Geliştirilmiş Patch-kelepçe kayıt için Basınç-parlatma Pipetler

Summary

Bu cam mikropipetler şeklini değiştirerek bir kılavuzdur. Özellikle, ısı ve hava basıncı ile konik pipet direnci azaltmak için, ucu açıklığı artırmadan genişletilinceye. Bu küçük hücrelerin düşük gürültü kayıtları elde etmek için kritik öneme sahiptir, ancak birçok uygulamada yararlıdır.

Abstract

Basınç-parlatma yama klemp kayıt için cam pipetler şekillendirmek için kullanılan bir yöntemdir. Biz ilk olarak küçük (<3 m) nöronal hücre gövdeleri kayıt için uygun pipetler imalatı için bu yöntemi geliştirdi. Temel prensip, cam üfleme benzer ve geleneksel bir mikropipet çektirmenin tarafından hazırlanan yama pipetler şeklini değiştirmek için, hava basıncı ve ısı birleştirir. Bu sözde yumuşak (kostik soda) ve sert (borosilikat) gözlük uygulanabilir. Genel olarak konuşmak gerekirse, basınç parlatma ucu açıklığı (Goodman ve Lockery, 2000) çapı düşürmeden, pipetle direnci% 25 oranında azaltabilir. Hemen her tür cam uygulanan ve bir yüksek basınç valfi ve bir microforge monte sadece ek gerektirir. Bu teknik ultrasmall hücreleri (<5 m) kayıt için gerekli ve ayrıca pipet direnci en aza indirerek, tek kanallı kayıt artırabilirsiniz. Künt şekli delikli yama kelepçe kayıt için de yararlıdır perforasyonu için daha büyük bir membran bleb bu ucu şeklini sonuçları.

Protocol

Çekme pipetler

Çektirmesi gibi filament kullanarak bir Sutter P-97 / Kahverengi Mikroelektrod Çektirme Flaming, yaklaşık 10-20 pipetler bir set çekin.

1. Cam seçin. Biz borosilikat (BF150-86-10, OD = 1.5 mm, ID = 0.86 mm) kullanın. Temiz ve tozsuz kalır cam dikkatlice saklayın.
2. Çekme programı tasarlayın. Birincil amacı, uygulamaya bağlı olacaktır yaklaşık istenen boyut, açılan bir ucu. Sutter P-97-Pipet Yemek Tarifleri ² mükemmel bir referans.
3. Açılış çap ve pürüzsüzlük belirlemek için mikroskop altında pipetler uyun. Kaba, düzensiz ya da düzensiz ipuçları atın. Karşısında 2-4 mikron olan bir ucu açılış standart yama kelepçe kayıt için en iyisidir. Künt ucu tercih edilir aynı açılış çapı, direnci düşük açar. Şekli ve boyutu aşağıda, parlatma sırasında değiştirilebilir.

Basınç parlatma pipetler

1. Temiz, sıkıştırılmış hava hattı için bir pipet tutucu takın. Bir regülatör kullanarak, sıkıştırılmış hava hattı basıncı ~ 40 PSI ayarlayın. Pipet tutucu basıncı ve devre dışı bırakılmasına izin verecek bir 4-yönlü kontrol valfi basınçlı hava hattı bağlayın. Tygon ⅛, uzunluğu ® boru ile kontrol vanası bir pipet tutucu bağlayın.
2. Yüksek basınçlı bir pipet tutucu, bir ayak pedalı, düşük ve yüksek büyütme, uzun çalışma mesafesi (ideal, 10x ve 100x) hava hedefleri ile donatılmış bir mikroskop tarafından kontrol edilen bir parlatma bobini ile parlatma teçhizat (microforge) kullanın. Pipet açılışı protokol sırasında gözlemlemek edebilmek için kritik öneme sahiptir.
3. İsteğe Bağlı: Kat kapasitans azaltmak ve gürültü özelliklerinin iyileştirilmesi ("bölümüne bakın" Çekme pipetler, bu tekniğin) hidrofobik bir yalıtkan pipet .
4. Basınç valfi kapalı konumda olduğundan emin olun. Pipet pipet tutucu içine yerleştirin ve parmak sıkı uydurma sıkın.
   
   Güvenlik notu: pipet pipet tutucu içine sıkıca tutulur, hava basıncı, pipet pipet tutucu uzaklaştırılırlar neden olacaktır .
   
   
5. Microforge pipet ve tutucu yerleştirin. Mikroskop sahneye pozisyon pipet tutucu ucu ve parlatma bobin hem microforge düşük güçte (10x) görülebilir. ~ 75 mikron filament ucu getir. Isıtıldığında filament genişletmek olacağını aklınızda bulundurun.
6. Yüksek güç (100x) amacı geçin. Pipet ve parlatma bobin Her iki odak ve görüş alanı içinde olmalıdır. Değilse, parlatma bobin yükseklik ayarı. (Pipet konumu ayarlanabilir olamaz). Pipet ve parlatma bobini zıt görüş alanında yakın olmalıdır. Onu ısıtır olarak genişletmek ve pipet içine darbelerim çünkü çok pipet yakın bobin koymaktan kaçının.
7. Pipet içine basınçlı hava doğrudan vana açın ve pipet ucu arkasındaki konik dışa balon başlayana kadar ısıtmak.
8. Isıtma ucu çok yoğun balonlar önce durdurun. Deney için uygun mesafe, ısı ve zaman istenilen şekil belirlemek için gereklidir.
9. İsteğe Bağlı: basınç yokluğunda ucu parlatma ucu açılış çapı azaltın. 7. ve 8. adımları pipet şekli ve boyutları hem de ince ayar yapmak için tekrar tekrar.
10. Basınç kapatın ve pipet güvenli bir yöne işaret ederken, pipet kaldırmak ve tozdan korunacak temiz bir saklama kutusu yerleştirin.
    
    Güvenlik notu: hava basıncı kapalı değilse, kaldırma sırasında pipet pipet tutucu çıkartıldığı olabilir.

Microforge ilgili notlar

Off-the-raf piyasada bulunan parçaları monte microforge kullanın. (Ayrıca birkaç şirket, örneğin, ALA Bilim, GlassWorx bir basınç parlatma kiti satın alabilirsiniz). Microforge ne olursa olsun, genellikle sadece birkaç mikron çapında ucu açılması, görmek için yeterli olan optik olması esastır. Bunun için uzun bir çalışma mesafesi 100x objektif kullanın. Ayrıca, mont için yüksek ergime sıcaklığına sahip cam parlatma bobin pipetler buharlaşmış dolgu en aza indirmek için.

Bölüm 3: Beklenen Sonuçlar

Orta basınç parlatma çapı açılması kayda değer bir değişiklik olmadan bir pipetle direnci azaltabilir. İsterseniz, bu protokolü 5-10M arasında mikron alt açıklıkların ve dirençleri pipetler yapmak için kullanılabilir.

Discussion

Biz aslında C. 2-3 mikron nöronlardan gelen patch-klemp kayıt için pipetler yararlı hale getirmek için bu yöntem geliştirdi elegans ^1. Goodman laboratuvarda rutin olarak kullanılması. Biz sadece kayıt için küçük C. basınç lehçe pipetler elegans nöronlar, aynı zamanda iyon kanalları Xenopus oositleri ifade macropatch ve tek kanallı kayıtları elde etmek için. Belirli bir ucu açılması çapı için, künt şekli, düşük bir direnç pipet oluşturur. Alt pipet direnci düşük seri direnç ve düşük gürültü kayıtları yol açar.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Glass Capillaries	Consumable	Sutter Instrument Co.	BF150-85-10 (or similar)	The method works with any type of capillary except those made from quartz. However, we recommend using capillaries with a filament.
Inverted Microscope	Microscope	Leica Microsystems	DM IL (or similar)	Any simple inverted microscope will do. However, it is essential to have sufficient magnification to see pipettes during polishing. We use a 100x metallurgical lens with a long working distance for this purpose.
Microforge Kit	Tool	ALA Science	CPM-2	Supplies polishing coil, controller and foot pedal.
Air pressure source	Tool	ALA Science	PR-60	Accessory for providing high pressure, includes a suitable valve. Alternatively, compressed air from the building can be used together with a filter/regulator (set to 40 PSI) and a 4-way valve (see below)
4-way valve	Tool	Cole-Parmer	A-98150-01	Fittings will be needed to couple valve to tubing
Pipette Holder with Luer Connector	Tool	World Precision Instruments, Inc.	MPH-6S20	Use a male luer-to-barb fitting to connect pipette holder to high-pressure tubing
Tygon® tubing	Tool	Cole-Parmer	06408-62	Use this tubing to connect pipette holder to 4-way valve