Summary
这是一个指导修改形状的玻璃微量。具体来说,通过热和空气压力的锥度不增加尖端张开扩大,导致较低的吸液管电阻。这是至关重要的,以获得小细胞低噪音录音,但在许多应用中非常有用。
Abstract
压力抛光塑造膜片钳记录玻璃移液器的方法。首先,我们开发了适合小(<3米)的神经元细胞体的录音编造移液器此方法。基本原理是类似玻璃吹制,并结合空气的压力和热量,修改形状由传统的微量车夫准备的补丁移液器。它可以应用到所谓的软(碱石灰)和硬(硼硅)眼镜。一般来说,抛光压力,可以减少25%,吸液管电阻不减少的尖端张开“(Goodman和Lockery,2000)直径。它可以适用于几乎任何类型的玻璃,只需要增加一个高压阀门及配件一个microforge。这种技术是必要的记录,从超小细胞(<5米)和,还可以通过单声道录音,最大限度地减少吸液管电阻。钝的形状也很有用穿孔膜片钳记录,因为这在一个较大的膜穿孔的气泡的笔尖形状结果。
Protocol
拉移液器
使用灯丝一个车夫,如萨特的P - 97火焰山/布朗微电极拖轮,拉约10-20移液器。
- 选择你的玻璃。我们使用硼硅(BF150 - 86 - 10,OD = 1.5毫米,编号= 0.86毫米)。商店的玻璃,仔细,所以保持清洁和无尘。
- 设计一个拉动的程序。其主要目的是尖端张开约所需的大小,这将取决于应用程序。萨特的 P - 97移液器食谱 2是一个很好的参考。
- 在显微镜下观察确定开口直径和平滑的移液器。舍弃粗糙,凹凸不平,或不规则的小窍门。对于标准的膜片钳记录,是2-4微米跨越的小费开放是最好的。一个先端钝,导致较低的电阻相同的开口直径,这是首选。形状和大小,在抛光过程中,可以修改如下。
压力抛光移液器
- 将吸管持有人一个干净,压缩空气。使用稳压器,设置压缩空气〜40 PSI压力。 4路控制阀,使吸管持有人的压力,要打开和关闭连接的压缩空气。 ⅛®管长度在聚乙烯吸管持有人连接到控制阀。
- 使用一个高压力吸管架,抛光线圈由一个脚踏,配备低和高放大倍率,长工作距离(理想情况下,10X和100X)空中目标显微镜控制抛光钻机(microforge)。它是重要的是要能够观察到在协议吸管开放。
- 可选 :涂层具有疏水性的绝缘体,以减少电容和改善噪声特性(见“拉移液器”这种技术)的吸管。
- 验证压力阀在关闭的位置。吸管放入吸管持有人,并用手指拧紧拧紧接头。
安全注意事项 :如果移液器吸管持有人持有的紧密,空气压力会导致移液器移液器支架弹出。 - 将在microforge的移液器和持有人。位置显微镜舞台上的吸管持有这样既尖和抛光线圈microforge电源低(10倍)可见。带来的长丝的一角〜75微米。请记住,灯丝加热时,将扩大。
- 切换到高功率(100倍)的目标。枪头和抛光线圈应在重点和视野。如果不是,调整抛光线圈的高度。 (吸管的位置,无法调整)。枪头和抛光线圈应靠近两侧的视野。避免定位线圈太近,因为它会扩大,因为它加热到您的移液器和凹凸的枪头 。
- 打开阀门,直接加压空气进入移液器,枪头,直到热背后的尖端锥度开始向外气球。
- 停止加热前提示气球太广泛。实验是必需的,以确定适当的距离,热量和时间,所需的形状。
- 可选 :抛光的提示,在没有压力的情况下,减少尖端张开直径。步骤7和8可以反复微调的形状和尺寸的枪头。
- 关闭的压力,同时指出在一个安全的方向的枪头,取出吸管,并放置在一个干净的储物盒,将防尘。
安全注意事项 :如果不关闭,气压吸管吸管持有人可在取出弹出。
注意事项的microforge
我们使用过的,现成的市售零件组装一个microforge。 (您也可以购买由少数几家公司,如ALA的科学,GlassWorx压力抛光套件)。不管的microforge,它是必不可少的,有不够好,看到提示开放,这常常是一个直径只有几微米的光学。为此目的,我们使用长工作距离的100倍镜头。此外,大衣抛光线圈,以尽量减少高熔化温度,以玻璃上沉积的移液器汽化的金属。
第3部分:预期结果
适度的压力抛光,可以减少没有明显变化,在开口直径的吸液管的阻力。如果需要,该协议可用于亚微米开口与5 -10MΩ电阻移液器。
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Discussion
我们最初开发这种方法使移液器有用2-3μm的神经元在 C片钳记录线虫 1。它是在古德曼实验室常规使用。我们的压力不仅波兰移液器录制从微小的C。线虫的神经元,但也获得macropatch表示在爪蟾卵母细胞的离子通道和单通道录音。对于一个给定的尖端开口直径,生硬的造型产生一个低电阻的吸管。下吸液管电阻会导致较低的串联电阻和低噪声录音。
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Acknowledgments
压力抛光技术的开发与SR Lockery合作。
Materials
Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
Glass Capillaries | Consumable | Sutter Instrument Co. | BF150-85-10 (or similar) | The method works with any type of capillary except those made from quartz. However, we recommend using capillaries with a filament. |
Inverted Microscope | Microscope | Leica Microsystems | DM IL (or similar) | Any simple inverted microscope will do. However, it is essential to have sufficient magnification to see pipettes during polishing. We use a 100x metallurgical lens with a long working distance for this purpose. |
Microforge Kit | Tool | ALA Science | CPM-2 | Supplies polishing coil, controller and foot pedal. |
Air pressure source | Tool | ALA Science | PR-60 | Accessory for providing high pressure, includes a suitable valve. Alternatively, compressed air from the building can be used together with a filter/regulator (set to 40 PSI) and a 4-way valve (see below) |
4-way valve | Tool | Cole-Parmer | A-98150-01 | Fittings will be needed to couple valve to tubing |
Pipette Holder with Luer Connector | Tool | World Precision Instruments, Inc. | MPH-6S20 | Use a male luer-to-barb fitting to connect pipette holder to high-pressure tubing |
Tygon® tubing | Tool | Cole-Parmer | 06408-62 | Use this tubing to connect pipette holder to 4-way valve |
References
- Goodman, M. B., Lockery, S. R. Pressure polishing: a method for re-shaping patch pipettes during fire polishing. . J Neurosci Methods. 100, 13-15 (2000).
- Sutter Instrument, P-97 Pipette Cookbook. , Sutter Instrument. http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf (2008).