Pressione lucidatura Pipette per una migliore patch-clamp di registrazione

Summary

Questa è una guida per modificare la forma di micropipette di vetro. In particolare, utilizzando il calore e la pressione dell'aria la conicità è allargato senza aumentare l'apertura punta, con conseguente minore resistenza pipetta. Questo è fondamentale per ottenere registrazioni a basso rumore di piccole cellule, ma è utile in molte applicazioni.

Abstract

Pressione lucidatura è un metodo per modellare pipette di vetro per patch-clamp registrazione. In primo luogo abbiamo sviluppato questo metodo per la realizzazione di pipette adatto per la registrazione di piccole dimensioni (<3 m) corpi cellulari neuronali. Il principio di base è simile al vetro soffiato e combina la pressione dell'aria e del calore per modificare la forma di pipette di patch preparata da un estrattore micropipetta convenzionale. Può essere applicato ai cosiddetti soft (calce sodata) e difficile (borosilicato) occhiali. In generale, la lucidatura della pressione può ridurre la resistenza pipetta del 25% senza diminuire il diametro dell'apertura punta (Goodman e Lockery, 2000). Può essere applicato a qualsiasi tipo di vetro e richiede solo l'aggiunta di un valvola di alta pressione e montato su un microforge. Questa tecnica è essenziale per la registrazione da cellule ultrasmall (<5 m) e può anche migliorare singolo canale di registrazione, riducendo al minimo la resistenza pipetta. La forma smussata è utile anche per la registrazione perforata-patch clamp, perché i risultati in forma di questa punta una bozza membrana più disponibile per la perforazione.

Protocol

Pipette tirando

Utilizzando un filamento estrattore come un Sutter P-97 Flaming Puller microelettrodo / Brown, tirare un insieme di circa 10-20 pipette.

1. Seleziona il tuo bicchiere. Noi usiamo borosilicato (BF150-86-10, OD = 1,5 mm, ID = 0,86 mm). Conservare con cura il vetro in modo che rimane pulito e senza polvere.
2. Progettare un programma di trazione. L'obiettivo primario è una punta di apertura circa la dimensione desiderata, che dipende dalla applicazione. Sutter P-97 Cookbook Pipettare ² è un eccellente punto di riferimento.
3. Osservate la vostra pipette al microscopio per determinare diametro di apertura e morbidezza. Eliminare ruvido, consigli irregolare, o irregolari. Per la registrazione standard di patch clamp, un'apertura punta che è di 2-4 micron tutto è meglio. Una punta smussata porta ad una minore resistenza per il diametro dell'apertura stessa, che si preferisce. Forma e dimensioni possono essere modificate durante la lucidatura, di seguito.

Pressione lucidatura pipette

1. Collegare un titolare pipetta con una linea pulita ed aria compressa. Utilizzando un regolatore, impostare la pressione dell'aria compressa linea a ~ 40 PSI. Collegare la linea di aria compressa ad una valvola a 4 vie di controllo che permetterà la pressione titolare pipetta ad essere attivata e disattivata. Collegare un titolare pipetta alla valvola di controllo con una lunghezza di ⅛ in Tygon ® tubazione.
2. Utilizzare un impianto di lucidatura (microforge) con un alta pressione titolare pipetta, una bobina di lucidatura controllato da un pedale, un microscopio equipaggiato con un ingrandimento basso e alto, lunga distanza (idealmente, 10x e 100x) aria obiettivi. E 'fondamentale essere in grado di osservare l'apertura pipetta durante il protocollo.
3. Opzionale: Cappotto la pipetta con un isolante idrofoba per diminuire capacità e migliorare le caratteristiche del rumore (vedi "pipette Pulling" per questa tecnica).
4. Verificare che la valvola è in posizione off. Inserire una pipetta nel supporto pipetta e stringere il raccordo di a mano.
   
   Nota di sicurezza: se la pipetta venga mantenuta ferma nel supporto pipetta, la pressione dell'aria provoca la pipetta di essere espulso dal titolare pipetta.
   
   
5. Posizionare la pipetta e titolare nel microforge. Posizionare il titolare pipetta sul palco microscopio in modo che sia la punta e la bobina lucidatura sono visibili in basso (10x) accendere il microforge. Portare la punta ~ 75 micron dal filamento. Tieni presente che il filamento si espande quando riscaldato.
6. Passare alla elevata potenza (100x) obiettivo. Sia la punta della pipetta e la bobina lucidatura dovrebbe essere a fuoco e nel campo di vista. In caso contrario, regolare l'altezza della bobina lucidatura. (La posizione della pipetta non può essere regolata). La punta della pipetta e la bobina di lucidatura dovrebbe essere vicino ai lati opposti del campo visivo. Evitare di posizionare la bobina troppo vicino alla punta della pipetta, perché si espanderà in caso di riscaldamento e di rilievo nella vostra pipetta.
7. Girate la valvola per dirigere l'aria pressurizzata nella pipetta, e il calore la punta della pipetta fino a quando il cono dietro la punta comincia a palloncino verso l'esterno.
8. Interrompere il riscaldamento prima che la punta palloncini troppo ampiamente. La sperimentazione è necessaria per determinare la distanza appropriata, il calore, e il tempo per la forma desiderata.
9. Opzionale: ridurre il diametro di apertura punta da lucidare la punta, in assenza di pressione. I punti 7 e 8 può ripetere per mettere a punto sia la forma e le dimensioni della punta della pipetta.
10. Spegnere la pressione e puntando la punta della pipetta in una direzione sicura, rimuovere la pipetta e metterla in un contenitore pulito, dove sarà protetta dalla polvere.
    
    Nota di sicurezza: Se la pressione dell'aria non è spento, la pipetta può essere espulso dal titolare pipetta durante la rimozione.

Note sui microforge

Usiamo un microforge assemblato da off-the-shelf parti disponibili in commercio. (È possibile anche acquistare un kit di lucidatura pressione da alcune aziende, ad esempio, ALA Scienza, GlassWorx). Indipendentemente dal microforge, è essenziale avere ottiche che sono buone abbastanza per vedere l'apertura punta, che è spesso solo un paio di micron di diametro. Usiamo un lungo lavoro obiettivo 100x a distanza per questo scopo. Inoltre, il cappotto la bobina di lucidatura ad alta temperatura di fusione del vetro in modo da minimizzare il deposito di metallo vaporizzato sul pipette.

Parte 3: risultati attesi

Lucidatura moderata pressione può ridurre la resistenza di una pipetta senza modificare sensibilmente l'apertura diametro. Se lo si desidera, questo protocollo può essere usato per fare pipette con sub-micron aperture e resistenze tra 5-10MΩ.

Discussion

Inizialmente abbiamo sviluppato questo metodo per pipette utile per patch-clamp registrazione 2-3 micron neuroni in C. elegans ^1. E 'in uso di routine nel laboratorio Goodman. Noi pipette pressione smalto non solo per la registrazione da piccolo C. elegans neuroni, ma anche per l'ottenimento di registrazioni macropatch e single-channel dei canali ionici espressi in ovociti di Xenopus. Per un dato in punta di apertura del diametro, la forma smussata produce una minore resistenza pipetta. Resistenza pipetta inferiore porta alla resistenza in serie sempre più in basso di rumore registrazioni.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Glass Capillaries	Consumable	Sutter Instrument Co.	BF150-85-10 (or similar)	The method works with any type of capillary except those made from quartz. However, we recommend using capillaries with a filament.
Inverted Microscope	Microscope	Leica Microsystems	DM IL (or similar)	Any simple inverted microscope will do. However, it is essential to have sufficient magnification to see pipettes during polishing. We use a 100x metallurgical lens with a long working distance for this purpose.
Microforge Kit	Tool	ALA Science	CPM-2	Supplies polishing coil, controller and foot pedal.
Air pressure source	Tool	ALA Science	PR-60	Accessory for providing high pressure, includes a suitable valve. Alternatively, compressed air from the building can be used together with a filter/regulator (set to 40 PSI) and a 4-way valve (see below)
4-way valve	Tool	Cole-Parmer	A-98150-01	Fittings will be needed to couple valve to tubing
Pipette Holder with Luer Connector	Tool	World Precision Instruments, Inc.	MPH-6S20	Use a male luer-to-barb fitting to connect pipette holder to high-pressure tubing
Tygon® tubing	Tool	Cole-Parmer	06408-62	Use this tubing to connect pipette holder to 4-way valve