Medicine

细胞外囊泡组织因子活性测定

Published: December 29, 2023 doi: 10.3791/65840

¹Division of Hematology, UNC Blood Research Center, University of North Carolina at Chapel Hill

Summary

在这里，我们描述了一种内部细胞外囊泡组织因子活性测定。基于活性的测定和基于抗原的测定已被用于测量人血浆样品中细胞外囊泡中的组织因子。与基于抗原的检测相比，基于活性的检测具有更高的灵敏度和特异性。

Abstract

组织因子（TF）是因子（F） VII 和 FVIIa 的跨膜受体。TF/FVIIa 复合物通过激活 FIX 和 FX 启动凝血级联反应。TF 以细胞外囊泡（EV）的形式从细胞释放到循环中。TF 阳性（⁺） EV 水平在各种疾病中升高，包括癌症、细菌和病毒感染以及肝硬化，并且与血栓形成、弥散性血管内凝血、疾病严重程度和死亡率有关。有两种方法可以测量血浆中的 TF⁺ EV：基于抗原和活性的测定。数据表明，基于活性的检测比基于抗原的检测具有更高的灵敏度和特异性。本文介绍了我们基于两阶段 FXa 生成测定的内部 EVTF 活性测定。将FVIIa，FX和钙添加到含TF ⁺ EV的样品中，以在存在和不存在抗TF抗体的情况下产生FXa，以区分TF依赖性FXa世代和TF非依赖性FXa世代。使用 FXa 切割的显色底物来测定 FXa 水平，而使用可靠的重组 TF 生成的标准曲线用于测定 TF 浓度。这种内部 EVTF 活性测定比商业 TF 活性测定具有更高的灵敏度和特异性。

Introduction

凝血是通过因子（F） VII/VIIa 与组织因子（TF）¹ 的结合开始的。TF/FVIIa 复合物可激活 FIX 和 FX 以激活凝血¹。全长膜结合TF有两种形式：加密和主动。此外，还有一种可变剪接形式的TF（asTF）。细胞膜外叶中的鞘磷脂和磷脂酰胆碱将 TF 维持在加密状态 ^2,3,4。当细胞被激活或损伤时，磷脂混血酶将磷脂酰丝氨酸和其他带负电荷的磷脂转移到外叶¹。细胞的活化还导致酸性鞘磷脂酶易位到外叶，在那里它将鞘磷脂降解为神经酰胺⁵。这两种机制将加密的 TF 转换为活动形式。也有人提出，蛋白质二硫键异构酶介导加密TF中Cys186和Cys209之间的二硫键形成，从而导致TF ^6,7,8的解密。asTF也存在于循环中，但缺乏跨膜结构域，因此可溶性^9,10。重要的是，与全长活性TF^10,11相比，asTF具有非常低的促凝血活性水平。

细胞外囊泡（EV）从静息、活化和垂死的宿主细胞以及癌细胞中释放¹²。EV 表达来自其亲本细胞的蛋白质¹²。活性 TF 携带 EV 从活化的单核细胞、内皮细胞和肿瘤细胞释放到循环中 13,14,15。血浆中TF的水平可以通过基于活性和抗原的测定来测量。基于抗原的检测包括 ELISA 和流式细胞术¹⁶。有两种不同的基于活性的测定：一期和两阶段 TF 活性测定。一阶段测定基于基于血浆的凝血测定。将含TF的样品加入血浆中，并在再钙化后测量形成凝块的时间。两阶段测定通过添加 FVII 或 FVIIa、FX 和钙来测量样品的 FXa 生成。FXa水平使用被FXa切割的底物确定。

在一阶段和两阶段TF活性测定中，TF浓度均使用重组TF生成的标准曲线测定。两阶段检测比一阶段检测具有更高的灵敏度和特异性。许多研究已经证实，基于活性的检测比基于抗原的检测具有更高的灵敏度和特异性17,18,19,20,21。此外，我们的内部活性检测比商业活性检测具有更高的灵敏度和特异性²².健康个体在血浆中的EVTF活性水平非常低或检测不到。相比之下，患有癌症、肝硬化、脓毒症和病毒感染等病理疾病的个体具有可检测到的 EVTF 活性水平，这与血栓形成、弥散性血管内凝血、疾病严重程度和死亡率相关 23,24,25,26,27,28。在这里，我们将介绍这种内部两阶段 EVTF 活性测定。

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Protocol

该研究得到了北卡罗来纳大学教堂山分校机构审查委员会的批准（协议编号：14-2108）。

1. 从献血者那里采集血液

使用 21 G 针头将干净的静脉穿刺收集到肘前静脉中。丢弃前 3 mL 血液，因为这部分血液可能含有来自血管周围细胞的 TF。
将 2.7 或 1.8 mL（取决于试管的大小）血液抽入含有 3.2% 柠檬酸钠（0.109 mol/L）的真空吸液器中。不要过度填充或不足管子。采血后立即轻轻倒置试管以分散柠檬酸钠。
如果试管在加工前运输，请避免搅拌。在采血后2小时内制备血浆。

2.阴性对照血浆的制备

注意：在最终冷冻之前的任何时候都不应将样品放在冰上。

使用来自健康志愿者的全血制备阴性对照血浆。采血后立即制备无血小板血浆，如下所示。
1. 将血液样本从真空管转移到 15 mL 管中。
2. 在室温（20-24°C）下以2,500× g 离心血液样品15分钟，无需制动器。
3. 将上清液（贫血小板血浆）转移到新管中，并在相同条件下重复旋转。
4. 将上清液（血小板耗竭血浆）转移到新管中。
5. 将样品分装成 ≥100 μL 等分试样。在试管底部留下约 100 μL。
6. 立即将血小板耗尽的血浆冷冻在-80°C（图1）。

3.阳性对照血浆的制备

注意：对脂多糖的反应因人而异。

将血液样本从真空吸尘器转移到 15 mL 试管中。
使用来自 大肠杆菌 O111：B4（10μg/ mL）的脂多糖（LPS）刺激的健康志愿者的全血制备阳性对照血浆，在37°C下搅拌5小时。
孵育5小时后，按照步骤2.1.2至2.1.6进行操作。

4. 从血浆中分离细胞外囊泡

注意：EV 颗粒可能不可见。解冻时间取决于样品体积，但我们通常在37°C下解冻100μL血浆30分钟。

在37°C下解冻等离子体样品。
在 1.5 mL 试管中向每 100 μL 血浆样品中加入 1 mL 不含钙的 HBSA [HBSA-Ca（-）] 缓冲液 [137 mM NaCl、5.38 mM KCl、5.55 mM 葡萄糖、10 mM HEPES、0.1% （w/v）牛血清白蛋白]。
在4°C下以20,000× g 离心血浆样品15分钟。
将上清液吸至20μL，而不会干扰EV沉淀。
通过向每个试管中加入1mL HBSA-Ca（-）缓冲液来重新配制EV沉淀，在EV沉淀的位置上下移液，并在4°C下以20,000× g 第二次离心15分钟之前涡旋每个试管。
将上清液吸至20μL，而不会干扰EV沉淀。
在80μLHBSA-Ca（-）中重新配制EV沉淀，并在EV沉淀的位置上下移液（图2）。

5. 选项：使用超速离心机分离小的细胞外囊泡

在步骤4.3之后，收集上清液并在4°C下以100,000× g 超速离心70分钟。
将上清液吸至20μL，而不会干扰EV沉淀。
通过向每个试管中加入1mL HBSA-Ca（-）缓冲液并涡旋每个试管来重新配制EV沉淀，然后在4°C下以100,000× g 进行第二次超速离心70分钟。
将上清液吸至20μL，而不会干扰EV沉淀。
在 80 μL HBSA-Ca（-）中复溶 EV 沉淀。

6. 细胞外囊泡组织因子活性的测量

注意：在添加到孔中之前，应将 EV 样品移液并涡旋充分混合。EDTA-二钠会抑制FXa裂解显色底物的能力。因此，在步骤6.7中，EDTA-二钠不能用作EDTA-四钠的替代品。

将 40 μL EV 样品加入 96 孔板的两个孔中。
将 11 μL 抑制性小鼠抗人 TF IgG [（36.4 μg/mL，终浓度 7.8 μg/mL）] 加入到一个 EV 样品孔中，向另一个孔中加入 11 μL 对照小鼠 IgG [（36.4 μg/mL，终浓度 7.8 μg/mL）]。
将96孔板在室温下孵育15分钟。
在孵育期间，使用可靠的重组TF制备50μL/孔TF标准品（0,0.32,0.63,1.25,2.5,5,10和20pg / mL）。
通过将 4 mL HBSA 与钙 [HBSA-Ca（+）] [HBSA-Ca（-） + 10 mM CaCl₂，终浓度 10 mM]、800 μL 900 nM FX 的 HBSA-Ca（+）（终浓度：146.4 nM）和 120 μL 的 200 nM FVIIa 的 HBSA-CA（+）（终浓度：4.8 nM）混合来制备因子混合物。
向每个孔中加入50μL因子混合溶液，用薄膜覆盖板，并在37°C的培养箱中孵育2小时。
2小时后，通过加入25μLHBSA乙二胺四乙酸（EDTA）缓冲液[HBSA-Ca（-）+ 25mM EDTA-四钠，终浓度5mM]并在室温下孵育5分钟来停止FXa生成。
将FXa裂解的显色底物复溶至4mM（向25mg小瓶中加入8.7mL蒸馏水）。
向每个孔中加入25μL显色底物溶液，用薄膜覆盖板，然后用铝箔覆盖以避光，并在37°C下孵育15分钟。
孵育15分钟后，用针头或以1,500× g 离心1分钟除去气泡。
在读取之前，使用酶标仪读取 405 nm 的板，并进行一次混合。
使用使用可靠的重组 TF 生成的标准曲线将每个孔的 FXa 生成转换为 TF 活性。
使用公式（1）计算 TF 依赖性 FXa 生成（EVTF 活性）：
TF依赖性FXa生成（EVTF活性[pg/mL]）=总FXa生成（对照IgG孔）-TF非依赖性FXa生成（抗TF IgG孔）（图3）（1）

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Representative Results

成功的结果给出的阳性对照值为 ≥0.5 pg/mL，阴性对照值为 <0.5 pg/mL。对于阳性对照，最好找到 EVTF 活性为 >1.0 pg/mL 的高 LPS 反应者。代表性结果显示了从 11 名健康供体的全血血浆中分离出的 EV 的 EVTF 活性，有和没有 LPS 激活（图 4）。11 个供体中有 6 个（捐献者 2、4、5、8、10、11）是中高 LPS 反应者，而 11 个捐献者中有 5 个（捐献者 1、3、6、7、9）是低 LPS 反应者。

图1：血小板耗竭血浆的制备。该图是从 Hisada 和 Mackman²⁹ 修改而来的。缩写：PDP = 血小板耗竭血浆。请点击这里查看此图的较大版本.

图2：从血小板耗竭血浆中分离细胞外囊泡。 该图是从 Hisada 和 Mackman²⁹ 修改而来的。缩写：PDP = 血小板耗竭血浆;EVs = 细胞外囊泡。请点击这里查看此图的较大版本.

图3：细胞外囊泡组织因子活性的测量。该图是从 Hisada 和 Mackman²⁹ 修改而来的。缩写：TF = 组织因子;EVs = 细胞外囊泡。请点击这里查看此图的较大版本.

图 4：11 名健康供体全血血浆的 EVTF 活性，有和没有 LPS 激活。 在与阳性对照相同的条件下进行LPS激活。阳性对照来自已知的 LPS 反应者，而 11 名健康供体对 LPS 的反应在实验时尚不清楚。白条和黑条分别表示有和没有 LPS 激活。缩写：EVTF = 细胞外囊泡组织因子;LPS = 脂多糖。请点击这里查看此图的较大版本.

表 1：比较这种内部 EVTF 活性测定、商业 TF ELISA 和活性测定的研究摘要。 缩写：EVTF = 细胞外囊泡组织因子;ELISA = 酶联免疫吸附测定。请按此下载此表格。

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Discussion

在这里，介绍了我们内部EVTF活性测定的方案。该协议有三个关键步骤。复溶 EV 沉淀时，即使在 EV 沉淀不可见的位置，也要在 EV 沉淀的位置上下移液。EV 沉淀的不完全复溶将导致样品的 EVTF 活性值出现假阴性或低估。其次，在方案步骤6.5中使用HBSA-Ca（+）至关重要，因为没有钙就无法产生FXa生成。第三，使用EDTA-四钠而不是EDTA-二钠来阻止FXa的产生至关重要，因为后者会抑制FXa裂解显色底物的能力。

对于每种试剂，我们推荐以下储存和使用方法。我们将测定缓冲液和重组的底物储存在4°C下，并重复使用它们，直到我们用完它们。如果我们在 2-3 周内没有用完基材，我们会丢弃它，因为它会变黄。我们将重组TF，抗体，FVIIa和FX储存在-80°C下，并建议为一次检测制作等分试样，以避免冻融循环。

在初步研究中，我们将血浆样品在室温下放置9小时，在-80°C下重新冷冻过夜，并在第二天进行测定。作为对照，我们解冻了相同的血浆并立即重新冷冻。我们发现，与立即解冻并重新冷冻的样品相比，在室温下放置 9 小时的样品的 EVTF 活性降低了 16%（Hisada 和 Mackman，2017 年未发表的数据）。

除了对LPS的反应差异外，个体供体血浆中EV浓度的差异可以解释不同供体的不同EVTF活性。事实上，我们观察到 LPS 刺激的全血血浆中 EV 浓度的一些变化（1.9 ± 0.6 ×^{10 10} 颗粒/mL，n = 6，平均值±标准差）³⁰。

这种内部 EVTF 活性检测具有商业检测所不具备的几个功能。首先，该检测使用抗 TF 抗体来区分 TF 依赖性 FXa 代和非 TF 非依赖性 FXa 代。据称有三种商业活性测定法可以测量血浆中的 TF 活性，但没有一种使用抗 TF 抗体¹⁶。因此，这些商业检测仅测量总 FXa 生成量，而不是 TF 依赖性 FXa 生成量。其次，我们使用 2.4 nM 的 FVIIa（反应中的最终浓度）来最大限度地减少 FVIIa 产生的 TF 非依赖性 FXa。一种商业活性测定在反应中使用 12 nM 的 FVIIa，其背景很高²²。事实上，在没有 TF³¹ 的情况下，FVIIa 根据 FVIIa 浓度线性激活 FX。我们总结了比较这种内部EVTF活性测定和商业TF ELISA以及表1中的活性测定的研究。

提出了柠檬酸血小板贫乏血浆 EVTF 活性的四种反应分类：零（0 至 <0.5 pg/mL）;弱（0.5 至 <1.0 pg/mL）、中等（1.0 至 <2.0 pg/mL）和强（≥2.0 pg/mL）²³。值得注意的是，不同的抗凝剂会影响 EVTF 活性测定的结果。例如，与柠檬酸钠相比，在LPS刺激后使用肝素观察到更高水平的EVTF活性（供体A：4.6（柠檬酸盐）vs 28.6（肝素）pg/mL和供体B：3.4（柠檬酸盐）vs 26.0（肝素）pg/mL，分别为Hisada和Mackman未发表的数据2017）。相比之下，与柠檬酸钠相比，LPS刺激后使用EDTA观察到的EVTF活性水平较低（供体C：3.9（柠檬酸盐）vs1.4（EDTA）pg/mL，供体D：3.8（柠檬酸盐）vs0.4（EDTA）pg/mL，分别为Tatsumi和Mackman未发表的数据2016）。这些结果表明，当使用不同的抗凝剂时，EVTF活性数据没有可比性。

该方法存在一些限制。与临床检测相比，变异系数（CV）相对较高。事实上，在七项独立研究中，阳性对照的CV为24%^17,29。使用离心沉淀分离 EV，不仅使用离心颗粒，还使用细胞碎片分离 EV。我们之前通过透射电子显微镜分析了富含血小板的血浆沉淀，并观察到血小板、EV 和细胞碎片³²。我们使用固定角转子，没有经历过 20,000 × g 离心的摆出式转子。我们最近发现，可以用 100,000 × g 但不能用 20,000 × g 颗粒的小型 EV 在胰腺癌和 COVID-19 患者中具有 EVTF 活性³⁰。这表明该协议不测量来自小型EV（例如外泌体）的EVTF活性。值得注意的是，外泌体是富含鞘磷脂的 EV，并且已经报道了携带 TF 的外泌体的存在^30,33,34,35。我们建议使用 100,000 × g 在血浆中沉淀 EV，以更准确地确定样品中 EVTF 活性的总量。值得注意的是，它需要超速离心机和更长的分析时间，因为离心时间从 15 分钟增加到 70 分钟。

该方法可应用于任何疾病的血浆样本。EVTF 活性与患有不同疾病（包括癌症、COVID-19、细菌感染和肝硬化）的患者的疾病严重程度和生存率相关 23,26,27。

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Disclosures

没有需要披露的竞争利益。

Acknowledgments

这项工作得到了美国国立卫生研究院NHLBI R35HL155657（N.M.）和John C. Parker教授（N.M.）的支持。我们要感谢塞拉·阿奇博尔德女士的有益评论

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL tube for 20,000 x g centrifuge	any company	N/A	We use the one from Fisher Scientific (Catalog number: 05-408-129).
1.5 mL tube for ultracentrifuge	any company	N/A	We use the one from Beckman Coulter (Catalog number: 357448)
15 mL tube	any company	N/A	We use the one from VWR (Catalog number: 89039-666)
21 G x .75 in. BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Set with 12 in. tubing and luer adapter	BD	367281
96-well plate	any company	N/A	We use the one from Globe Scientific (Catalog number: 120338).
BD Vacutainer Citrate Tubes	BD	363083
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A9418
Calcium chloride	Fisher Scientific	C69-500
Centrifuge for 1.5 mL tube	any company	N/A	We use the Centrifuge 5417R (Eppendorf).
Centrifuge for 15 mL tube	any company	N/A	We use the Centrifuge 5810R (Eppendorf).
D-(+)-Glucose	Sigma Aldrich	G7021
Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrate	Sigma Aldrich	E6511
Hepes	Sigma Aldrich	H4034
Human FVIIa	Enzyme Research Laboratory	HFVIIa	The solution should be diluted with HBSA-Ca(+).
Human FX	Enzyme Research Laboratory	HFX1010	The solution should be diluted with HBSA-Ca(+).
Inhibitory mouse anti-human tissue factor IgG, clone HTF-1	Fisher Scientific	550252
Lipopolysaccharide from Escherichia coli O111:B4	Sigma Aldrich	L2630	There are several lipopolysaccharide from different E. coli. Different lipopolysaccharide have different potential to activate monocytes.
Mouse IgG	Sigma Aldrich	I5381
Pefachrome FXa 8595	Enzyme Research Laboratory	085-27
Plate reader	any company	N/A	We use the SpectraMax i3x from Molecular Devices
Re-lipidated recombinant tissue factor, Dade Innovin	Siemens	10873566
Sodium chloride	Fisher Scientific	S271-500
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima TLX
Ultracentrifuge rotor	Beckman Coulter	TLA-55