Summary
Her beskriver vi en intern ekstracellulær vesikelvævsfaktoraktivitetsanalyse. Aktivitetsbaserede assays og antigenbaserede assays er blevet anvendt til at måle vævsfaktor i ekstracellulære vesikler fra humane plasmaprøver. Aktivitetsbaserede assays har højere følsomhed og specificitet end antigenbaserede assays.
Abstract
Vævsfaktor (TF) er en transmembranreceptor for faktor (F) VII og FVIIa. TF/FVIIa-komplekset initierer koagulationskaskaden ved at aktivere både FIX og FX. TF frigives fra celler til cirkulationen i form af ekstracellulære vesikler (EV'er). Niveauet af TF-positive (+) EV'er øges i forskellige sygdomme, herunder kræft, bakterielle og virale infektioner og skrumpelever, og er forbundet med trombose, dissemineret intravaskulær koagulation, sygdommens sværhedsgrad og dødelighed. Der er to måder at måle TF+ EV'er i plasma: antigen- og aktivitetsbaserede assays. Data indikerer, at aktivitetsbaserede assays har højere følsomhed og specificitet end antigenbaserede assays. Dette papir beskriver vores interne EVTF-aktivitetsanalyse baseret på et to-trins FXa-generationsassay. FVIIa, FX og calcium tilsættes til TF+ EV-holdige prøver for at generere FXa i nærvær og fravær af anti-TF-antistof for at skelne TF-afhængig FXa-generering fra TF-uafhængig FXa-generation. Et kromogent substrat spaltet af FXa anvendes til at bestemme FXa-niveauet, mens en standardkurve genereret med en relipideret rekombinant TF anvendes til bestemmelse af TF-koncentrationen. Denne interne EVTF-aktivitetsanalyse har højere følsomhed og specificitet end et kommercielt TF-aktivitetsassay.
Introduction
Blodkoagulation initieres med binding af faktor (F) VII/VIIa til vævsfaktor (TF)1. TF / FVIIa-komplekset aktiverer både FIX og FX for at aktivere blodkoagulation1. Der er to former for membranbundet TF i fuld længde: krypteret og aktiv. Derudover er der en alternativt splejset form af TF (asTF). Sphingomyelin og phosphatidylcholin i cellemembranens ydre folder opretholder TF i krypteret tilstand 2,3,4. Når celler aktiveres eller beskadiges, overfører phospholipidscramblase phosphatidylserin og andre negativt ladede phospholipider til den ydre folder1. Aktiveringen af celler resulterer også i translokation af sur sphingomyelinase til den ydre folder, hvor den nedbryder sphingomyelin til ceramid5. Disse to mekanismer konverterer krypteret TF til den aktive form. Det foreslås også, at proteindisulfidisomerase medierer disulfidbindingsdannelse mellem Cys186 og Cys209 i krypteret TF, hvilket resulterer i dekryptering af TF 6,7,8. asTF er også til stede i cirkulationen, men mangler transmembrandomænet og er derfor opløseligt 9,10. Det er vigtigt, at asTF har meget lave niveauer af prokoagulerende aktivitet sammenlignet med aktiv TF10,11 i fuld længde.
Ekstracellulære vesikler (EV'er) frigives fra hvilende, aktiverede og døende værtsceller samt kræftceller12. Elbiler udtrykker proteiner fra deres forældreceller12. Aktive TF-bærende EV'er frigives fra aktiverede monocytter, endotelceller og tumorceller i cirkulationen 13,14,15. Niveauer af TF i plasma kan måles ved aktivitets- og antigenbaserede assays. Antigenbaserede assays inkluderer ELISA og flowcytometri16. Der er to forskellige aktivitetsbaserede assays: et- og to-trins TF-aktivitetsassays. Ettrinsanalysen er baseret på et plasmabaseret koagulationsassay. Den TF-holdige prøve tilsættes til plasma, og tiden til dannelse af en koagulation måles efter genforkalkning. To-trins analysen måler FXa-generering af prøver ved at tilføje FVII eller FVIIa, FX og calcium. FXa-niveauer bestemmes ved hjælp af et substrat, der spaltes af FXa.
I både et- og totrins TF-aktivitetsassays bestemmes TF-koncentrationen ved hjælp af en standardkurve genereret med rekombinant TF. To-trins assays har højere følsomhed og specificitet end et-trins assayet. Mange undersøgelser har bekræftet, at aktivitetsbaserede assays har højere følsomhed og specificitet end antigenbaserede assays 17,18,19,20,21. Derudover har vores interne aktivitetsanalyse højere følsomhed og specificitet end et kommercielt aktivitetsassay22. Raske individer har meget lave eller uopdagelige niveauer af EVTF-aktivitet i plasma. I modsætning hertil har personer med patologiske tilstande, såsom kræft, skrumpelever, sepsis og virusinfektion, påviselige niveauer af EVTF-aktivitet, og dette er forbundet med trombose, dissemineret intravaskulær koagulation, sygdomssværhedsgrad og dødelighed 23,24,25,26,27,28. Her vil vi beskrive dette interne to-trins EVTF-aktivitetsassay.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forskningen blev godkendt af Institutional Review Board ved University of North Carolina i Chapel Hill (protokolnummer: 14-2108).
1. Blodindsamling fra donorer
- Fuldblod opsamles ved hjælp af ren venepunktur i den antecubitale vene med en 21 G nål. Kassér de første 3 ml blod, fordi denne del af blodet kan indeholde TF fra perivaskulære celler.
- Træk 2,7 eller 1,8 ml (afhængigt af størrelsen af rørene) blod i en vakutainer indeholdende 3,2% natriumcitrat (0,109 mol / l). Du må ikke over- eller underfylde slangerne. Vend forsigtigt rør umiddelbart efter blodindsamling for at sprede natriumcitratet.
- Undgå omrøring, hvis rørene transporteres inden forarbejdning. Forbered plasma inden for 2 timer efter blodindsamling.
2. Fremstilling af negativt kontrolplasma
BEMÆRK: Prøver bør ikke lægges på is på noget tidspunkt før den endelige frysning.
- Forbered negativt kontrolplasma ved hjælp af fuldblod fra raske frivillige. Umiddelbart efter blodindsamling fremstilles blodpladefrit plasma som følger.
- Overfør blodprøver fra vacutainerrørene til 15 ml rør.
- Blodprøver centrifugeres ved 2.500 × g i 15 minutter ved stuetemperatur (20-24 °C) uden bremse.
- Supernatanten (blodpladefattigt plasma) overføres til et nyt glas, og centrifugeringen gentages under de samme betingelser.
- Supernatanten (trombocytdepleteret plasma) overføres til et nyt glas.
- Prøven omregnes til ≥100 μL delprøver. Efterlad ca. 100 μL i bunden af røret.
- Det blodpladedepleterede plasma fryses straks ved -80 °C (figur 1).
3. Fremstilling af positivt kontrolplasma
BEMÆRK: Respons på lipopolysaccharid varierer mellem individer.
- Overfør blodprøver fra vacutainerne til 15 ml rør.
- Forbered positivt kontrolplasma med fuldblod fra raske frivillige, der stimuleres med lipopolysaccharid (LPS) fra Escherichia coli O111:B4 (10 μg/ml) i 5 timer ved 37 °C under omrystning.
- Efter 5 timers inkubation følges trin 2.1.2 til 2.1.6.
4. Isolering af ekstracellulære vesikler fra plasma
BEMÆRK: EV-pellets er muligvis ikke synlige. Optøningstiden afhænger af prøvevolumen, men vi optøer normalt 100 μL plasma i 30 minutter ved 37 °C.
- Optø plasmaprøver ved 37 °C.
- Der tilsættes 1 ml HBSA uden calciumbuffer [HBSA-Ca(-)] [137 mM NaCl, 5,38 mM KCl, 5,55 mM glucose, 10 mM HEPES, 0,1% (w/v) bovint serumalbumin] til hver 100 μL plasmaprøve i et 1,5 ml glas.
- Plasmaprøverne centrifugeres ved 20.000 × g i 15 minutter ved 4 °C.
- Supernatanten suges ned til 20 μL uden at forstyrre EV-pelleten.
- EV-pelleten rekonstitueres ved at tilsætte 1 ml HBSA-Ca(-)-buffer til hvert rør, pipettere op og ned på EV-pelletens placering og hvirvel hvert rør, før det centrifugeres for anden gang ved 20.000 × g i 15 minutter ved 4 °C.
- Supernatanten suges ned til 20 μL uden at forstyrre EV-pelleten.
- EV-pelleten rekonstitueres i 80 μL HBSA-Ca(-) og pipetteres op og ned på EV-pelletens placering (figur 2).
5. Mulighed: Isolering af små ekstracellulære vesikler ved hjælp af ultracentrifuge
- Efter trin 4.3 opsamles supernatanten og ultracentrifugen ved 100.000 × g i 70 minutter ved 4 °C.
- Supernatanten suges ned til 20 μL uden at forstyrre EV-pelleten.
- EV-pelleten rekonstitueres ved at tilsætte 1 ml HBSA-Ca(-)buffer til hvert rør og hvirvel hvert rør, før der ultracentrifugeres for anden gang ved 100.000 × g i 70 minutter ved 4 °C.
- Supernatanten suges ned til 20 μL uden at forstyrre EV-pelleten.
- EV-pellet rekonstitueres i 80 μL HBSA-Ca(-).
6. Måling af ekstracellulær vesikelvævsfaktoraktivitet
BEMÆRK: EV-prøver skal pipetteres og hvirvelblandes godt for at blande, før de tilsættes til brønde. EDTA-dinatrium vil hæmme FXa's evne til at spalte det kromogene substrat. EDTA-dinatrium kan derfor ikke anvendes som erstatning for EDTA-tetranatrium i trin 6.7.
- Der tilsættes 40 μL af en EV-prøve til to huller i en plade med 96 brønde.
- Der tilsættes 11 μL af en hæmmende anti-human TF IgG fra mus [(36,4 μg/ml, slutkoncentration 7,8 μg/ml)] til det ene hul i en EV-prøve og 11 μL kontrolmus IgG [(36,4 μg/ml, slutkoncentration 7,8 μg/ml)] til det andet hul.
- Inkuber 96-brøndpladen i 15 minutter ved stuetemperatur.
- I løbet af inkubationstiden fremstilles 50 μL/hul TF-standarder (0, 0,32, 0,63, 1,25, 2,5, 5, 10 og 20 pg/ml) i to eksemplarer ved hjælp af relipideret rekombinant TF.
- Der fremstilles faktorblanding ved at blande 4 ml HBSA med calcium [HBSA-Ca(+)] [HBSA-Ca(-) + 10 mMCaCl2, slutkoncentration 10 mM], 800 μL 900 nM FX i HBSA-Ca(+) (slutkoncentration: 146,4 nM) og 120 μL 200 nM FVIIa i HBSA-CA(+) (slutkoncentration: 4,8 nM).
- Der tilsættes 50 μL af faktorblandingsopløsningen til hvert hul, pladen dækkes med film og inkuberes i 2 timer i en inkubator ved 37 °C.
- Efter 2 timer stoppes FXa-dannelsen ved tilsætning af 25 μL HBSA-ethylendiamintetraeddikesyrebuffer (EDTA) [HBSA-Ca(-) + 25 mM EDTA-tetranatrium, slutkoncentration 5 mM] og inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Rekonstituér det kromogene substrat, der spaltes af FXa til 4 mM (tilsæt 8,7 ml destilleret vand til et 25 mg hætteglas).
- Der tilsættes 25 μL kromogen substratopløsning til hvert hul, pladen dækkes med film og derefter med aluminiumsfolie for at beskytte den mod lys, og den inkuberes i 15 minutter ved 37 °C.
- Efter 15 minutters inkubation fjernes bobler med en nål eller ved centrifugering ved 1.500 × g i 1 min.
- Pladen aflæses ved 405 nm ved hjælp af en pladelæser med én blanding, før der aflæses.
- Konverter FXa-genereringen af hver brønd til TF-aktivitet ved hjælp af standardkurven genereret ved hjælp af relipideret rekombinant TF.
- Beregn TF-afhængig FXa-generering (EVTF-aktivitet) ved hjælp af ligning (1):
TF-afhængig FXa-generering (EVTF-aktivitet [pg/ml]) = Samlet FXa-generering (kontroller IgG-brønd) - TF-uafhængig FXa-generation (anti-TF IgG-brønd) (figur 3) (1)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et vellykket resultat giver en positiv kontrolværdi på ≥0,5 pg/ml og en negativ kontrolværdi på <0,5 pg/ml. Det er bedst at finde en høj LPS-responder med >1,0 pg/ml EVTF-aktivitet for en positiv kontrol. Det repræsentative resultat viser EVTF-aktiviteten af EV'er isoleret fra plasma fra fuldblod fra 11 raske donorer, med og uden LPS-aktivering (figur 4). Seks ud af elleve donorer (donor 2, 4, 5, 8, 10, 11) var mellemstore til høje LPS-respondenter, mens fem ud af elleve donorer (donor 1, 3, 6, 7, 9) var lave LPS-respondenter.
Figur 1: Fremstilling af blodplade-depleteret plasma. Figuren blev ændret fra Hisada og Mackman29. Forkortelse: PDP = blodplade-depleteret plasma. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Isolering af ekstracellulære vesikler fra blodpladeforarmet plasma. Figuren blev ændret fra Hisada og Mackman29. Forkortelser: PDP = blodplade-depleteret plasma; EV'er = ekstracellulære vesikler. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Måling af ekstracellulær vesikelvævsfaktoraktivitet. Figuren blev ændret fra Hisada og Mackman29. Forkortelser: TF = vævsfaktor; EV'er = ekstracellulære vesikler. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: EVTF-aktivitet af plasma fra fuldblod fra 11 raske donorer, med og uden LPS-aktivering. LPS-aktivering blev udført under samme betingelse som den positive kontrol. Den positive kontrol var fra en kendt LPS-responder, mens responserne på LPS fra 11 raske donorer ikke var kendt på tidspunktet for eksperimentet. Hvide og sorte bjælker angiver henholdsvis med og uden LPS-aktivering. Forkortelser: EVTF = ekstracellulær vesikelvævsfaktor; LPS = lipopolysaccharid. Klik her for at se en større version af denne figur.
Tabel 1: Et resumé af undersøgelserne, der sammenligner dette interne EVTF-aktivitetsassay, en kommerciel TF-ELISA og et aktivitetsassay. Forkortelser: EVTF = ekstracellulær vesikelvævsfaktor; ELISA = enzymbundet immunosorbentassay. Klik her for at downloade denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her præsenteres protokollen for vores interne EVTF-aktivitetsanalyse. Der er tre kritiske trin i protokollen. Ved rekonstituering af EV-pillen er det vigtigt at pipette op og ned på EV-pelletens placering, selvom den ikke er synlig. Ufuldstændig rekonstitution af EV-pelleten vil resultere i en falsk negativ eller undervurdering af EVTF-aktivitetsværdier for prøverne. For det andet er brug af HBSA-Ca (+) kritisk i protokoltrin 6.5, fordi FXa-generering ikke kan genereres uden calcium. For det tredje er det afgørende at bruge EDTA-tetranatrium, men ikke EDTA-dinatrium til at stoppe FXa-generering, fordi sidstnævnte hæmmer FXa's evne til at spalte det kromogene substrat.
Vi anbefaler følgende opbevarings- og anvendelsesmetode for hvert reagens. Vi opbevarer analysebuffere og det rekonstituerede substrat ved 4 °C og bruger dem gentagne gange, indtil vi løber tør for dem. Hvis vi ikke løber tør for substratet inden for 2-3 uger, kasserer vi det, fordi det bliver gult. Vi opbevarer rekombinant TF, antistoffer, FVIIa og FX ved -80 °C og anbefaler at lave alikvoter til et assay for at undgå en fryse-optøningscyklus.
I en foreløbig undersøgelse efterlod vi plasmaprøver i 9 timer ved stuetemperatur, genfrøs dem ved -80 °C natten over og udførte analysen den næste dag. Som kontrol optog vi det samme plasma og frøs det straks igen. Vi fandt ud af, at prøven, der blev efterladt i 9 timer ved stuetemperatur, havde et fald på 16% i EVTF-aktivitet sammenlignet med den, der blev optøet og genfrosset straks (Hisada og Mackman, upublicerede data 2017).
Ud over forskellen i respons på LPS kan forskellen i koncentrationen af EV'er i plasma fra individuelle donorer forklare forskellige donorers forskellige EVTF-aktivitet. Faktisk observerede vi nogle variationer i koncentrationerne af EV'er i plasma fra LPS-stimuleret fuldblod (1,9 ± 0,6 ×10 10 partikler/ml, n = 6, gennemsnitlig ± standardafvigelse)30.
Denne interne EVTF-aktivitetsanalyse har flere funktioner, som kommercielle analyser ikke har. For det første bruger analysen et anti-TF-antistof til at skelne TF-afhængig FXa-generation fra TF-uafhængig FXa-generation. Tre kommercielle aktivitetsassays hævdes at måle TF-aktivitet i plasma, men ingen af dem bruger anti-TF-antistoffer16. Derfor måler disse kommercielle analyser simpelthen den samlede FXa-generation, men ikke TF-afhængig FXa-generation. For det andet bruger vi 2,4 nM FVIIa (den endelige koncentration i reaktionen) for at minimere TF-uafhængig FXa-generering af FVIIa. Et kommercielt aktivitetsassay bruger 12 nM FVIIa i reaktionen, hvilket giver en høj baggrund22. Faktisk aktiverer FVIIa FX lineært afhængigt af FVIIa-koncentration i fravær af TF31. Vi opsummerede de undersøgelser, der sammenlignede denne interne EVTF-aktivitetsanalyse og kommercielle TF-ELISA og et aktivitetsassay i tabel 1.
Der foreslås fire responsklassifikationer af EVTF-aktivitet for citreret blodpladefattigt plasma: nul (0 til <0,5 pg/ml); svag (0,5 til <1,0 pg/ml), moderat (1,0 til <2,0 pg/ml) og stærk (≥2,0 pg/ml)23. Især påvirker forskellige antikoagulantia resultaterne af EVTF-aktivitetsassays. For eksempel blev der observeret højere niveauer af EVTF-aktivitet ved anvendelse af heparin efter LPS-stimulering sammenlignet med natriumcitrat (donor A: 4,6 (citrat) vs 28,6 (heparin) pg / ml og donor B: 3,4 (citrat) vs 26,0 (heparin) pg / ml, henholdsvis Hisada og Mackman upublicerede data 2017). I modsætning hertil blev der observeret lavere niveauer af EVTF-aktivitet ved anvendelse af EDTA efter LPS-stimulering sammenlignet med natriumcitrat (donor C: 3,9 (citrat) vs 1,4 (EDTA) pg / ml, donor D: 3,8 (citrat) vs 0,4 (EDTA) pg / ml, henholdsvis Tatsumi og Mackman upublicerede data 2016). Disse resultater indikerer, at EVTF-aktivitetsdata ikke er sammenlignelige, når der anvendes forskellige antikoagulantia.
Der er et par begrænsninger for metoden. Variationskoefficienten (CV) er relativt høj sammenlignet med kliniske assays. Faktisk var CV'et for den positive kontrol i syv uafhængige undersøgelser 24%17,29. Isolering af elbiler ved hjælp af centrifugeringspiller, ikke kun elbiler, men også celleaffald. Vi har tidligere analyseret pellet af blodpladerigt plasma ved transmissionselektronmikroskopi og observerede blodplader, EV'er og cellulært affald32. Vi bruger en fastvinklet rotor og har ikke oplevet en svingrotor til 20.000 × g centrifugering. Vi fandt for nylig, at små elbiler, der kan pelleteres med 100.000 × g, men ikke med 20.000 × g, har EVTF-aktivitet hos patienter med kræft i bugspytkirtlen og COVID-1930. Dette indikerer, at denne protokol ikke måler EVTF-aktivitet fra små elbiler, såsom exosomer. Især exosomer er sphingomyelin-rige EV'er, og tilstedeværelsen af TF-bærende exosomer er blevet rapporteret 30,33,34,35. Vi anbefaler pelletering af EV'er i plasma ved hjælp af 100.000 × g for mere nøjagtigt at bestemme den samlede mængde EVTF-aktivitet i prøven. Bemærk, at det kræver en ultracentrifuge og en længere analysetid, fordi centrifugeringstiden øges fra 15 min til 70 min.
Denne metode kan anvendes på plasmaprøver fra enhver form for sygdom. EVTF-aktivitet er forbundet med sygdommens sværhedsgrad og overlevelse hos patienter med forskellige sygdomme, herunder kræft, COVID-19, bakteriel infektion og skrumpelever 23,26,27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Der er ingen konkurrerende interesser at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af NIH NHLBI R35HL155657 (N.M.) og John C. Parker professoratet (N.M.). Vi vil gerne takke fru Sierra J. Archibald for hendes nyttige kommentarer
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL tube for 20,000 x g centrifuge | any company | N/A | We use the one from Fisher Scientific (Catalog number: 05-408-129). |
| 1.5 mL tube for ultracentrifuge | any company | N/A | We use the one from Beckman Coulter (Catalog number: 357448) |
| 15 mL tube | any company | N/A | We use the one from VWR (Catalog number: 89039-666) |
| 21 G x .75 in. BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Set with 12 in. tubing and luer adapter | BD | 367281 | |
| 96-well plate | any company | N/A | We use the one from Globe Scientific (Catalog number: 120338). |
| BD Vacutainer Citrate Tubes | BD | 363083 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A9418 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | C69-500 | |
| Centrifuge for 1.5 mL tube | any company | N/A | We use the Centrifuge 5417R (Eppendorf). |
| Centrifuge for 15 mL tube | any company | N/A | We use the Centrifuge 5810R (Eppendorf). |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G7021 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrate | Sigma Aldrich | E6511 | |
| Hepes | Sigma Aldrich | H4034 | |
| Human FVIIa | Enzyme Research Laboratory | HFVIIa | The solution should be diluted with HBSA-Ca(+). |
| Human FX | Enzyme Research Laboratory | HFX1010 | The solution should be diluted with HBSA-Ca(+). |
| Inhibitory mouse anti-human tissue factor IgG, clone HTF-1 | Fisher Scientific | 550252 | |
| Lipopolysaccharide from Escherichia coli O111:B4 | Sigma Aldrich | L2630 | There are several lipopolysaccharide from different E. coli. Different lipopolysaccharide have different potential to activate monocytes. |
| Mouse IgG | Sigma Aldrich | I5381 | |
| Pefachrome FXa 8595 | Enzyme Research Laboratory | 085-27 | |
| Plate reader | any company | N/A | We use the SpectraMax i3x from Molecular Devices |
| Re-lipidated recombinant tissue factor, Dade Innovin | Siemens | 10873566 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima TLX | |
| Ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | TLA-55 |
References
- Grover, S. P., Mackman, N. Tissue factor: an essential mediator of hemostasis and trigger of thrombosis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38 (4), 709-725 (2018).
- Shaw, A. W., Pureza, V. S., Sligar, S. G., Morrissey, J. H. The local phospholipid environment modulates the activation of blood clotting. Journal of Biological Chemistry. 282 (9), 6556-6563 (2007).
- Tavoosi, N., et al. Molecular determinants of phospholipid synergy in blood clotting. Journal of Biological Chemistry. 286 (26), 23247-23253 (2011).
- Wang, J., Pendurthi, U. R., Rao, L. V. M. Sphingomyelin encrypts tissue factor: ATP-induced activation of A-SMase leads to tissue factor decryption and microvesicle shedding. Blood Advances. 1 (13), 849-862 (2017).
- Kornhuber, J., Rhein, C., Muller, C. P., Muhle, C. Secretory sphingomyelinase in health and disease. Biological Chemistry. 396 (6-7), 707-736 (2015).
- Versteeg, H. H., Ruf, W. Tissue factor coagulant function is enhanced by protein-disulfide isomerase independent of oxidoreductase activity. Journal of Biological Chemistry. 282 (35), 25416-25424 (2007).
- Reinhardt, C., et al. Protein disulfide isomerase acts as an injury response signal that enhances fibrin generation via tissue factor activation. Journal of Clinical Investigation. 118 (3), 1110-1122 (2008).
- Langer, F., et al. Rapid activation of monocyte tissue factor by antithymocyte globulin is dependent on complement and protein disulfide isomerase. Blood. 121 (12), 2324-2335 (2013).
- Bogdanov, V. Y., et al. Alternatively spliced human tissue factor: a circulating, soluble, thrombogenic protein. Nature Medicine. 9 (4), 458-462 (2003).
- Mackman, N. Alternatively spliced tissue factor - one cut too many. Thrombosis and Haemostasis. 97 (1), 5-8 (2007).
- Censarek, P., Bobbe, A., Grandoch, M., Schror, K., Weber, A. A. Alternatively spliced human tissue factor (asHTF) is not pro-coagulant. Thrombosis and Haemostasis. 97 (1), 11-14 (2007).
- Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (16), 2667-2688 (2011).
- Osterud, B., Bjorklid, E. Tissue factor in blood cells and endothelial cells. Frontiers in Bioscience (Elite Edition). 4 (1), 289-299 (2012).
- Hisada, Y., Mackman, N. Cancer cell-derived tissue factor-positive extracellular vesicles: biomarkers of thrombosis and survival. Current Opinion in Hematology. 26 (5), 349-356 (2019).
- Vatsyayan, R., Kothari, H., Pendurthi, U. R., Rao, L. V. 4-Hydroxy-2-nonenal enhances tissue factor activity in human monocytic cells via p38 mitogen-activated protein kinase activation-dependent phosphatidylserine exposure. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (7), 1601-1611 (2013).
- Mackman, N., Sachetto, A. T. A., Hisada, Y. Measurement of tissue factor-positive extracellular vesicles in plasma: strengths and weaknesses of current methods. Current Opinion in Hematology. 29 (5), 266-274 (2022).
- Lee, R. D., et al. Pre-analytical and analytical variables affecting the measurement of plasma-derived microparticle tissue factor activity. Thrombosis Research. 129 (1), 80-85 (2012).
- Claussen, C., et al. Microvesicle-associated tissue factor procoagulant activity for the preoperative diagnosis of ovarian cancer. Thrombosis Research. 141, 39-48 (2016).
- Mackman, N., Hisada, Y., Archibald, S. J., et al. Tissue factor and its procoagulant activity on cancer-associated thromboembolism in pancreatic cancer: Comment by Mackman et al. Cancer Science. 113 (5), 1885-1887 (2022).
- Sachetto, A. T. A., et al. Evaluation of four commercial ELISAs to measure tissue factor in human plasma. Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 7 (3), 100133 (2023).
- Archibald, S. J., Hisada, Y., Bae-Jump, V. L., Mackman, N. Evaluation of a new bead-based assay to measure levels of human tissue factor antigen in extracellular vesicles in plasma. Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 6 (2), e12677 (2022).
- Tatsumi, K., et al. Evaluation of a new commercial assay to measure microparticle tissue factor activity in plasma: communication from the SSC of the ISTH. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (11), 1932-1934 (2014).
- Hisada, Y., et al. Measurement of microparticle tissue factor activity in clinical samples: A summary of two tissue factor-dependent FXa generation assays. Thrombosis Research. 139, 90-97 (2016).
- Tatsumi, K., Hisada, Y., Connolly, A. F., Buranda, T., Mackman, N. Patients with severe orthohantavirus cardiopulmonary syndrome due to Sin Nombre Virus infection have increased circulating extracellular vesicle tissue factor and an activated coagulation system. Thrombosis Research. 179, 31-33 (2019).
- Schmedes, C. M., et al. Circulating Extracellular Vesicle Tissue Factor Activity During Orthohantavirus Infection Is Associated With Intravascular Coagulation. Journal of Infectious Diseases. 222 (8), 1392-1399 (2020).
- Rosell, A., et al. Patients with COVID-19 have elevated levels of circulating extracellular vesicle tissue factor activity that is associated with severity and mortality-Brief report. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 878-882 (2021).
- Campbell, R. A., et al. Comparison of the coagulopathies associated with COVID-19 and sepsis. Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 5 (4), e12525 (2021).
- Guervilly, C., et al. Dissemination of extreme levels of extracellular vesicles: tissue factor activity in patients with severe COVID-19. Blood Advances. 5 (3), 628-634 (2021).
- Hisada, Y., Mackman, N. Measurement of tissue factor activity in extracellular vesicles from human plasma samples. Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 3 (1), 44-48 (2019).
- Sachetto, A. T. A., et al. Tissue factor activity of small and large extracellular vesicles in different diseases. Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 7 (3), 100124 (2023).
- Bom, V. J., Bertina, R. M. The contributions of Ca2+, phospholipids and tissue-factor apoprotein to the activation of human blood-coagulation factor X by activated factor VII. Biochemical Journal. 265 (2), 327-336 (1990).
- Tilley, R. E., Holscher, T., Belani, R., Nieva, J., Mackman, N. Tissue factor activity is increased in a combined platelet and microparticle sample from cancer patients. Thrombosis Research. 122 (5), 604-609 (2008).
- Gurung, S., Perocheau, D., Touramanidou, L., Baruteau, J. The exosome journey: from biogenesis to uptake and intracellular signalling. Cell Communication and Signaling. 19 (1), 47 (2021).
- Garnier, D., et al. Cancer cells induced to express mesenchymal phenotype release exosome-like extracellular vesicles carrying tissue factor. Journal of Biological Chemistry. 287 (52), 43565-43572 (2012).
- Park, J. A., et al. Tissue factor-bearing exosome secretion from human mechanically stimulated bronchial epithelial cells in vitro and in vivo. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 130 (6), 1375-1383 (2012).
