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Medicine

एक्स्ट्रासेलुलर वेसिकल टिशू फैक्टर गतिविधि परख

Published: December 29, 2023 doi: 10.3791/65840
Automatic Translation
1, 1
1Division of Hematology, UNC Blood Research Center, University of North Carolina at Chapel Hill

Summary

यहां हम एक इन-हाउस एक्स्ट्रासेलुलर पुटिका ऊतक कारक गतिविधि परख का वर्णन करते हैं। गतिविधि-आधारित परख और प्रतिजन-आधारित assays का उपयोग मानव प्लाज्मा नमूनों से बाह्य पुटिकाओं में ऊतक कारक को मापने के लिए किया गया है। गतिविधि-आधारित परखों में एंटीजन-आधारित परख की तुलना में उच्च संवेदनशीलता और विशिष्टता होती है।

Abstract

ऊतक कारक (TF) कारक (F) VII और FVIIA के लिए एक ट्रांसमेम्ब्रेन रिसेप्टर है। TF/FVIIa कॉम्प्लेक्स FIX और FX दोनों को सक्रिय करके जमावट कैस्केड शुरू करता है। TF को कोशिकाओं से बाह्य पुटिकाओं (EVs) के रूप में परिसंचरण में छोड़ा जाता है। टीएफ-पॉजिटिव (+) ईवीएस का स्तर कैंसर, जीवाणु और वायरल संक्रमण, और सिरोसिस सहित विभिन्न बीमारियों में बढ़ जाता है, और घनास्त्रता, प्रसारित इंट्रावास्कुलर जमावट, रोग की गंभीरता और मृत्यु दर से जुड़ा होता है। प्लाज्मा में TF+ EVs को मापने के दो तरीके हैं: एंटीजन- और गतिविधि-आधारित परख। डेटा इंगित करता है कि गतिविधि-आधारित assays में एंटीजन-आधारित assays की तुलना में उच्च संवेदनशीलता और विशिष्टता है। यह पत्र दो-चरण एफएक्सए पीढ़ी परख के आधार पर हमारे इन-हाउस ईवीटीएफ गतिविधि परख का वर्णन करता है। FVIIa, FX, और कैल्शियम TF+ EV युक्त नमूनों में जोड़ा जाता है ताकि TF-स्वतंत्र FXa पीढ़ी को TF-स्वतंत्र FXa पीढ़ी से अलग करने के लिए एंटी-TF एंटीबॉडी की उपस्थिति और अनुपस्थिति में FXa उत्पन्न किया जा सके। एफएक्सए द्वारा क्लीव किए गए एक क्रोमोजेनिक सब्सट्रेट का उपयोग एफएक्सए स्तर को निर्धारित करने के लिए किया जाता है, जबकि टीएफ एकाग्रता के निर्धारण के लिए एक रिलिपिडेटेड पुनः संयोजक टीएफ के साथ उत्पन्न एक मानक वक्र का उपयोग किया जाता है। इस इन-हाउस ईवीटीएफ गतिविधि परख में वाणिज्यिक टीएफ गतिविधि परख की तुलना में उच्च संवेदनशीलता और विशिष्टता है।

Introduction

रक्त जमावट कारक (F) VII/VIIa से ऊतक कारक (TF)1 के बंधन के साथ शुरू किया जाता है। TF/FVIIa कॉम्प्लेक्स रक्त जमावट को सक्रिय करने के लिए FIX और FX दोनों को सक्रिय करता है1. पूर्ण-लंबाई, झिल्ली-बाध्य TF के दो रूप हैं: एन्क्रिप्टेड और सक्रिय। इसके अलावा, TF (asTF) का एक वैकल्पिक रूप से विभाजित रूप है। कोशिका झिल्ली के बाहरी पत्रक में स्फिंगोमाइलिन और फॉस्फेटिडिलकोलाइन एक एन्क्रिप्टेड अवस्था 2,3,4 में TF बनाए रखते हैं। जब कोशिकाएं सक्रिय या क्षतिग्रस्त हो जाती हैं, तो फॉस्फोलिपिड स्क्रैम्बलेस फॉस्फेटिडाइलेरिन और अन्य नकारात्मक चार्ज फॉस्फोलिपिड्स को बाहरी पत्रक1 में स्थानांतरित करता है। कोशिकाओं की सक्रियता के परिणामस्वरूप एसिड स्फिंगोमाइलिनेज का बाहरी पत्रक में स्थानांतरण होता है जहां यह स्फिंगोमाइलिन को सेरामाइड5 में नीचा दिखाता है। ये दो तंत्र एन्क्रिप्टेड TF को सक्रिय रूप में परिवर्तित करते हैं। यह भी प्रस्तावित है कि प्रोटीन डाइसल्फ़ाइड आइसोमेरेज़ एन्क्रिप्टेड TF में Cys186 और Cys209 के बीच डाइसल्फ़ाइड बॉन्ड गठन की मध्यस्थता करता है, जिसके परिणामस्वरूप TF 6,7,8 का डी-एन्क्रिप्शन होता है। asTF भी परिसंचरण में मौजूद है लेकिन ट्रांसमेम्ब्रेन डोमेन का अभाव है और इसलिए घुलनशील 9,10 है। महत्वपूर्ण रूप से, asTF में पूर्ण लंबाई वाले सक्रिय TF10,11 की तुलना में प्रोकोआगुलेंट गतिविधि का स्तर बहुत कम है।

बाह्य पुटिकाओं (ईवीएस) आराम करने, सक्रिय, और मेजबान कोशिकाओं, साथ ही कैंसर कोशिकाओं12 मरने से जारी कर रहे हैं. ईवीएस अपने पैतृक कोशिकाओं से प्रोटीन व्यक्त करते हैं12. सक्रिय टीएफ-असर ईवीएस सक्रिय मोनोसाइट्स, एंडोथेलियल कोशिकाओं और ट्यूमर कोशिकाओं से परिसंचरण 13,14,15में जारी किए जाते हैं। प्लाज्मा में टीएफ के स्तर को गतिविधि और एंटीजन-आधारित परख द्वारा मापा जा सकता है। एंटीजन आधारित assays एलिसा और प्रवाह cytometry16 शामिल. दो अलग-अलग गतिविधि-आधारित परखें हैं: एक और दो-चरण TF गतिविधि परख। एक चरण परख एक प्लाज्मा आधारित थक्के परख पर आधारित है. TF युक्त नमूने को प्लाज्मा में जोड़ा जाता है और थक्का बनाने का समय पुन: कैल्सीफिकेशन के बाद मापा जाता है। दो-चरण परख FVII या FVIIa, FX और कैल्शियम जोड़कर नमूनों की FXa पीढ़ी को मापता है। एफएक्सए स्तर एक सब्सट्रेट का उपयोग करके निर्धारित किया जाता है जो एफएक्सए द्वारा क्लीव किया जाता है।

एक और दो चरण TF गतिविधि परख दोनों में, TF एकाग्रता पुनः संयोजक TF के साथ उत्पन्न एक मानक वक्र का उपयोग कर निर्धारित किया जाता है. दो-चरण परख में एक-चरण परख की तुलना में उच्च संवेदनशीलता और विशिष्टता होती है। कई अध्ययनों ने पुष्टि की है कि गतिविधि आधारित assays में एंटीजन-आधारित assays 17,18,19,20,21की तुलना में उच्च संवेदनशीलता और विशिष्टता है। इसके अलावा, हमारे घर में गतिविधि परख एक वाणिज्यिक गतिविधि परख22 की तुलना में उच्च संवेदनशीलता और विशिष्टता है. स्वस्थ व्यक्तियों में प्लाज्मा में ईवीटीएफ गतिविधि का बहुत कम या ज्ञानी स्तर होता है। इसके विपरीत, कैंसर, सिरोसिस, सेप्सिस और वायरल संक्रमण जैसी पैथोलॉजिकल स्थितियों वाले व्यक्तियों में ईवीटीएफ गतिविधि का पता लगाने योग्य स्तर होता है और यह घनास्त्रता, प्रसारित इंट्रावास्कुलर जमावट, रोग की गंभीरता और मृत्यु दर 23,24,25,26,27,28 से जुड़ा होता है। यहां, हम इस इन-हाउस दो-चरण ईवीटीएफ गतिविधि परख का वर्णन करेंगे।

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Protocol

अनुसंधान चैपल हिल (प्रोटोकॉल संख्या: 14-2108) में उत्तरी कैरोलिना विश्वविद्यालय के संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया था.

1. दाताओं से रक्त संग्रह

  1. एक 21 जी सुई के साथ एंटेक्यूबिटल नस में साफ वेनिपंक्चर का उपयोग करके पूरे रक्त को इकट्ठा करें। रक्त के पहले 3 एमएल को त्यागें क्योंकि रक्त के इस हिस्से में पेरिवस्कुलर कोशिकाओं से टीएफ हो सकता है।
  2. 3.2% सोडियम साइट्रेट (0.109 mol/L) युक्त वैक्यूटेनर में रक्त के 2.7 या 1.8 एमएल (ट्यूबों के आकार के आधार पर) ड्रा करें। ट्यूबों को ओवर- या अंडरफिल न करें। सोडियम साइट्रेट को फैलाने के लिए रक्त संग्रह के तुरंत बाद ट्यूबों को धीरे से पलटें।
  3. यदि ट्यूबों को प्रसंस्करण से पहले ले जाया जाता है तो आंदोलन से बचें। रक्त संग्रह के 2 घंटे के भीतर प्लाज्मा तैयार करें।

2. नकारात्मक नियंत्रण प्लाज्मा की तैयारी

नोट: नमूने अंतिम फ्रीज से पहले किसी भी समय बर्फ पर नहीं रखा जाना चाहिए।

  1. स्वस्थ स्वयंसेवकों से पूरे रक्त का उपयोग करके नकारात्मक नियंत्रण प्लाज्मा तैयार करें। रक्त संग्रह के तुरंत बाद, प्लेटलेट-मुक्त प्लाज्मा निम्नानुसार तैयार करें।
    1. वैक्यूटेनर ट्यूबों से रक्त के नमूनों को 15 एमएल ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
    2. ब्रेक के बिना कमरे के तापमान (20-24 डिग्री सेल्सियस) पर 15 मिनट के लिए 2,500 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र रक्त के नमूने।
    3. सतह पर तैरनेवाला (प्लेटलेट-गरीब प्लाज्मा) को एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें और उसी परिस्थितियों में स्पिन दोहराएं।
    4. सतह पर तैरनेवाला (प्लेटलेट-समाप्त प्लाज्मा) को एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    5. ≥ 100 μL aliquots में नमूना विभाज्य है. ट्यूब के तल पर लगभग 100 माइक्रोन छोड़ दें।
    6. प्लेटलेट-समाप्त प्लाज्मा को -80 डिग्री सेल्सियस (चित्रा 1) पर तुरंत फ्रीज करें।

3. सकारात्मक नियंत्रण प्लाज्मा की तैयारी

नोट: लिपोपॉलेसेकेराइड की प्रतिक्रिया व्यक्तियों के बीच परिवर्तनशील है।

  1. वैक्यूटेनर्स से रक्त के नमूनों को 15 एमएल ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
  2. आंदोलन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 घंटे के लिए एस्चेरिचिया कोलाई ओ 111: बी 4 (10 माइक्रोग्राम / एमएल) से लिपोपॉलेसेकेराइड (एलपीएस) के साथ उत्तेजित स्वस्थ स्वयंसेवकों से पूरे रक्त का उपयोग करके सकारात्मक नियंत्रण प्लाज्मा तैयार करें।
  3. 5 घंटे इनक्यूबेशन के बाद, 2.1.2 से 2.1.6 चरणों का पालन करें।

4. प्लाज्मा से बाह्य पुटिकाओं का अलगाव

नोट: EV छर्रों दिखाई नहीं दे सकता है। डीफ़्रॉस्टिंग समय नमूना मात्रा पर निर्भर है लेकिन हम आम तौर पर 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 100 माइक्रोन प्लाज्मा डीफ्रॉस्ट करते हैं।

  1. 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लाज्मा नमूने डीफ्रॉस्ट करें।
  2. कैल्शियम के बिना एचबीएसए के 1 एमएल जोड़ें [एचबीएसए-सीए (-)] बफर [137 एमएम एनएसीएल, 5.38 एमएम केसीएल, 5.55 एमएम ग्लूकोज, 10 एमएम एचईपीईएस, 0.1% (डब्ल्यू / वी) गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन] 1.5 एमएल ट्यूब में प्लाज्मा नमूने के प्रत्येक 100 माइक्रोन के लिए।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिन के लिए 20,000 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र प्लाज्मा नमूने।
  4. ईवी गोली को परेशान किए बिना सतह पर तैरनेवाला को 20 माइक्रोन तक एस्पिरेट करें।
  5. प्रत्येक ट्यूब में एचबीएसए-सीए (-) बफर के 1 एमएल जोड़कर ईवी गोली का पुनर्गठन करें, ईवी गोली के स्थान पर पिपेट ऊपर और नीचे, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 20,000 × ग्राम पर दूसरी बार सेंट्रीफ्यूज करने से पहले प्रत्येक ट्यूब को भंवर करें।
  6. ईवी गोली को परेशान किए बिना सतह पर तैरनेवाला को 20 माइक्रोन तक एस्पिरेट करें।
  7. एचबीएसए-सीए (-) के 80 माइक्रोन में ईवी गोली का पुनर्गठन करें और ईवी गोली (चित्रा 2) के स्थान पर ऊपर और नीचे पिपेट का पुनर्गठन करें।

5. विकल्प: अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज का उपयोग करके छोटे बाह्य पुटिकाओं का अलगाव

  1. चरण 4.3 के बाद, 4 डिग्री सेल्सियस पर 70 मिनट के लिए 100,000 × ग्राम पर सतह पर तैरनेवाला और अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज इकट्ठा करें।
  2. ईवी गोली को परेशान किए बिना सतह पर तैरनेवाला को 20 माइक्रोन तक एस्पिरेट करें।
  3. प्रत्येक ट्यूब में एचबीएसए-सीए (-) बफर के 1 एमएल जोड़कर ईवी गोली का पुनर्गठन करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 70 मिनट के लिए 100,000 ×ग्राम पर दूसरी बार अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजिंग से पहले प्रत्येक ट्यूब को भंवर करें।
  4. ईवी गोली को परेशान किए बिना सतह पर तैरनेवाला को 20 माइक्रोन तक एस्पिरेट करें।
  5. एचबीएसए-सीए (-) के 80 माइक्रोन में ईवी गोली का पुनर्गठन करें।

6. बाह्य पुटिका ऊतक कारक गतिविधि का मापन

नोट: ईवी नमूनों को पाइप किया जाना चाहिए और कुओं में जोड़ने से पहले मिश्रण करने के लिए अच्छी तरह से भंवर होना चाहिए। ईडीटीए-डिसोडियम क्रोमोजेनिक सब्सट्रेट को साफ करने के लिए एफएक्सए की क्षमता को बाधित करेगा। इसलिए, चरण 6.7 में ईडीटीए-टेट्रासोडियम के प्रतिस्थापन के रूप में ईडीटीए-डिसोडियम का उपयोग नहीं किया जा सकता है।

  1. एक 96 अच्छी तरह से थाली के दो कुओं के लिए एक EV नमूने के 40 माइक्रोन जोड़ें.
  2. एक निरोधात्मक माउस विरोधी मानव TF IgG [(36.4 μg/mL, अंतिम एकाग्रता 7.8 μg/mL)] के 11 माइक्रोन को EV नमूने के एक कुएं में और नियंत्रण माउस IgG के 11 μL [(36.4 μg/mL, अंतिम एकाग्रता 7.8 μg/mL)] को दूसरे कुएं में जोड़ें।
  3. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 96 अच्छी तरह से थाली सेते हैं.
  4. इनक्यूबेशन समय के दौरान, 50 μL/TF मानकों के अच्छी तरह से तैयार (0, 0.32, 0.63, 1.25, 2.5, 5, 10, और 20 pg/mL) relipidated पुनः संयोजक TF का उपयोग कर डुप्लिकेट में.
  5. कैल्शियम [एचबीएसए-सीए (+)] [एचबीएसए-सीए (-) + 10 एमएम सीएसीएल2, अंतिम एकाग्रता 10 एमएम], एचबीएसए-सीए (+) में 900 एनएम एफएक्स के 800 माइक्रोन के 800 एमएल के साथ एचबीएसए के 4 एमएल मिलाकर कारक मिश्रण तैयार करें (अंतिम एकाग्रता: 146.4 एनएम), और एचबीएसए-सीए (+) (अंतिम एकाग्रता: 4.8 एनएम) में 200 एनएम एफवीआईए के 120 माइक्रोन।
  6. प्रत्येक अच्छी तरह से कारक मिश्रण समाधान के 50 माइक्रोन जोड़ें, फिल्म के साथ प्लेट को कवर करें, और 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  7. 2 घंटे के बाद, एचबीएसए एथिलीनमाइनेटेट्राएसेटिक एसिड (ईडीटीए) बफर [एचबीएसए-सीए (-) + 25 एमएम ईडीटीए-टेट्रासोडियम, अंतिम एकाग्रता 5 मिमी] के 25 माइक्रोन जोड़कर एफएक्सए पीढ़ी को रोकें और कमरे के तापमान पर 5 मिन के लिए इनक्यूबेट करें।
  8. क्रोमोजेनिक सब्सट्रेट का पुनर्गठन करें जो एफएक्सए द्वारा 4 एमएम तक क्लीव किया जाता है (25 मिलीग्राम शीशी में आसुत जल के 8.7 एमएल जोड़ें)।
  9. प्रत्येक अच्छी तरह से क्रोमोजेनिक सब्सट्रेट समाधान के 25 माइक्रोन जोड़ें, फिल्म के साथ प्लेट को कवर करें और फिर एल्यूमीनियम पन्नी के साथ इसे प्रकाश से बचाने के लिए, और 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिन के लिए इनक्यूबेट करें।
  10. इनक्यूबेशन के 15 मिनट के बाद, एक सुई के साथ या 1 मिनट के लिए 1,500 × ग्राम पर centrifugation द्वारा बुलबुले हटा दें.
  11. पढ़ने से पहले एक मिश्रण के साथ एक प्लेट रीडर का उपयोग कर 405 एनएम पर थाली पढ़ें.
  12. relipidated पुनः संयोजक TF का उपयोग कर उत्पन्न मानक वक्र का उपयोग कर TF गतिविधि के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से FXa पीढ़ी कन्वर्ट.
  13. समीकरण (1) का उपयोग करके TF-निर्भर FXa पीढ़ी (EVTF गतिविधि) की गणना करें:
    TF-निर्भर FXa पीढ़ी (EVTF गतिविधि [pg/mL]) = कुल FXa पीढ़ी (IgG अच्छी तरह से नियंत्रण) - TF- स्वतंत्र FXa पीढ़ी (विरोधी TF IgG अच्छी तरह से) (चित्रा 3) (1)

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Representative Results

एक सफल परिणाम ≥0.5 pg/mL का सकारात्मक नियंत्रण मान और <0.5 pg/mL का नकारात्मक नियंत्रण मान देता है। सकारात्मक नियंत्रणासाठी >1.0 pg/mL EVTF गतिविधिसह उच्च LPS उत्तरदाता शोधणे सर्वोत्तम आहे. प्रतिनिधि परिणाम एलपीएस सक्रियण (चित्रा 4) के साथ और बिना 11 स्वस्थ दाताओं के पूरे रक्त से प्लाज्मा से अलग ईवीएस की ईवीटीएफ गतिविधि को दर्शाता है। ग्यारह दाताओं में से छह (दाता 2, 4, 5, 8, 10, 11) मध्यम से उच्च एलपीएस उत्तरदाता थे, जबकि ग्यारह दाताओं में से पांच (दाता 1, 3, 6, 7, 9) कम एलपीएस उत्तरदाता थे।

Figure 1
चित्रा 1: प्लेटलेट-समाप्त प्लाज्मा की तैयारी। आंकड़ा हिसाडा और मैकमैन29 से संशोधित किया गया था। संक्षिप्त: पीडीपी = प्लेटलेट-समाप्त प्लाज्मा। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: प्लेटलेट-समाप्त प्लाज्मा से बाह्य पुटिकाओं का अलगाव। आंकड़ा हिसाडा और मैकमैन29 से संशोधित किया गया था। संक्षिप्ताक्षर: पीडीपी = प्लेटलेट-समाप्त प्लाज्मा; EVs = बाह्य पुटिकाएं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: बाह्य पुटिका ऊतक कारक गतिविधि का मापन। आंकड़ा हिसाडा और मैकमैन29 से संशोधित किया गया था। संक्षिप्ताक्षर: TF = ऊतक कारक; EVs = बाह्य पुटिकाएं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: एलपीएस सक्रियण के साथ और बिना 11 स्वस्थ दाताओं के पूरे रक्त से प्लाज्मा की ईवीटीएफ गतिविधि। एलपीएस सक्रियण सकारात्मक नियंत्रण के समान स्थिति में किया गया था। सकारात्मक नियंत्रण एक ज्ञात एलपीएस उत्तरदाता से था, जबकि प्रयोग के समय 11 स्वस्थ दाताओं के एलपीएस की प्रतिक्रियाएं ज्ञात नहीं थीं। सफेद और काली पट्टियाँ क्रमशः एलपीएस सक्रियण के साथ और बिना इंगित करती हैं। संक्षिप्ताक्षर: EVTF = बाह्य पुटिका ऊतक कारक; LPS = लिपोपॉलेसेकेराइड। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: इस इन-हाउस ईवीटीएफ गतिविधि परख, एक वाणिज्यिक टीएफ एलिसा और एक गतिविधि परख की तुलना में अध्ययनों का सारांश। संक्षिप्ताक्षर: EVTF = बाह्य पुटिका ऊतक कारक; एलिसा = एंजाइम से जुड़े इम्युनोसॉरबेंट परख। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यहां, हमारे इन-हाउस ईवीटीएफ गतिविधि परख का प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। प्रोटोकॉल में तीन महत्वपूर्ण कदम हैं. EV पेलेट का पुनर्गठन करते समय, EV पेलेट के स्थान पर पिपेट को ऊपर और नीचे करना महत्वपूर्ण है, भले ही वह दिखाई न दे। ईवी गोली के अपूर्ण पुनर्गठन के परिणामस्वरूप नमूनों के ईवीटीएफ गतिविधि मूल्यों का गलत नकारात्मक या कम करके आंका जाएगा। दूसरा, HBSA-Ca(+) का उपयोग प्रोटोकॉल चरण 6.5 में महत्वपूर्ण है क्योंकि FXa पीढ़ी कैल्शियम के बिना उत्पन्न नहीं किया जा सकता है. तीसरा, एफएक्सए पीढ़ी को रोकने के लिए ईडीटीए-टेट्रासोडियम का उपयोग करना महत्वपूर्ण है लेकिन ईडीटीए-डिसोडियम नहीं है क्योंकि बाद वाला क्रोमोजेनिक सब्सट्रेट को साफ करने के लिए एफएक्सए की क्षमता को रोकता है।

हम प्रत्येक अभिकर्मक के लिए निम्नलिखित भंडारण और उपयोग विधि की अनुशंसा करते हैं। हम परख बफ़र्स और पुनर्गठित सब्सट्रेट को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करते हैं और बार-बार उनका उपयोग करते हैं जब तक कि हम उनसे बाहर नहीं निकलते। यदि हम 2-3 सप्ताह के भीतर सब्सट्रेट से बाहर नहीं निकलते हैं, तो हम इसे त्याग देते हैं क्योंकि यह पीला हो जाता है। हम -80 डिग्री सेल्सियस पर पुनः संयोजक TF, एंटीबॉडी, FVIIa, और FX की दुकान और एक फ्रीज पिघलना चक्र से बचने के लिए एक परख के लिए aliquots बनाने की सिफारिश.

एक प्रारंभिक अध्ययन में, हम कमरे के तापमान पर 9 घंटे के लिए प्लाज्मा नमूने छोड़ दिया, उन्हें रात भर -80 डिग्री सेल्सियस पर refrozen है, और अगले दिन परख प्रदर्शन किया. एक नियंत्रण के रूप में, हमने उसी प्लाज्मा को पिघलाया और इसे तुरंत फिर से जमा दिया। हमने पाया कि कमरे के तापमान पर 9 घंटे के लिए छोड़े गए नमूने में ईवीटीएफ गतिविधि में 16% की कमी आई थी, जो कि तुरंत पिघल गई थी और फिर से जमी हुई थी (हिसाडा और मैकमैन, अप्रकाशित डेटा 2017)।

एलपीएस के जवाब में अंतर के अलावा, व्यक्तिगत दाताओं से प्लाज्मा में ईवीएस की एकाग्रता में अंतर विभिन्न दाताओं की विभिन्न ईवीटीएफ गतिविधि की व्याख्या कर सकता है। दरअसल, हमने एलपीएस-उत्तेजित पूरे रक्त (1.9 ± 0.6 × 1010 कण/एमएल, एन = 6, मतलब ± मानक विचलन)30से प्लाज्मा में ईवीएस की सांद्रता में कुछ बदलाव देखे।

इस इन-हाउस ईवीटीएफ गतिविधि परख में कई विशेषताएं हैं जो वाणिज्यिक परख में नहीं हैं। सबसे पहले, परख TF-स्वतंत्र FXa पीढ़ी से TF-निर्भर FXa पीढ़ी को अलग करने के लिए एक एंटी-TF एंटीबॉडी का उपयोग करता है। तीन वाणिज्यिक गतिविधि assays प्लाज्मा में TF गतिविधि को मापने का दावा कर रहे हैं, लेकिन उनमें से कोई भी विरोधी TF एंटीबॉडी16 का उपयोग करता है. इसलिए, ये वाणिज्यिक परख केवल कुल एफएक्सए पीढ़ी को मापते हैं लेकिन टीएफ-निर्भर एफएक्सए पीढ़ी को नहीं। दूसरा, हम FVIIa द्वारा TF-स्वतंत्र FXa पीढ़ी को कम करने के लिए FVIIa (प्रतिक्रिया में अंतिम एकाग्रता) के 2.4 एनएम का उपयोग करते हैं। एक वाणिज्यिक गतिविधि परख प्रतिक्रिया में FVIIa के 12 एनएम का उपयोग करता है, जो एक उच्च पृष्ठभूमि22 देता है. दरअसल, FVIIa TF31 की अनुपस्थिति में FVIIa एकाग्रता के आधार पर FX को रैखिक रूप से सक्रिय करता है। हमने उन अध्ययनों को संक्षेप में प्रस्तुत किया है जो इस इन-हाउस ईवीटीएफ गतिविधि परख और वाणिज्यिक टीएफ एलिसा और तालिका 1 में एक गतिविधि परख की तुलना करते हैं।

साइट्रेटेड प्लेटलेट-गरीब प्लाज्मा के लिए ईवीटीएफ गतिविधि के चार प्रतिक्रिया वर्गीकरण प्रस्तावित हैं: शून्य (0 से <0.5 पीजी / एमएल); कमजोर (0.5 से <1.0 पीजी/एमएल), मध्यम (1.0 से <2.0 पीजी/एमएल), और मजबूत (≥2.0 पीजी/एमएल)23. विशेष रूप से, विभिन्न एंटीकोआगुलंट्स ईवीटीएफ गतिविधि परख के परिणामों को प्रभावित करते हैं। उदाहरण के लिए, सोडियम साइट्रेट (डोनर ए: 4.6 (साइट्रेट) बनाम 28.6 (हेपरिन) पीजी/एमएल और डोनर बी: 3.4 (साइट्रेट) बनाम 26.0 (हेपरिन) पीजी/एमएल, क्रमशः, हिसाडा और मैकमैन अप्रकाशित डेटा 2017) की तुलना में एलपीएस उत्तेजना के बाद हेपरिन का उपयोग करके ईवीटीएफ गतिविधि के उच्च स्तर देखे गए। इसके विपरीत, सोडियम साइट्रेट (डोनर सी: 3.9 (साइट्रेट) बनाम 1.4 (ईडीटीए) पीजी/एमएल, डोनर डी: 3.8 (साइट्रेट) बनाम 0.4 (ईडीटीए) पीजी/एमएल, क्रमशः, तत्सुमी और मैकमैन अप्रकाशित डेटा 2016) की तुलना में एलपीएस उत्तेजना के बाद ईडीटीए का उपयोग करके ईवीटीएफ गतिविधि के निचले स्तर देखे गए। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि विभिन्न एंटीकोआगुलंट्स का उपयोग करते समय ईवीटीएफ गतिविधि डेटा तुलनीय नहीं होते हैं।

विधि की कुछ सीमाएँ हैं। नैदानिक परख की तुलना में भिन्नता (सीवी) का गुणांक अपेक्षाकृत अधिक है। दरअसल, सात स्वतंत्र अध्ययनों में सकारात्मक नियंत्रण के लिए सीवी 24%17,29था। सेंट्रीफ्यूजेशन छर्रों का उपयोग करके ईवीएस का अलगाव न केवल ईवीएस बल्कि सेलुलर मलबे भी। हम पहले ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा प्लेटलेट समृद्ध प्लाज्मा की गोली का विश्लेषण किया और प्लेटलेट्स, ईवीएस, और सेलुलर मलबे32 मनाया. हम एक निश्चित कोण रोटर का उपयोग करें और 20,000 × जी centrifugation के लिए एक स्विंग-आउट रोटर का अनुभव नहीं किया है. हमने हाल ही में पाया कि छोटे ईवी जिन्हें 100,000 × ग्राम के साथ पेलेट किया जा सकता है, लेकिन 20,000 × ग्राम के साथ नहीं, अग्नाशय के कैंसर और COVID-1930 के रोगियों में EVTF गतिविधि है। यह इंगित करता है कि यह प्रोटोकॉल एक्सोसोम जैसे छोटे ईवीएस से ईवीटीएफ गतिविधि को मापता नहीं है। विशेष रूप से, एक्सोसोम स्फिंगोमाइलिन समृद्ध ईवी हैं और टीएफ-असर एक्सोसोम की उपस्थिति30,33,34,35 बताई गई है। हम नमूने में ईवीटीएफ गतिविधि की कुल मात्रा को अधिक सटीक रूप से निर्धारित करने के लिए 100,000 × ग्राम का उपयोग करके प्लाज्मा में ईवीएस को पेलेट करने की सलाह देते हैं। ध्यान दें, यह एक ultracentrifuge और एक लंबे समय परख समय की आवश्यकता है क्योंकि centrifugation समय 15 मिनट से 70 मिनट तक बढ़ जाती है.

इस विधि को किसी भी प्रकार की बीमारी से प्लाज्मा नमूनों पर लागू किया जा सकता है। ईवीटीएफ गतिविधि कैंसर, सीओवीआईडी -19, जीवाणु संक्रमण और सिरोसिस 23,26,27 सहित विभिन्न बीमारियों वाले रोगियों में रोग की गंभीरता और अस्तित्व से जुड़ी है।

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Disclosures

खुलासा करने के लिए कोई प्रतिस्पर्धी हित नहीं हैं।

Acknowledgments

इस काम एनआईएच NHLBI R35HL155657 द्वारा समर्थित किया गया (एनएम) और जॉन सी. पार्कर प्रोफेसरशिप (एनएम). हम सुश्री सिएरा जे आर्चीबाल्ड को उनकी उपयोगी टिप्पणियों के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL tube for 20,000 x g centrifuge any company N/A We use the one from Fisher Scientific (Catalog number: 05-408-129).
1.5 mL tube for ultracentrifuge any company N/A We use the one from Beckman Coulter (Catalog number: 357448)
15 mL tube any company N/A We use the one from VWR (Catalog number: 89039-666)
21 G x .75 in. BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Set with 12 in. tubing and luer adapter BD 367281
96-well plate any company N/A We use the one from Globe Scientific (Catalog number: 120338).
BD Vacutainer Citrate Tubes BD 363083
Bovine serum albumin Sigma Aldrich A9418
Calcium chloride Fisher Scientific C69-500
Centrifuge for 1.5 mL tube any company N/A We use the Centrifuge 5417R (Eppendorf).
Centrifuge for 15 mL tube any company N/A We use the Centrifuge 5810R (Eppendorf).
D-(+)-Glucose Sigma Aldrich G7021
Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrate Sigma Aldrich E6511
Hepes Sigma Aldrich H4034
Human FVIIa Enzyme Research Laboratory HFVIIa The solution should be diluted with HBSA-Ca(+).
Human FX Enzyme Research Laboratory HFX1010 The solution should be diluted with HBSA-Ca(+).
Inhibitory mouse anti-human tissue factor IgG, clone HTF-1 Fisher Scientific 550252
Lipopolysaccharide from Escherichia coli O111:B4 Sigma Aldrich L2630 There are several lipopolysaccharide from different E. coli. Different lipopolysaccharide have different potential to activate monocytes.
Mouse IgG Sigma Aldrich I5381
Pefachrome FXa 8595 Enzyme Research Laboratory 085-27
Plate reader any company N/A We use the SpectraMax i3x from Molecular Devices
Re-lipidated recombinant tissue factor, Dade Innovin Siemens 10873566
Sodium chloride  Fisher Scientific S271-500
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima TLX
Ultracentrifuge rotor Beckman Coulter TLA-55

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चिकित्सा अंक 202
एक्स्ट्रासेलुलर वेसिकल टिशू फैक्टर गतिविधि परख
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Hisada, Y., Mackman, N. Extracellular Vesicle Tissue Factor Activity Assay. J. Vis. Exp. (202), e65840, doi:10.3791/65840 (2023).

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