering (nano-ESI) sprøyte ved 320 ° C kapillærtemperatur og sprøytespenning på 2,2 kV.
- Samle massespektrale data ved hjelp av dataavhengig innsamlingsmodus med en oppløsningsevne på 120 000 for full skannemodus og 15 000 ved MS / MS-modus .
- Utfør fulle skanninger i orbitrap fra skanneområde 250 m/z til 1800 m/z og isolasjonsvindu med 1,6 m/z.
- Velg de 20 beste intense ionene for HCD-fragmentering (høyere energikollisjonsdissosiasjon) med en normalisert kollisjonsenergi på 29 % og mål i ioneseparatoren.
MERK: Typiske massespektrometriske forhold var som følger: Mål for automatisk forsterkningskontroll (AGC) var 3 x 106 ioner for fulle skanninger og 2 x 105 for MS / MS-skanninger; maksimal injeksjonstid var 80 ms for fullstendige skanninger og 19 ms for MS/MS-skanninger. og dynamisk ekskludering ble brukt i 13 s.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For sEV-ene isolert ved differensiell ultrasentrifugering (figur 1) evaluerte vi deres morfologi, partikkelstørrelsesfordeling og proteinmarkører i henhold til International Society for Extracellular Vesicles (ISEV)17.
Først ble morfologien til sEV observert av TEM, som viste en typisk kopplignende struktur (figur 2A). NTA viste at isolerte sEV for det meste var konsentrert ved 136 nm (figur 2B), noe som var konsistent med rapportert størrelse (30-150 nm)1. Til slutt ble sEVs proteinmarkører identifisert av western blot. Resultatene viste at isolerte sEV-er var signifikant beriket av sEVs markører, inkludert CD9, β-aktin og TSG101. Den endoplasmatiske retikulummarkøren, GRP94, ble kun påvist i helcellelysat (figur 2C). Disse resultatene indikerte at metodene som ble brukt resulterte i et høyt renhetsnivå for de isolerte sEV-ene.
Figur 1: Skjematisk fremstilling av isolerende sEV ved differensial ultrasentrifugering. Sentrifugering utføres ved 4 °C. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Karakterisering av iBMDM-deriverte sEVs. (A) Isolerte sEVer observert ved transmisjonselektronmikroskopi. Skala bar: 200 nm. (B) Partikkelstørrelse av de isolerte sEVene ved nanopartikkelsporingsanalyse. (C) Identifisering av sEVs og non-sEVs markører av sEVs av western blot. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Når man undersøker funksjonen til sEV-er, er det viktig å oppnå sEV-er med høy renhet fra komplekse biologiske prøver for å unngå potensielle forurensninger. Det er utviklet en rekke metoder for isolering av sEV13, og blant disse metodene har differensielle ultrasentrifugeringsbaserte metoder vist relativt høy renhet av sEV. I denne studien ble 200 ml cellesupernatant samlet i 6 timer, og ca. 200-300 μg sEV ble oppnådd ved differensiell ultrasentrifugering. Det skal imidlertid bemerkes at sEVs pellet kanskje ikke er synlig under ultrasentrifugering (trinn 1.8). Derfor anbefales det å pipette rørets bunn så mye som mulig. Dette trinnet er kritisk og vil direkte påvirke utbyttet av sEV-er. I tillegg er det nødvendig med ytterligere optimalisering av protokollen for å forbedre utbyttet, for eksempel å forlenge sentrifugeringstiden eller cellesupernatantinnsamlingsperioden når sEV utfelles ved 110 000 × g (trinn 1,8 og 1,9). Selv om sEV-ene isolert ved differensiell ultrasentrifugering har høy renhet, tar det også lang tid.
Med fremskritt innen moderne massespektrometriteknologi og genetiske databaser har titusenvis av peptider blitt identifisert i forskjellige organismers vev og kroppsvæsker, og varierer betydelig i kilde, overflod og biologisk funksjon20. LC-MS / MS-baserte peptidomer gir en omfattende tilnærming til å undersøke sEVs peptidoms sammensetning, dynamisk forandring og funksjon. Den lave overfloden av peptider i sEV-er gjør imidlertid identifisering av sEV-peptidom ustabilt. I tillegg må peptidekstraksjon utføres på is for å unngå at proteinnedbrytning forstyrrer peptididentifikasjon. I denne studien krevde 2-4 μg peptider nesten 1 mg sEV for peptidomanalyse. Dette krever en større prøvestørrelse enn sEVs proteomikk. Samtidig, på grunn av den ekstremt lave peptidkonsentrasjonen i sEV, bør det rettes mer oppmerksomhet mot plastforurensning enn proteomikk. Enten det er cellekultur eller reagenspreparat, bruk forbruksvarer av massespektrometrikvalitet så mye som mulig. Derfor er det behov for mer optimaliserte peptidekstraksjonsmetoder for å øke antall identifiserte peptider i sEVs. I tillegg er peptidomdatabasen ikke komplett, noe som begrenser fremdriften av sEVs peptidomforskning.
For tiden fokuserer de fleste studier på sEV på proteinene og mikroRNAene de bærer, med lite kjent om deres peptidkomponenter 4,21,22. Denne artikkelen gir en enkel og lett å følge protokoll for studiet av sEVs peptider for ytterligere å avdekke sEVs biologiske funksjon fra peptidomets perspektiv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av tilskudd fra Natural Science Foundation of China (3157270). Vi takker Dr. Feng Shao (National Institute of Biological Sciences, Kina) for å gi iBMDM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BCA Protein Assay Kit | Beyotime Technology | P0012 | |
| CD9 | Beyotime Technology | AF1192 | |
| Centrifugal filter tube | Millipore | UFC5010BK | |
| Centrifuge bottles polypropylene | Beckman Coulter | 357003 | High-speed centrifuge |
| Chemiluminescent substrate | Thermo Fisher Scientific | 34580 | |
| Dithiothreitol | Solarbio | D8220 | 100 g |
| DMEM culture medium | Cell World | N?A | |
| GRP94 | Cell Signaling Technology | 20292 | |
| High-speed centrifuge | Beckman Coulter | Avanti JXN-26 | Centrifuge rotor (JA-25.50) |
| Immortalized bone marrow-derived macrophages (iBMDM) | National Institute of Biological Sciences, China | Provided by Dr. Feng Shao (National Institute of Biological Sciences, China) | |
| Iodoacetamide | Sigma | l1149 | 5 g |
| Microfuge tube polypropylene | Beckman Coulter | 357448 | 1.5 mL, Tabletop ultracentrifuge |
| nano-high-performance LC system | Thermo Fisher Scientific | EASY-nLC 1000 | |
| Nanoparticle tracking analysis | Malvern Panalytical | NanoSight LM10 | NanoSight NTA3.4 |
| Orbitrap Q Exactive HF-X mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Phosphate-buffered saline | Solarbio | P1020 | |
| Polyallomer centrifuge tubes | Beckman Coulter | 326823 | Ultracentrifuge |
| Protease inhibitor | Bimake | B14002 | |
| SpeedVac vacuum concentrator | Eppendorf | Concentrator plus | |
| Tabletop ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima MAX-XP | Ultracentrifuge rotor (TLA 55) |
| Transmission electron microscope | HITACHI | H-7650B | |
| TSG101 | Sigma | AF8258 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima XPN-100 | Ultracentrifuge rotor (SW32 Ti) |
| Ultrasonic cell disruptor | Scientz | SCIENTZ-IID | |
| Western Blot imager | Bio-Rad | ChemiDocXRs | Image lab 4.0 (beta 7) |
| β-actin | Sigma | A3853 |
References
- Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), (2020).
- Thery, C. Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications. F1000 Biology Reports. 3, 15 (2011).
- Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Thery, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
- Chen, G., et al. Exosomal PD-L1 contributes to immunosuppression and is associated with anti-PD-1 response. Nature. 560 (7718), 382-386 (2018).
- Ti, D., et al. LPS-preconditioned mesenchymal stromal cells modify macrophage polarization for resolution of chronic inflammation via exosome-shuttled let-7b. Journal of Translational Medicine. 13, 308 (2015).
- Sun, H., et al. Exosomal S100A4 derived from highly metastatic hepatocellular carcinoma cells promotes metastasis by activating STAT3. Signal Transduction and Targeted Therapy. 6 (1), 187 (2021).
- Xun, J., et al. Cancer-derived exosomal miR-138-5p modulates polarization of tumor-associated macrophages through inhibition of KDM6B. Theranostics. 11 (14), 6847-6859 (2021).
- Tai, Y. L., Chen, K. C., Hsieh, J. T., Shen, T. L. Exosomes in cancer development and clinical applications. Cancer Science. 109 (8), 2364-2374 (2018).
- Mashouri, L., et al. Exosomes: composition, biogenesis, and mechanisms in cancer metastasis and drug resistance. Molecular Cancer. 18 (1), 75 (2019).
- Yang, D., et al. Progress, opportunity, and perspective on exosome isolation - efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
- Zhang, Y., et al. Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. International Journal of Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).
- Xu, R., Greening, D. W., Zhu, H. J., Takahashi, N., Simpson, R. J. Extracellular vesicle isolation and characterization: toward clinical application. The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1152-1162 (2016).
- Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z.
- Palanski, B. A., et al. An efficient urine peptidomics workflow identifies chemically defined dietary gluten peptides from patients with celiac disease. Nature Communications. 13, 888 (2022).
- Kalaora, S., et al. Identification of bacteria-derived HLA-bound peptides in melanoma. Nature. 592 (7852), 138-143 (2021).
- Hamley, I. W. Small bioactive peptides for biomaterials design and therapeutics. Chemical Reviews. 117 (24), 14015-14041 (2017).
- Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).
- Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Kim, Y. G., Lone, A. M., Saghatelian, A. Analysis of the proteolysis of bioactive peptides using a peptidomics approach. Nature Protocols. 8 (9), 1730-1742 (2013).
- Lyapina, I., Ivanov, V., Fesenko, I.
- Keller, M. D., et al. Decoy exosomes provide protection against bacterial toxins. Nature. 579 (7798), 260-264 (2020).
- Koeppen, K., et al. Let-7b-5p in vesicles secreted by human airway cells reduces biofilm formation and increases antibiotic sensitivity of P. aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (28), e2105370118 (2021).
