Summary
यह कांच micropipettes के आकार को संशोधित करने के लिए एक गाइड है. विशेष रूप से, गर्मी और हवा के दबाव का उपयोग करके घटना बढ़ती टिप खोलने के बिना चौड़ी है, कम विंदुक प्रतिरोध करने के लिए अग्रणी. इस छोटे कोशिकाओं के कम शोर रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है, लेकिन कई अनुप्रयोगों में उपयोगी है.
Abstract
दबाव चमकाने पैच दबाना रिकॉर्डिंग के लिए गिलास pipettes आकार देने के लिए एक विधि है. हम पहली बार छोटे (<3 मीटर) neuronal सेल निकायों से रिकॉर्डिंग के लिए उपयुक्त pipettes fabricating के लिए इस विधि विकसित की है. बुनियादी प्रिंसिपल गिलास उड़ा करने के लिए समान है और हवा के दबाव और गर्मी को जोड़ती है पैच एक पारंपरिक micropipette खींचने के द्वारा तैयार pipettes के आकार को संशोधित. यह तथाकथित (नींबू सोडा) नरम और हार्ड चश्मा (borosilicate) के लिए लागू किया जा सकता है. सामान्यतया, दबाव चमकाने 25% से टिप खोलने (Goodman और Lockery, 2000) का व्यास घटते बिना विंदुक प्रतिरोध को कम कर सकते हैं. यह कांच के लगभग किसी भी प्रकार के लिए लागू किया जा सकता है और केवल एक उच्च दबाव वाल्व और एक microforge के लिए फिटिंग के अलावा की आवश्यकता है. इस तकनीक ultrasmall कोशिकाओं (<5 मीटर) से रिकॉर्डिंग के लिए आवश्यक है और विंदुक प्रतिरोध कम करके एकल चैनल रिकॉर्डिंग में सुधार कर सकते हैं. कुंद आकार भी छेदा पैच दबाना रिकॉर्डिंग के लिए उपयोगी है एक बड़ा झिल्ली वेध के लिए उपलब्ध छाला में इस टिप आकार परिणाम के बाद से.
Protocol
पुलिंग pipettes
डांड़ी जैसे एक फिलामेंट का प्रयोग एक Sutter पी-97 / ब्राउन microelectrode डांड़ी ज्वलंत लगभग 10-20 pipettes का एक सेट खींच.
- अपने गिलास का चयन करें. हम borosilicate (BF150 86-10, ओवर ड्राफ्ट = 1.5 मिमी, आईडी = 0.86 मिमी) का उपयोग करें. कांच स्टोर सावधानी से तो यह साफ है और धूल मुक्त रहता है.
- एक खींच प्रोग्राम डिजाइन. प्राथमिक लक्ष्य लगभग इच्छित आकार है, जो आवेदन पर निर्भर करेगा खोलने टिप है. Sutter पी 97 पिपेट 2 रसोई की किताब एक उत्कृष्ट संदर्भ है.
- खोलने व्यास और चिकनाई का निर्धारण के लिए एक खुर्दबीन के नीचे अपने pipettes देखो. किसी न किसी तरह, असमान या अनियमित सुझावों त्यागें. मानक पैच दबाना रिकॉर्डिंग के लिए, कोई टिप खोलने है कि भर में 2-4 सुक्ष्ममापी है सबसे अच्छा है. एक कुंद टिप करने के लिए एक ही खोलने की व्यास, जो पसंद है के लिए प्रतिरोध कम होता है. आकृति और आकार चमकाने के दौरान संशोधित किया जा सकता है नीचे,.
दबाव चमकाने pipettes
- एक साफ, संपीड़ित हवा लाइन के लिए एक विंदुक धारक संलग्न. एक नियामक का प्रयोग, संपीड़ित हवा लाइन ~~ 40 साई के दबाव निर्धारित किया है. एक नियंत्रण 4 तरह वाल्व है कि विंदुक धारक दबाव और बंद हो गया अनुमति देगा करने के लिए संपीड़ित हवा लाइन कनेक्ट. नियंत्रण वाल्व Tygon में ⅛ की लंबाई ® टयूबिंग के साथ एक विंदुक धारक कनेक्ट.
- एक उच्च दबाव विंदुक धारक, एक चमकाने एक पैर पेडल, एक कम और उच्च वृद्धि, लंबे समय (आदर्श, 10x और 100x) काम दूरी हवा के उद्देश्यों के साथ एक सुसज्जित खुर्दबीन द्वारा नियंत्रित का तार के साथ एक चमकाने रिग (microforge) का प्रयोग करें. यह प्रोटोकॉल के दौरान विंदुक खोलने का पालन करने में सक्षम होने के लिए महत्वपूर्ण है.
- वैकल्पिक: एक hydrophobic समाई कम होती है और शोर विशेषताओं में सुधार ("इस तकनीक के लिए पुलिंग pipettes" देखें) इन्सुलेटर कोट के साथ विंदुक.
- सत्यापित करें दबाव वाल्व बंद की स्थिति में है. विंदुक धारक में एक विंदुक प्लेस और उंगली तंग फिटिंग कस.
सुरक्षा नोट: यदि विंदुक कसकर पिपेट धारक में आयोजित किया जाता है, हवा के दबाव विंदुक विंदुक धारक से निकली कारण होगा. - Microforge में पिपेट धारक रखें. विंदुक धारक स्थिति खुर्दबीन मंच पर इतना है कि दोनों टिप और चमकाने का तार microforge पर कम शक्ति (10x) में दिखाई दे रहे हैं. ~~ 75 माइक्रोन फिलामेंट से टिप ले आओ. ध्यान रखें कि फिलामेंट जब गरम का विस्तार होगा.
- उच्च शक्ति उद्देश्य (100x) करने के लिए स्विच करें. दोनों विंदुक टिप और चमकाने का तार ध्यान केंद्रित करने में और देखने के क्षेत्र में होना चाहिए. यदि नहीं, तो चमकाने का तार की ऊंचाई समायोजित करें. (विंदुक स्थिति को समायोजित नहीं किया जा सकता है). विंदुक टिप और चमकाने का तार देखने के क्षेत्र के विपरीत पक्षों के करीब होना चाहिए. कुंडल स्थिति भी विंदुक टिप करने के लिए करीब क्योंकि यह रूप में यह तपता विस्तार और अपने पिपेट में टक्कर से बचें.
- मुड़ें वाल्व पिपेट में प्रत्यक्ष दबाव हवा और गर्मी विंदुक टिप टिप के पीछे शंकु तक बाहर गुब्बारा शुरू होता है.
- हीटिंग बंद करो पहले टिप भी बड़े पैमाने पर गुब्बारे. प्रयोगों के लिए इच्छित आकार के लिए उचित दूरी, गर्मी, और समय निर्धारित करने की आवश्यकता है.
- वैकल्पिक: टिप खोलने व्यास कम दबाव के अभाव में टिप चमकाने के द्वारा . चरण 7 और 8 विंदुक टिप के आकार और दोनों आयामों - ठीक धुन करने के लिए दोहराया जा सकता.
- बंद दबाव स्विच और जबकि एक सुरक्षित दिशा में विंदुक टिप ओर इशारा करते हुए, पिपेट हटाने और यह एक साफ भंडारण बॉक्स जहां यह धूल से संरक्षित किया जाएगा में जगह.
सुरक्षा नोट: यदि हवा का दबाव बंद नहीं चालू है, विंदुक विंदुक धारक से हटाने के दौरान निकली जा सकता है.
Microforge के बारे में नोट्स
हम एक बंद-the-शेल्फ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध भागों से इकट्ठे microforge का उपयोग करें. (आप भी कुछ कंपनियों, जैसे, ALA विज्ञान, GlassWorx से दबाव चमकाने किट खरीद सकते हैं). Microforge के बावजूद, यह आवश्यक है प्रकाशिकी है कि काफी अच्छा टिप खोलने, जो अक्सर केवल व्यास में कुछ सुक्ष्ममापी देख कर रहे हैं. हम इस उद्देश्य के लिए लंबी दूरी काम कर रहे 100x लेंस का उपयोग करें. इसके अलावा, कोट क्रम में उच्च पिघलने तापमान गिलास के साथ चमकाने का तार pipettes पर vaporized धातु जमा कम से कम करने के लिए.
भाग 3: प्रत्याशित परिणाम
मध्यम दबाव चमकाने व्यास को खोलने में एक सराहनीय परिवर्तन के बिना एक विंदुक के प्रतिरोध को कम कर सकते हैं. अगर वांछित, इस प्रोटोकॉल के लिए उप माइक्रोन के उद्घाटन और resistances के साथ 5-10MΩ के बीच pipettes बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
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Discussion
हम मूल रूप से इस पद्धति विकसित करने के लिए pipettes सी में 2-3 सुक्ष्ममापी न्यूरॉन्स से पैच - दबाना रिकॉर्डिंग के लिए उपयोगी बनाने के 1 एलिगेंस. यह गुडमैन प्रयोगशाला में नियमित प्रयोग में है. छोटे सी. से हम दबाव पॉलिश रिकॉर्डिंग के लिए न केवल pipettes एलिगेंस न्यूरॉन्स, लेकिन यह भी Xenopus oocytes में व्यक्त आयन चैनलों के macropatch और एकल चैनल रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के लिए. एक दिया व्यास टिप खोलने के लिए, कुंद आकार एक विंदुक कम प्रतिरोध पैदा करता है. लोअर विंदुक प्रतिरोध कम श्रृंखला प्रतिरोध और कम शोर रिकॉर्डिंग की ओर जाता है है.
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Acknowledgments
तकनीक दबाव चमकाने एसआर Lockery के साथ सहयोग में विकसित किया गया था.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass Capillaries | Consumable | Sutter Instrument Co. | BF150-85-10 (or similar) | The method works with any type of capillary except those made from quartz. However, we recommend using capillaries with a filament. |
| Inverted Microscope | Microscope | Leica Microsystems | DM IL (or similar) | Any simple inverted microscope will do. However, it is essential to have sufficient magnification to see pipettes during polishing. We use a 100x metallurgical lens with a long working distance for this purpose. |
| Microforge Kit | Tool | ALA Science | CPM-2 | Supplies polishing coil, controller and foot pedal. |
| Air pressure source | Tool | ALA Science | PR-60 | Accessory for providing high pressure, includes a suitable valve. Alternatively, compressed air from the building can be used together with a filter/regulator (set to 40 PSI) and a 4-way valve (see below) |
| 4-way valve | Tool | Cole-Parmer | A-98150-01 | Fittings will be needed to couple valve to tubing |
| Pipette Holder with Luer Connector | Tool | World Precision Instruments, Inc. | MPH-6S20 | Use a male luer-to-barb fitting to connect pipette holder to high-pressure tubing |
| Tygon® tubing | Tool | Cole-Parmer | 06408-62 | Use this tubing to connect pipette holder to 4-way valve |
References
- Goodman, M. B., Lockery, S. R. Pressure polishing: a method for re-shaping patch pipettes during fire polishing. . J Neurosci Methods. 100, 13-15 (2000).
- Sutter Instrument, P-97 Pipette Cookbook. , Sutter Instrument. http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf (2008).
